Summary
ヒト膜トランスポーターの構造的および生化学的研究には、安定で無傷の均質なタンパク質がミリグラム単位で必要です。ここでは、コドン最適化遺伝子を用いてヒト溶質キャリアトランスポーターをスクリーニング、発現、精製するためのスケーラブルな方法について説明します。
Abstract
溶質担体(SLC)は、イオン、栄養素、代謝物、神経伝達物質、医薬品など、さまざまな内因性および外因性の基質を輸出入する膜トランスポーターです。このタンパク質群は、魅力的な治療標的および疾患マーカーとして浮上しているにもかかわらず、現在の医薬品では比較的薬漬けにされていません。これらのトランスポーターの創薬プロジェクトは、構造的、機能的、生理学的知識が限られているために妨げられており、最終的にはこのクラスの膜包埋タンパク質の発現と精製が困難であるためです。ここでは、コドン最適化遺伝子配列を用いて、高純度のミリグラム量のヒトSLCトランスポータータンパク質を得る方法を紹介します。これらのプロトコルは、コンストラクトデザインとハイスループット発現の体系的な探索と併せて、標的タンパク質の構造的完全性と生化学的活性の維持を保証します。また、これらのタンパク質の真核細胞発現、アフィニティー精製、およびサイズ排除クロマトグラフィーにおける重要なステップについても強調しています。最終的に、このワークフローにより、高分解能構造決定、輸送研究、低分子結合アッセイ、およびハイスループットin vitro スクリーニングに適した、純粋で機能活性かつ安定したタンパク質調製が得られます。
Introduction
膜タンパク質は、長い間、研究者や製薬業界の標的となってきました。これらのうち、溶質キャリア(SLC)は、ヒトゲノム1内にコードされている400を超える二次トランスポーター遺伝子のファミリーです。これらのトランスポーターは、イオン2、神経伝達物質3、脂質4,5,6,7、アミノ酸8、栄養素9,10,11、医薬品12など、多数の分子の輸出入に関与しています。このような幅広い基質により、これらのタンパク質は、毒素の輸送13、乱用薬物の輸送と阻害14,15、または有害な突然変異16を通じて、さまざまな病態生理学にも関与しています。細菌の相同体は、いくつかのSLCファミリーの基本的な輸送メカニズムのプロトタイプとして機能してきました17、18、19、20、21、22、23、24、25。ヒトタンパク質とは対照的に、原核生物のオルソログは、よく理解されている大腸菌発現系でよりよく発現することが多く26,27、X線結晶構造解析用の整然とした結晶を生成する小さな界面活性剤でより安定しています28。しかし、配列と機能の違いは、これらの遠縁タンパク質の創薬への使用を複雑にします29,30。したがって、SLCを標的とする薬物の作用機序を解読するために、ヒトタンパク質の直接的な研究がしばしば必要になります31、32、33、34、35。クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)の最近の進歩により、より天然に近い条件でのSLCの構造特性評価が可能になりましたが36,37、これらのタンパク質の発現と精製の難しさは、標的治療薬や診断薬の開発にとって依然として課題です。
この課題を軽減するため、RESOLUTE コンソーシアム (re-solute.eu) は、ヒト SLC ファミリータンパク質の大規模な発現と精製のためのリソースとプロトコルを開発しました38。コドン最適化遺伝子を皮切りに、SLCコンストラクトのハイスループットクローニングおよびスクリーニング法を開発しました。これらの方法はSLCファミリー全体に系統的に適用され、遺伝子はBacMamウイルス発現系にクローニングされ、タンパク質発現は、以前に記述されたハイスループットクローニングおよび発現試験の方法に基づいてヒト細胞株で試験された39。要約すると、SLC遺伝子はpDONR221プラスミドからpHTBV1.1ベクターにクローニングされます。その後、このコンストラクトを使用して、哺乳類細胞で発現するためのサイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハンサー要素を含む昆虫細胞をトランスフェクションするためのバクミドベクターに目的の遺伝子を転置します。得られたバキュロウイルスは、標的SLCタンパク質の発現のために哺乳類細胞を形質導入するために使用できます。
さらに、選択したSLCの大規模発現と安定精製のための標準化された方法を開発しました(図1)。このプロトコルには、効果的なトラブルシューティングを容易にし、実験間のばらつきを最小限に抑えるための複数のチェックポイントが含まれています。特に、タンパク質の発現と局在のルーチンモニタリング、および個々のターゲットの精製条件の小規模な最適化は、連鎖球菌および緑色蛍光タンパク質(GFP)タグによって支援されました41,42。
最終的に、これらの化学的に純粋で構造的に均質なタンパク質サンプルは、X線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)による構造決定、生化学的ターゲットエンゲージメントアッセイ、結合剤生成のための免疫、および化学的に定義されたリポソームへの再構成による無細胞機能研究に使用できます。
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Protocol
注:すべてのコドン最適化 RESOLUTE SLC 遺伝子は AddGene43 に寄託されており、そのリンクは RESOLUTE 公開試薬44 のリストに掲載されています。これらの遺伝子はpDONR221プラスミドにクローニングされており、組換えクローニングを用いて目的ベクターへの遺伝子の直接クローニングを可能にする45。並行性を最大化するために、細菌、昆虫、および哺乳類細胞を、それぞれバクミド産生(セクション3)、バキュロウイルス増幅(セクション5)、および発現試験(セクション6)のためにブロックフォーマットで増殖させます。これらのステップでは、十分な混合と曝気を確保するために、微量発現シェーカーが必要です。
