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Biochemistry

संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए मानव विलेय वाहक की उच्च-थ्रूपुट अभिव्यक्ति और शुद्धि

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

मानव झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन स्थिर की मिलीग्राम मात्रा की आवश्यकता है, अक्षुण्ण, और सजातीय प्रोटीन. यहां हम कोडन-अनुकूलित जीन का उपयोग करके मानव विलेय वाहक ट्रांसपोर्टरों को स्क्रीन, व्यक्त और शुद्ध करने के लिए स्केलेबल तरीकों का वर्णन करते हैं।

Abstract

विलेय वाहक (एसएलसी) झिल्ली ट्रांसपोर्टर हैं जो आयनों, पोषक तत्वों, चयापचयों, न्यूरोट्रांसमीटर और फार्मास्यूटिकल्स सहित अंतर्जात और बहिर्जात सब्सट्रेट की एक श्रृंखला का आयात और निर्यात करते हैं। आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य और बीमारी के मार्करों के रूप में उभरने के बावजूद, प्रोटीन का यह समूह अभी भी वर्तमान फार्मास्यूटिकल्स द्वारा अपेक्षाकृत कम है। इन ट्रांसपोर्टरों के लिए दवा खोज परियोजनाएं सीमित संरचनात्मक, कार्यात्मक और शारीरिक ज्ञान से बाधित होती हैं, अंततः झिल्ली-एम्बेडेड प्रोटीन के इस वर्ग की अभिव्यक्ति और शुद्धि में कठिनाइयों के कारण। यहां, हम कोडन-अनुकूलित जीन अनुक्रमों का उपयोग करके मानव एसएलसी ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की उच्च शुद्धता, मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के तरीकों का प्रदर्शन करते हैं। निर्माण डिजाइन और उच्च-थ्रूपुट अभिव्यक्ति के व्यवस्थित अन्वेषण के संयोजन के साथ, ये प्रोटोकॉल लक्ष्य प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता और जैव रासायनिक गतिविधि के संरक्षण को सुनिश्चित करते हैं। हम यूकेरियोटिक सेल अभिव्यक्ति, आत्मीयता शुद्धि और इन प्रोटीनों के आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी में महत्वपूर्ण चरणों को भी उजागर करते हैं। अंततः, इस कार्यप्रवाह शुद्ध पैदावार, कार्यात्मक सक्रिय, और उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त स्थिर प्रोटीन तैयारी, परिवहन अध्ययन, छोटे अणु सगाई assays, और इन विट्रो स्क्रीनिंग में उच्च throughput.

Introduction

झिल्ली प्रोटीन लंबे समय से शोधकर्ताओं और दवा उद्योगों के लिए समान रूप से लक्ष्य रहे हैं। इनमें से, विलेय वाहक (एसएलसी) मानव जीनोम1 के भीतर एन्कोड किए गए 400 से अधिक माध्यमिक ट्रांसपोर्टर जीन का एक परिवार है। ये ट्रांसपोर्टर आयनोंसहित कई अणुओं के आयात और निर्यात में शामिल हैं 2, न्यूरोट्रांसमीटर3, लिपिड 4,5,6,7, अमीनो एसिड8, पोषक तत्व 9,10,11, और फार्मास्यूटिकल्स 12. सब्सट्रेट की इतनी चौड़ाई के साथ, इन प्रोटीनों को विषाक्त पदार्थोंके परिवहन 13, दुरुपयोग 14,15, या हानिकारक उत्परिवर्तन 16 की दवाओं द्वारा परिवहन और निषेध के माध्यम से पैथोफिज़ियोलॉजी की एक श्रृंखला में भी फंसाया जाता है। बैक्टीरियल होमोलॉग ने कई एसएलसी परिवारों 17,18,19,20,21,22,23,24,25 के मौलिक परिवहन तंत्र के लिए प्रोटोटाइप के रूप में कार्य किया है। मानव प्रोटीन के विपरीत, प्रोकैरियोटिक orthologs अक्सर बेहतर अच्छी तरह से समझा Escherichia कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली 26,27 में व्यक्त कर रहे हैं और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी28 के लिए अच्छी तरह से आदेश दिया क्रिस्टल उपज जो छोटे डिटर्जेंट में अधिक स्थिर हैं. हालांकि, अनुक्रम और कार्यात्मक मतभेद दवा की खोज29,30 के लिए इन दूर से संबंधित प्रोटीन के उपयोग को जटिल बनाते हैं। नतीजतन, एसएलसी31,32,33,34,35को लक्षित करने वाली दवाओं की कार्रवाई के तंत्र को समझने के लिए अक्सर मानव प्रोटीन के प्रत्यक्ष अध्ययन की आवश्यकता होती है। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में हालिया प्रगति ने अधिक देशी जैसी स्थितियों36,37 में एसएलसी के संरचनात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम किया है, इन प्रोटीनों को व्यक्त करने और शुद्ध करने में कठिनाई लक्षित चिकित्सीय और निदान विकसित करने के लिए एक चुनौती बनी हुई है।

इस चुनौती को कम करने के लिए, संकल्प संघ (re-solute.eu) बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति और मानव एसएलसी परिवार प्रोटीन38 की शुद्धि के लिए संसाधनों और प्रोटोकॉल विकसित किया है. कोडन-अनुकूलित जीन से शुरू करते हुए, हमने एसएलसी निर्माणों के उच्च-थ्रूपुट क्लोनिंग और स्क्रीनिंग के लिए तरीके विकसित किए हैं। इन विधियों को व्यवस्थित रूप से एसएलसी के पूरे परिवार पर लागू किया गया था, जीन को बैकमैम वायरल अभिव्यक्ति प्रणाली में क्लोन किया गया था, और प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण मानव कोशिका लाइनों39 में उच्च-थ्रूपुट क्लोनिंग और अभिव्यक्ति परीक्षण40 के लिए पहले वर्णित तरीकों के आधार पर किया गया था। सारांश में, SLC जीन pDONR221 प्लाज्मिड से pHTBV1.1 वेक्टर में क्लोन किया जाता है। इस निर्माण का उपयोग बाद में कीट कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए एक बैक्मिड वेक्टर में ब्याज के जीन को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है, जिसमें स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए एक साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर और बढ़ाने वाले तत्व शामिल हैं। परिणामी बैकुलोवायरस का उपयोग लक्ष्य एसएलसी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है।

हमने बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति और चयनित एसएलसी(चित्रा 1)की स्थिर शुद्धि के लिए मानकीकृत तरीके विकसित किए हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रभावी समस्या निवारण की सुविधा और प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कई चौकियां शामिल हैं। विशेष रूप से, प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण की नियमित निगरानी, साथ ही व्यक्तिगत लक्ष्यों के लिए शुद्धि की स्थिति के छोटे पैमाने पर अनुकूलन, स्ट्रेप और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग41,42 द्वारा सहायता प्राप्त थी।

