Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Høy gjennomstrømningsuttrykk og rensing av menneskelige løsemiddelbærere for strukturelle og biokjemiske studier

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturelle og biokjemiske studier av menneskelige membrantransportører krever milligram mengder stabilt, intakt og homogent protein. Her beskriver vi skalerbare metoder for å screene, uttrykke og rense menneskelige løsemiddelbærere ved hjelp av kodonoptimaliserte gener.

Abstract

Løsemiddelbærere (SLC) er membrantransportører som importerer og eksporterer en rekke endogene og eksogene substrater, inkludert ioner, næringsstoffer, metabolitter, nevrotransmittere og legemidler. Til tross for å ha dukket opp som attraktive terapeutiske mål og markører for sykdom, er denne gruppen proteiner fortsatt relativt undermedisinert av dagens legemidler. Narkotikaforskningsprosjekter for disse transportørene hindres av begrenset strukturell, funksjonell og fysiologisk kunnskap, til slutt på grunn av vanskelighetene med ekspresjon og rensing av denne klassen av membraninnebygde proteiner. Her demonstrerer vi metoder for å oppnå høy renhet, milligram mengder humane SLC-transportørproteiner ved hjelp av kodonoptimaliserte gensekvenser. I forbindelse med en systematisk utforskning av begrepsdesign og høy gjennomstrømningsuttrykk, sikrer disse protokollene bevaring av målproteinenes strukturelle integritet og biokjemiske aktivitet. Vi fremhever også kritiske trinn i eukaryot celleuttrykk, affinitetsrensing og størrelsesekskluderingskromatografi av disse proteinene. Til syvende og sist gir denne arbeidsflyten rene, funksjonelt aktive og stabile proteinpreparater som er egnet for strukturbestemmelse med høy oppløsning, transportstudier, småmolekylære engasjementsanalyser og høy gjennomstrømning in vitro-screening .

Introduction

Membranproteiner har lenge vært mål for både forskere og farmasøytisk industri. Av disse er løsemiddelbærerne (SLC) en familie av over 400 sekundære transportørgener kodet i det menneskelige genom1. Disse transportørene er involvert i import og eksport av mange molekyler, inkludert ioner2, nevrotransmittere3, lipider 4,5,6,7, aminosyrer8, næringsstoffer 9,10,11 og legemidler 12. Med en slik bredde av substrater er disse proteinene også involvert i en rekke patofysiologier gjennom transport av toksiner13, transport av og inhibering av rusmidler 14,15 eller skadelige mutasjoner16. Bakterielle homologer har fungert som prototyper for den grunnleggende transportmekanismen til flere SLC-familier: 17,18,19,20,21,22,23,24,25. I motsetning til humane proteiner er prokaryote ortologer ofte bedre uttrykt i det godt forståtte Escherichia coli-ekspresjonssystemet 26,27 og er mer stabile i de mindre vaskemidlene som gir velordnede krystaller for røntgenkrystallografi28. Imidlertid kompliserer sekvens og funksjonelle forskjeller bruken av disse fjernrelaterte proteinene for narkotikaforskning29,30. Følgelig er det ofte nødvendig med direkte studier av det humane proteinet for å dechiffrere virkningsmekanismen til legemidler rettet mot SLC 31,32,33,34,35. Mens de siste fremskrittene i kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har muliggjort strukturell karakterisering av SLC i mer innfødte-lignende forhold36,37, er vanskeligheter med å uttrykke og rense disse proteinene fortsatt en utfordring for å utvikle målrettet terapi og diagnostikk.

For å bøte på denne utfordringen har RESOLUTE-konsortiet (re-solute.eu) utviklet ressurser og protokoller for storskala ekspresjon og rensing av humane SLC-familieproteiner38. Med utgangspunkt i kodonoptimaliserte gener har vi utviklet metoder for høy gjennomstrømningskloning og screening av SLC-konstruksjoner. Disse metodene ble systematisk anvendt på hele familien av SLC, genene ble klonet inn i BacMam virale ekspresjonssystemet, og proteinuttrykket ble testet i humane cellelinjer39 basert på tidligere beskrevne metoder for høy gjennomstrømningskloning og ekspresjonstesting40. Oppsummert klones SLC-genet fra pDONR221-plasmidet til en pHTBV1.1-vektor. Denne konstruksjonen brukes senere til å transponere genet av interesse til en bacmidvektor for transfektering av insektceller, som inkluderer en cytomegaloviruspromotor og forsterkerelementer for ekspresjon i pattedyrceller. Det resulterende baculoviruset kan brukes til å transducere pattedyrceller for ekspresjonen av mål-SLC-proteinet.

Vi videreutviklet standardiserte metoder for storskala ekspresjon og stabil rensing av utvalgte SLC-er (figur 1). Denne protokollen inneholder flere kontrollpunkter for å legge til rette for effektiv feilsøking og minimere variasjonen mellom eksperimenter. Spesielt ble rutinemessig overvåking av proteinuttrykk og lokalisering, samt småskala optimalisering av rensebetingelser for individuelle mål, hjulpet av Strep og Green Fluorescent Protein (GFP) koder41,42.