1. pHTBV1.1バクミドへのSLCの(ハイスループット)クローニング
注:クローニングステップは、熱ショック法46を用いて、効率的なクローニングおよび大腸菌(大腸菌)への形質転換のための組換えクローニングプロトコルを使用する。このプロトコルは、複数のターゲットまたはコンストラクトのハイスループットおよび並列クローニング用に設計されていますが、より小さなスケールにも容易に適合させることができます。
- 96ウェルプレートに、150 ngのpDONR221 SLCクローンと100 ngのpHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTWベクターを添加します。10 mM Tris pH 8.0で反応容量を8 μLにし、組換え酵素ミックス2 μLを添加します。
- 室温で1時間インキュベートし、1μLのプロテイナーゼKを加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 4 μLの反応混合物を使用して、50 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 MACH-1細胞をヒートショック法46 およびSOC培地を使用して形質転換します。100 μg/mL のアンピシリンを添加した 5% スクロース(SOC 寒天培地)を含む LB-寒天培地にプレーティングします。
- 適切なプライマー(表1を参照)およびコロニーPCR47の標準プロトコルを使用して、SLC遺伝子インサートでpHTBV1.1ベクターを有するコロニーを同定します。
- プラスミドミニプレップキットを使用して、目的の遺伝子を持つ単一コロニーから組換えプラスミドを精製します。
2. 移調
注:以下のステップは、sf9細胞におけるBacMamバキュロウイルス産生のために、pHTBV1.1ベクターからのSLC遺伝子をバクミドに転置するために使用されます。ヒートショック法46を用いて、pHTBV1.1ベクターは、lacZ−mini−attTn7融合を有する親バクミドを含むDH10Bacコンピテント 大腸菌 細胞に形質転換される。転位は、ヘルパープラスミド48によって提供される転位タンパク質の存在下で、pHTBV1.1ベクターの要素と親バクミドとの間で起こる。このプロトコルで使用される溶液の組成については、 表2 を参照してください。
- 3 μLの100-200 ng/μL精製pHTBV1.1ベクターDNAを用いて、96ウェルPCRプレート内でヒートショック法を用いてDH10Bacを形質転換します。細胞を回収培地中で37°Cで4〜5時間インキュベートし、マイクロエクスプレッションシェーカーで700rpmで振とうして細胞を回収します。
- 形質転換細胞50 μLをDH10Bac選択プレートに広げます。プレートをホイルで覆い、37°Cで48時間インキュベートします。
- 単一の白いコロニー(組換えDNAを含む)を選び、希釈するまで縞模様にします。37°Cで一晩インキュベートします。
3. 高スループットのbacmidの生産
注:このプロトコルでは、96ウェルバクミド精製キットを使用してバクミドを抽出する手順を説明しています。
- 個々のホワイトコロニー(縞模様のあるプレートから希釈プレートまで単離)を、1 mLの2x LB培地を含む96ディープウェルブロックのウェルに接種します(表2)。
- 多孔質シールで覆い、37°C、700rpmで一晩、マイクロエクスプレッションシェーカーでインキュベートします。
- マイクロタイタープレートで培養液120 μLと60%グリセロール30 μLを混合して細胞のグリセロールストックを調製し、-80°Cで保存します。
- 深井戸ブロックを 2,600 × g で 30 分間遠心分離します。上澄み液を除染に適した容器にデカントします。ブロックを反転させ、ペーパータオルを軽くたたきます。マルチチャンネルピペットを使用して、250 μLの溶液1をブロックの各ウェルに添加します。
- ペレットを再懸濁します。必要に応じて、マルチチャンネルピペットを使用してください。
- 250 μLの溶液2を各ウェルに加え、シリコンマットで密封します。静かに5回反転させ、室温で10分間インキュベートします。非常に短いスピン。
- 300 μLの溶液3を加え、シリコンマットで密封します。5倍にひっくり返して、穏やかに、しかし完全に混ぜます。
- サンプルを氷上に20分間置き、2,600 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 透明な上清を新しい96ウェルブロックに移します。2,600 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 新鮮な 96 ディープウェルブロックで、ウェルあたり 0.8 mL の 100% イソプロパノールを分注します。対応するウェルから上清 0.8 mL を添加します。
- ピペットを使用して静かにピペットで上下させ、氷上で30分間または4°Cで一晩インキュベートして、より多くのバクミドを生成します。
- 2,600 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 生物学的安全キャビネット内で、ブロックの外側に70%エタノールをスプレーし、ブロックを開き、上清を廃棄します。
- 500 μLの70%エタノール(v/v)を各ウェルに加え、ブロックを軽くたたいてペレットを洗浄します。粘着プラスチックシールで覆い、2,600 × g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 生物学的安全キャビネット内で、ブロックを開き、上清を廃棄します。ブロックをペーパータオルで軽くたたいて、エタノールを取り除きます。ブロックをフード内で1〜2時間、または50°Cのオーブンで乾燥させます。
