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Biochemistry

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Abstract

Los transportadores de solutos (SLC) son transportadores de membrana que importan y exportan una variedad de sustratos endógenos y exógenos, incluidos iones, nutrientes, metabolitos, neurotransmisores y productos farmacéuticos. A pesar de haber surgido como dianas terapéuticas atractivas y marcadores de enfermedades, este grupo de proteínas sigue estando relativamente infradrogado por los productos farmacéuticos actuales. Los proyectos de descubrimiento de fármacos para estos transportadores se ven obstaculizados por el limitado conocimiento estructural, funcional y fisiológico, debido en última instancia a las dificultades en la expresión y purificación de esta clase de proteínas incrustadas en la membrana. Aquí, demostramos métodos para obtener cantidades de miligramos de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas utilizando secuencias de genes optimizadas para codones. Junto con una exploración sistemática del diseño de constructos y la expresión de alto rendimiento, estos protocolos garantizan la preservación de la integridad estructural y la actividad bioquímica de las proteínas diana. También destacamos los pasos críticos en la expresión de las células eucariotas, la purificación de la afinidad y la cromatografía de exclusión por tamaño de estas proteínas. En última instancia, este flujo de trabajo produce preparaciones de proteínas puras, funcionalmente activas y estables adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución, estudios de transporte, ensayos de compromiso de moléculas pequeñas y cribado in vitro de alto rendimiento.

Introduction

Las proteínas de membrana han sido durante mucho tiempo objetivos tanto para los investigadores como para las industrias farmacéuticas. De estos, los portadores de solutos (SLC) son una familia de más de 400 genes transportadores secundarios codificados dentro del genomahumano. Estos transportadores están involucrados en la importación y exportación de numerosas moléculas, incluidos iones2, neurotransmisores3, lípidos 4,5,6,7, aminoácidos8, nutrientes 9,10,11 y productos farmacéuticos 12. Con tal amplitud de sustratos, estas proteínas también están implicadas en una serie de fisiopatologías a través del transporte de toxinas13, el transporte y la inhibición por drogas de abuso 14,15 o mutaciones deletéreas16. Los homólogos bacterianos han servido como prototipos para el mecanismo de transporte fundamental de varias familias de SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A diferencia de las proteínas humanas, los ortólogos procariotas a menudo se expresan mejor en el bien conocido sistema de expresión de Escherichia coli 26,27 y son más estables en los detergentes más pequeños que producen cristales bien ordenados para la cristalografía de rayos X 28. Sin embargo, las diferencias de secuencia y funcionales complican el uso de estas proteínas lejanamente relacionadas para el descubrimiento de fármacos29,30. En consecuencia, a menudo se necesita un estudio directo de la proteína humana para descifrar el mecanismo de acción de los fármacos dirigidos a las SLC 31,32,33,34,35. Si bien los avances recientes en criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) han permitido la caracterización estructural de las SLC en condiciones más nativas36,37, la dificultad para expresar y purificar estas proteínas sigue siendo un desafío para el desarrollo de terapias y diagnósticos dirigidos.

Para paliar este reto, el consorcio RESOLUTE (re-solute.eu) ha desarrollado recursos y protocolos para la expresión y purificación a gran escala de proteínas humanas de la familia SLC38. A partir de genes optimizados para codones, hemos desarrollado métodos para la clonación de alto rendimiento y el cribado de construcciones de SLC. Estos métodos se aplicaron sistemáticamente a toda la familia de SLC, los genes se clonaron en el sistema de expresión viral BacMam y la expresión de proteínas se probó en líneas celulares humanas39 sobre la base de métodos descritos anteriormente para la clonación de alto rendimiento y las pruebas de expresión40. En resumen, el gen SLC se clona a partir del plásmido pDONR221 en un vector pHTBV1.1. Esta construcción se utiliza posteriormente para transponer el gen de interés en un vector bacmid para la transfección de células de insectos, que incluye un promotor de citomegalovirus y elementos potenciadores para su expresión en células de mamíferos. El baculovirus resultante se puede utilizar para transducir células de mamíferos para la expresión de la proteína SLC diana.

Además, desarrollamos métodos estandarizados para la expresión a gran escala y la purificación estable de SLC seleccionadas (Figura 1). Este protocolo incluye varios puntos de control para facilitar la resolución eficaz de problemas y minimizar la variabilidad entre experimentos. En particular, el monitoreo rutinario de la expresión y localización de proteínas, así como la optimización a pequeña escala de las condiciones de purificación para objetivos individuales, se vieron ayudados por las etiquetas Strep y Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

En última instancia, estas muestras de proteínas químicamente puras y estructuralmente homogéneas se pueden utilizar para la determinación estructural mediante cristalografía de rayos X o criomicroscopía electrónica (Cryo-EM), ensayos bioquímicos de compromiso con dianas, inmunización para la generación de aglutinantes y estudios funcionales libres de células mediante la reconstitución en liposomas químicamente definidos.

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Protocol

NOTA: Todos los genes RESOLUTE SLC optimizados para codones se han depositado en AddGene43, cuyos enlaces están disponibles en la lista de reactivos públicos RESOLUTE44. Estos genes se han clonado en el plásmido pDONR221 y permiten la clonación directa de los genes en el vector de destino mediante clonación por recombinación45. Para maximizar el paralelismo, las células bacterianas, de insectos y de mamíferos se cultivan en formato de bloque para la producción de bacimida (sección 3), la amplificación de baculovirus (sección 5) y las pruebas de expresión (sección 6), respectivamente. Para estos pasos, se requiere un agitador de microexpresión para garantizar una mezcla y aireación suficientes.