Til slutt kan disse kjemisk rene og strukturelt homogene proteinprøvene brukes til strukturell bestemmelse ved røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), biokjemiske målengasjementsanalyser, immunisering for bindemiddelgenerering og cellefrie funksjonelle studier via rekonstituering til kjemisk definerte liposomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle kodonoptimaliserte RESOLUTE SLC-gener er deponert i AddGene43, hvis lenker er tilgjengelige på listen over RESOLUTE offentlige reagenser44. Disse genene har blitt klonet inn i pDONR221-plasmidet og tillater direkte kloning av genene i destinasjonsvektoren ved hjelp av rekombinasjonskloning45. For å maksimere parallellitet dyrkes bakterie-, insekt- og pattedyrceller i blokkformat for henholdsvis bacmidproduksjon (seksjon 3), baculovirusamplifikasjon (seksjon 5) og ekspresjonstesting (seksjon 6). For disse trinnene er det nødvendig med en mikrouttrykksrister for å sikre tilstrekkelig blanding og lufting.

1. (Høy gjennomstrømning) kloning av SLC til pHTBV1.1 bacmid

MERK: Kloningstrinnet bruker en rekombinasjonskloningsprotokoll for effektiv kloning og transformasjon til Escherichia coli (E. coli) ved bruk av varmesjokkmetoden46. Protokollen er designet for høy gjennomstrømning og parallell kloning av flere mål eller konstruksjoner, men kan lett tilpasses mindre skalaer.

  1. I en 96-brønnsplate, tilsett 150 ng av pDONR221 SLC-klonen og 100 ng av pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-vektoren. Bring reaksjonsvolumet til 8 μL med 10 mM Tris pH 8,0, og tilsett deretter 2 μL av rekombinasjonsenzymblandingen.
  2. Inkuber ved romtemperatur i 1 time, tilsett 1 μL proteinase K og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  3. Bruk 4 μL av reaksjonsblandingen for å transformere 50 μL kjemisk kompetente E. coli MACH-1-celler ved bruk av varmesjokkmetoden46 og SOC-medium for gjenvinning. Plate på LB-agar inneholdende 5% sukrose, eller SOC-agar, supplert med 100 μg/ml ampicillin.
  4. Identifiser kolonier som har pHTBV1.1-vektoren med SLC-geninnsatsen ved hjelp av passende primere (se tabell 1) og standardprotokoller for koloni-PCR47.
  5. Rens det rekombinante plasmidet fra enkeltkolonier med genet av interesse ved hjelp av et plasmid miniprep-sett.

2. Gjennomføring

MERK: Følgende trinn brukes til å transponere SLC-gener fra pHTBV1.1-vektoren til et bacmid for BacMam baculovirusgenerering i Sf9-celler. Ved hjelp av varmesjokkmetoden46 transformeres pHTBV1.1-vektoren til DH10Bac-kompetente E. coli-celler , som inneholder et foreldrebacmid med en lacZ-mini-attTn7-fusjon. Transposisjon skjer mellom elementene i pHTBV1.1-vektoren og moderbacmidet i nærvær av transposisjonsproteinene tilveiebragt av et hjelperplasmid48. Se tabell 2 for sammensetningen av løsninger brukt i denne protokollen.

  1. Bruk 3 μL av 100-200 ng / μL renset pHTBV1.1 vektor DNA, transformer DH10Bac ved hjelp av varmesjokkmetoden i en 96-brønns PCR-plate. Gjenopprett cellene ved å inkubere dem i gjenopprettingsmedium i 4-5 timer ved 37 °C mens du rister ved 700 o / min i en mikroekspresjonsrister.
  2. Spred 50 μL transformerte celler på DH10Bac valgplater. Inkuber platene ved 37 °C i 48 timer dekket med folie.
  3. Velg en enkelt hvit koloni (som inneholder det rekombinante DNA) og strek til fortynning. Inkuber ved 37 °C over natten.

3. Bacmidproduksjon med høy gjennomstrømning

MERK: Protokollen beskriver trinnene for utvinning av bacmider ved hjelp av et 96-brønns bacmidrensingssett.

  1. Inokuler individuelle hvite kolonier (isolert fra de stripete til fortynningsplatene) i brønner i en 96-dypbrønnblokk, som inneholder 1 ml 2x LB medium (tabell 2).
  2. Dekk til med en porøs forsegling og rug ved 37 °C over natten ved 700 o / min i en mikrouttrykksrister.
  3. Forbered et glyserollager av cellene ved å blande 120 μL av kulturen med 30 μL 60% glyserol i en mikrotiterplate og lagre ved -80 ° C.
  4. Sentrifuger den dype brønnblokken ved 2 600 × g i 30 minutter. Dekanter supernatanten i en egnet beholder for dekontaminering. Snu blokken og trykk forsiktig på et papirhåndkle. Tilsett 250 μL løsning 1 til hver brønn i blokken ved hjelp av en flerkanalspipettte.
  5. Resuspend pellets; Bruk om nødvendig en flerkanalspipett.
  6. Tilsett 250 μl løsning 2 til hver brønn og forsegle med en silikonmatte. Inverter forsiktig 5x og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Spinn veldig kort.
  7. Tilsett 300 μL løsning 3 og forsegl med en silikonmatte. Bland forsiktig, men grundig ved å snu 5x.
  8. Legg prøven på is i 20 min, deretter sentrifuge ved 2 600 × g i 30 min ved 4 °C.
  9. Overfør den klare supernatanten til en fersk blokk på 96 brønner. Sentrifuge igjen ved 2 600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  10. I en fersk blokk med 96 dype brønner dispenseres 0,8 ml 100 % isopropanol per brønn. Tilsett 0,8 ml supernatanter fra de tilsvarende brønnene.
  11. Pipetter forsiktig opp og ned med en pipette, og rug deretter på is i 30 minutter eller over natten ved 4 °C for å gi mer bacmid.
  12. Sentrifuge ved 2 600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  13. Inne i et biologisk sikkerhetsskap, spray utsiden av blokken med 70% etanol, åpne blokken og kast supernatanten.
  14. Tilsett 500 μL 70% etanol (v/v) i hver brønn og bank forsiktig på blokken for å vaske pelleten. Dekk til med en selvklebende plastforsegling og sentrifuge ved 2 600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  15. Åpne blokken inne i et biologisk sikkerhetsskap og kast supernatanten. Trykk på blokken veldig forsiktig på et papirhåndkle for å fjerne etanol. La blokken tørke enten inne i hetten i 1-2 timer eller i en ovn på 50 °C.
  16. Tilsett 50 μL steril TE-buffer for å resuspendere bacmid-DNA og forsegle ved hjelp av en selvklebende plastforsegling. Overfør innholdet til en V-bunns mikrotiterplate. Oppbevar bacmid-DNA ved 4 °C til testrensingen er fullført, og oppbevar det deretter ved -20 °C.
    MERK: Selv om det ikke rutinemessig måles, kan det vanligvis forventes et utbytte på 500 til 2000 ng / μL bacmid-DNA.
  17. Bruk standard koloni-PCR-metoder47, og følgende vektorprimere for å screene for bacmider som vellykket inkorporerer målgenet:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    MERK: Amplikonen vil være omtrent 700 bp større enn målgenet.