- 50 μLの滅菌TEバッファーを添加してバクミドDNAを再懸濁し、粘着プラスチックシールを使用して密封します。内容物をV底のマイクロタイタープレートに移します。バクミドDNAは、試験精製が完了するまで4°Cで保存し、その後-20°Cで保存します。
注:日常的に測定されるわけではありませんが、一般的に500〜2,000 ng/μLのバクミドDNAの収量が期待できます。 - 標準的なコロニーPCR法47、および以下のベクタープライマーを使用して、標的遺伝子をうまく組み込んだバクミドをスクリーニングします。
pFBM - fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
注:アンプリコンは、標的遺伝子よりも約700 bp大きくなります。
4. トランスフェクション
注:これらのステップは、Sf9昆虫細胞にバクミドをトランスフェクションするために使用され、昆虫細胞にバキュロウイルス粒子(P0)を生成させます。
- 無血清昆虫培地中でSf9細胞を2.0〜2.4×106 細胞/mLの密度で増殖させます。細胞を無血清昆虫培地中で2 × 105 細胞/mLに希釈し、希釈した細胞1 mLを24ウェル組織培養プレートウェルに分注します。 トランスフェクション試薬のみの コントロールと 細胞のみ のコントロールを含めます。プレートを加湿したインキュベーターで27°Cで1時間インキュベートし、細胞を接着させます。
- 無血清昆虫培地1ウェルあたり38 μLとトランスフェクション試薬1ウェルあたり2 μLを混合します。混合物 40 μL を 96 ウェル滅菌平底マイクロタイタープレートに分注します。2 μLの組換えバクミドDNAを0.5-2.0 μg/μLで添加し、プレートを覆い、微生物学的安全キャビネット内で15分間インキュベートします。
- 160 μLの無血清昆虫培地を、DNAトランスフェクション試薬混合物を含むマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。
- ステップ4.1で細胞から培地を吸引します。200 μLのバクミド-トランスフェクション試薬-培地混合物を細胞に穏やかに添加し、プレートを覆い、加湿したインキュベーターで27°Cで4時間インキュベートします。
- 2% FBSを添加した無血清昆虫培地400 μLを各ウェルに加えます。蒸発を減らすために、プレートを清潔なビニール袋に移しますが、密封しないでください。プレートを加湿インキュベーターで27°Cで72時間インキュベートします。
- 3日後、培地をプレートから滅菌した96ディープウェルブロックに移し、室温で1,500 × g で20分間遠心分離します。P0バキュロウイルスを含む清澄化上清を滅菌96深ウェルブロックに移し、光を避けて4°Cで保存します。
5. BacMamのbaculovirusのamplification
注:次の手順は、最初のP0バキュロウイルスを高力価のウイルスストックに増幅するために使用されます。つまり、P1、P2、およびP3です。最終的なP3力価は、形質導入およびタンパク質発現に適しています。効率と並列性のために、このプロトコルはウイルス増幅に固定体積比を使用し、経験的に最適化されています。しかし、その後に形質導入された細胞がGFP蛍光を示さず、顕微鏡検査によって細胞径が増加しない場合、またはタンパク質発現が失敗した場合(セクション6および8を参照)、バキュロウイルス力価49,50,51,52を定量した後、各ステップでの感染の多様性が低いようにバキュロウイルス増幅を再最適化し、GFP蛍光顕微鏡法によって感染をモニターし、細胞径を増加させる必要があります53。
- 無血清昆虫培地中でSf9細胞を2×106 細胞/mLの密度に増殖させてP1ウイルスストックを調製し、2%FBSを添加し、24ウェルウェルブロックに細胞を播種し、最終容量が1ウェルあたり3 mLになるようにします。120 μLのP0ウイルスストックを細胞に加えます。
- ブロックを27°Cでインキュベートし、450rpmで66〜72時間マイクロエクスプレッションシェーカーで振とうします。ブロックを室温で1,500 × g で20分間遠心分離し、上清を96ディープウェルブロックに回収します。P1ウイルスストックとして、光から4°C離れた場所で保管してください。
- 2% FBSを添加した無血清昆虫培地で増殖させた50 mLのSf9細胞(2 × 106 細胞/mL細胞密度)に250 μLのP1ウイルスストックを感染させて、P2ウイルスストックを調製します。細胞を27°Cでインキュベートし、110rpmで振とうします。
- 1,500 × g で20分間遠心分離することにより、66〜72時間後にP2ウイルスストックを回収し、光から4°C離れた場所で保存します。
- 所望の量のSf9細胞(2 × 106 細胞/mL細胞密度)に1:200(v/v)のP2ウイルスストックを感染させて、P3ウイルスストックを調製します。細胞を27°Cでインキュベートし、110rpmで振とうします。
- 66〜72時間後、1,500 × g で20分間遠心分離し、上清を回収してP3ウイルスを回収し、光から保護して4°Cで保存します。
6. 発現試験のための形質導入
注:次のセクションでは、小規模な発現テストについて説明し、ディープウェルブロックを使用して複数のコンストラクトを並行してテストするために変更できます。
- 200gのPEG 10,000と12gのNaClを600mLの二重蒸留H2Oに溶解して、20%(w/v)ポリエチレングリコール溶液を調製し、攪拌し、最終容量を1,000mLにします。溶液をオートクレーブします。
- 採取したP1ウイルス300 μLを24ディープウェルブロックのウェルに添加し、75 μLのPEG溶液を各ウェルに加えます。ブロックを18°Cの微量発現シェーカーでインキュベートし、300rpmで5分間振とうし、ブロックを4°Cで一晩保存します。