अंततः, इन रासायनिक रूप से शुद्ध और संरचनात्मक रूप से सजातीय प्रोटीन नमूनों का उपयोग एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम), जैव रासायनिक लक्ष्य-सगाई परख, बाइंडर पीढ़ी के लिए टीकाकरण, और रासायनिक रूप से परिभाषित लिपोसोम में पुनर्गठन के माध्यम से सेल-मुक्त कार्यात्मक अध्ययन द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: सभी कोडन-अनुकूलित रेसोल्यूट एसएलसी जीन को AddGene43 में जमा किया गया है, जिसके लिंक RESOLUTE सार्वजनिक अभिकर्मकों44 की सूची में उपलब्ध हैं। इन जीनों pDONR221 प्लाज्मिड में क्लोन किया गया है और पुनर्संयोजन क्लोनिंग45 का उपयोग कर गंतव्य वेक्टर में जीन के प्रत्यक्ष क्लोनिंग की अनुमति देते हैं. समांतरता को अधिकतम करने के लिए, बैक्टीरिया, कीट और स्तनधारी कोशिकाओं को क्रमशः बैक्मिड उत्पादन (धारा 3), बैकुलोवायरस प्रवर्धन (धारा 5), और अभिव्यक्ति परीक्षण (धारा 6) के लिए ब्लॉक प्रारूप में उगाया जाता है। इन चरणों के लिए, पर्याप्त मिश्रण और वातन सुनिश्चित करने के लिए एक सूक्ष्म अभिव्यक्ति प्रकार के बरतन की आवश्यकता होती है।

1. (उच्च-थ्रूपुट) एसएलसी की pHTBV1.1 bacmid में क्लोनिंग

नोट: क्लोनिंग चरण हीट-शॉक विधि46 का उपयोग करके कुशल क्लोनिंग और एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) में परिवर्तन के लिए एक पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल को उच्च-थ्रूपुट और कई लक्ष्यों या निर्माणों के समानांतर क्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन इसे छोटे पैमाने पर आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. 96-वेल प्लेट में, pDONR221 SLC क्लोन के 150 एनजी और pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW वेक्टर के 100 एनजी जोड़ें। 10 एमएम ट्रिस पीएच 8.0 के साथ प्रतिक्रिया की मात्रा को 8 माइक्रोन तक लाएं, और फिर पुनर्संयोजन एंजाइम मिश्रण के 2 माइक्रोन जोड़ें।
  2. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, प्रोटीनेज के 1 माइक्रोन जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई मैक -1 कोशिकाओं के 50 माइक्रोन को बदलने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 4 माइक्रोन का उपयोग करें, हीट-शॉक विधि46 और वसूली के लिए एसओसी माध्यम का उपयोग करें। एलबी-अगर पर प्लेट जिसमें 5% सुक्रोज, या एसओसी अगर होता है, जो 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक होता है।
  4. उपयुक्त प्राइमरों (तालिका 1 देखें) और कॉलोनी पीसीआर47 के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर एसएलसी जीन डालने के साथ pHTBV1.1 वेक्टर को परेशान कालोनियों की पहचान करें।
  5. एक प्लाज्मिड miniprep किट का उपयोग कर ब्याज की जीन के साथ एकल कालोनियों से पुनः संयोजक प्लाज्मिड शुद्ध.

2. ट्रांसपोज़िशन

नोट: निम्नलिखित चरणों का उपयोग एसएलसी जीन को pHTBV1.1 वेक्टर से Sf9 कोशिकाओं में BacMam बैकुलोवायरस पीढ़ी के लिए बैक्मिड में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। हीट-शॉक विधि46 का उपयोग करते हुए, pHTBV1.1 वेक्टर DH10Bac सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में बदल जाता है, जिसमें lacZ-mini-attTn7 संलयन के साथ एक मूल बैक्मिड होता है। एक सहायक प्लाज्मिड48 द्वारा प्रदान किए गए ट्रांसपोज़िशन प्रोटीन की उपस्थिति में pHTBV1.1 वेक्टर और मूल बैक्मिड के तत्वों के बीच स्थानांतरण होता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त समाधानों की संरचना के लिए तालिका 2 देखें।

  1. 100-200 एनजी/जेडएल शुद्ध पीएचटीबीवी1.1 वेक्टर डीएनए के 3 माइक्रोन का उपयोग करके, 96-वेल पीसीआर प्लेट में हीट-शॉक विधि का उपयोग करके डीएच10बीएसी को बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 घंटे के लिए वसूली माध्यम में इनक्यूबेट करके कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें, जबकि एक सूक्ष्म अभिव्यक्ति प्रकार के बरतन में 700 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  2. DH10Bac चयन प्लेटों पर रूपांतरित कोशिकाओं के 50 माइक्रोन फैलाएं। पन्नी के साथ कवर 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को सेते हैं।
  3. एक एकल सफेद कॉलोनी (पुनः संयोजक डीएनए युक्त) और कमजोर पड़ने के लिए लकीर उठाओ. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

3. उच्च-थ्रूपुट बैकमिड उत्पादन

नोट: प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से bacmid शुद्धि किट का उपयोग bacmids निकालने के लिए चरणों का वर्णन करता है.

  1. व्यक्तिगत सफेद कालोनियों (कमजोर पड़ने प्लेटों के लिए लकीर से अलग) एक 96 गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक के कुओं में, 2x पौंड मध्यम (तालिका 2) के 1 एमएल युक्त.
  2. एक झरझरा सील के साथ कवर करें और एक सूक्ष्म अभिव्यक्ति प्रकार के बरतन में 700 आरपीएम पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. एक माइक्रोटिटर प्लेट में 60% ग्लिसरॉल के 30 माइक्रोन के साथ संस्कृति के 120 माइक्रोन को मिलाकर कोशिकाओं का ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 30 मिनट के लिए 2,600 × ग्राम पर गहरे कुएं ब्लॉक अपकेंद्रित्र. परिशोधन के लिए एक उपयुक्त कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला छानना. ब्लॉक को उल्टा करें और एक कागज़ के तौलिये पर धीरे से टैप करें। एक बहु चैनल विंदुक का उपयोग ब्लॉक के प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान 1 के 250 माइक्रोन जोड़ें.
  5. छर्रों को फिर से निलंबित करें; यदि आवश्यक हो, तो एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान 2 के 250 माइक्रोन जोड़ें और एक सिलिकॉन चटाई के साथ सील करें। धीरे 5x पलटें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. बहुत संक्षेप में स्पिन करें।
  7. समाधान 3 के 300 माइक्रोन जोड़ें और एक सिलिकॉन चटाई के साथ सील करें। धीरे से लेकिन 5x को उल्टा करके अच्छी तरह मिलाएं।
  8. 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना रखें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2,600 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र.
  9. एक ताजा 96 अच्छी तरह से ब्लॉक के लिए स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2,600 × ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र।
  10. एक ताजा 96-गहरे-अच्छी तरह से ब्लॉक में, प्रति अच्छी तरह से 100% आइसोप्रोपेनॉल के 0.8 एमएल का वितरण करें। इसी कुओं से सतह पर तैरनेवाला के 0.8 एमएल जोड़ें.
  11. धीरे विंदुक ऊपर और नीचे एक विंदुक का उपयोग कर, तो 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अधिक bacmid उपज के लिए.
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2,600 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  13. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, 70% इथेनॉल के साथ ब्लॉक के बाहर स्प्रे, ब्लॉक खुला, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  14. प्रत्येक अच्छी तरह से 70% इथेनॉल (वी / वी) के 500 माइक्रोन जोड़ें और गोली धोने के लिए धीरे से ब्लॉक नल. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2,600 × ग्राम पर एक चिपकने वाला प्लास्टिक सील और अपकेंद्रित्र के साथ कवर करें।
  15. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, ब्लॉक खोलें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इथेनॉल को हटाने के लिए एक कागज तौलिया पर बहुत धीरे से ब्लॉक ठोकर. ब्लॉक को 1-2 घंटे के लिए हुड के अंदर या 50 डिग्री सेल्सियस ओवन में सूखने दें।
  16. बाँझ ते बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें बैक्मिड डीएनए को फिर से निलंबित करने और चिपकने वाला प्लास्टिक सील का उपयोग करके सील करें। एक वी नीचे microtiter प्लेट के लिए सामग्री स्थानांतरण. परीक्षण शुद्धि पूरा होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बैकमिड डीएनए स्टोर करें और फिर इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: जबकि नियमित रूप से मापा नहीं जाता है, आम तौर पर 500 से 2,000 एनजी /
  17. मानक कॉलोनी पीसीआर विधियों47, और सफलतापूर्वक लक्ष्य जीन को शामिल करने bacmids के लिए स्क्रीन करने के लिए निम्नलिखित वेक्टर प्राइमरों का उपयोग करें:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    नोट: एम्प्लिकॉन लक्ष्य जीन से लगभग 700 बीपी बड़ा होगा।