4. Transfeksjon

MERK: Disse trinnene brukes til å transfektere Sf9 insektceller med produsert bacmid, noe som får insektcellene til å generere baculoviruspartikler (P0).

  1. Vokse Sf9 celler i serumfritt insektmedium til en tetthet på 2,0-2,4 × 106 celler / ml. Fortynn cellene til 2 × 105 celler / ml i serumfritt insektmedium og dispenser 1 ml av de fortynnede cellene i en 24-brønns vevskulturplatebrønn. Inkluder en transfeksjonsreagens-bare så vel som en celle-bare kontroll. Inkuber platen i en fuktet inkubator ved 27 °C i 1 time for å tillate cellefeste.
  2. Bland 38 μL per brønn serumfritt insektmedium med 2 μL per brønn av transfeksjonsreagenset. Dispenser 40 μL av blandingen i en 96-brønns steril flatbunns mikrotiterplate. Tilsett 2 μL rekombinant bakmid-DNA ved 0,5-2,0 μg / μL, dekk platen og inkuber inne i det mikrobiologiske sikkerhetsskapet i 15 minutter.
  3. Tilsett 160 μl serumfritt insektmedium i hver brønn i mikrotiterplaten som inneholder DNA-transfeksjonsreagensblandingen.
  4. Aspirasjonsmedium fra cellene i trinn 4.1. Tilsett forsiktig 200 μL bacmid-transfeksjonsreagens-mediumblanding på cellene, dekk platen og inkuber i 4 timer i en fuktet inkubator ved 27 ° C.
  5. Tilsett 400 μL serumfritt insektmedium supplert med 2% FBS til hver brønn. For å redusere fordampning, overfør platen til en ren plastpose, men ikke forsegl den. Inkuber platen ved 27 °C i 72 timer i en fuktet inkubator.
  6. Etter 3 dager, overfør mediet fra platen til en steril 96-dyp brønnblokk og sentrifuge ved 1,500 × g i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør den klargjorte supernatanten som inneholder P0-baculovirus til en steril 96-dypbrønnblokk og oppbevares ved 4 °C fra lys.

5. BacMam baculovirus forsterkning

MERK: Følgende trinn brukes til å forsterke det første P0-baculoviruset til høyere titervirale aksjer; nemlig P1, P2 og P3. Den endelige P3-titeren er egnet for transduksjon og proteinuttrykk. For effektivitet og parallellitet bruker denne protokollen faste volumetriske forhold for viral amplifikasjon, som er empirisk optimalisert. Imidlertid, hvis de etterfølgende transducerte cellene ikke viser GFP-fluorescens og økt cellediameter ved mikroskopi eller hvis proteinekspresjon mislykkes (se avsnitt 6 og 8), bør baculovirusamplifikasjon optimaliseres for en lav infeksjonsmangfoldighet ved hvert trinn etter kvantifisering av baculovirustiteren 49,50,51,52, og infeksjon overvåket ved GFP-fluorescensmikroskopi og økt cellediameter 53.

  1. Forbered P1-virusbestanden ved å dyrke Sf9-celler i serumfritt insektmedium til en tetthet på 2 × 106 celler / ml, tilsett 2% FBS og frø cellene i en 24-dypbrønnblokk i et endelig volum på 3 ml per brønn. Tilsett 120 μL P0-viruslager til cellene.
  2. Inkuber blokken ved 27 °C mens du rister ved 450 o / min i en mikrouttrykksrister i 66-72 timer. Sentrifuger blokken ved 1 500 × g i 20 minutter ved romtemperatur og høst supernatanten i 96 dype brønnblokker. Oppbevares som P1-viruslager ved 4 °C, beskyttet mot lys.
  3. Forbered P2-viruslager ved å infisere 50 ml Sf9-celler (2 × 106 celler/ml celletetthet), dyrket i serumfritt insektmedium supplert med 2% FBS, med 250 μL P1-virusstam. Inkuber cellene ved 27 °C med risting ved 110 o / min.
  4. Høst P2 virusbestand etter 66-72 timer ved sentrifugering ved 1 500 × g i 20 min og oppbevares ved 4 °C vekk fra lys.
  5. Forbered P3-viruslager ved å infisere ønsket volum av Sf9-celler (2 × 106 celler/ml celletetthet) med 1:200 (v/v) P2 viral stam. Inkuber cellene ved 27 °C med risting ved 110 o / min.
  6. Etter 66-72 timer, sentrifuge ved 1,500 × g i 20 min og høst P3-viruset ved å samle supernatanten og lagre ved 4 ° C, beskyttet mot lys.