- ブロックを18°Cで300rpmで30分間再度振とうし、ブロックを3,000× g で45分間遠心分離します。上清はピペットを使用して微生物学的安全キャビネットに廃棄します。
- 懸濁液に適合したHEK293細胞をHEK293培地中で2 × 106 細胞/mLの密度で調製し、ウイルスペレットを含む各ウェルに3 mLを播種し、5 mM酪酸ナトリウムを添加します。
- ブロックを30°Cで8%CO2でインキュベートし、200〜250rpmで72 時間振とうします。
注:細胞培養中のベンダー推奨の CO2 濃度は、懸濁液適応型 HEK293 細胞株と祖先 HEK293 細胞株で異なり、それぞれ 8% と 5% です。 - 900 × g で20分間遠心分離して細胞を回収し、各ウェルを1 mLのPBSで洗浄します。
注:再懸濁した細胞を10 μL吸引し、GFP適合フィルターキューブを用いた蛍光顕微鏡で細胞を観察し、タンパク質の発現と局在を評価します。10〜15μLの再懸濁細胞を吸引し、ゲル内GFP蛍光検出用の全細胞SDS-PAGEゲルを泳動させる54。 - 再び900× g で20分間遠心分離します。ペレットを-80°Cで凍結します。
7. ハイスループットの小規模試験精製
注:以下のステップでは、個々のSLCの発現レベルをスクリーニングするための24ウェルブロックフォーマットでの迅速検査精製ワークフローについて説明します。このプロトコルで使用される溶液の組成については、 表2 を参照してください。
- 回収した細胞の各ウェルに1 mLのHT溶解バッファーを添加し、24ヘッドプローブを使用して24ウェルブロックで全長4分間(3秒オン/15秒オフでサイクリング)氷上で超音波処理します。
- 内容物を深さ96のウェルブロックに移し、125 μLの洗剤ストックを加え、シリコンシールで密封します。ブロックを4°Cで1時間静かに回転させます。または、ドデシルマルトシド(DDM)とヘミコハク酸コレステロール(CHS)を 24 ウェルブロックに直接添加し、4 °C のロッカーシェーカーに置きます。
- ブロックを 2600 × g で 4 °C で 20 分間遠心分離し、上清を新しい 96 ディープウェルブロックに移します。
- 溶解緩衝液であらかじめ平衡化した高容量Strep-Tactin樹脂の50%ストックを調製します。
- 再懸濁したレジンストックを100 μLずつ各ウェルに加えます。
- ブロックをシリコンシールで覆い、4°Cで2時間回転させた後、遠心分離機を短時間(最大200× g)かけてカバーに付着した液体を取り除きます。
- 空のブロックの上に96ウェルフィルタープレートを置き、レジンと上清の混合物をフィルタープレートに移します。ディープウェルブロックのウェルを800 μLのHT洗浄バッファーですすぎ、フィルターブロックに移して最大量のレジンを回収します。
- バッファーを滴下するか、200 × g で短時間遠心分離し、フロースルーを回収します。フィルタープレートを新しいウォッシュブロックの上に置き、800 μLのHTウォッシュバッファーでレジンを洗浄し、バッファーを滴下させます(または短時間遠心分離します)。洗浄ステップをさらに 2 回繰り返し、ブロックを 500 × g で 3 分間遠心分離して、残留 HT 洗浄バッファーを除去します。
- フィルタープレートを96ウェルマイクロタイタープレートの上に置きます。50 μL の HT 溶出バッファーを添加し、室温で 10 分間振とうしながらインキュベートします。500 × g で3分間遠心分離してサンプルを溶出します。
- 溶出したサンプル15 μLをCoomassie染色したSDS-PAGEゲルに流し、タンパク質発現を確認します。残りの溶離液サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)または蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)システムにロードして、DDM/CHS中のタンパク質単分散性を評価します。
8. 大規模発現のための形質導入
注: 以下のステップは、SLC 発現用の標準的な RESOLUTE プロトコルです。個々のターゲットでは、発現時間、インキュベーション温度、酪酸ナトリウムの濃度をさらに最適化する必要があります。さらに、懸濁液に適応したHEK293細胞への感染に用いるP3ウイルスの様々な体積比を小規模実験で試験することにより、バキュロウイルスの感染の多重度を日常的に最適化しています。これは時間効率が良く、すでに手元にある技術と機器を使用し、目的の実験結果を直接評価します。しかしながら、この経験的方法は、P3ウイルスの増幅ごとに再最適化を必要とし、バキュロウイルス粒子を定量するために他の方法が利用可能である49,50,51,52。
- HEK293培地中の懸濁液適合HEK293細胞の必要量をスケールアップします。
- 懸濁液に適合したHEK293細胞を1×106 細胞/mLに希釈し、24時間増殖させます(2 Lローラーボトルの場合は170 rpm、3 Lローラーボトルの場合は105 rpm)。
- 細胞1リットルあたり30 mLのP3ウイルスを添加し、5 mMの酪酸ナトリウムを加えます。細胞を37°Cで48時間、または30°Cで72時間インキュベートします。
- インキュベーション期間中およびインキュベーション期間後には、明視野顕微鏡を用いて細胞を検査し、微生物汚染と細胞生存率をチェックすることが 重要なステップ となります。GFP適合フィルターキューブを用いた蛍光顕微鏡を用いて、タンパク質の発現と局在を評価します。
- 900 × g で20分間遠心分離して細胞を回収します。
- 細胞培養液1リットルあたり10〜15mLのPBSに再懸濁して細胞ペレットを洗浄し、900× g で20分間再度ペレット化します。