1. Clonación (de alto rendimiento) de SLC en pHTBV1.1 bacmid

NOTA: La etapa de clonación utiliza un protocolo de clonación por recombinación para la clonación eficiente y la transformación en Escherichia coli (E. coli) utilizando el método de choque térmico46. El protocolo está diseñado para la clonación paralela y de alto rendimiento de múltiples objetivos o construcciones, pero se puede adaptar fácilmente a escalas más pequeñas.

  1. En una placa de 96 pocillos, agregue 150 ng del clon pDONR221 SLC y 100 ng del vector pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Lleve el volumen de reacción a 8 μL con 10 mM de Tris pH 8.0 y luego agregue 2 μL de la mezcla de enzimas de recombinación.
  2. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h, añadir 1 μL de proteinasa K e incubar durante 30 min a 37 °C.
  3. Utilice 4 μL de la mezcla de reacción para transformar 50 μL de células MACH-1 de E. coli químicamente competentes utilizando el método de choque térmico46 y medio SOC para la recuperación. Aplicar una placa sobre agar LB que contenga un 5% de sacarosa, o agar SOC, suplementado con 100 μg/ml de ampicilina.
  4. Identificar las colonias que albergan el vector pHTBV1.1 con el inserto del gen SLC utilizando cebadores apropiados (ver Tabla 1) y protocolos estándar para la PCR de colonias47.
  5. Purifique el plásmido recombinante de colonias individuales con el gen de interés utilizando un kit de minipreparación de plásmidos.

2. Transposición

NOTA: Los siguientes pasos se utilizan para transponer los genes SLC del vector pHTBV1.1 a un bacmid para la generación de baculovirus BacMam en células Sf9. Utilizando el método de choque térmico46, el vector pHTBV1.1 se transforma en células de E. coli competentes para DH10Bac, que contienen un bacmid parental con una fusión lacZ-mini-attTn7. La transposición se produce entre los elementos del vector pHTBV1.1 y el bacmido progenitor en presencia de las proteínas de transposición proporcionadas por un plásmido auxiliar48. Consulte la Tabla 2 para conocer la composición de las soluciones utilizadas en este protocolo.

  1. Usando 3 μL de 100-200 ng/μL de ADN vectorial pHTBV1.1 purificado, transforme DH10Bac usando el método de choque térmico en una placa de PCR de 96 pocillos. Recuperar las células incubándolas en medio de recuperación durante 4-5 h a 37 °C mientras se agitan a 700 rpm en un agitador de microexpresión.
  2. Extienda 50 μL de células transformadas en placas de selección DH10Bac. Incubar las placas a 37 °C durante 48 h cubiertas con papel de aluminio.
  3. Escoge una sola colonia blanca (que contenga el ADN recombinante) y veta hasta la dilución. Incubar a 37 °C durante la noche.

3. Producción de bacmid de alto rendimiento

NOTA: El protocolo describe los pasos para extraer los bácmidos utilizando un kit de purificación de bácmidos de 96 pocillos.

  1. Inocular colonias blancas individuales (aisladas de las placas rayadas a las de dilución) en pocillos de un bloque de 96 pocillos de profundidad, que contiene 1 mL de medio 2x LB (Tabla 2).
  2. Cubrir con un sello poroso e incubar a 37 °C durante la noche a 700 rpm en un agitador de microexpresión.
  3. Preparar una reserva de glicerol de las células mezclando 120 μL del cultivo con 30 μL de glicerol al 60% en una placa de microtitulación y almacenar a -80 °C.
  4. Centrifugar el bloque de pocillos profundos a 2.600 × g durante 30 min. Decantar el sobrenadante en un recipiente adecuado para su descontaminación. Invierte el bloque y golpea suavemente una toalla de papel. Añadir 250 μL de solución 1 a cada pocillo del bloque con una pipeta multicanal.
  5. Vuelva a suspender los gránulos; Si es necesario, utilice una pipeta multicanal.
  6. Agregue 250 μL de solución 2 a cada pocillo y selle con una estera de silicona. Invierta suavemente 5 veces e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Gira muy brevemente.
  7. Añadir 300 μL de solución 3 y sellar con una estera de silicona. Mezcle suave pero bien invirtiendo 5 veces.
  8. Coloque la muestra en hielo durante 20 minutos, luego centrifugue a 2.600 × g durante 30 minutos a 4 °C.
  9. Transfiera el sobrenadante transparente a un bloque nuevo de 96 pocillos. Centrifugar de nuevo a 2.600 × g durante 30 min a 4 °C.
  10. En un bloque fresco de 96 pocillos profundos, dispense 0,8 ml de isopropanol al 100% por pocillo. Añadir 0,8 mL de sobrenadantes de los pocillos correspondientes.
  11. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta, luego incubar en hielo durante 30 minutos o toda la noche a 4 °C para producir más bacmid.
  12. Centrifugar a 2.600 × g durante 30 min a 4 °C.
  13. Dentro de un gabinete de seguridad biológica, rocíe el exterior del bloque con etanol al 70%, abra el bloque y deseche el sobrenadante.
  14. Agregue 500 μL de etanol al 70% (v/v) a cada pocillo y golpee suavemente el bloque para lavar el gránulo. Cubrir con un precinto adhesivo de plástico y centrifugar a 2.600 × g durante 30 min a 4 °C.
  15. Dentro de un gabinete de seguridad biológica, abra el bloque y deseche el sobrenadante. Golpee el bloque muy suavemente sobre una toalla de papel para eliminar el etanol. Deje que el bloque se seque dentro de la campana durante 1-2 h o en un horno a 50 °C.
  16. Añadir 50 μL de tampón TE estéril para resuspender el ADN de bacmid y sellar con un sello adhesivo de plástico. Transfiera el contenido a una placa de microtitulación con fondo en V. Almacene el ADN de bacmid a 4 °C hasta que se complete la purificación de la prueba y, a continuación, guárdelo a -20 °C.
    NOTA: Si bien no se mide de forma rutinaria, generalmente se puede esperar un rendimiento de 500 a 2,000 ng/μL de ADN de bacmid.
  17. Utilice los métodos estándar de PCR de colonias47 y los siguientes cebadores vectoriales para detectar bácmidos que incorporan con éxito el gen diana:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    NOTA: El amplicón será aproximadamente 700 pb más grande que el gen diana.