6. Transduksjon for ekspresjonstesting

MERK: Følgende avsnitt beskriver ekspresjonstesting i liten skala og kan modifiseres for parallell testing av flere konstruksjoner ved hjelp av dype brønnblokker.

  1. Lag en 20 % (w / v) polyetylenglykoloppløsning ved å oppløse 200 g PEG 10 000 og 12 g NaCl i 600 ml dobbeltdestillertH2O. Rør og bring til et endelig volum på 1000 ml. Autoklav løsningen.
  2. Tilsett 300 μL høstet P1-virus i brønnene i en 24-dypbrønnblokk og 75 μL av PEG-løsningen til hver brønn. Inkuber blokken i en mikrouttrykksrister ved 18 °C mens du rister ved 300 o / min i 5 minutter og oppbevar blokken ved 4 ° C over natten.
  3. Rist blokken igjen ved 300 o / min i 30 minutter ved 18 ° C og sentrifuge blokken ved 3000 × g i 45 minutter. Kast supernatanten med en pipette i et mikrobiologisk sikkerhetsskap.
  4. Forbered suspensjonstilpassede HEK293-celler i HEK293-medium til en tetthet på 2 × 106 celler/ml, og frø 3 ml i hver brønn som inneholder viruspelleten, supplere med 5 mM natriumbutyrat.
  5. Inkuber blokken ved 30 °C med 8% CO2 mens du rister ved 200-250 o / min i 72 timer.
    MERK: De leverandøranbefalte CO2-konsentrasjonene under cellekultur er forskjellige for suspensjonstilpassede og forfedre HEK293-cellelinjer, henholdsvis 8% og 5%.
  6. Høst cellene ved sentrifugering ved 900 × g i 20 minutter og vask hver brønn med 1 ml PBS.
    MERK: Aspirer 10 μL av resuspenderte celler og se cellene under et fluorescensmikroskop med en GFP-kompatibel filterkube for å vurdere proteinuttrykk og lokalisering. Aspirer 10-15 μL av resuspenderte celler og kjør en helcelle SDS-PAGE gel for in-gel GFP fluorescens deteksjon54.
  7. Sentrifuge igjen ved 900 × g i 20 min. Frys pellets ved -80 °C.

7. Testrensing i liten skala med høy gjennomstrømning

MERK: Følgende trinn beskriver en arbeidsflyt for rask testrensing i et blokkformat med 24 brønner for screening av uttrykksnivåene til individuelle SLC-er. Se tabell 2 for sammensetningen av løsninger brukt i denne protokollen.

  1. Tilsett 1 ml HT-lysisbuffer til hver brønn av høstede celler og fortsett å sonikere på is i en total lengde på 4 minutter (sykling ved 3 s på / 15 s av) i 24-brønnblokker ved bruk av en 24-hodesonde.
  2. Overfør innholdet til en 96 dyp brønnblokk, tilsett 125 μL vaskemiddellager og forsegl med silikonforsegling. Roter blokken forsiktig ved 4 °C i 1 time. Alternativt kan du tilsette dodecylmaltosid (DDM) og kolesterolhemisuccinat (CHS) direkte til 24-brønnblokkene og plassere dem på en vipper-shaker ved 4 °C.
  3. Sentrifuger blokken ved 2600 × g i 20 minutter ved 4 °C og overfør supernatanten til en ny blokk med 96 dype brønner.
  4. Forbered et 50% lager av høykapasitets Strep-Tactin harpiks preequilibrated med lysis buffer.
  5. Tilsett 100 μL resuspendert harpikslager til hver brønn.
  6. Dekk blokken med en silikonforsegling og roter ved 4 °C i 2 timer og sentrifuge deretter veldig kort (opptil 200 × g) for å fjerne væske som fester seg til dekselet.
  7. Plasser en 96-brønns filterplate på toppen av en tom blokk og overfør harpiks/supernatantblandingen inn i filterplaten. Skyll brønnene i den dype brønnblokken med 800 μL HT-vaskebuffer og overfør til filterblokken for å samle maksimal mengde harpiks.
  8. La bufferen dryppe gjennom eller sentrifugere kort ved 200 × g og samle gjennomstrømningen. Plasser filterplaten på toppen av en ny vaskeblokk og vask harpiksen med 800 μL HT-vaskebuffer, slik at bufferen drypper gjennom (eller sentrifugerer kort). Gjenta vasketrinnet to ganger til og sentrifuger blokken ved 500 × g i 3 minutter for å fjerne den gjenværende HT-vaskebufferen.
  9. Plasser filterplaten på toppen av en 96-brønns mikrotiterplate. Tilsett 50 μL HT-elueringsbuffer og inkuber med risting ved romtemperatur i 10 minutter. Elute prøver ved sentrifugering ved 500 × g i 3 minutter.
  10. Kjør 15 μL av den eluerte prøven på en Coomassie-farget SDS-PAGE gel for å kontrollere proteinuttrykket. Legg de resterende prøvene av eluent på et Size Exclusion Chromatography (SEC) eller Fluorescence-detection Size Exclusion Chromatography (FSEC)-system for å evaluere proteinmonodispersitet i DDM/CHS.