- 細胞ペレットを液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。
9. 蛋白質の浄化
注:以下は、5 L の細胞培養に対する SLC 精製の標準的な RESOLUTE メソッドです。SLCターゲットごとに、最適な界面活性剤を経験的に決定する必要があります。ベースバッファー、界面活性剤原液、洗浄、溶出、SECバッファーを事前に準備します(表2)。テストされた標準洗剤のリストについては、 表 3 を参照してください。洗浄バッファー中のATPとMgCl2 は、ヒートショックタンパク質による汚染を低減します。
- 1日目
- 凍結細胞ペレットを室温に設定したウォーターバスで解凍します。
- 135 mLの塩基性緩衝液と3錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤で可溶化緩衝液を調製します。錠剤を溶かします。
- 解凍したペレットを可溶化緩衝液で再懸濁します。細胞ペレット10〜15gあたり27 mLの可溶化バッファーを使用し、DNaseを添加し、氷冷したDounceホモジナイザーに注ぎます。プランジャーを約20回上下に動かし、ホモジナイザーを氷上に保ち、溶液を均質化します。
注:再懸濁量は、標的タンパク質と細胞ペレットの質量に基づいて最適化する必要がありますが、細胞ペレットの質量は回収時の細胞密度によって変化します。商用DNaseは、製造元の指示に従って追加できます。DNaseは、確立されたプロトコル55を用いて社内で発現および精製することもできる。 - 界面活性剤原液を最終濃度1%まで加えます。
注:タンパク質精製を最適化するための 重要なステップ は、SLCの可溶化および精製に最適な界面活性剤を特定することですが、これは経験的に特定する必要があります。私たちは定期的にさまざまな洗剤を利用してきました。それぞれ単独で、およびヘミコハク酸コレステリルと組み合わせて、界面活性剤とCHSの質量比を10:1に保ちます。 - 可溶化混合物を50 mLのコニカルチューブに移します。4°Cで1時間ゆっくりと回転させます。
- 溶液を50,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。 上澄み液を採取します。
- 4〜6 mLのStrep-Tactin樹脂をベースバッファーと平衡化します。
- 可溶化した上清に平衡化レジンを添加し、4°Cで2時間回転させます。
- 溶液を重力流柱に注ぎ、溶液を流します。
- 溶連菌洗浄バッファーのベッド容量の30倍で、等量3回に分けてレジンを洗浄します。
- 3〜5 mLの溶出バッファーを加え、15分間インキュベートし、溶出液を回収します。このステップをさらに 4 回繰り返し、各溶出画分を別々に回収します。
注: 重要なステップ は、溶出バッファーを添加するたびに15分間インキュベートすることが重要であるStrep-Tactin樹脂からのタンパク質溶出です。典型的には、第1の溶出液画分は、残留洗浄緩衝液による溶出緩衝液の希釈により、より低濃度のタンパク質を含有する。したがって、第1の溶出液画分は、より高い最終タンパク質濃度が望まれる場合には廃棄されてもよい。あるいは、すべての連続溶出中のタンパク質濃度をSDS-PAGEを使用して分析し、プロトコルを最適化することもできます。 - UV吸光度分光法でタンパク質濃度を測定し、目的の溶出画分を組み合わせ、3Cプロテアーゼを1:5(w/w)から1:10(w/w)の比率で添加します。
- 4°Cで一晩ゆっくりと回転させます。
注意: 手順9.1.12および9.1.13は、GFPタグを削除する必要がある場合にのみ必要です。タグの削除が不要な場合は、手順9.2.4に直接進んでください。あるいは、タンパク質を4°Cで一晩保存して、翌日も継続することもできます。さらに、安定性が低下したSLCの場合、プロテアーゼの濃度、インキュベーション期間、および温度を最適化する必要がある場合があります。3Cプロテアーゼは幅広い温度範囲で活性があり、さまざまなSLCに最適な最適化が可能です。
- 2日目
- 2〜4 mLのコバルト金属アフィニティー樹脂をSECバッファーで平衡化します。
- 平衡化したコバルト金属アフィニティー樹脂を一晩の3C反応混合物に加え、4°Cで1時間回転させます。
- 溶液を重力流柱に注ぎ、流路を収集します。
- 4 °C で 3,000 × g で遠心して 100 kDa カットオフ遠心フィルターに流液を濃縮し、目的の SEC 注入量に達するまで 5 分ごとにサンプルを静かに混合します。
- SEC バッファーを使用して、デキストラン-アガロースベースのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。SEC手順は、4°C(冷却チャンバーまたはコールドルーム)で実行する必要があります。
注: 重要なステップ:SLC のオリゴマー状態に応じて、アガロースベースのサイズ排除クロマトグラフィーカラムなどの異なるカラムを使用して SEC を実行することができます。 - サンプルをサンプルループに注入し、カラム圧力がカラムメーカーの仕様を下回る流速で SEC プログラムを実行します。フラクションコレクターを使用して、SEC 分析全体にわたって 0.3 mL フラクションを自動的に回収します。
- ピークフラクションをプールし、UV 吸光度を測定し、4 °C で 3,000 × g で遠心して、100 kDa カットオフ遠心濃縮装置で必要な容量/濃度になるまで濃縮します。
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Representative Results
SLC 遺伝子は、RESOLUTE pDONR プラスミドから哺乳類発現用の BacMam ベクターにクローニングできます
クローニング、発現、および精製のための記載されたプロトコルは、複数のタンパク質フォールドにわたる多くのSLCトランスポーターに対して成功していることが証明されています。それにもかかわらず、この手順には、進行をモニタリングするためのいくつかのチェックポイントが含まれており、発現、タンパク質のフォールディング、脂質および界面活性剤依存性の安定性、およびバッファー条件に対する感受性の違いを説明するための最適化が可能です。
SLCクローニングおよび小規模発現時のチェックポイント
クローニングステップでは、アガロースゲル電気泳動を使用して、PCRおよび消化産物の正しいサイズを確保する必要があります。同様に、ゲートウェイ反応と転位反応は、コロニーPCR反応で検証できます(図2A、B)。バキュロウイルスの生成は、必要に応じて標準的な技術を用いて監視することができる49,50,51,52。初期発現は小規模に行い、SDS-PAGEによるタンパク質収量を評価します(図2B)。同様に、緑色蛍光細胞の割合、総タンパク質発現、およびタンパク質の局在は、蛍光顕微鏡法を使用して記録する必要があります(図2C、D)。タンパク質の発現は、細胞の種類、温度、時間、およびシャペロンや複合体のパートナーを共発現させる必要性に合わせて最適化する必要があります。この発現は、二次構造予測56,57,58に基づいて、無秩序なN末端およびC末端を切り捨てるように構成体を修正し、アフィニティタグのタイプと配置をテストすることによって、さらに最適化することができる。タンパク質の安定性は、FSEC(図2E)、SECベースのサーマルシフトアッセイ(SEC-Ts)、およびDSF 41、42、59、60、61、62によって小規模に評価する必要があります。基質や阻害剤、界面活性剤、ヘミコハク酸コレステロール、脂質、pHなどの低分子は、タンパク質の機能と天然の細胞内環境を考慮し、それに応じて修飾されたその後の精製バッファーを考慮して、タンパク質の安定性を改善するかどうかをテストする必要があります。小規模および大規模の発現セットアップにおいて、細胞の生存率とコンタミネーションについて顕微鏡を使用してモニターする必要があります。
大規模トランスポーター精製の最適化
GFPタグ付きタンパク質を特異的にモニターするためのゲル内蛍光や、そのタグの酵素的除去など、大規模なタンパク質精製の各ステップをSDS-PAGEで評価する必要があります。実際には、GFPタグ付きSLC発現細胞は黄緑色に見えます。Twin-Strepタグクロマトグラフィー溶出後、精製タンパク質を含む溶離液は白色光下でネオングリーンの蛍光を発します。化学的および構造的に均質なタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー中に単一の単分散 A280 ピークを生成し(図 2F、G)、SDS-PAGE では単一のバンドを示すはずです。予想されるSLCに対応するSDS-PAGEバンド、および予期しないバンドは、トリプシン消化質量分析を使用して分析する必要があります。SDS-PAGEゲル上の複数のバンドは、タンパク質分解、汚染タンパク質、またはSDS耐性オリゴマーのいずれかを示します。夾雑なタンパク質は、可溶化緩衝液のNaCl濃度を上げるか、アフィニティータグを変更することで除去できます。タンパク質分解は、タンパク質の純度を向上させ、すべてのステップが4°Cまたは氷上で行われるようにし、各ステップの時間を最小限に抑えるようにプロトコルを最適化することで制限できます。SEC プロファイルにブロードピーク、複数のピーク、または大きなボイドピークがある場合(図 2F の紫色のトレースなど)は、FSEC、SEC-Ts、または DSF41、42、59、60、61、62 を使用して、コンストラクトおよび精製条件を小規模に最適化する必要があります。
図 1: SLC の発現と精製のための RESOLUTE ワークフローの概略図。組換えクローニング、BacMamバキュロウイルス調製、タンパク質発現と精製、およびダウンストリームアプリケーションのステップバイステップの図解。略語:SLC =溶質キャリア;クライオ電子顕微鏡 = クライオ電子顕微鏡;SEC = サイズ排除クロマトグラフィー。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:SLCの発現と精製に関する代表的な結果 。 (A)pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTWへのハイスループットSLCクローニングのコロニーPCR。(B)24種類の完全長SLCの単回小規模並行発現試験のCoomassie染色SDS-PAGE。 (C)主に原形質膜に局在するGFPタグ付きSLCの細胞内蛍光。(D)有意な細胞内局在を伴うGFPタグ付きSLCの細胞内蛍光。(E)親水性の中性シリカベースの UHPLC カラムで分離した 4 つの SLC の代表的な FSEC トレース。(F)デキストラン-アガロースまたは(G)アガロースサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製した 6 つの SLC の代表的な SEC トレース。精製に用いたSLC複合体と界面活性剤の分子量は、オリゴマー状態が実験的に決定された場所に示しています。略語:SLC =溶質キャリア;GFP = 緑色蛍光タンパク質;FSEC = 蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:精製SLCの下流アプリケーション 。 (A)界面活性剤中のSLC1A1の顕微鏡写真。(B)界面活性剤中のSLC1A1の2Dクラス平均。(C)さまざまな濃度のタウロリトコール酸3-硫酸とインキュベートしたSLC10A6のCPM熱変性アッセイの生蛍光。(D)SLC10A6のCPM熱変性の1次導関数。SLC10A6の融解温度は、120 μMのタウロリトコール酸3-硫酸の存在下で10°C上昇しました。略語:SLC =溶質キャリア;CPM = N-[4-(7-ジエチルアミノ-4-メチル-3-クマリニル)フェニル]マレイミド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ベクトル名 | 抗生物質マーカー | 浄化のためのタグ | スクリーニングプライマー | PCR中にbpを追加 | ||