4. Transfección

NOTA: Estos pasos se utilizan para transfectar células de insectos Sf9 con la bacimida producida, lo que hace que las células de insectos generen partículas de baculovirus (P0).

  1. Cultive células Sf9 en medio de insectos libre de suero a una densidad de 2.0-2.4 × 106 células/mL. Diluir las células a 2 × 105 células/ml en medio de insectos sin suero y dispensar 1 ml de las células diluidas en un pocillo en placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Incluya un control de solo reactivo de transfección , así como un control de solo células . Incubar la placa en una incubadora humidificada a 27 °C durante 1 h para permitir la adhesión celular.
  2. Mezclar 38 μL por pocillo de medio de insectos sin suero con 2 μL por pocillo del reactivo de transfección. Dispense 40 μL de la mezcla en una placa de microtitulación estéril de fondo plano de 96 pocillos. Añadir 2 μL de ADN bacmid recombinante a 0,5-2,0 μg/μL, tapar la placa e incubar dentro de la cabina de seguridad microbiológica durante 15 min.
  3. Añadir 160 μL de medio de insectos sin suero en cada pocillo de la placa de microtitulación que contiene la mezcla de reactivo de transfección de ADN.
  4. Aspire el medio de las células en el paso 4.1. Añadir suavemente los 200 μL de mezcla de bacmid-reactivo de transfección-medio sobre las células, tapar la placa e incubar durante 4 h en una incubadora humidificada a 27 °C.
  5. Añadir 400 μL de medio de insectos sin suero suplementado con 2% de FBS a cada pocillo. Para reducir la evaporación, transfiera la placa a una bolsa de plástico limpia, pero no la selle. Incubar la placa a 27 °C durante 72 h en una incubadora humidificada.
  6. Después de 3 días, transfiera el medio de la placa a un bloque estéril de 96 pocillos profundos y centrifugue a 1.500 × g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante clarificado que contiene baculovirus P0 a un bloque estéril de 96 pocillos de profundidad y guárdelo a 4 °C protegido de la luz.

5. Amplificación del baculovirus BacMam

NOTA: Los siguientes pasos se utilizan para amplificar el baculovirus P0 inicial a poblaciones virales de título más alto; a saber, P1, P2 y P3. El título final de P3 es apropiado para la transducción y la expresión de proteínas. Por eficiencia y paralelismo, este protocolo utiliza proporciones volumétricas fijas para la amplificación viral, que han sido optimizadas empíricamente. Sin embargo, si las células transducidas posteriormente no muestran fluorescencia de GFP y aumento del diámetro celular por microscopía o si falla la expresión de proteínas (ver secciones 6 y 8), la amplificación de baculovirus debe reoptimizarse para una baja multiplicidad de infección en cada paso después de cuantificar el título de baculovirus 49,50,51,52, y la infección monitoreada por microscopía de fluorescencia GFP y el aumento del diámetro celular 53.

  1. Prepare el stock de virus P1 cultivando células Sf9 en medio de insectos libre de suero a una densidad de 2 × 106 células/mL, agregue 2% de FBS y siembre las células en un bloque de 24 pocillos profundos en un volumen final de 3 mL por pocillo. Añadir 120 μL de cepo del virus P0 a las células.
  2. Incubar el bloque a 27 °C agitando a 450 rpm en un agitador de microexpresión durante 66-72 h. Centrifugar el bloque a 1.500 × g durante 20 minutos a temperatura ambiente y cosechar el sobrenadante en bloques de 96 pocillos profundos. Almacenar como caldo de virus P1 a 4 °C de protección de la luz.
  3. Preparar el stock de virus P2 infectando 50 ml de células Sf9 (2 × 106 células/ml de densidad celular), cultivadas en medio de insectos sin suero suplementado con un 2% de FBS, con 250 μl de stock de virus P1. Incubar las células a 27 °C con agitación a 110 rpm.
  4. Cosechar el stock de virus P2 después de 66-72 h por centrifugación a 1.500 × g durante 20 min y almacenar a 4 °C protegido de la luz.
  5. Prepare el stock de virus P3 infectando el volumen deseado de células Sf9 (2 × 106 células/ml de densidad celular) con un stock viral P2 1:200 (v/v). Incubar las células a 27 °C con agitación a 110 rpm.
  6. Después de 66-72 h, centrifugar a 1.500 × g durante 20 min y recolectar el virus P3 recogiendo el sobrenadante y almacenar a 4 °C, protegido de la luz.