8. Transduksjon for storskala uttrykk

Følgende trinn er standard RESOLUTE-protokoll for SLC-uttrykk. Individuelle mål vil kreve ytterligere optimalisering for uttrykkstid, inkubasjonstemperatur og konsentrasjon av natriumbutyrat. Videre optimaliserer vi rutinemessig baculovirusets mangfoldighet av infeksjon ved å teste forskjellige volumetriske forhold mellom P3-viruset som brukes til å infisere de suspensjonstilpassede HEK293-cellene i småskala eksperimenter. Dette er tidseffektivt, bruker teknikker og utstyr som allerede er tilgjengelig, og evaluerer direkte ønsket eksperimentell utgang. Imidlertid krever denne empiriske metoden reoptimalisering med hver forsterkning av P3-viruset, og andre metoder er tilgjengelige for å kvantifisere baculoviruspartiklene 49,50,51,52.

  1. Skaler opp det nødvendige volumet av suspensjonstilpassede HEK293-celler i HEK293-medium.
  2. Fortynn suspensjonstilpassede HEK293-celler til 1 × 106 celler/ml og vokse i 24 timer (ved 170 o / min for 2 l rulleflasker og 105 o / min for 3 l rulleflasker).
  3. Tilsett 30 ml P3-virus per liter celler og tilsett 5 mM natriumbutyrat. Inkuber celler ved 37 °C i 48 timer eller ved 30 °C i 72 timer.
  4. Under og etter inkubasjonsperioden er et nøkkeltrinn å undersøke cellene ved hjelp av lysfeltmikroskopi for å sjekke for mikrobiell forurensning og cellelevedyktighet. Vurder proteinuttrykk og lokalisering ved hjelp av fluorescensmikroskopi med en GFP-kompatibel filterkube.
  5. Høst cellene ved sentrifugering ved 900 × g i 20 minutter.
  6. Vask cellepelleten ved å resuspendere den i 10-15 ml PBS per liter cellekultur og pellet igjen ved 900 × g i 20 minutter.
  7. Snap-frys cellepelletsene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C.

9. Proteinrensing

MERK: Følgende er standard RESOLUTE-metode for SLC-rensing for 5 liter cellekultur. For hvert SLC-mål må det optimale vaskemiddelet bestemmes empirisk. Forbered basebuffer, vaskemiddelløsning, vask, eluering og SEC-buffere på forhånd (tabell 2). For en liste over standard vaskemidler testet, se tabell 3. ATP ogMgCl2 i vaskebufferen reduserer forurensning av varmesjokkproteiner.

  1. Dag 1
    1. Tine den frosne cellepelleten i et vannbad satt til romtemperatur.
    2. Klargjør oppløselighetsbuffer med 135 ml basebuffer og tre proteasehemmercocktailtabletter. La tablettene løses opp.
    3. Suspender den tinte pelleten med oppløselighetsbuffer. Bruk 27 ml solubiliseringsbuffer per 10-15 g cellepellet, tilsett DNase og hell i en iskald Dounce-homogenisator. Homogeniser løsningen ved å bevege stempelet opp og ned ca. 20x, og hold homogenisatoren på is.
      MERK: Suspensjonsvolumet må optimaliseres basert på målproteinet og cellepelletsmassen, som vil variere på grunn av celletettheten ved innhøsting. Kommersiell DNase kan legges i henhold til produsentens instruksjoner. DNase kan også uttrykkes og renses internt ved hjelp av etablerte protokoller55.
    4. Tilsett vaskemiddelløsning til 1 % sluttkonsentrasjon.
      MERK: Et viktig skritt for å optimalisere proteinrensing er å identifisere det optimale vaskemiddelet for SLC-oppløseliggjøring og rensing, som må identifiseres empirisk. Vi har jevnlig brukt ulike vaskemidler; hver alene og i kombinasjon med kolesterylhemisuccinat, og holder vaskemiddelet til CHS-masseforholdet på 10: 1.
    5. Overfør oppløselighetsblandingen til 50 ml koniske rør. Roter sakte i 1 time ved 4 °C.
    6. Sentrifuger oppløsningen ved 50 000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten.
    7. Balanserer 4-6 ml sengevolum av Strep-Tactin harpiks med basebufferen.
    8. Tilsett likevektsharpiks til den solubiliserte supernatanten og roter i 2 timer ved 4 °C.
    9. Hell løsningen i en tyngdekraftskolonne og la løsningen strømme gjennom.
    10. Vask harpiksen med 30x sengevolumet av Strep vaskebuffer i 3 like volumtrinn.
    11. Tilsett 3-5 ml elueringsbuffer, inkuber i 15 minutter og samle eluatet. Gjenta dette trinnet fire ganger til, og samle hver elueringsfraksjon separat.
      MERK: Et nøkkeltrinn er proteineluering fra strep-taktinharpiksen, hvor det er viktig å inkubere i 15 minutter etter hver tilsetning av elueringsbufferen. Vanligvis inneholder den første eluatfraksjonen en lavere konsentrasjon av protein på grunn av fortynning av elueringsbufferen med den gjenværende vaskebufferen. Derfor kan den første eluatfraksjonen kasseres hvis en høyere endelig proteinkonsentrasjon er ønskelig. Alternativt kan proteinkonsentrasjonen i alle serielle elusjoner også analyseres ved hjelp av SDS-PAGE for å optimalisere protokollen.
    12. Mål proteinkonsentrasjonen ved UV-absorbansspektroskopi, kombiner de ønskede elueringsfraksjonene og tilsett 3C-protease i forholdet 1:5 (w/w) til 1:10 (w/w).
    13. Roter sakte over natten ved 4 °C.
      MERK: Trinn 9.1.12 og 9.1.13 er bare nødvendige hvis GFP-taggen må fjernes. Hvis fjerning av taggen ikke er nødvendig, går du direkte til trinn 9.2.4. Alternativt kan proteinet oppbevares ved 4 °C over natten for å fortsette neste dag. Videre, for SLC-er med redusert stabilitet, kan proteasekonsentrasjonen, inkubasjonsperioden og temperaturen trenge optimalisering. 3C-proteasen er aktiv over et bredt spekter av temperaturer og muliggjør optimalisering som passer best for ulike SLC-er.
  2. Dag 2
    1. Balanser 2-4 ml sengevolum av koboltmetallaffinitetsharpiks med SEC-buffer.
    2. Tilsett likevektig koboltmetallaffinitetsharpiks til 3C-reaksjonsblandingen over natten og roter i 1 time ved 4 °C.
    3. Hell løsningen i en tyngdekraftstrømskolonne og samle gjennomstrømningen.
    4. Konsentrer gjennomstrømningen i et 100 kDa avskåret sentrifugalfilter ved å spinne ved 3000 × g ved 4 °C og bland prøven forsiktig hvert 5. minutt til ønsket SEC-injeksjonsvolum er nådd.
    5. Balanserer en dekstran-agarosebasert størrelsesekskluderingskromatografikolonne ved hjelp av SEC-buffer. SEC-prosedyren bør utføres ved 4 °C (avkjølt kammer eller kjølerom).
      MERK: Nøkkeltrinn: Avhengig av den oligomere tilstanden til SLC, kan en annen kolonne, for eksempel en agarosebasert størrelsesekskluderingskromatografikolonne, brukes til å utføre SEC.
    6. Injiser prøven i prøvesløyfen og kjør SEC-programmet, med en strømningshastighet slik at kolonnetrykket er under kolonneprodusentens spesifikasjoner. Ved hjelp av en brøkkollektor samler du automatisk 0,3 ml fraksjoner over hele SEC-kjøringen.
    7. Bassengtoppfraksjoner, mål UV-absorbans og konsentrer i en 100 kDa cut-off sentrifugalkonsentrator til ønsket volum / konsentrasjon ved å spinne ved 3000 × g ved 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SLC-gener kan klones fra RESOLUTE pDONR-plasmider til BacMam-vektorer for pattedyruttrykk
De beskrevne protokollene for kloning, uttrykk og rensing har vist seg å være vellykkede for mange SLC-transportører over flere proteinfolder. Likevel inkluderer prosedyrene flere kontrollpunkter for overvåking av fremgang, noe som muliggjør optimalisering for å ta hensyn til forskjeller i uttrykk, proteinfolding, lipid- og vaskemiddelavhengig stabilitet og følsomhet for bufferbetingelser.