| pHTBV1.1 - C3CGFP - SIII - 10H - GTWの | アンプR | C端子 | pHTBV-F(クタタタアクタッグカカック) | ~350 | ||
| 3Cプロテアーゼ部位 GFP | ||||||
| ツイン連鎖球菌 | GFP-R(CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC) | |||||
| 彼の10 | ||||||
| pDONR221(プドン221) | 菅R | 何一つ | M13 フォワード | ~190 | ||
| M13リバース | ||||||
表 1: RESOLUTE クローニングと BacMam の作製に使用したプラスミド。
| 解決 | 組成 |
| DH10Bacセレクションプレート | 50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、7 μg/mL のゲンタマイシン、40 μg/mL の IPTG、および 100 μg/mL の bluo-gal を含む LB-寒天プレート |
| 2x LB培地(抗生物質を含む) | 50 μg/mL のカナマイシン、10 μg/mL のテトラサイクリン、および 7 μg/mL のゲンタマイシンを含む 2 個の LB ブロス |
| HT Lysis バッファー | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、250 mM NaCl、5% グリセロール、EDTA フリープロテアーゼ阻害剤 |
| HT洗浄バッファー | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、250 mM NaCl、5% グリセロール、0.03% DDM/0.003% CHS |
| HT 溶出バッファー | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、250 mM NaCl、5% グリセロール、0.03% DDM/0.003% CHS、100 mM D-ビオチン |
| ベースバッファ | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、150 mM NaCl |
| 洗剤原液 | 10%(w / v)界面活性剤、必要に応じて1%CHSの有無にかかわらず。4°Cで一晩混合し、-20°Cで保存します。 |
| 溶連菌洗浄バッファー | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、150 mM NaCl、界面活性剤(3 倍 CMC)、10 mM MgCl2、1 mM ATP |
| 溶出溶出バッファー | 50 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、150 mM NaCl、100 mM D-ビオチン、界面活性剤(3 倍 CMC) |
| サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)バッファー | 20 mM HEPES-NaOH、pH 7.5、150 mM NaCl、界面活性剤(2 倍 CMC)。0.22 μMメンブレンでろ過します。 |
| 酪酸ナトリウム | DPBS溶液1 M、-20°Cで保存して長期間使用。 |
表2:このプロトコルで使用される溶液とその組成のリスト。
| 洗剤システム | 抽出濃度 | 精製濃度(%w/v) |
| DDMの | 1% | 0.03% |
| DDM+CHSの | 1% + 0.1% | 0.03% + 0.003% |
| DMの | 1% | 0.25% |
| DM+CHSの | 1% + 0.1% | 0.25% + 0.025% |
| NGの | 1% | 0.60% |
| OGの | 1.5% | 1.50% |
| LDAO(ディーディーエム) | 1% | 0.07% |
| LDAO + CHSの | 1% + 0.1% | 0.07% + 0.007% |
| C12E8型 | 1% | 0.015% |
| C12E8 + CHSの | 1% + 0.1% | 0.015% + 0.0015% |
| C12E9 + CHSの | 1% + 0.1% | 0.01 + 0.001% |
| CYMAL-5 (サイマル 5) | 1% | 0.40% |
| LMNGの | 1% | 0.005% |
| LMNG + CHSの | 1% + 0.1% | 0.005% + 0.0005% |
| GDNの | 1% | 0.02% |
| デジトニン | 0.05% | |
| OGNG + CHSの | 1% + 0.1% | 0.18% + 0.018% |
| C12E10 + CHSの | 1% + 0.1% | 0.04% + 0.004% |
| Fos Choline-12 | 1% | 0.14% |
表3:膜の可溶化とSLCの単分散性と安定性の試験に使用される標準界面活性剤。
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Discussion