6. Transducción para pruebas de expresión

NOTA: En la siguiente sección se describen las pruebas de expresión a pequeña escala y se pueden modificar para realizar pruebas paralelas de varias construcciones utilizando bloques de pozos profundos.

  1. Prepare una solución de polietilenglicol al 20% (p/v) disolviendo 200 g de PEG 10.000 y 12 g de NaCl en 600 ml de H2O de doble destilación. Revuelva y lleve a un volumen final de 1.000 ml. Esterilizar la solución en autoclave.
  2. Agregue 300 μL de virus P1 recolectado en los pocillos de un bloque de 24 pocillos profundos y 75 μL de la solución PEG a cada pocillo. Incubar el bloque en un agitador de microexpresión a 18 °C agitando a 300 rpm durante 5 min y almacenar el bloque a 4 °C durante la noche.
  3. Agitar de nuevo el bloque a 300 rpm durante 30 min a 18 °C y centrifugar el bloque a 3.000 × g durante 45 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta en una cabina de seguridad microbiológica.
  4. Preparar células HEK293 adaptadas a la suspensión en medio HEK293 a una densidad de 2 × 106 células/mL, y sembrar 3 mL en cada pocillo que contenga el gránulo del virus, suplementando con 5 mM de butirato de sodio.
  5. Incubar el bloque a 30 °C con 8% de CO2 mientras se agita a 200-250 rpm durante 72 h.
    NOTA: Las concentraciones de CO2 recomendadas por el proveedor durante el cultivo celular son diferentes para las líneas celulares HEK293 adaptadas a la suspensión y ancestrales, al 8 % y al 5 %, respectivamente.
  6. Recolectar las células por centrifugación a 900 × g durante 20 min y lavar cada pocillo con 1 mL de PBS.
    NOTA: Aspire 10 μL de células resuspendidas y observe las células bajo un microscopio de fluorescencia con un cubo de filtro compatible con GFP para evaluar la expresión y localización de proteínas. Aspirar 10-15 μL de células resuspendidas y utilizar un gel SDS-PAGE de célula entera para la detección de fluorescencia GFP en gel54.
  7. Centrifugar de nuevo a 900 × g durante 20 min. Congelar los gránulos a -80 °C.

7. Purificación de prueba a pequeña escala de alto rendimiento

NOTA: Los siguientes pasos describen un flujo de trabajo de purificación de prueba rápida en un formato de bloque de 24 pocillos para detectar los niveles de expresión de SLC individuales. Consulte la Tabla 2 para conocer la composición de las soluciones utilizadas en este protocolo.

  1. Agregue 1 ml de tampón de lisis HT a cada pocillo de células recolectadas y proceda a sonicar en hielo durante una duración total de 4 minutos (ciclo a 3 s encendido/15 s apagado) en bloques de 24 pocillos utilizando una sonda de 24 cabezales.
  2. Transfiera el contenido a un bloque de pocillos de 96 de profundidad, agregue 125 μL de material detergente y selle con un sello de silicona. Gire el bloque suavemente a 4 °C durante 1 h. Alternativamente, agregue dodecilmaltósido (DDM) y hemisuccinato de colesterol (CHS) directamente a los bloques de 24 pocillos y colóquelos en un agitador basculante a 4 °C.
  3. Centrifugar el bloque a 2600 × g durante 20 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo bloque de 96 pocillos de profundidad.
  4. Prepare un stock al 50% de resina Strep-Tactin de alta capacidad preequilibrada con tampón de lisis.
  5. Agregue 100 μL de material de resina resuspendida a cada pocillo.
  6. Cubra el bloque con un sello de silicona y gírelo a 4 °C durante 2 h y luego centrifugue muy brevemente (hasta 200 × g) para eliminar el líquido que se adhiere a la tapa.
  7. Coloque una placa de filtro de 96 pocillos encima de un bloque vacío y transfiera la mezcla de resina/sobrenadante a la placa de filtro. Enjuague los pocillos del bloque de pocillos profundos con 800 μL de tampón de lavado HT y transfiéralos al bloque de filtro para recolectar la máxima cantidad de resina.
  8. Deje que el tampón gotee o centrifugue brevemente a 200 × g y recoja el flujo. Coloque la placa filtrante encima de un nuevo bloque de lavado y lave la resina con 800 μL de tampón de lavado HT, permitiendo que el tampón gotee (o centrifugue brevemente). Repita el paso de lavado dos veces más y centrifugue el bloque a 500 × g durante 3 minutos para eliminar el tampón de lavado HT residual.
  9. Coloque la placa de filtro encima de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Añadir 50 μL de tampón de elución HT e incubar agitando a temperatura ambiente durante 10 min. Eluir las muestras centrifugando a 500 × g durante 3 min.
  10. Aplicar 15 μL de la muestra eluida en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie para comprobar la expresión de la proteína. Cargue las muestras restantes de eluyente en un sistema de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o cromatografía de exclusión por tamaño (FSEC) de detección de fluorescencia para evaluar la monodispersidad de proteínas en DDM/CHS.

8. Transducción para la expresión a gran escala

NOTA: Los siguientes pasos son el protocolo RESOLUTE estándar para la expresión de SLC. Los objetivos individuales requerirán una mayor optimización del tiempo de expresión, la temperatura de incubación y la concentración de butirato de sodio. Además, optimizamos rutinariamente la multiplicidad de infección por baculovirus probando varias proporciones volumétricas del virus P3 utilizadas para infectar las células HEK293 adaptadas a la suspensión en experimentos a pequeña escala. Esto es eficiente en el tiempo, utiliza técnicas y equipos ya disponibles, y evalúa directamente el resultado experimental deseado. Sin embargo, este método empírico requiere una reoptimización con cada amplificación del virus P3, y existen otros métodos para cuantificar las partículas de baculovirus 49,50,51,52.

  1. Amplíe el volumen requerido de células HEK293 adaptadas a la suspensión en medio HEK293.
  2. Diluir las células HEK293 adaptadas a la suspensión a 1 × 106 células/ml y crecer durante 24 h (a 170 rpm para botellas con rodillo de 2 L y a 105 rpm para botellas con rodillo de 3 L).
  3. Agregue 30 mL de virus P3 por litro de células y agregue 5 mM de butirato de sodio. Incubar las células a 37 °C durante 48 h o a 30 °C durante 72 h.
  4. Durante y después del período de incubación, un paso clave es examinar las células mediante microscopía de campo claro para comprobar la contaminación microbiana y la viabilidad celular. Evalúe la expresión y localización de proteínas mediante microscopía de fluorescencia con un cubo de filtro compatible con GFP.
  5. Recolectar las células por centrifugación a 900 × g durante 20 min.
  6. Lavar el pellet celular resuspendiéndolo en 10-15 mL de PBS por litro de cultivo celular y pellet de nuevo a 900 × g durante 20 min.
  7. Congele rápidamente los gránulos de celda en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.

9. Purificación de proteínas

NOTA: El siguiente es el método estándar RESOLUTE para la purificación de SLC para 5 L de cultivo celular. Para cada objetivo de SLC, el detergente óptimo debe determinarse empíricamente. Prepare con anticipación el tampón base, la solución madre de detergente, el lavado, la elución y los tampones SEC (Tabla 2). Para obtener una lista de los detergentes estándar probados, consulte la Tabla 3. El ATP y el MgCl2 en el tampón de lavado reducen la contaminación por proteínas de choque térmico.

  1. Día 1
    1. Descongele el gránulo de celda congelado en un baño de agua a temperatura ambiente.
    2. Prepare el tampón de solubilización con 135 ml de tampón base y tres comprimidos de cóctel inhibidor de proteasas. Deje que las tabletas se disuelvan.
    3. Vuelva a suspender el gránulo descongelado con tampón de solubilización. Use 27 ml de tampón de solubilización por cada 10-15 g de gránulo celular, agregue DNasa y vierta en un homogeneizador Dounce helado. Homogeneice la solución moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces, manteniendo el homogeneizador en hielo.
      NOTA: El volumen de resuspensión deberá optimizarse en función de la proteína objetivo y la masa de gránulos celulares, que variará debido a la densidad celular en el momento de la cosecha. La DNasa comercial se puede agregar según las instrucciones del fabricante. La DNasa también puede ser expresada y purificada internamente utilizando protocolos establecidos55.
    4. Agregue la solución de detergente a la concentración final al 1%.
      NOTA: Un paso clave para optimizar la purificación de proteínas es identificar el detergente óptimo para la solubilización y purificación de SLC, que debe identificarse empíricamente. Hemos utilizado regularmente varios detergentes; cada uno solo y en combinación con hemisuccinato de colesterol, manteniendo la relación de masa de detergente a CHS en 10:1.
    5. Transfiera la mezcla de solubilización a tubos cónicos de 50 ml. Gire lentamente durante 1 h a 4 °C.
    6. Centrifugar la solución a 50.000 × g durante 30 min a 4 °C. Recoge el sobrenadante.
    7. Equilibre el volumen de lecho de 4-6 ml de resina Strep-Tactin con el tampón base.
    8. Añadir resina equilibrada al sobrenadante solubilizado y girar durante 2 h a 4 °C.
    9. Vierta la solución en una columna de flujo por gravedad y deje que la solución fluya a través de ella.
    10. Lave la resina con 30 veces el volumen de lecho del tampón de lavado Strep en 3 pasos de igual volumen.
    11. Agregue 3-5 ml de tampón de elución, incube durante 15 minutos y recoja el eluido. Repita este paso cuatro veces más, recogiendo cada fracción de elución por separado.
      NOTA: Un paso clave es la elución de proteínas a partir de la resina Strep-Tactin, donde es importante incubar durante 15 minutos después de cada adición del tampón de elución. Normalmente, la primera fracción eluida contiene una menor concentración de proteína debido a la dilución del tampón de elución por el tampón de lavado residual. Por lo tanto, la primera fracción eluida puede descartarse si se desea una mayor concentración final de proteína. Alternativamente, la concentración de proteínas en todas las eluciones seriadas también se puede analizar utilizando SDS-PAGE para optimizar el protocolo.
    12. Mida la concentración de proteínas mediante espectroscopía de absorbancia UV, combine las fracciones de elución deseadas y agregue proteasa 3C en una proporción de 1:5 (p/p) a 1:10 (p/p).
    13. Rotar lentamente durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Los pasos 9.1.12 y 9.1.13 solo son necesarios si es necesario eliminar la etiqueta GFP. Si no es necesaria la eliminación de la etiqueta, continúe directamente con el paso 9.2.4. Alternativamente, la proteína se puede mantener a 4 °C durante la noche para continuar al día siguiente. Además, en el caso de los SLC con estabilidad disminuida, es posible que sea necesario optimizar la concentración de proteasas, el período de incubación y la temperatura. La proteasa 3C es activa en un amplio rango de temperaturas y permite la optimización más adecuada para varios SLC.
  2. Día 2
    1. Equilibre 2-4 mL de volumen de lecho de resina de afinidad de metal cobalto con tampón SEC.
    2. Agregue resina de afinidad de metal de cobalto equilibrada a la mezcla de reacción 3C durante la noche y gire durante 1 h a 4 °C.
    3. Vierta la solución en una columna de flujo por gravedad y recoja el flujo.
    4. Concentre el flujo en un filtro centrífugo de corte de 100 kDa girando a 3.000 × g a 4 °C y mezcle suavemente la muestra cada 5 minutos hasta alcanzar el volumen de inyección SEC deseado.
    5. Equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño basada en dextrán-agarosa utilizando tampón SEC. El procedimiento SEC debe llevarse a cabo a 4 °C (cámara refrigerada o cámara frigorífica).
      NOTA: Paso clave: Dependiendo del estado oligomérico del SLC, se puede utilizar una columna diferente, como una columna de cromatografía de exclusión por tamaño basada en agarosa, para realizar la SEC.
    6. Inyecte la muestra en el circuito de muestra y ejecute el programa SEC, con un caudal tal que la presión de la columna esté por debajo de las especificaciones del fabricante de la columna. Con un colector de fracciones, recoja automáticamente fracciones de 0,3 ml durante toda la ejecución de la SEC.
    7. Agrupe las fracciones máximas, mida la absorbancia UV y concéntrelas en un concentrador centrífugo de corte de 100 kDa hasta el volumen/concentración requerido girando a 3.000 × g a 4 °C.

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Representative Results

Los genes SLC se pueden clonar a partir de plásmidos pDONR RESOLUTE en vectores BacMam para la expresión en mamíferos
Los protocolos descritos para la clonación, la expresión y la purificación han demostrado ser exitosos para muchos transportadores de SLC a través de múltiples pliegues de proteínas. Sin embargo, los procedimientos incluyen varios puntos de control para monitorear el progreso, lo que permite la optimización para tener en cuenta las diferencias en la expresión, el plegamiento de proteínas, la estabilidad dependiente de lípidos y detergentes, y la sensibilidad a las condiciones del tampón.

Puntos de control durante la clonación de SLC y la expresión a pequeña escala
En las etapas de clonación, se debe utilizar la electroforesis en gel de agarosa para garantizar el tamaño correcto de la PCR y los productos de digestión. Del mismo modo, las reacciones de Gateway y transposición se pueden validar con una reacción de PCR de colonia (Figura 2A, B). La generación de baculovirus puede ser monitoreada utilizando técnicas estándar según sea necesario 49,50,51,52. La expresión inicial debe realizarse a pequeña escala, evaluando el rendimiento proteico mediante SDS-PAGE (Figura 2B). Del mismo modo, la fracción de células fluorescentes verdes, la expresión total de proteínas y la localización de proteínas deben anotarse mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2C, D). La expresión de proteínas debe optimizarse para el tipo de célula, la temperatura, el tiempo y la necesidad de coexpresar chaperonas o socios complejos. La expresión se puede optimizar aún más modificando el constructo para truncar los extremos N y C desordenados, basándose en la predicción de la estructura secundaria56,57,58, y probando los tipos y la ubicación de las etiquetas de afinidad. La estabilidad de las proteínas debe evaluarse a pequeña escala mediante FSEC (Figura 2E), ensayo de desplazamiento térmico basado en SEC (SEC-TS) y DSF 41,42,59,60,61,62. Las moléculas pequeñas, como sustratos e inhibidores, detergentes, hemisuccinato de colesterol, lípidos y pH, deben probarse para mejorar la estabilidad de la proteína, teniendo en cuenta la función de la proteína y el entorno subcelular nativo y los tampones de purificación posteriores modificados en consecuencia. Tanto en configuraciones de expresión a pequeña como a gran escala, las células deben monitorearse mediante microscopía para determinar su viabilidad y contaminación.