4. अभिकर्मक

नोट: इन चरणों का उपयोग Sf9 कीट कोशिकाओं को उत्पादित bacmid के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए किया जाता है, जिससे कीट कोशिकाएं बैकुलोवायरस कण (P0) उत्पन्न करती हैं।

  1. सीरम मुक्त कीट माध्यम में Sf9 कोशिकाओं को 2.0-2.4 × 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व तक बढ़ाएं। सीरम मुक्त कीट माध्यम में कोशिकाओं को 2 × 105 कोशिकाओं/एमएल तक पतला करें और पतला कोशिकाओं के 1 एमएल को 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से फैलाएं। एक अभिकर्मक-अभिकर्मक-केवल और साथ ही एक कोशिकाओं-केवल नियंत्रण शामिल करें। सेल लगाव की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं.
  2. अभिकर्मक अभिकर्मक के प्रति अच्छी तरह से 2 माइक्रोन प्रति 2 माइक्रोन के साथ सीरम मुक्त कीट माध्यम के कुएं में 38 माइक्रोन मिलाएं। मिश्रण के 40 माइक्रोन को 96-अच्छी तरह से बाँझ फ्लैट-बॉटम माइक्रोटिटर प्लेट में फैलाएं। 0.5-2.0 μg/μL पर पुनः संयोजक bacmid डीएनए के 2 माइक्रोन जोड़ें, प्लेट को कवर करें, और 15 मिनट के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट के अंदर सेते हैं।
  3. डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण युक्त microtiter प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में सीरम मुक्त कीट माध्यम के 160 माइक्रोन जोड़ें.
  4. चरण 4.1 में कोशिकाओं से एस्पिरेट मीडियम। धीरे से, कोशिकाओं पर bacmid-अभिकर्मक अभिकर्मक-मध्यम मिश्रण के 200 माइक्रोन जोड़ें, प्लेट को कवर करें, और 27 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से 2% एफबीएस के साथ पूरक सीरम मुक्त कीट माध्यम के 400 माइक्रोन जोड़ें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए, प्लेट को एक साफ प्लास्टिक बैग में स्थानांतरित करें लेकिन इसे सील न करें। एक humidified इनक्यूबेटर में 72 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
  6. 3 दिनों के बाद, थाली से मीडिया को एक बाँझ 96-गहरे-अच्छी तरह से ब्लॉक में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। P0 baculovirus युक्त स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला एक बाँझ 96 गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में स्थानांतरण और प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

5. बैकमैम बैकुलोवायरस प्रवर्धन

नोट: प्रारंभिक P0 बैकुलोवायरस को उच्च टिटर वायरल स्टॉक में बढ़ाने के लिए निम्नलिखित चरणों का उपयोग किया जाता है; अर्थात् P1, P2, और P3। अंतिम P3 अनुमापांक पारगमन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है। दक्षता और समांतरता के लिए, यह प्रोटोकॉल वायरल प्रवर्धन के लिए निश्चित वॉल्यूमेट्रिक अनुपात का उपयोग करता है, जिसे अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित किया गया है। हालांकि, अगर बाद में ट्रांसड्यूड कोशिकाएं जीएफपी प्रतिदीप्ति और माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल व्यास में वृद्धि नहीं दिखाती हैं या यदि प्रोटीन अभिव्यक्ति विफल हो जाती है (अनुभाग 6 और 8 देखें), बैकुलोवायरस प्रवर्धन को बैकुलोवायरस टिटर 49,50,51,52 की मात्रा निर्धारित करने के बाद प्रत्येक चरण में संक्रमण की कम बहुलता के लिए फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए, और जीएफपी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और सेल व्यास 53 में वृद्धि की निगरानी की जाती है।

  1. सीरम मुक्त कीट माध्यम में Sf9 कोशिकाओं को 2 × 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व तक बढ़ाकर P1 वायरस स्टॉक तैयार करें, 2% FBS जोड़ें, और कोशिकाओं को 24-गहरे-कुएं वाले ब्लॉक में 3 एमएल प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में बीज दें। कोशिकाओं के लिए P0 वायरस स्टॉक के 120 माइक्रोन जोड़ें.
  2. 66-72 घंटे के लिए एक सूक्ष्म अभिव्यक्ति प्रकार के बरतन में 450 आरपीएम पर मिलाते हुए 27 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक सेते हैं. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर ब्लॉक अपकेंद्रित्र और 96 गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में सतह पर तैरनेवाला फसल. प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर पी 1 वायरस स्टॉक के रूप में स्टोर करें।
  3. Sf9 कोशिकाओं (2 × 106 कोशिकाओं/एमएल सेल घनत्व) के 50 एमएल को संक्रमित करके पी 2 वायरस स्टॉक तैयार करें, सीरम मुक्त कीट माध्यम में 2% एफबीएस के साथ पूरक होते हैं, पी 1 वायरस स्टॉक के 250 माइक्रोन के साथ। 110 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 20 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 66-72 घंटे के बाद हार्वेस्ट पी 2 वायरस स्टॉक और प्रकाश से दूर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. Sf9 कोशिकाओं (2 × 106 कोशिकाओं/एमएल सेल घनत्व) की वांछित मात्रा को 1:200 (v/v) P2 वायरल स्टॉक के साथ संक्रमित करके P2 वायरस स्टॉक तैयार करें। 110 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. 66-72 घंटे के बाद, 20 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला और स्टोर इकट्ठा करके पी 3 वायरस की फसल।