SLCを標的とする治療法の開発は、トランスポーター機能の体系的な特徴付けが欠如しているため、依然として妨げられてきました。これにより、正常および病態生理学的プロセスにおける多くの役割にもかかわらず、GPCRおよびイオンチャネル63と比較して、このタンパク質クラスを標的とする薬剤が不釣り合いに少なくなっています。RESOLUTE は、現在の SLC 研究を加速し、改善するための最先端の研究手法とツールの開発を目的とした国際コンソーシアムです。RESOLUTE の一環として、ヒト SLC の効率的なクローニング、コンストラクトスクリーニング、大規模発現および精製のためのプロトコルを開発しました。
本稿では、推定SLCおよび孤立SLCを含むヒトSLCトランスポーターの系統的探索に成功したスケーラブルなSLCクローニングおよび発現法について述べる。 特に、この方法で精製されたSLCは、その後のトランスポーター構造、生化学、機能、結合剤生成、および低分子結合の研究で成功裏に使用されている。この方法を定期的に採用してミリグラム単位のSLCを精製し、最適な条件下では、クローニングや組織培養のステップを含むプロトコル全体を4〜5週間で完了することができます。
私たちの手法は、複数のターゲットを体系的に評価するために、経済性と並列性に最適化されています。しかし、このハイスループット法は、異なるクローニングプライマーまたはベクターを用いて、さまざまな切り捨てやタグを持つ単一ターゲットのコンストラクトの並列生成にも容易に適応できます。これは、標的64に対して複数のコンストラクトを最適化する方法と似ていますが、私たちのプロトコルは、並行クローニング、バキュロウイルス生成、および発現試験により、さらなる効率を提供します。トランスフェクションは、バキュロウイルス第65世代を省略することで、コンストラクトクローニングから発現までの時間を短縮できますが、大規模な発現には大幅にコストと労力がかかります。対照的に、安定な細胞株は大規模発現66に対しては安価である可能性が高いが、高発現のクローン細胞株を作製するには、より多くの時間と専門的なリソースが必要になる可能性がある。最後に、このプロトコルが蛋白質の生産のために人間のセルラインを使用する間、昆虫のセルラインはSpodopteraのfrugiperdaおよびTrichoplusiaのniからののようなまた大規模なSLCの表現5,31,64のために首尾よく使用された。ヒト細胞株での発現は培地コストを増加させるが、よりネイティブな翻訳後修飾と脂質環境を提供する39,67。
このプロトコルは、さまざまなメンブレントランスポーターや実験ニーズに適合させることができますが、精製タンパク質サンプルの品質と収量にはいくつかの要因が影響します。完全長タンパク質の研究は理想的ですが、より優れた発現、精製、および再構成収量を達成するには、ある程度の配列切断が必要になる場合があります。すべての RESOLUTE SLC コンストラクトには、SLC の発現、細胞局在、精製のモニタリングに有用な切断可能な GFP がタグ付けされています。これらの実験で使用された懸濁液適合HEK293細胞発現系は、優れた収量をもたらし、推奨されていますが、懸濁液適合HEK293 GnTl-細胞株を介して複雑なグリコシル化を伴わないタンパク質を日常的に産生しています。形質導入細胞によるタンパク質発現のインキュベーション温度と長さは、ターゲットごとに最適化する必要がありますが、30°Cで72時間が適切なデフォルトであることがわかりました。
すべてのタンパク質精製ステップは、氷上または4°Cで実施し、精製されたタンパク質が急速凍結されたら、凍結融解サイクルは避けてください。膜可溶化および精製バッファーに使用される界面活性剤の種類と量は重要であり、SLCごとに経験的に決定する必要があります。
この方法で精製されたSLCは、均質で構造的および機能的に無傷のサンプルが得られ、さまざまな生化学的および生物物理学的研究に使用できます。陰性染色およびクライオ電子顕微鏡(図3A、B)によって可溶化および精製されたSLCタンパク質の単一の個別の粒子を観察することは、その後の構造決定に有望である可能性がある37。界面活性剤中の精製SLCは、基質、阻害剤、脂質などの低分子とのタンパク質相互作用を調査するための熱安定性アッセイ(図3C、D)などの生物物理学的アッセイに使用できます59,62。最後に、生化学的アッセイでこのプロトコルを使用して精製されたSLCは、機能アッセイ68のためにリポソームまたはナノディスクに再構成され、抗体およびナノボディの生成および選択に使用される69,70。これらの手法を新しいSLC標的低分子の発見に必要なスループットに適合させることは依然として課題ですが1、in vitroハイスループットスクリーニング技術の分野では有望な進歩が見られました71,72,73,74。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作業は RESOLUTE プロジェクト内で行われました。RESOLUTE は、Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (革新的医薬品イニシアチブ 2 共同事業) から助成金契約 No 777372 に基づき資金提供を受けました。この共同事業は、欧州連合(EU)の研究・イノベーションプログラム「ホライズン2020」とEFPIAの支援を受けています。この記事は著者の見解のみを反映しており、IMIも欧州連合およびEFPIAも、そこに含まれる情報の使用について責任を負いません。pHTBVプラスミドは、Frederick Boyce教授(ハーバード大学)のご厚意により提供していただきました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3C protease | Produced in-house | ||
| 50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
| Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
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