Sjekkpunkter under SLC-kloning og småskala uttrykk
I kloningstrinnene bør agarosegelelektroforese brukes for å sikre riktig størrelse på PCR og fordøyelsesprodukter. På samme måte kan gateway- og transposisjonsreaksjonene valideres med en koloni-PCR-reaksjon (figur 2A,B). Baculovirus generasjon kan overvåkes ved hjelp av standard teknikker etter behov 49,50,51,52. Det første uttrykket bør gjøres i liten skala, evaluere proteinutbyttet ved SDS-PAGE (figur 2B). På samme måte bør fraksjonen av grønne fluorescerende celler, totalt proteinuttrykk og proteinlokalisering noteres ved bruk av fluorescensmikroskopi (figur 2C, D). Proteinuttrykk bør optimaliseres for celletype, temperatur, tid og nødvendigheten av å uttrykke chaperoner eller komplekse partnere. Uttrykket kan optimaliseres ytterligere ved å endre konstruksjonen for å avkorte uordnede N- og C-terminaler, basert på sekundærstrukturprediksjon56,57,58, og teste typene og plasseringen av affinitetskoder. Proteinstabilitet bør evalueres i liten skala ved hjelp av FSEC (figur 2E), SEC-basert termisk skiftanalyse (SEC-Ts) og DSF 41,42,59,60,61,62. Små molekyler, som substrater og hemmere, vaskemidler, kolesterolhemisuccinat, lipider og pH bør testes for å forbedre proteinstabiliteten med tanke på proteinets funksjon og innfødte subcellulære miljø og påfølgende rensebuffere modifisert tilsvarende. I både små og store ekspresjonsoppsett bør cellene overvåkes ved hjelp av mikroskopi for levedyktighet og forurensning.