Optimización de la purificación del transportador a gran escala
Cada paso de la purificación de proteínas a gran escala debe ser evaluado por SDS-PAGE, incluida la fluorescencia en gel para monitorear específicamente la proteína marcada con GFP y la eliminación enzimática de esa marca. En la práctica, las células que expresan SLC marcadas con GFP tienen un aspecto verde amarillento. Después de la elución cromatográfica Twin-Strep-tag, el eluyente que contiene la proteína purificada aparece de color verde neón fluorescente bajo luz blanca. La proteína química y estructuralmente homogénea debe producir un solo pico monodisperso A280 durante la cromatografía de exclusión por tamaño (Figura 2F, G), y debe mostrar una sola banda en SDS-PAGE. La banda SDS-PAGE correspondiente al SLC esperado, y cualquier banda inesperada, debe analizarse utilizando espectrometría de masas de digestión tríptica. Múltiples bandas en el gel SDS-PAGE indican degradación proteolítica, proteínas contaminantes u oligómeros resistentes a SDS. Las proteínas contaminantes pueden eliminarse aumentando la concentración de NaCl del tampón de solubilización o cambiando la etiqueta de afinidad. La proteólisis se puede limitar mejorando la pureza de la proteína, asegurando que todos los pasos se realicen a 4 °C o en hielo, y optimizando el protocolo para minimizar el tiempo de cada paso. Si el perfil SEC tiene un pico amplio, varios picos o un pico vacío grande (como la traza púrpura de la Figura 2F), las condiciones de construcción y purificación deben optimizarse a pequeña escala utilizando FSEC, SEC-T o DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de RESOLUTE para la expresión y purificación de SLC. Ilustración paso a paso de la clonación por recombinación, la preparación del baculovirus BacMam, la expresión y purificación de proteínas y las aplicaciones posteriores. Abreviaturas: SLC = portador de soluto; Crio-EM = criomicroscopía electrónica; SEC = cromatografía de exclusión por tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de la expresión y purificación de SLC. (A) PCR de colonias de clonación de SLC de alto rendimiento en pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) SDS-PAGE teñido con Coomassie de una sola prueba de expresión paralela a pequeña escala de 24 SLC diferentes de longitud completa. (C) Fluorescencia en la célula de un SLC marcado con GFP que se localiza principalmente en la membrana plasmática. (D) Fluorescencia en la célula de un SLC marcado con GFP con localización intracelular significativa. (E) Trazas representativas de FSEC para cuatro SLC resueltas en una columna de UHPLC hidrófila a base de sílice neutra. Trazas SEC representativas de seis SLC purificadas en columnas de cromatografía de exclusión por tamaño de dextra-agarosa (F) o (G) agarosa. Los pesos moleculares del complejo SLC y del detergente utilizados para la purificación se indican cuando se ha determinado experimentalmente el estado oligomérico. Abreviaturas: SLC = portador de soluto; GFP = proteína verde fluorescente; FSEC = cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aplicaciones posteriores de SLC purificados . (A) Micrografía de SLC1A1 en detergente. (B) Promedios de clase 2D de SLC1A1 en detergente. (C) Ensayo de desnaturalización térmica de fluorescencia cruda de CPM de SLC10A6 incubado con varias concentraciones de ácido taurolitocólico 3-sulfato. (D) Primera derivada de la desnaturalización térmica CPM de SLC10A6. La temperatura de fusión del SLC10A6 aumentó en 10 °C en presencia de 120 μM de ácido taurolitocólico 3-sulfato. Abreviaturas: SLC = portador de soluto; CPM = N-[4-(7-dietilamino-4-metil-3-cumarinanil)fenil]maleimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre del vector Marcadores antibióticos Etiquetas para purificación Imprimaciones de cribado bp añadido durante la PCR
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW AmperajeR Terminal C pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
GFP en el sitio de la proteasa 3C
Estreptococo gemelo GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Sus10
pDONR221 KanR ninguno M13 Delantero ~190
M13 Reversa

Tabla 1: Plásmidos utilizados para la clonación de RESOLUTE y la generación de BacMam.

Solución Composición
Placas de selección DH10Bac Placas de agar LB que contienen 50 μg/mL de kanamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 7 μg/mL de gentamicina, 40 μg/mL de IPTG y 100 μg/mL de bluo-gal
2x LB medio (con antibióticos) 2 lb de caldo que contiene 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina y 7 μg/ml de gentamicina
Tampón de lisis HT 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM de NaCl, 5% de glicerol, inhibidor de la proteasa sin EDTA
Tampón HT Wash 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM de NaCl, 5% glicerol, 0,03% DDM/0,003% CHS
Tampón de elución HT 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM de NaCl, 5% de glicerol, 0,03% de DDM/0,003% de CHS, 100 mM de D-biotina
Búfer base 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl
Solución madre de detergente Detergente al 10% (p/v), con o sin CHS al 1%, según corresponda. Mezclar a 4 °C durante la noche y conservar a -20 °C.
Tampón de lavado estreptocócico 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM de NaCl, detergente a 3 veces CMC, 10 mM de MgCl2, 1 mM de ATP
Tampón de elución de estreptococos 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 100 mM de D-Biotina, detergente a 3 veces CMC
Tampón de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM de NaCl, detergente a 2 veces CMC. Filtrar a través de una membrana de 0,22 μM.
Butirato de sodio Solución 1 M en DPBS, almacenar a -20 °C para uso a largo plazo.

Tabla 2: Lista de soluciones utilizadas en este protocolo y su composición.

Sistema de detergente Concentración de extracción Concentración de purificación (% p/v)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
DECÍMETRO 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
NG 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
CYMAL-5 1% 0.40%
LMNG 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
Digitonina 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos Colina-12 1% 0.14%

Tabla 3: Detergentes estándar utilizados para probar la solubilización de la membrana y la monodispersidad y estabilidad del SLC.