6. अभिव्यक्ति परीक्षण के लिए पारगमन

नोट: निम्नलिखित खंड छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति परीक्षण का वर्णन करता है और गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक का उपयोग करके कई निर्माणों के समानांतर परीक्षण के लिए संशोधित किया जा सकता है।

  1. डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ के 600 एमएल में खूंटी 10,000 के 200 ग्राम और एनएसीएल के 12 ग्राम को भंग करके 20% (डब्ल्यू / वी) पॉलीथीन ग्लाइकोल समाधान तैयार करें। समाधान को आटोक्लेव करें।
  2. एक 24 गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक और प्रत्येक अच्छी तरह से खूंटी समाधान के 75 माइक्रोन के कुओं में काटा पी 1 वायरस के 300 माइक्रोन जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 आरपीएम पर मिलाते हुए 18 डिग्री सेल्सियस पर एक सूक्ष्म अभिव्यक्ति प्रकार के बरतन में ब्लॉक सेते हैं और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक की दुकान.
  3. 18 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 300 आरपीएम पर फिर से ब्लॉक हिलाएं और 45 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर ब्लॉक को अपकेंद्रित्र करें। एक सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट में एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  4. HEK293 मध्यम में 2 × 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व के लिए निलंबन-अनुकूलित HEK293 कोशिकाओं को तैयार करें, और वायरस गोली वाले प्रत्येक कुएं में बीज 3 mL, 5 मिमी सोडियम ब्यूटायरेट के साथ पूरक हो।
  5. 72 घंटे के लिए 200-250 आरपीएम पर मिलाते हुए 8% सीओ2 के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सेल संस्कृति के दौरान विक्रेता द्वारा अनुशंसित सीओ2 सांद्रता क्रमशः 8% और 5% पर निलंबन-अनुकूलित और पैतृक HEK293 सेल लाइनों के लिए अलग हैं।
  6. 20 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को फसल और पीबीएस के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
    नोट: resuspended कोशिकाओं के 10 माइक्रोन महाप्राण और प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए एक GFP संगत फिल्टर घन के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखने के लिए. resuspended कोशिकाओं के 10-15 माइक्रोन महाप्राण और में जेल GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने54 के लिए एक पूरे सेल एसडीएस-पेज जेल चलाने.
  7. 20 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र। -80 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों फ्रीज.

7. उच्च थ्रूपुट छोटे पैमाने पर परीक्षण शुद्धि

नोट: निम्नलिखित चरणों में व्यक्तिगत एसएलसी के अभिव्यक्ति स्तरों की स्क्रीनिंग के लिए 24-अच्छी तरह से ब्लॉक प्रारूप में तेजी से परीक्षण शुद्धि वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त समाधानों की संरचना के लिए तालिका 2 देखें।

  1. कटा कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एचटी lysis बफर के 1 एमएल जोड़ें और एक 24 सिर जांच का उपयोग कर 24 अच्छी तरह से ब्लॉक में 4 मिनट (3 एस पर / 15 एस बंद पर साइकिल चलाना) की कुल लंबाई के लिए बर्फ पर sonicate करने के लिए आगे बढ़ें.
  2. सामग्री को 96-गहरे कुएं ब्लॉक में स्थानांतरित करें, डिटर्जेंट स्टॉक के 125 माइक्रोन जोड़ें, और सिलिकॉन सील के साथ सील करें। ब्लॉक को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से घुमाएं। वैकल्पिक रूप से, dodecylmaltoside (DDM) और कोलेस्ट्रॉल hemisuccinate (सीएचएस) सीधे 24 अच्छी तरह से ब्लॉक करने के लिए जोड़ने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव प्रकार के बरतन पर उन्हें जगह है.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2600 × ग्राम पर ब्लॉक अपकेंद्रित्र और एक नया 96 गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
  4. उच्च क्षमता वाले स्ट्रेप-टैक्टिन राल का 50% स्टॉक तैयार करें जो लाइसिस बफर के साथ पूर्व-संतुलित हो।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से निलंबित राल स्टॉक के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  6. एक सिलिकॉन सील के साथ ब्लॉक को कवर करें और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं और फिर कवर से चिपके तरल को हटाने के लिए बहुत संक्षेप में (200 × ग्राम तक) अपकेंद्रित्र करें।
  7. एक खाली ब्लॉक के शीर्ष पर एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट प्लेस और फिल्टर प्लेट में राल / सतह पर तैरनेवाला मिश्रण हस्तांतरण. एचटी वॉश बफर के 800 माइक्रोन के साथ गहरे कुएं ब्लॉक के कुओं को कुल्ला और राल की अधिकतम मात्रा एकत्र करने के लिए फिल्टर ब्लॉक में स्थानांतरित करें।
  8. बफर के माध्यम से ड्रिप या 200 × ग्राम पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र और flowthrough इकट्ठा. फिल्टर प्लेट को एक नए वॉश ब्लॉक के ऊपर रखें और राल को एचटी वॉश बफर के 800 माइक्रोन से धो लें, जिससे बफर (या संक्षेप में अपकेंद्रित्र) टपक सके। धोने के कदम को दो बार और दोहराएं और अवशिष्ट एचटी वॉश बफर को हटाने के लिए 3 मिन के लिए 500 × ग्राम पर ब्लॉक को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. फिल्टर प्लेट को 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के ऊपर रखें। एचटी क्षालन बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर झटकों के साथ सेते हैं। 3 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर centrifuging द्वारा नमूनों elute.
  10. प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए कूमासी दाग एसडीएस-पेज जेल पर एल्यूटेड नमूने के 15 माइक्रोन चलाएं। DDM/CHS में प्रोटीन मोनोडिस्पर्सिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) या प्रतिदीप्ति-पहचान आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफएसईसी) प्रणाली पर एलुएंट के शेष नमूनों को लोड करें।

8. बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए पारगमन

नोट: निम्नलिखित चरण एसएलसी अभिव्यक्ति के लिए मानक संकल्प प्रोटोकॉल हैं। व्यक्तिगत लक्ष्यों को अभिव्यक्ति समय, इनक्यूबेशन तापमान और सोडियम ब्यूटायरेट की एकाग्रता के लिए और अनुकूलन की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, हम नियमित रूप से छोटे पैमाने पर प्रयोगों में निलंबन-अनुकूलित HEK293 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले P3 वायरस के विभिन्न वॉल्यूमेट्रिक अनुपातों का परीक्षण करके संक्रमण की बैकोलोवायरस बहुलता का अनुकूलन करते हैं। यह समय कुशल है, पहले से ही तकनीक और उपकरणों का उपयोग करता है, और सीधे वांछित प्रयोगात्मक उत्पादन का मूल्यांकन करता है. हालांकि, इस अनुभवजन्य विधि P3 वायरस के प्रत्येक प्रवर्धन के साथ फिर से अनुकूलन की आवश्यकता है, और अन्य तरीकों बैकुलोवायरस कणों 49,50,51,52 यों निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं.

  1. HEK293 माध्यम में निलंबन-अनुकूलित HEK293 कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा को बढ़ाएं।
  2. निलंबन-अनुकूलित HEK293 कोशिकाओं को 1 × 106 कोशिकाओं/mL तक पतला करें और 24 घंटे (2 L रोलर बोतलों के लिए 170 rpm पर और 3 L रोलर बोतलों के लिए 105 rpm पर) के लिए बढ़ें।
  3. प्रति लीटर कोशिकाओं में पी 3 वायरस के 30 एमएल जोड़ें और 5 मिमी सोडियम ब्यूटिरेट जोड़ें। कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या 72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेशन अवधि के दौरान और बाद में, माइक्रोबियल संदूषण और सेल व्यवहार्यता की जांच के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिकाओं की जांच करना एक महत्वपूर्ण कदम है। एक GFP संगत फिल्टर घन के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का आकलन करें.
  5. 20 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल.
  6. सेल संस्कृति के प्रति लीटर पीबीएस के 10-15 एमएल में इसे निलंबित करके सेल गोली धो लें और 20 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर फिर से गोली लें।
  7. स्नैप-तरल नाइट्रोजन में सेल छर्रों फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.

9. प्रोटीन शुद्धिकरण

नोट: सेल संस्कृति के 5 एल के लिए एसएलसी शुद्धि के लिए मानक संकल्प विधि निम्नलिखित है। प्रत्येक एसएलसी लक्ष्य के लिए, इष्टतम डिटर्जेंट को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। बेस बफर, डिटर्जेंट स्टॉक समाधान, धोने, क्षालन, और एसईसी बफ़र्स अग्रिम में तैयार करें (तालिका 2)। परीक्षण किए गए मानक डिटर्जेंट की सूची के लिए, तालिका 3 देखें। वॉश बफर में एटीपी और एमजीसीएल2 हीट-शॉक प्रोटीन द्वारा संदूषण को कम करते हैं।

  1. दिन 1
    1. कमरे के तापमान पर सेट पानी के स्नान में जमे हुए सेल गोली को पिघलाएं।
    2. बेस बफर के 135 एमएल और तीन प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल टैबलेट के साथ घुलनशीलता बफर तैयार करें। गोलियों को घुलने दें।
    3. घुलनशीलता बफर के साथ पिघले हुए गोली को फिर से निलंबित करें। सेल गोली के 10-15 ग्राम प्रति घुलनशीलता बफर के 27 एमएल का उपयोग करें, DNase जोड़ें, और एक बर्फ-ठंडा Dounce homogenizer में डालना. प्लंजर को लगभग 20x ऊपर और नीचे ले जाकर समाधान को समरूप बनाएं, होमोजेनाइज़र को बर्फ पर रखें।
      नोट: resuspension मात्रा लक्ष्य प्रोटीन और सेल गोली द्रव्यमान के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी, जो फसल पर सेल घनत्व के कारण अलग अलग होंगे. निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक DNase जोड़ा जा सकता है। DNase को स्थापित प्रोटोकॉल55 का उपयोग करके घर में भी व्यक्त और शुद्ध किया जा सकता है।
    4. 1% अंतिम एकाग्रता के लिए डिटर्जेंट स्टॉक समाधान जोड़ें।
      नोट: प्रोटीन शुद्धि के अनुकूलन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एसएलसी घुलनशीलता और शुद्धिकरण के लिए इष्टतम डिटर्जेंट की पहचान कर रहा है, जिसे अनुभवजन्य रूप से पहचाना जाना चाहिए। हमने नियमित रूप से विभिन्न डिटर्जेंट का उपयोग किया है; प्रत्येक अकेले और कोलेस्टेरिल हेमिसुकेट के साथ संयोजन में, डिटर्जेंट को सीएचएस द्रव्यमान अनुपात में 10: 1 पर रखते हुए।
    5. घुलनशीलता मिश्रण को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए धीरे-धीरे घुमाएं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 50,000 × ग्राम पर समाधान अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए.
    7. बेस बफर के साथ स्ट्रेप-टैक्टिन राल की 4-6 एमएल बेड वॉल्यूम को संतुलित करें।
    8. घुलनशील सतह पर तैरनेवाला के लिए संतुलित राल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बारी बारी से.
    9. एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में समाधान डालो और समाधान के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं.
    10. 3 बराबर मात्रा चरणों में स्ट्रेप वॉश बफर के बिस्तर की मात्रा 30x के साथ राल को धोएं।
    11. क्षालन बफर के 3-5 एमएल जोड़ें, 15 मिनट के लिए सेते हैं, और एल्यूट इकट्ठा करते हैं। इस चरण को चार बार दोहराएं, प्रत्येक क्षालन अंश को अलग से इकट्ठा करें।
      नोट: एक महत्वपूर्ण कदम स्ट्रेप-टैक्टिन राल, जहां यह क्षालन बफर के प्रत्येक इसके अलावा के बाद 15 मिनट के लिए सेते करने के लिए महत्वपूर्ण है से प्रोटीन क्षालन है. आमतौर पर, पहले एल्यूएट अंश में अवशिष्ट वॉश बफर द्वारा क्षालन बफर के कमजोर पड़ने के कारण प्रोटीन की कम सांद्रता होती है। इसलिए, पहले eluate अंश त्याग दिया जा सकता है अगर एक उच्च अंतिम प्रोटीन एकाग्रता वांछित है. वैकल्पिक रूप से, सभी धारावाहिक elutions में प्रोटीन एकाग्रता भी प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए SDS-पेज का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है.
    12. यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापें, वांछित क्षालन अंशों को मिलाएं, और 1:5 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) से 1:10 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) के अनुपात में 3 सी प्रोटीज जोड़ें।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर धीरे-धीरे घुमाएँ.
      नोट: चरण 9.1.12 और 9.1.13 केवल तभी आवश्यक हैं जब GFP टैग को हटाने की आवश्यकता हो। यदि टैग हटाने की आवश्यकता नहीं है, तो सीधे चरण 9.2.4 पर आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन को अगले दिन जारी रखने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। इसके अलावा, कम स्थिरता वाले एसएलसी के लिए, प्रोटीज एकाग्रता, इनक्यूबेशन अवधि और तापमान को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। 3C प्रोटीज तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर सक्रिय है और विभिन्न एसएलसी के लिए सबसे उपयुक्त अनुकूलन की अनुमति देता है।
  2. दिन 2
    1. एसईसी बफर के साथ कोबाल्ट धातु आत्मीयता राल के बिस्तर की मात्रा के 2-4 एमएल को संतुलित करें।
    2. रात भर 3 सी प्रतिक्रिया मिश्रण में संतुलित कोबाल्ट धातु आत्मीयता राल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए घुमाएं।
    3. एक गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ में समाधान डालो और flowthrough इकट्ठा.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 × ग्राम पर कताई द्वारा एक 100 केडीए कट ऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर में flowthrough ध्यान केंद्रित और धीरे वांछित एसईसी इंजेक्शन मात्रा तक पहुँच गया है जब तक हर 5 मिनट नमूना मिश्रण.
    5. एसईसी बफर का उपयोग करके एक डेक्सट्रान-एगरोज़-आधारित आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी कॉलम को संतुलित करें। एसईसी प्रक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस (ठंडा कक्ष या ठंडा कमरा) पर किया जाना चाहिए।
      नोट: मुख्य कदम: एसएलसी के ऑलिगोमेरिक राज्य के आधार पर, एक अलग कॉलम, जैसे कि एक एग्रोज-आधारित आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी कॉलम, का उपयोग एसईसी करने के लिए किया जा सकता है।
    6. नमूना पाश में नमूना इंजेक्ट और एसईसी कार्यक्रम चलाने, एक प्रवाह दर के साथ इस तरह है कि स्तंभ दबाव स्तंभ निर्माता के विनिर्देशों से नीचे है. एक अंश कलेक्टर का उपयोग करके, पूरे एसईसी रन पर स्वचालित रूप से 0.3 एमएल अंश एकत्र करें।
    7. पूल पीक अंश, यूवी अवशोषण को मापते हैं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 × ग्राम पर कताई करके आवश्यक मात्रा / एकाग्रता के लिए 100 केडीए कट-ऑफ केन्द्रापसारक सांद्रक में ध्यान केंद्रित करते हैं।

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Representative Results

SLC जीन को स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए RESOLUTE pDONR प्लास्मिड से BacMam वैक्टर में क्लोन किया जा सकता है
क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए वर्णित प्रोटोकॉल कई प्रोटीन सिलवटों में कई एसएलसी ट्रांसपोर्टरों के लिए सफल साबित हुए हैं। फिर भी, प्रक्रियाओं में प्रगति की निगरानी के लिए कई चौकियां शामिल हैं, जो अभिव्यक्ति में अंतर, प्रोटीन तह, लिपिड- और डिटर्जेंट-निर्भर स्थिरता, और बफर स्थितियों के प्रति संवेदनशीलता के लिए अनुकूलन की अनुमति देती हैं।

एसएलसी क्लोनिंग और छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति के दौरान चौकियां
क्लोनिंग चरणों में, पीसीआर और पाचन उत्पादों के सही आकार को सुनिश्चित करने के लिए अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाना चाहिए। इसी तरह, गेटवे और स्थानांतरण प्रतिक्रियाओं एक कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रिया(चित्रा 2ए,बी)के साथ मान्य किया जा सकता है. बैकोलोवायरस पीढ़ी की निगरानी मानक तकनीकों का उपयोग करके आवश्यक 49,50,51,52 के रूप में की जा सकती है। प्रारंभिक अभिव्यक्ति एक छोटे पैमाने पर किया जाना चाहिए, एसडीएस-पेज (चित्रा 2 बी) द्वारा प्रोटीन उपज का मूल्यांकन. इसी तरह, हरे फ्लोरोसेंट कोशिकाओं, कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति, और प्रोटीन स्थानीयकरण के अंश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2सी,डी)का उपयोग कर नोट किया जाना चाहिए. प्रोटीन अभिव्यक्ति सेल प्रकार, तापमान, समय, और सह व्यक्त chaperones या जटिल भागीदारों की आवश्यकता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. अभिव्यक्ति आगे अव्यवस्थित एन छंटनी करने के लिए निर्माण को संशोधित करके अनुकूलित किया जा सकता है- और सी-टर्मिनी, माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी56,57,58 के आधार पर, और प्रकार और आत्मीयता टैग के प्लेसमेंट का परीक्षण. प्रोटीन स्थिरता एफएसईसी (चित्रा 2ई), एसईसी आधारित थर्मल शिफ्ट परख (एसईसी-टीएस), और डीएसएफ 41,42,59,60,61,62 द्वारा एक छोटे पैमाने पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए. छोटे अणुओं, जैसे सब्सट्रेट और अवरोधक, डिटर्जेंट, कोलेस्ट्रॉल हेमिसुकेट, लिपिड, और पीएच को प्रोटीन के कार्य और देशी उपकोशिकीय वातावरण और बाद में शुद्धि बफ़र्स को तदनुसार संशोधित करते हुए प्रोटीन स्थिरता में सुधार के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति setups में, कोशिकाओं व्यवहार्यता और संदूषण के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की जानी चाहिए.

बड़े पैमाने पर ट्रांसपोर्टर शुद्धि का अनुकूलन
बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धि के प्रत्येक चरण में विशेष रूप से GFP टैग प्रोटीन और उस टैग के एंजाइमी हटाने की निगरानी करने के लिए में जेल प्रतिदीप्ति सहित, एसडीएस-पेज द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए. व्यवहार में, GFP टैग एसएलसी व्यक्त कोशिकाओं पीले-हरे रंग दिखाई देते हैं. ट्विन-स्ट्रेप-टैग क्रोमैटोग्राफिक क्षालन के बाद, शुद्ध प्रोटीन युक्त एलुएंट सफेद रोशनी के नीचे फ्लोरोसेंट नीयन-हरा दिखाई देता है। रासायनिक और संरचनात्मक रूप से सजातीय प्रोटीन को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2 एफ, जी) के दौरान एक एकल मोनोडिस्पर्स ए280 चोटी का उत्पादन करना चाहिए, और एसडीएस-पेज पर एक एकल बैंड दिखाना चाहिए। अपेक्षित एसएलसी के अनुरूप एसडीएस-पेज बैंड, और किसी भी अप्रत्याशित बैंड का विश्लेषण ट्रिप्टिक पाचन द्रव्यमान-स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके किया जाना चाहिए। एसडीएस-पेज जेल पर कई बैंड या तो प्रोटियोलिटिक गिरावट, दूषित प्रोटीन, या एसडीएस-प्रतिरोधी ओलिगोमर्स का संकेत देते हैं। घुलनशीलता बफर के NaCl एकाग्रता को बढ़ाकर या आत्मीयता टैग को बदलकर दूषित प्रोटीन को हटाया जा सकता है। प्रोटीन की शुद्धता में सुधार करके प्रोटियोलिसिस को सीमित किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करना कि सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर किए जाते हैं, और प्रत्येक चरण के समय को कम करने के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन करते हैं। यदि एसईसी प्रोफाइल में एक व्यापक शिखर, कई चोटियां, या बड़ी शून्य चोटी (जैसे चित्रा 2 एफ का बैंगनी निशान) है, तो निर्माण और शुद्धिकरण की स्थिति को एफएसईसी, एसईसी-टीएस, या डीएसएफ 41,42,59,60,61,62 का उपयोग करके छोटे पैमाने पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: एसएलसी अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए दृढ़ वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। पुनर्संयोजन क्लोनिंग का चरण-दर-चरण चित्रण, बैकम बैकुलोवायरस तैयारी, प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण, और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग। संक्षिप्ताक्षर: एसएलसी = विलेय वाहक; क्रायो-ईएम = क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एसएलसी अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) पीएचटीबीवी1.1-सी3सीजीएफपी-एसआईआईआई-10एच-जीटीडब्ल्यू में उच्च-थ्रूपुट एसएलसी क्लोनिंग की कॉलोनी पीसीआर। (बी) 24 अलग-अलग पूर्ण-लंबाई एसएलसी के एकल छोटे पैमाने पर, समानांतर अभिव्यक्ति परीक्षण के कोमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज। (सी) प्लाज्मा झिल्ली के लिए मुख्य रूप से स्थानीयकरण एक GFP टैग एसएलसी के सेल प्रतिदीप्ति. (डी)महत्वपूर्ण इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण के साथ एक जीएफपी-टैग एसएलसी के इन-सेल प्रतिदीप्ति। (ई) चार एसएलसी के लिए प्रतिनिधि एफएसईसी निशान एक हाइड्रोफिलिक, तटस्थ सिलिका-आधारित यूएचपीएलसी कॉलम पर हल किए गए। प्रतिनिधि एसईसी छह एसएलसी के लिए या तो एक (एफ) डेक्सट्रान-अगारोज या (जी) एगरोज आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर शुद्ध होते हैं। शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले एसएलसी कॉम्प्लेक्स और डिटर्जेंट के आणविक भार को इंगित किया जाता है जहां ऑलिगोमेरिक राज्य प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया गया है। संक्षिप्ताक्षर: एसएलसी = विलेय वाहक; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; FSEC = प्रतिदीप्ति का पता लगाने आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: शुद्ध एसएलसी के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग । (ए) डिटर्जेंट में एसएलसी 1 ए 1 का माइक्रोग्राफ। (बी) डिटर्जेंट में एसएलसी 1 ए 1 के 2 डी वर्ग औसत। (सी)सीपीएम थर्मल विकृतीकरण परख की कच्ची प्रतिदीप्ति टॉरोलिथोकोलिक एसिड 3-सल्फेट की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन SLC10A6। (डी) SLC10A6 के सीपीएम थर्मल विकृतीकरण का पहला व्युत्पन्न। 120 माइक्रोन टॉरोलिथोकोलिक एसिड 3-सल्फेट की उपस्थिति में SLC10A6 के पिघलने का तापमान 10 डिग्री सेल्सियस बढ़ गया। संक्षिप्ताक्षर: एसएलसी = विलेय वाहक; सीपीएम = एन- [4- (7-डायथाइलैमिनो-4-मिथाइल-3-कौमारिनिल) फिनाइल] मैलिमाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वेक्टर नाम एंटीबायोटिक मार्कर शुद्धिकरण के लिए टैग स्क्रीनिंग प्राइमर पीसीआर के दौरान बीपी जोड़ा गया
पीएचटीबीवी 1.1-सी 3 सीजीएफपी-एसआईआईआई -10 एच-जीटीडब्ल्यू एम्पआर सी-टर्मिनल pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~ 350
3C प्रोटीज साइट GFP
ट्विन-स्ट्रेप GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
उनके10
पीडीओएनआर221 कानआर कोई नहीं M13 फॉरवर्ड ~190
M13 रिवर्स

तालिका 1: प्लास्मिड का उपयोग रेसोल्यूट क्लोनिंग और बैकमैम पीढ़ी के लिए किया जाता है।

विलयन संयोजन
DH10Bac चयन प्लेटहरू एलबी-अगर प्लेटें जिनमें 50 μg/mL कनामाइसिन, 10 μg/mL टेट्रासाइक्लिन, 7μg/mL जेंटामाइसिन, 40 μg/mL IPTG, और 100 μg/mL ब्लू-गैल शामिल हैं
2x एलबी माध्यम (एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) 2x LB शोरबा जिसमें 50 μg/mL कनामाइसिन, 10 μg/mL टेट्रासाइक्लिन और 7 μg/mL जेंटामाइसिन होता है
एचटी Lysis बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 250 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, EDTA-मुक्त प्रोटीज अवरोधक
एचटी वॉश बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 250 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 0.03% DDM/0.003% CHS
एचटी क्षालन बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 250 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 0.03% DDM/0.003% CHS, 100 मिमी डी-बायोटिन
बेस बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl
डिटर्जंट स्टॉक सॉल्यूशन 10% (w/v) डिटर्जेंट, उपयुक्त के रूप में 1% सीएचएस के साथ या बिना। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
स्ट्रेप वॉश बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 3 गुना CMC पर डिटर्जेंट, 10 मिमी MgCl2, 1 मिमी एटीपी
स्ट्रेप क्षालन बफर 50 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 100 मिमी डी-बायोटिन, 3 गुना सीएमसी पर डिटर्जेंट
आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) बफर 20 मिमी HEPES-NaOH, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 2 गुना सीएमसी पर डिटर्जेंट। 0.22 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें।
सोडियम ब्यूटायरेट DPBS में 1 M समाधान, दीर्घकालीन उपयोग के लिए -20 °C पर स्टोर करें।

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल और उनकी संरचना में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की एक सूची।

डिटर्जंट प्रणाली निष्कर्षण एकाग्रता शुद्धिकरण एकाग्रता (% w/v)
डीडीएम 1% 0.03%
डीडीएम + सीएचएस 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
डीएम 1% 0.25%
डीएम + सीएचएस 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
एनजी 1% 0.60%
ओग 1.5% 1.50%
एलडीएओ 1% 0.07%
एलडीएओ + सीएचएस 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
सी12ई8 1% 0.015%
सी 12 ई 8 + सीएचएस 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
सी 12 ई 9 + सीएचएस 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
सायमल-5 1% 0.40%
एल.एम.जी. 1% 0.005%
एलएमएनजी + सीएचएस 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
जीडीएन 1% 0.02%
डिजिटोनिन 0.05%
ओजीएनजी + सीएचएस 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
सी 12 ई 10 + सीएचएस 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos Choline-12 1% 0.14%

तालिका 3: झिल्ली घुलनशीलता और एसएलसी मोनोडिस्पर्सिटी और स्थिरता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक डिटर्जेंट।

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Discussion

ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन के व्यवस्थित लक्षण वर्णन की अनुपस्थिति के कारण एसएलसी-लक्ष्यीकरण उपचारों का विकास बाधित रहा है। इसने सामान्य और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं में उनकी कई भूमिकाओं के बावजूद, जीपीसीआर और आयन चैनल63 के सापेक्ष इस प्रोटीन वर्ग को लक्षित करने वाली असमान रूप से कम दवाओं का नेतृत्व किया है। रेसोल्यूट एक अंतरराष्ट्रीय संघ है जिसका उद्देश्य वर्तमान एसएलसी अनुसंधान में तेजी लाने और सुधार करने के लिए अत्याधुनिक अनुसंधान तकनीकों और उपकरणों को विकसित करना है। रेसोल्यूट के एक भाग के रूप में, हमने कुशल क्लोनिंग, निर्माण स्क्रीनिंग, और बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति और मानव एसएलसी की शुद्धि के लिए इन प्रोटोकॉल को विकसित किया है।

यहां हम स्केलेबल एसएलसी क्लोनिंग और अभिव्यक्ति विधियों का वर्णन करते हैं जो मानव एसएलसी ट्रांसपोर्टरों का व्यवस्थित रूप से पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किए गए थे, जिसमें ख्यात और अनाथ एसएलसी शामिल हैं। विशेष रूप से, इस तरह से शुद्ध एसएलसी का ट्रांसपोर्टर संरचना, जैव रसायन, कार्य, बाइंडर पीढ़ी और छोटे-अणु बंधन के बाद के अध्ययनों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हम नियमित रूप से विभिन्न एसएलसी की मिलीग्राम मात्रा को शुद्ध करने के लिए इस विधि को नियोजित करते हैं और इष्टतम स्थितियों के तहत, क्लोनिंग और टिशू कल्चर चरणों सहित पूरे प्रोटोकॉल को 4-5 सप्ताह में पूरा किया जा सकता है।

हमारी विधि अर्थव्यवस्था और समानता के लिए अनुकूलित है ताकि व्यवस्थित रूप से कई लक्ष्यों का मूल्यांकन किया जा सके। हालांकि, इस उच्च-थ्रूपुट विधि को अलग-अलग क्लोनिंग प्राइमरों या वैक्टर का उपयोग करके विभिन्न ट्रंकेशन या टैग के साथ एकल लक्ष्य के लिए निर्माणों की समानांतर पीढ़ी के लिए आसानी से अनुकूलित किया जाता है। यह उन तरीकों के समान है जो लक्ष्य64 के लिए कई निर्माणों को भी अनुकूलित करते हैं, हालांकि हमारा प्रोटोकॉल समानांतर क्लोनिंग, बैकुलोवायरस पीढ़ी और अभिव्यक्ति परीक्षण के साथ और क्षमता प्रदान करता है। अभिकर्मक बैकोलोवायरस पीढ़ी65 से गुजरने से निर्माण क्लोनिंग और अभिव्यक्ति के बीच एक कम समय प्रदान करता है, लेकिन बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए काफी अधिक महंगा और श्रमसाध्य है। इसके विपरीत, स्थिर सेल लाइनों की संभावना बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति66 के लिए कम खर्चीला है, लेकिन अत्यधिक व्यक्त क्लोनल सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए अधिक समय और विशेष संसाधनों की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, जबकि यह प्रोटोकॉल प्रोटीन उत्पादन के लिए मानव सेल लाइनों का उपयोग करता है, कीट कोशिकाओं की लाइन जैसे कि स्पोडोप्टेरा फ्रूजाइपेर्डा और ट्राइकोप्लुसिया नी का भी बड़े पैमाने पर एसएलसी अभिव्यक्ति 5,31,64 के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। मानव सेल लाइनों में अभिव्यक्ति मीडिया लागत बढ़ जाती है, लेकिन अधिक देशी की तरह अनुवाद के बाद संशोधनों और लिपिड वातावरण39,67 प्रदान करता है.

जबकि प्रोटोकॉल विभिन्न झिल्ली ट्रांसपोर्टरों और प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कई कारक शुद्ध प्रोटीन नमूनों की गुणवत्ता और उपज को प्रभावित करते हैं। हालांकि यह पूर्ण लंबाई प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, अनुक्रम छंटनी के कुछ डिग्री बेहतर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है, शुद्धि, और पुनर्गठन पैदावार. सभी दृढ़ एसएलसी निर्माणों को एक क्लीवेबल जीएफपी के साथ टैग किया गया है, जो एसएलसी अभिव्यक्ति, सेलुलर स्थानीयकरण और शुद्धिकरण की निगरानी में मूल्यवान है। इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले निलंबन-अनुकूलित HEK293 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली ने बेहतर पैदावार की है और इसकी सिफारिश की जाती है, हालांकि हम नियमित रूप से निलंबन-अनुकूलित HEK293 GnTl- सेल लाइन के माध्यम से जटिल ग्लाइकोसिलेशन के बिना प्रोटीन का उत्पादन करते हैं। ट्रांसड्यूड कोशिकाओं द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इनक्यूबेशन तापमान और लंबाई को प्रत्येक लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, हालांकि हमने 30 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे को एक अच्छा डिफ़ॉल्ट पाया है।

सभी प्रोटीन शुद्धि चरणों को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए और एक बार शुद्ध प्रोटीन स्नैप-जमे हुए होने के बाद, फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचा जाना चाहिए। झिल्ली घुलनशीलता और शुद्धिकरण बफ़र्स में उपयोग किए जाने वाले डिटर्जेंट का प्रकार और मात्रा महत्वपूर्ण है और प्रत्येक एसएलसी के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

इस विधि से शुद्ध किए गए एसएलसी सजातीय और संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से बरकरार नमूने उत्पन्न करते हैं, जिनका उपयोग विभिन्न जैव रासायनिक और बायोफिजिकल अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। नकारात्मक दाग और क्रायो-ईएम(चित्रा 3ए,बी)द्वारा घुलनशील और शुद्ध एसएलसी प्रोटीन के एकल, असतत कणों का अवलोकन करना बाद में संरचना निर्धारण37के लिए आशाजनक हो सकता है। डिटर्जेंट में शुद्ध एसएलसी इस तरह के सब्सट्रेट, अवरोधकों, या लिपिड59,62 के रूप में छोटे अणुओं के साथ प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए थर्मल स्थिरता परख (चित्रा 3 सी, डी) के रूप में बायोफिजिकल परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, जैव रासायनिक assays में इस प्रोटोकॉल का उपयोग शुद्ध एसएलसी कार्यात्मक assays68 के लिए liposomes या nanodiscs में पुनर्गठन किया जा सकता है और एंटीबॉडी और नैनो पीढ़ी औरचयन 69,70 के लिए इस्तेमाल किया. हालांकि नए एसएलसी-लक्षित छोटे अणुओं 1 की खोज के लिए आवश्यक थ्रूपुट के लिए इन तरीकों को अनुकूलित करना एक चुनौती बनी हुई है, इन विट्रो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों 71,72,73,74 के क्षेत्र में आशाजनक प्रगति हुई है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम रेसोल्यूट प्रोजेक्ट के भीतर किया गया था। रेसोल्यूट को अनुदान समझौते संख्या 777372 के तहत इनोवेटिव मेडिसिन्स इनिशिएटिव 2 संयुक्त उपक्रम से धन प्राप्त हुआ है। इस संयुक्त उपक्रम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम और ईएफपीआईए से समर्थन प्राप्त होता है। यह लेख केवल लेखकों के विचारों को दर्शाता है और न तो आईएमआई और न ही यूरोपीय संघ और ईएफपीआईए किसी भी उपयोग के लिए जिम्मेदार हैं जो उसमें निहित जानकारी से बना हो सकता है। pHTBV प्लाज्मिड कृपया प्रो फ्रेडरिक बॉयस (हार्वर्ड) द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

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Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

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