Optimalisering av transportørrensing i stor skala
Hvert trinn med storskala proteinrensing bør evalueres av SDS-PAGE, inkludert in-gel fluorescens for spesifikt å overvåke GFP-merket protein og enzymatisk fjerning av den taggen. I praksis ser de GFP-merkede SLC-uttrykkende cellene gulgrønne ut. Etter Twin-Strep-tag kromatografisk eluering fremstår eluenten som inneholder det rensede proteinet fluorescerende neongrønt under hvitt lys. Kjemisk og strukturelt homogent protein bør gi en enkelt monodisperse A280 topp under størrelse-ekskluderingskromatografi (figur 2F,G), og bør vise et enkelt bånd på SDS-PAGE. SDS-PAGE-båndet som tilsvarer forventet SLC, og eventuelle uventede bånd, bør analyseres ved hjelp av tryptisk fordøyelse massespektrometri. Flere bånd på SDS-PAGE gel indikerer enten proteolytisk nedbrytning, forurensende proteiner eller SDS-resistente oligomerer. Forurensende proteiner kan fjernes ved å øke NaCl-konsentrasjonen i løsningsbufferen eller endre affinitetskoden. Proteolyse kan begrenses ved å forbedre proteinets renhet, sikre at alle trinn gjøres ved 4 ° C eller på is, og optimalisere protokollen for å minimere tiden for hvert trinn. Hvis SEC-profilen har en bred topp, flere topper eller stor tomromstopp (for eksempel det lilla sporet av figur 2F), bør konstruksjons- og renseforholdene optimaliseres i liten skala ved hjelp av FSEC, SEC-Ts eller DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av RESOLUTE-arbeidsflyt for SLC-uttrykk og rensing. Steg-for-steg illustrasjon av rekombinasjon kloning, BacMam baculovirus forberedelse, protein uttrykk og rensing, og nedstrøms applikasjoner. Forkortelser: SLC = løsemiddelbærer; Cryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; SEC = størrelse ekskluderingskromatografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater for SLC-uttrykk og rensing . (A) Koloni-PCR for SLC-kloning med høy gjennomstrømning til pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) Coomassie-farget SDS-PAGE av enkel småskala, parallell ekspresjonstest av 24 forskjellige full-lengde SLC. (C) In-cell fluorescens av en GFP-merket SLC lokalisert primært til plasmamembranen. (D) In-cell fluorescens av en GFP-merket SLC med signifikant intracellulær lokalisering. (E) Representative FSEC-spor for fire SLC-er løst på en hydrofil, nøytral silikabasert UHPLC-kolonne. Representative SEC-spor for seks SLC-er renset på enten en (F) dekstran-agarose eller (G) agarosestørrelsesekskluderingskromatografikolonner. Molekylvekter av SLC-komplekset og vaskemiddelet som brukes til rensing er indikert der den oligomere tilstanden er eksperimentelt bestemt. Forkortelser: SLC = løsemiddelbærer; GFP = grønt fluorescerende protein; FSEC = fluorescens-deteksjonsstørrelse, ekskluderingskromatografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nedstrøms anvendelser av rensede SLC-er . (A) Mikrografi av SLC1A1 i vaskemiddel. (B) 2D-klasse gjennomsnitt av SLC1A1 i vaskemiddel. (C) Rå fluorescens av CPM termisk denatureringsanalyse av SLC10A6 inkubert med forskjellige konsentrasjoner av Taurolithocholsyre 3-sulfat. (D) Første derivat av CPM termisk denaturering av SLC10A6. SLC10A6 smeltetemperatur økte med 10 °C i nærvær av 120 μM Taurolithocholsyre 3-sulfat. Forkortelser: SLC = løsemiddelbærer; CPM = N-[4-(7-dietylamino-4-metyl-3-kumarinyl)fenyl]maleimid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vektornavn Antibiotiske markører Koder for rensing Screening Primers bp lagt til under PCR
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW AmpR C-terminal pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
3C proteasested GFP
Twin-streptokokker GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Hans10
pDONR221 KanR ingen M13 fremover ~190
M13 Omvendt

Tabell 1: Plasmider brukt til RESOLUTE-kloning og BacMam-generering.

Løsning Komposisjon
DH10Bac valgskilt LB-agarplater inneholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin, 7μg/ml gentamycin, 40 μg/ml IPTG og 100 mikrog/ml bluo-gal
2x LB medium (med antibiotika) 2x LB buljong inneholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin og 7 μg/ml gentamycin
HT lysis buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glyserol, EDTA-fri proteasehemmer
HT Vask buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glyserol, 0,03% DDM/0,003% CHS
HT-elueringsbuffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glyserol, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 mM D-biotin
Grunnleggende buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl
Vaskemiddelløsning 10 % (w/v) vaskemiddel, med eller uten 1 % CHS etter behov. Bland ved 4 °C over natten og oppbevares ved -20 °C.
Strep vask buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, vaskemiddel ved 3 ganger CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP
Strep eluering buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotin, vaskemiddel ved 3 ganger CMC
Buffer for størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, vaskemiddel ved 2 ganger CMC. Filtrer gjennom en 0,22 μM membran.
Natriumbutyrat 1 M oppløsning i DPBS, oppbevares ved -20 °C for langvarig bruk.

Tabell 2: En liste over løsninger som brukes i denne protokollen og deres sammensetning.

Vaskemiddel system Ekstraksjonskonsentrasjon Rensekonsentrasjon (% w/v)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
DM 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
NG 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
CYMAL-5 1% 0.40%
LMNG 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
Digitonin 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos kolin-12 1% 0.14%

Tabell 3: Standard vaskemidler som brukes til å teste membranoppløseliggjøring og SLC-monodispersjon og stabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utviklingen av SLC-målrettede terapier har forblitt hemmet på grunn av fraværet av systematisk karakterisering av transportørfunksjonen. Dette har ført til uforholdsmessig færre legemidler rettet mot denne proteinklassen i forhold til GPCR og ionkanaler63, til tross for deres mange roller i normale og patofysiologiske prosesser. RESOLUTE er et internasjonalt konsortium som har som mål å utvikle banebrytende forskningsteknikker og verktøy for å akselerere og forbedre dagens SLC-forskning. Som en del av RESOLUTE har vi utviklet disse protokollene for effektiv kloning, construct screening og storskala uttrykk og rensing av menneskelige SLC-er.

Her beskriver vi skalerbare SLC-klonings- og uttrykksmetoder som med hell ble brukt til systematisk å utforske de menneskelige SLC-transportørene, inkludert antatte og foreldreløse SLC-er. Spesielt har SLC-er renset på denne måten blitt vellykket brukt i etterfølgende studier av transportørstruktur, biokjemi, funksjon, bindemiddelgenerering og småmolekylbinding. Vi bruker regelmessig denne metoden for å rense milligrammengder av forskjellige SLC-er, og under optimale forhold kan hele protokollen, inkludert klonings- og vevskulturtrinnene, fullføres på 4-5 uker.