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Discussion

El desarrollo de terapias dirigidas al SLC se ha visto obstaculizado debido a la ausencia de una caracterización sistemática de la función transportadora. Esto ha llevado a un número desproporcionadamente menor de fármacos dirigidos a esta clase de proteínas en relación con los GPCR y los canales iónicos63, a pesar de sus numerosas funciones en los procesos normales y fisiopatológicos. RESOLUTE es un consorcio internacional destinado a desarrollar técnicas y herramientas de investigación de vanguardia para acelerar y mejorar la investigación actual de SLC. Como parte de RESOLUTE, hemos desarrollado estos protocolos para la clonación eficiente, el cribado de constructos y la expresión y purificación a gran escala de SLC humanas.

Aquí describimos los métodos escalables de clonación y expresión de SLC que se utilizaron con éxito para explorar sistemáticamente los transportadores de SLC humanos, incluidos los SLC putativos y huérfanos. En particular, los SLC purificados de esta manera se han utilizado con éxito en estudios posteriores de la estructura del transportador, la bioquímica, la función, la generación de aglutinantes y la unión a moléculas pequeñas. Empleamos regularmente este método para purificar cantidades de miligramos de varios SLC y, en condiciones óptimas, todo el protocolo, incluidos los pasos de clonación y cultivo de tejidos, se puede completar en 4-5 semanas.

Nuestro método está optimizado para la economía y el paralelismo para evaluar sistemáticamente múltiples objetivos. Sin embargo, este método de alto rendimiento también se adapta fácilmente a la generación paralela de construcciones para un solo objetivo con varios truncamientos o etiquetas mediante el uso de distintos cebadores o vectores de clonación. Esto es similar a los métodos que también optimizan múltiples construcciones para un objetivo64, aunque nuestro protocolo ofrece más eficiencias con la clonación paralela, la generación de baculovirus y las pruebas de expresión. La transfección ofrece un tiempo más corto entre la clonación de constructo y la expresión al renunciar a la generación de baculovirus65, pero es significativamente más costosa y laboriosa para la expresión a gran escala. Por el contrario, es probable que las líneas celulares estables sean menos costosas para la expresión a gran escala66, pero la generación de líneas celulares clonales de alta expresión puede requerir más tiempo y recursos especializados. Por último, si bien este protocolo utiliza líneas celulares humanas para la producción de proteínas, las líneas celulares de insectos como las de Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni también se han utilizado con éxito para la expresión de SLC a gran escala 5,31,64. La expresión en líneas celulares humanas aumenta los costos de los medios, pero ofrece más modificaciones post-traducción nativas y un entorno lipídico39,67.

Si bien el protocolo se puede adaptar a diferentes transportadores de membrana y necesidades experimentales, varios factores influyen en la calidad y el rendimiento de las muestras de proteínas purificadas. Aunque es ideal para estudiar proteínas de longitud completa, es posible que se requiera cierto grado de truncamiento de secuencia para lograr mejores rendimientos de expresión, purificación y reconstitución. Todas las construcciones de SLC RESOLUTE han sido marcadas con una GFP escindible, que es valiosa para monitorear la expresión, la localización celular y la purificación de SLC. El sistema de expresión celular HEK293 adaptado a la suspensión utilizado en estos experimentos ha dado lugar a rendimientos superiores y se recomienda, aunque también producimos proteínas de forma rutinaria sin glicosilación compleja a través de la línea celular HEK293 GnTl- adaptada a la suspensión. La temperatura de incubación y la duración de la expresión de proteínas por parte de las células transducidas deben optimizarse para cada objetivo, aunque hemos encontrado que 72 h a 30 °C es un buen valor predeterminado.

Todos los pasos de purificación de proteínas deben llevarse a cabo en hielo o a 4 °C y, una vez que la proteína purificada se ha congelado rápidamente, deben evitarse los ciclos de congelación y descongelación. El tipo y la cantidad de detergentes utilizados en los tampones de solubilización y purificación por membrana son críticos y deben determinarse empíricamente para cada SLC.

Los SLC purificados con este método producen muestras homogéneas y estructural y funcionalmente intactas, que pueden utilizarse para una variedad de estudios bioquímicos y biofísicos. La observación de partículas individuales y discretas de la proteína SLC solubilizada y purificada mediante tinción negativa y Cryo-EM (Figura 3A, B) puede ser prometedora para la determinación posterior de la estructura37. El SLC purificado en detergente se puede utilizar para ensayos biofísicos como el ensayo de estabilidad térmica (Figura 3C, D) para investigar las interacciones de las proteínas con moléculas pequeñas como sustratos, inhibidores o lípidos59,62. Finalmente, las SLCs purificadas mediante este protocolo en ensayos bioquímicos pueden ser reconstituidas en liposomas o nanodiscos para ensayos funcionales68 y utilizadas para la generación y selección de anticuerpos y nanocuerpos 69,70. Si bien sigue siendo un desafío adaptar estos métodos al rendimiento necesario para el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas dirigidas a SLC 1, se han logrado avances prometedores en el campo de las tecnologías de cribado in vitro de alto rendimiento71,72,73,74.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo se realizó dentro del proyecto RESOLUTE. RESOLUTE ha recibido financiación de la Empresa Común para la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores 2 en virtud del acuerdo de subvención n.º 777372. Esta Empresa Común cuenta con el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y de la EFPIA. Este artículo refleja únicamente las opiniones de los autores y ni el IMI ni la Unión Europea y EFPIA son responsables del uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo. El plásmido pHTBV fue amablemente proporcionado por el Prof. Frederick Boyce (Harvard).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

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