Vår metode er optimalisert for økonomi og parallellitet for systematisk å evaluere flere mål. Imidlertid er denne høykapasitetsmetoden også lett tilpasset den parallelle genereringen av konstruksjoner for et enkelt mål med forskjellige avkortninger eller koder ved å bruke distinkte kloningprimere eller vektorer. Dette ligner på metoder som også optimaliserer flere konstruksjoner for et mål64, selv om protokollen vår gir ytterligere effektivitet med parallell kloning, baculovirusgenerering og ekspresjonstesting. Transfeksjon gir kortere tid mellom konstruksjonskloning og uttrykk ved å gi avkall på baculovirus generasjon65, men er betydelig dyrere og arbeidskrevende for storskala uttrykk. I motsetning til dette er stabile cellelinjer sannsynligvis billigere for storskala uttrykk66, men å generere høyt uttrykkende klonale cellelinjer kan kreve mer tid og spesialiserte ressurser. Til slutt, mens denne protokollen bruker humane cellelinjer for proteinproduksjon, har insektcellelinje som fra Spodoptera frugiperda og Trichoplusia ni også blitt brukt til storskala SLC-uttrykk 5,31,64. Ekspresjon i humane cellelinjer øker mediekostnadene, men tilbyr mer innfødte-lignende post-oversettelsesmodifikasjoner og lipidmiljø39,67.

Mens protokollen kan tilpasses for forskjellige membrantransportører og eksperimentelle behov, påvirker flere faktorer kvaliteten og utbyttet av de rensede proteinprøvene. Selv om det er ideelt å studere proteiner i full lengde, kan det være nødvendig med en viss grad av sekvensavkorting for å oppnå bedre uttrykk, rensing og rekonstitueringsutbytte. Alle RESOLUTE SLC-konstruksjoner har blitt merket med en spaltbar GFP, som er verdifull for å overvåke SLC-uttrykk, cellulær lokalisering og rensing. Det suspensjonstilpassede HEK293-celleuttrykkssystemet som ble brukt i disse eksperimentene har ført til overlegne utbytter og anbefales, selv om vi rutinemessig også produserer proteiner uten kompleks glykosylering via den suspensjonstilpassede HEK293 GnTl-cellelinjen. Inkubasjonstemperaturen og lengden for proteinuttrykk av transducerte celler bør optimaliseres for hvert mål, selv om vi har funnet at 72 timer ved 30 °C er en god standard.

Alle trinn for proteinrensing bør utføres på is eller ved 4 °C, og når det rensede proteinet er snap-frosset, bør fryse-tine-sykluser unngås. Typen og mengden av vaskemidlene som brukes i membranoppløseliggjørings- og rensebuffere er kritiske og bør bestemmes empirisk for hver SLC.

SLC-ene renset med denne metoden gir homogene og strukturelt og funksjonelt intakte prøver, som kan brukes til en rekke biokjemiske og biofysiske studier. Observasjon av enkle, diskrete partikler av det solubiliserte og rensede SLC-proteinet ved negativ flekk og Cryo-EM (figur 3A,B) kan være lovende for senere strukturbestemmelse37. Den rensede SLC i vaskemiddel kan brukes til biofysiske analyser som termisk stabilitetsanalyse (figur 3C, D) for å undersøke proteininteraksjonene med små molekyler som substrater, hemmere eller lipider59,62. Til slutt kan SLC-ene renset ved hjelp av denne protokollen i biokjemiske analyser rekonstitueres i liposomer eller nanodisker for funksjonelle analyser68 og brukes til antistoff- og nanokroppsgenerering og valg69,70. Selv om det fortsatt er en utfordring å tilpasse disse metodene til gjennomstrømningen som er nødvendig for oppdagelsen av nye SLC-målrettede små molekyler 1, har lovende fremskritt blitt gjort innen in vitro screeningteknologier med høy gjennomstrømning71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble utført innenfor RESOLUTE-prosjektet. RESOLUTE har mottatt støtte fra Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking under tilskuddsavtale No 777372. Dette fellesforetaket mottar støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 og EFPIA. Denne artikkelen gjenspeiler bare forfatternes synspunkter, og verken IMI eller EU og EFPIA er ansvarlig for eventuell bruk av informasjonen som finnes der. pHTBV-plasmidet ble vennlig levert av professor Frederick Boyce (Harvard).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Høy gjennomstrømningsuttrykk rensing menneskelige løsemiddelbærere strukturelle studier biokjemiske studier membrantransportører endogene substrater eksogene substrater terapeutiske mål sykdomsmarkører legemidler legemiddeloppdagelsesprosjekter begrenset strukturell kunnskap begrenset funksjonell kunnskap begrenset fysiologisk kunnskap uttrykk og rensingsvansker milligrammengder kodonoptimaliserte gensekvenser konstruksjonsdesign uttrykk for høy gjennomstrømningsuttrykk bevaring av strukturell integritet bevaring av biokjemisk aktivitet eukaryot celleuttrykk affinitetsrensing størrelsesekskluderingskromatografi høyoppløselig strukturbestemmelse transportstudier, Engasjementsanalyser med små molekyler in vitro-screening med høy gjennomstrømning
Høy gjennomstrømningsuttrykk og rensing av menneskelige løsemiddelbærere for strukturelle og biokjemiske studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter