Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיון חד-תאי של תאי גזע מזנכימליים אימונופנוטיפיים משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65723
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים בשיטת המיון של תא יחיד. באופן ספציפי, השימוש במיון תא בודד יכול להשיג טוהר של 99% של התאים האימונופנוטיפיים מאוכלוסייה הטרוגנית בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית.

Abstract

תאי הגזע המזנכימליים (MSCs) של אורגניזם הם בעלי יכולת יוצאת דופן להתמיין לשושלות מרובות של תאים בוגרים בגוף וידועים בתכונותיהם האימונומודולטוריות והאנטי דלקתיות. השימוש בתאי גזע אלה הוא ברכה לתחום הביולוגיה הרגנרטיבית, אך בה בעת, פגע ברפואה רגנרטיבית ובטיפולים בשל העמימות התאית המרובים הקשורים אליהם. עמימות זו עשויה לנבוע מהמגוון במקור של תאי גזע אלה ומתנאי הגידול שלהם במבחנה , שניהם משקפים את ההטרוגניות התפקודית שלהם.

זה מצדיק מתודולוגיות לספק אוכלוסיות מטוהרות והומוגניות של MSCs ליישומים טיפוליים. ההתקדמות בתחום ציטומטריית הזרימה אפשרה זיהוי אוכלוסיות חד-תאיות בגישה רב-פרמטרית. פרוטוקול זה מתווה דרך לזהות ולטהר תאי גזע משיני נשירים אנושיים (SHEDs) באמצעות מיון חד-תאי בסיוע פלואורסצנטי. ביטוי סימולטני של סמנים על פני השטח, כלומר, CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC), ו- CD44-V450, זיהה את הביטויים החיוביים "הבהירים" של MSCs באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. עם זאת, נצפתה ירידה משמעותית באחוזים של מבטאים מרובעים של סמנים חיוביים אלה מקטע 7 ואילך לקטעים המאוחרים יותר.

תת-האוכלוסיות האימונופנוטיפיות מוינו באמצעות מצב מיון של תא בודד, שבו רק שני סמן חיובי וסמן שלילי אחד היוו את קריטריוני ההכללה. מתודולוגיה זו הבטיחה את יכולת הקיום של התאים של האוכלוסיות הממוינות ושמרה על התפשטות תאים לאחר המיון. היישום במורד הזרם עבור מיון כזה יכול לשמש להערכת הבחנה ספציפית לשושלת עבור תת-אוכלוסיות מגודרות. גישה זו יכולה להיות מיושמת במערכות חד-תאיות אחרות כדי לשפר את תנאי הבידוד ולהשיג מידע על סמנים מרובים של פני התא.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים להיחשב כמקור מדרגי של תאים המתאימים לטיפולים מבוססי תאים ועשויים להיחשב למערכת תקן זהב ברפואה רגנרטיבית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממגוון מקורות בגוף עם מקורות רקמה שונים1. בהתאם לרקמת המקור שלהם, כל סוג של MSC מציג התנהגות חוץ גופית מעורפלת2. זה נצפה היטב בתכונות המורפולוגיות והפונקציונליות שלהם3. מחקרים רבים הראו שונות תוך-שבטית במימדים, כולל התמיינות רקמות בוגרות, מצב גנומי וארכיטקטורה מטבולית ותאית של MSCs 2,4.

אימונופנוטיפ של תאים היה יישום נפוץ של ציטומטריית זרימה לזיהוי תאי גזע וזה נוצל על ידי האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית וגנטית (ISCT) בשנת 2006 כדי לקבוע רשימה של קריטריונים מינימליים לזיהוי תאים כ- MSC. הוא קבע כי יחד עם היצמדות פלסטית והיכולת להתמיין לשלוש שושלות (אוסטאוגנית, כונדרוגנית ואדיפוגנית) במבחנה, ≥95% מאוכלוסיית התאים חייבת לבטא CD105, CD73, CD90, ותאים אלה חייבים להיות חסרים את הביטוי (≤2% חיובי) של CD34, CD45, CD11b, CD14 ו- HLA-DR, כפי שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה5. אף על פי שה-MSCs הוגדרו על ידי קבוצה של סמנים ביולוגיים תחת הקריטריונים המינימליים של ISCT, לא ניתן היה למדוד את התכונות החיסוניות שלהם עם סמנים ביולוגיים אלה והיה צורך ביותר מעבר לקריטריונים אלה כדי להקל על השוואות צולבות ושינויים שבטיים לכימות2.

למרות ההנחיות שנקבעו על ידי ISCT, מחקר מקיף על MSCs הראה כי הטרוגניות קיימת באוכלוסייה זו, אשר יכולה לנבוע ממספר רב של גורמים, בעיקר בשל האופי הנפוץ של הטרוגניות המתעוררת בין תורמי MSC6, מקורות רקמות7, תאים בודדים בתוך אוכלוסיית שבטים8, ותנאי תרבית2,9, 10. אפיון וטיהור של תאים ראשוניים אלה ממגוון מקורות רקמה כדי להבטיח איכות וגורל התא הם שלבי מפתח בייצורם. הצורך להבין את השונות המוצגת באוכלוסייה מחייב שיטה יעילה כדי לפתור אותה לתת-אוכלוסיות שניתן לחלק ולאסוף בנפרד11. אנליזות ברמת התא הבודד מסייעות להתגבר על האתגרים של שונות תא-תא, להפחית רעש ביולוגי הנובע מאוכלוסייה הטרוגנית, ולהציע את היכולת לחקור ולאפיין תאים נדירים12.

בהתאם למטרה ולפרמטרים שנבחרו, ניתן להשתמש במספר שיטות כדי למיין ולהעשיר את האוכלוסיות שנבחרו. טכניקות מיון תאים יכולות לכלול הן מיון בתפזורת והן שיטות מיון של תא יחיד. בעוד שמיון בתפזורת יכול להעשיר אוכלוסיות יעד באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS)13, שבר 14 ואלוטריציה 15, מיון תא בודד יכול להעשיר אוכלוסיות הומוגניות יותר באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)11. ניתוח השוואתי של כל אחת משיטות אלה עם מערך יתרונות וחסרונות משלה מודגש בטבלה 1.

טבלה 1: ניתוחים השוואתיים של טכניקות שונות: MACS, Fractionation, Elutriation ו-FACS המדגישים את ההבדלים בעיקרון שלהם ואת היתרונות והחסרונות של בחירת טכניקה מסוימת על פני אחרת. קיצורים: MACS = מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

מאז הופעת הטכניקה, ציטומטריית זרימה של תא בודד מילאה תפקיד מרכזי בספירה16, גילוי ואפיון של אוכלוסיית תאים ספציפית במדגם הטרוגני17. יואיט ועמיתיו הניחו בשנת 2006 את הבסיס למתודולוגיית מיון תאים אוטומטית כדי לשפר את הבידוד של מאגרים הומוגניים של תאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs)18. מיון חד-תאי העשיר את אוכלוסיית תאי גזע עוברי גזע עוברי GFP והקל על בידוד שיבוטים מהונדסים גנטית, מה שפתח ממד חדש במחקר הקליני. כדי לשפר את יעילות המיון, ננקטו בדרך כלל שתי גישות; או שמדיית האיסוף של האוכלוסיות הממוינות משתנה כדי לקיים את הקיום וההתרבות של תאים לאחר מיון19 או שהאלגוריתם/התוכנה למיון תאים משתנים כראוי12.

עם התקדמות הטכנולוגיה, ציטומטרים מסחריים של זרימה וממייני תאים הצליחו לסייע בהתמודדות עם אתגרים שנענו תוך מיון אספטי של אוכלוסיות תאים שבריריות ונדירות, במיוחד תאי גזע ממקורות שונים. אחד האתגרים העיקריים של ביולוגים של תאי גזע היה בידוד השבט של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בעקבות פרוטוקולי טרנספקציה הנדרשים במחקרי עריכת גנים19. זה טופל על ידי מיון תאים בודדים ללוחות של 96 בארות שצופו בפיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) יחד עם תוספי מזון ומעכבי ROCK מסחריים של מולקולות קטנות. עם זאת, אסטרטגיות בידוד תאים יכולות להיות מעודנות במידה רבה באמצעות שימוש במיון אינדקסים, תכונה של אלגוריתם המיון המזהה את האימונופנוטיפ של תאים בודדים ממוינים12. שיטה מעודנת זו במיון תאים בודדים סייעה לא רק בשיפור יעילות המיון של תאי גזע, במיוחד ביחס לאוכלוסיות נדירות של תאי גזע המטופויטיים, אלא גם קישרה ביעילות שיבוטים של תאים בודדים למבחני התפקוד שלהם במורד הזרם20.

מאמר זה מתמקד במיון חד-תאי של תאי גזע אימונופנוטיפיים משיניים נשירות מתקלפות אנושיות (SHEDs) להעשרת תת-אוכלוסיות כדי לחקור את יכולות ההתמיינות התפקודית שלהן. באמצעות שילוב של שני סמנים חיוביים ל-MSC, CD90 ו-CD73, וסמן המטופויטי שלילי CD45, ה-MSCs עברו אימונופנוטיפ וזוהו המבטאים העמומים והאפסיים. בהתבסס על האימונופנוטיפ שלהם, תת-האוכלוסיות זוהו כ-MSCs טהורים, אוכלוסיות חיוביות בודדות ושליליות כפולות. הם מוינו באמצעות מצב מיון של תא בודד כדי לקבל תת-אוכלוסיות טהורות ומועשרות למחקרים פונקציונליים נוספים כדי לזהות אם הביטוי הדיפרנציאלי של סמנים היה תוצר של תנאי תרבית חוץ גופית או אם יש לו השפעה כלשהי גם על התכונות הפונקציונליות. תאים שלא היו מבטאים הומוגניים של "סמני MSC חיוביים" מוינו כדי לחקור את התכונות התפקודיות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור אתיקה והסכמה להשתתף: דגימות מוך שיניים נשיר פילינג אנושי התקבלו לאחר קבלת הסכמה מדעת ואישור אתי מלא על ידי מכללת סרי רג'יב גנדי לרפואת שיניים ובית החולים (SRGCDS) מחלקת הפה והלסת בבנגלור, בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי הוועדה לאישור אתי של בית החולים, SRGCDS. לאחר מכן הבידוד, התרבית, התחזוקה והיישום של סככות אושרו על ידי ובהתאם להנחיות המומלצות על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR) במכון מניפל לרפואה רגנרטיבית, MAHE - בנגלור. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת ריאגנטים ומאגרים

  1. לתחזוקת התרבות
    1. הכן מדיה של תרביות תאי MSC (10%) באמצעות מדיום בסיסי עבור תאי גזע עובריים עובריים (HSC) לא ממוינים, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-strep) (טבלה 2).
    2. הכן מדיה של תרבית תאי MSC (20%) באמצעות מדיום בסיסי עבור תאי גזע עובריים בלתי ממוינים, 20% FBS, 1% L-גלוטמין ו-1% Pen-strep (טבלה 2).
    3. הכינו חומר מנטרל באמצעות מדיום בסיסי עבור תאי גזע עובריים עובריים בלתי ממוינים, 1% L-גלוטמין ו-1% אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (אנטי-אנטי) (טבלה 2).
  2. לניתוח ומיון ציטומטרי של זרימה
    1. הכן חיץ צביעה באמצעות 2% FBS במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
    2. הכן תמיסת מלאי של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי הוספת 1 μL ב 1 מ"ל של PBS
  3. עבור הבחנה ספציפית לשושלת של MSCs
    1. הכינו אמצעי התמיינות להתמיינות אוסטאוגנית, כונדרוגנית ואדיפוגנית בהתאם להרכב המתואר בטבלה 3. אחסנו את האליציטוטים המוכנים בטמפרטורה של 4°C למשך הניסוי.
    2. הכינו חומרי הדפסה מורעבים לסרום (2% חומרי הדפסה) באמצעות מדיום בסיסי עבור תאי גזע עובריים עובריים בלתי מובחנים, 2% FBS, 1% L-גלוטמין ו-1% Pen-strep (טבלה 2).
סוג המדיה מטרת המדיה הרכב עבור 50 מ"ל
פ.ב.ס. Pen-Strep ל-גלוטמין מדיום בסיסי עבור תאי גזע עובריים בלתי מובחנים
10% מדיה התרבות והתחזוקה של MSC 5 מ"ל 500 μL 500 μL 44 מ"ל
20% מדיה בדיקת CFU-F 10 מ"ל 500 μL 500 μL 39 מ"ל
סרום מורעב (2%) מדיה מדיה לבארות בקרה בפרוטוקול בידול 1 מ"ל 500 μL 500 μL 48 מ"ל
נטרול מדיה מדיה לנטרול תרחיף התא לאחר טריפסיניזציה - 500 μL 500 μL 49 מ"ל

טבלה 2: מדיה של תרביות תאים לצורך תחזוקת תרביות ומבדקים. קיצורים: MSC = תא גזע מזנכימלי; CFU-F = יחידה יוצרת מושבה-פיברובלסט.

רכיבים מדיה אוסטאוגנית מדיה כונדרוגנית מדיה אדיפוגנית
בזל מדיה 90 מ"ל 90 מ"ל 90 מ"ל
מדיה אינדוקציה 10 מ"ל 10 מ"ל 10 מ"ל
נפח כולל 100 מ"ל 100 מ"ל 100 מ"ל

טבלה 3: מדיית בידול עבור התמיינות תלת-שושלת של SHEDs.

2. תרבות ותחזוקת סככות

  1. לשמור על תאים במדיית תרבית MSC של 10% ולבצע שינויי מדיה כל יומיים או לפי הצורך.
  2. טריפסיניזציה של תאים במפגש של 95% באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA.
  3. נטרול תאים לאחר טריפסיניזציה באמצעות מדיה מנטרלת.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה התא.
  5. דקנט את הסופרנאטנט והשהה מחדש את גלולת התא במדיה תרבית MSC של 10%.
  6. זרעו תאים לתוך צלחות תרבית תאים טריות המכילות 10% תרבית MSC מדיה לניסויים נוספים או תרבית משנה.
    הערה: צפיפות הזריעה האופטימלית עבור סככות היא 0.2 × 10 6 תאים בצלחת 100 מ"מ ו 0.8 × 10 6 תאים בצלוחית T-75, כדי לקבל 1.5 × 106 תאים ו 4 × 10 6 תאים, בהתאמה, במפגש של 90-100%.

3. אפיון MSCs

  1. בדיקת צמיחת תאים לטווח קצר
    1. זרעים 4 × 104 תאים/באר בטריפליקט לצלחות 6 בארות ב-10% תרבית MSC.
    2. לדגור את הצלחות במשך 7 ימים ב 37 ° C, ולבצע שינויי מדיה כל 2 ימים.
    3. קצרו את התאים בימים 2, 4 ו-8 באמצעות טיפול של 0.25% טריפסין ושטפו בתרבית.
    4. צנטריפוגות את התאים ב 300 גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיה.
    5. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר וקבעו את הכדאיות שלהם בשיטת ההדרה הכחולה של טריפאן.
    6. חשב את קצב ההתפשטות באמצעות משוואה (1):
      Equation 1(1)
  2. בדיקת יחידה-פיברובלסט יוצרת-מושבה (CFU-F)
    1. זרעו 10,000 תאים בצלחת של 100 מ"מ ותרבו אותם בתרבית של 20% MSC.
    2. לדגור את הצלחות במשך 14 ימים ב 37 ° C, ולבצע שינויי מדיה כל 3 ימים.
    3. לאחר 14 יום, שטפו את המושבות עם PBS, תקנו אותן בצבע סגול קריסטלי במתנול, ושטפו שוב עם PBS כדי להסיר את שאריות הכתם.
    4. ספרו ודמיינו את המושבות.
      הערה: ספירת מושבות עם >50 תאים. יעילות יצירת מושבות מחושבת כמספרי יחידות יוצרות מושבה.
  3. בדיקת Immunofluorescence
    1. זרעו את MSCs על כלים 35 מ"מ ולתת להם לגדול עד 80-90% מפגש.
    2. הסר את המדיה ושטוף את הכלים עם PBS פעם אחת.
    3. תקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) על ידי דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
    4. לאחר הקיבוע, לשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    5. הוסף 0.3% Triton X-100 ב- PBST (0.05% תמיסת Tween 20 ב- PBS) לחדירת התאים. שמור אותו על הנדנדה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    7. הוסיפו אלבומין בסרום בקר 3% (BSA) לחסימה ושמרו אותו על הנדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    8. לשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    9. מוסיפים 800 μL של דילול 1:500 של עכבר אנטי וימנטין (anti-vimentin), שומרים אותו על הנדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ומעבירים את הצלחת ל-4°C לדגירת לילה.
    10. למחרת, להסיר את הנוגדן העיקרי ולשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    11. הוסף 800 μL של דילול 1:1,000 של נוגדן משני מסוג IgG (H+L) נגד עכבר עז, Alexa Fluor 555, ושמור אותו למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
    12. לשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    13. הוסף את Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL ב- 1,000 μL של PBS ודגור בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות על הנדנדה.
    14. לשטוף את הבארות עם PBST במשך 3 x 5 דקות על נדנדה.
    15. הוסף 700 μL של DAPI mountant והתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ.
  4. הבחנה ספציפית לשושלת
    1. בידול בעקבות תרבות דו-ממדית
      1. קחו שתי צלחות בנות 48 בארות ותייגו אותן כשושלות אוסטאוגניות ואדיפוגניות, בהתאמה.
      2. זרעו 15,000 תאים/באר בארבע בארות של כל צלחת ותרבו אותם ב-10% תרבית MSC.
      3. לאחר ששכבת התאים החד-שכבתית הגיעה למפגש של 90%, תייגו את שתי הבארות הראשונות כ"בקרה" והחליפו את המדיה הקיימת במדיה מורעבת בסרום (2% מדיה). בשתי הבארות האחרונות המסומנות כ'מבחן', הוסף אמצעי בידול של אחת משתי השושלות, אדיפוגנית או אוסטאוגנית. סמן זאת כיום 0.
      4. החליפו בעדינות את המדיה כל שלושה ימים כדי לעקוף את הקילוף והיזהרו כדי למנוע זיהום.
      5. לשמור על תנאים אלה עד היום העשרים ואחד; לאחר מכן תהליך לניסוי הצביעה.
    2. בידול בעקבות תרבות תלת ממדית
      1. קח שתי שפופרות 15 מ"ל לביצוע התמיינות כונדרוגנית באמצעות תרבית גלולות תלת מימד.
      2. מעבירים 1 × 106 תאים לכל צינור וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 6 דקות כדי ליצור כדור. תייגו שפופרת אחת כ'שליטה' והוסיפו לה 10% מדיה תרבותית של MSC; תייגו את הצינור השני כ'בדיקה' והוסיפו אמצעי התמיינות כונדרוגניים. הניחו את הצינורות בזהירות באינקובטור כשהמכסים שלהם מוברגים באופן רופף. סמן זאת כיום 0.
      3. החליפו את המדיה כל שלושה ימים בזהירות, כדי לא לעקור/לפורר את הגלולה במהלך חילופי מדיה.
      4. שמור על תנאים אלה עד היום העשרים ואחד ולאחר מכן, לעבד את התאים לניסויים נוספים.
  5. צביעה ציטוכימית ספציפית לשושלת
    1. עבור תרביות דו-ממדיות, השתמש בלוחות MSC (בקרה) מובחנים ולא מובחנים (משלב 3.4.1.5.) עבור צביעה, ותחילה, הסר את המדיה ושטוף פעמיים עם PBS. תקן את התאים באמצעות 4% PFA במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant, ולשטוף פעם אחת עם PBS. בצע צביעה עבור כל שושלת באופן הבא.
      1. לשושלת אדיפוציטים, מוסיפים תמיסת חדירה מהערכה ודגרים על הצלחת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הכינו והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת עבודה O אדום שמן ושמרו אותה למשך 10 דקות. הסירו את הכתם ותנו חמש שטיפות במים מזוקקים.
      2. לשושלת אוסטיאוציטים, הוסיפו 5% חנקת כסף טרייה (במים מזוקקים) לכל באר ושמרו את הצלחת תחת UV למשך שעה אחת. הסר את הפתרון ולהוסיף 2.5% של thiosulphate נתרן כדי להסיר את הכסף unreacted; שמור אותו למשך 5 דקות. הסירו את הכתם, שטפו פעמיים במים מזוקקים והתבוננו בתאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ.
    2. עבור תרביות תלת ממדיות, לאסוף את הגלולה לאחר תום תקופת ההבחנה משלב 3.4.2.3 ולקבל cryosections של הרקמה המובחנת בצורה של הכדור. הניחו למגלשות להתייבש באוויר והיו בטמפרטורת החדר לפני שתמשיכו להכתמה.
      1. עבור שושלת כונדרוציטים, עקוב אחר ההוראות של ערכת הצביעה כדי להוסיף נפח מספיק של תמיסת כביסה, להסיר אותו, להוסיף את תמיסת הקיבוע, ולדגור במשך 30 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים, להוסיף את תמיסת הכתמים ולדגור במשך 30 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם 0.1 N חומצה הידרוכלורית; מוסיפים מים מזוקקים לנטרול החומציות. התבוננו בתאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.

4. צביעת פני התא לאימונופנוטיפ

הערה: לוחות תרבית תאים מומלצים לקבלת מספר אופטימלי של תאים בשלבים 4.2-4.5 הם צלחות 100 מ"מ או צלוחיות T75.

  1. הכנת תאים לניסויים ציטומטריים של זרימה
    1. טריפסינזציה ואיסוף התאים מצלחת/בקבוק וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 6 דקות כדי לקבל את כדורית התא.
    2. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיה ולקבוע את ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer בעקבות שיטת הרחקה כחול trypan.
    3. צנטריפוגה את מתלה התא שוב לאחר ספירה ולתת שתי שטיפות נוספות לגלולה עם 1 מ"ל של חיץ צביעה.
    4. השליכו את הסופרנאטנט ולבסוף השהו מחדש את הגלולה בנפח מתאים של חיץ הצביעה בהתאם לפרוטוקול (ראו שלבים 4.2 עד 4.5).
  2. הכנת בקרות פיצוי
    1. קח שבעה צינורות FACS ותייג אותם כ- Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 ו- APC.
    2. השהה מחדש את הגלולה הסופית במאגר הצביעה (ראה שלב 4.1.) תוך שמירה על צפיפות תאים של 0.5 × 106 תאים לכל 50 מיקרוליטר לצינור עבור צינורות לא מוכתמים ו- DAPI.
    3. הכינו את הצינורות המוכתמים הבודדים לפיצוי כמתואר בטבלה 4.
    4. מערבלים בעדינות כל צינור לאחר ההכנה ודגרים בחושך במשך 30 דקות.
    5. לאחר הדגירה, יש לבצע שתי שטיפות על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ מכתים לכל צינור, ולאחר מכן מערבולות קצרות וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ מכתים, והניחו אותה בצד עד לרכישה.
    7. עבור צינור DAPI, בצע טיפול בהלם חום על ידי דגירה באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 15 דקות על קרח. הוסף 5 μL של DAPI למתלים ושמור אותו בחושך עד לרכישת הריצה.
  3. הכנת פקדים פלואורסצנטיים פחות אחד (FMO)
    1. השהה מחדש את הגלולה הסופית במאגר צביעה (ראה שלב 4.1) תוך שמירה על צפיפות תאים של 0.5 × 106 תאים לכל 50 מיקרוליטר לכל צינור.
    2. קח חמש שפופרות FACS ותייג אותן כאיזוטיפ CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, איזוטיפ CD73-PerCP Cy5.5 ואיזוטיפ CD105-APC.
    3. הכינו את תרחיף התא והנוגדנים לפי טבלה 5.
    4. מערבבים את הצינורות בעדינות ודגרים עליהם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. לאחר הדגירה, יש לתת שתי שטיפות עם 1 מ"ל של חיץ מכתים לכל צינור ולאחר מכן מערבולות קצרות וצנטריפוגה ב 200 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ הכתמה, והניחו אותה בצד עד לרכישה.
  4. הכנת דגימות לניתוח
    1. השהה מחדש את הגלולה הסופית במאגר הצביעה (ראה שלב 4.1) תוך שמירה על צפיפות תאים של 0.5 × 106 תאים לכל 50 מיקרוליטר לכל צינור.
    2. קח שתי שפופרות FACS ותייג אותן כשפופרות מעורבות 1 ו- 2.
    3. הכינו את תרחיף התא והנוגדנים לפי טבלה 6.
    4. מערבבים את הצינורות בעדינות ודגרים עליהם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. לאחר הדגירה, יש לתת שתי שטיפות עם 1 מ"ל של חיץ מכתים לכל צינור ולאחר מכן מערבולות קצרות וצנטריפוגה ב 200 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ הכתמה, והניחו בצד עד לרכישה.
  5. הכנת דגימות למיון תא בודד
    1. קח שני צינורות FACS, הוסף 1mL של FBS, וגלגל את הצינור סביב עד שכבה שווה של FBS נוצר בחלק הפנימי של כל צינור. לדגור על זה במשך 1-2 שעות תוך עיבוד הדגימה עבור צביעה. תייגו צינורות אלה כשפופרות מעורבות 1 ו-2.
    2. השהה מחדש את הגלולה האחרונה במאגר הצביעה (ראה שלב 4.1) תוך שמירה על צפיפות תאים של 2-3 × 106 תאים לכל 50 מיקרוליטר לכל צינור.
    3. הכינו את תרחיף התא והנוגדנים בצינורות מעורבים 1 ו-2 לפי טבלה 7.
    4. מערבבים את הצינורות בעדינות ודגרים עליהם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. לאחר הדגירה, יש לתת שתי שטיפות עם 1 מ"ל של חיץ מכתים לכל צינור ולאחר מכן מערבולות קצרות וצנטריפוגה ב 200 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ מכתים, ולהניח בצד. הוסף 5 μL של DAPI 15 דקות לפני המיון.
      הערה: שים לב שעבור ניסויי מיון מומלצת צפיפות תאים גבוהה יותר לכל צינור.
סוג צינור חרוזי Comp חיוביים* חרוזי Comp שליליים* תאים הוספת נוגדנים
צינור FITC 1 טיפה 1 טיפה – CD90-FITC אנטי-אנושי (2 מיקרוליטר)
צינור V450 1 טיפה 1 טיפה – CD44-V450 אנטי-אנושי (2 מיקרוליטר)
צינור PerCP-Cy 5.5 1 טיפה 1 טיפה – CD73-PerCP Cy 5.5 אנטי-אנושי (2 μL)
צינור PE 1 טיפה 1 טיפה – CD45-PE אנטי-אנושי (2 מיקרוליטר)
צינור APC 1 טיפה 1 טיפה – CD105-APC אנטי-אנושי (2 מיקרוליטר)
צינור DAPI – – 50 מיקרוליטר –
צינור לא מוכתם – – 50 מיקרוליטר –
*טיפה אחת = 60 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים

טבלה 4: דגימות בקרת פיצוי. קיצורים: Comp = פיצוי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון.

סוג צינור נוגדן נגד סמן חיובי (2 מיקרוליטר) נוגדן נגד סמן שלילי (2 מיקרוליטר) הוספת נוגדני איזוטיפ (2 מיקרוליטר) נפח כולל של נוגדנים נפח מתלה התא נוסף נפח חיץ הצביעה נוסף
צינור FMO CD90-FITC - CD44-V450 אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי איזוטיפ FITC IgG1 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD73 אנטי-אנושי PerCP Cy 5.5
- CD105-APC אנטי-אנושי
CD73-PerCP Cy5.5 FMO צינור - CD44-V450 אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי איזוטיפ PerCP Cy 5.5 IgG1 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD90-FITC אנטי-אנושי
- CD105-APC אנטי-אנושי
צינור FMO CD44-V450 - CD90-FITC אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי איזוטיפ V450 IgG1 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD73-PerCP Cy 5.5 אנטי-אנושי
- CD105-APC אנטי-אנושי
צינור FMO CD105-APC - CD44-V450 אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי איזוטיפ APC IgG1 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD90-FITC אנטי-אנושי
- CD73-PerCP Cy 5.5 אנטי-אנושי
צינור FMO CD45-PE - CD44-V450 אנטי-אנושי - איזוטיפ PE IgG1 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD90-FITC אנטי-אנושי
- CD73-PerCP Cy 5.5 אנטי-אנושי
- CD105-APC אנטי-אנושי

טבלה 5: דגימות בקרת FMO. קיצורים: FMO = פלואורסצנטיות פחות אחת; FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון.

סוג צינור נוגדן נגד סמן חיובי (2 מיקרוליטר) נוגדן נגד סמן שלילי (2 מיקרוליטר) נפח כולל של נוגדנים נפח מתלה התא נוסף נפח חיץ הצביעה נוסף
צינור מעורב 1 - CD44-V450 אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD90-FITC אנטי-אנושי
- CD73-PerCP Cy5.5 אנטי-אנושי
- CD105-APC אנטי-אנושי
צינור מעורב 2 - CD44-V450 אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי 10 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר
- CD90-FITC אנטי-אנושי
- CD73-PerCP Cy5.5 אנטי-אנושי
- CD105-APC אנטי-אנושי

טבלה 6: מבחנות לדוגמה לאימונופנוטיפ צבעוני של SHEDs. קיצורים: SHEDs = תאי גזע משיניים נשירות אנושיות שעברו קילוף; PE = phycoerythrin.

סוג צינור נוגדן נגד סמן חיובי (3 מיקרוליטר) נוגדן נגד סמן שלילי (3 מיקרוליטר) נפח כולל של נוגדנים נפח מתלה התא נוסף נפח חיץ הכתמים נוסף
צינור מעורב 1 - CD90-FITC אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי 9 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 41 מיקרוליטר
- CD73-PerCP Cy5.5 אנטי-אנושי
צינור מעורב 2 - CD90-FITC אנטי-אנושי CD45-PE אנטי-אנושי 9 מיקרוליטר 50 מיקרוליטר 41 מיקרוליטר
- CD73-PerCP Cy5.5 אנטי-אנושי

טבלה 7: צינורות תגובת מיון חד-תאיים. קיצורים: FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון.

5. מיון תא בודד

  1. הכנת ממיין תאים
    1. התקן פייה של 100 מיקרומטר במיון.
      הערה: קוטר הזרבובית המתאימה הוא לפחות פי חמישה מקוטר החלקיק שיש למיין. נוזל הנדן שישמש למיון צריך להיות מוכרע על סמך סוג הדגימה ורגישות הניסוי; עבור ניסוי זה, נוזל נדן קנייני שימש.
    2. בצע את בדיקת איכות המכשיר היומית (QC) והגדר את הממיין לניסוי. עיין במדריך לוח המחוונים לקבלת מדריך מפורט להגדרת המכשירים.
  2. הגדרת מטריצת הפיצוי
    1. הגדר את מטריצת הפיצוי באמצעות צינורות פיצוי עם כתם יחיד משלב 4.2.
    2. בתוכנה הקניינית, בחר ניסוי מסרגל הכלים ולחץ על הגדרת פיצוי. פתח את צור פקדי פיצוי.
    3. בדוק את הסמנים ואשר. דגימה חדשה מתווספת בשם "פיצוי" ומתחתיה צינורות חדשים בשם פקדי הסמן מתווספים אוטומטית על ידי התוכנה.
    4. בחר את הצינור Unstained והפעל אותו, כדי להקליט 5,000 אירועים. גרור את השער לאוכלוסיית התאים והחל אותו על כל בקרות הפיצוי. זה כדי להגדיר את המתחים ואת השער השלילי עבור כל פרמטר פלואורסצנטי.
    5. באופן דומה, טען את צינורות הפיצוי של כתם יחיד בנפרד, ורשום ושמור את הנתונים. בחר את השער התוחם את האוכלוסייה המעניינת והחל על כל בקרות הפיצוי. זאת כדי לקבוע את השערים החיוביים עבור כל פרמטר פלואורסצנטי.
    6. בחר ניסוי מסרגל הכלים ולחץ על חישוב ערכי פיצוי | קישור ושמירה.
      הערה: לאחר יצירת מטריצת הקומפוזיציה האוטומטית באמצעות התוכנה, לא ניתן לשנות את פרמטרי המתח של הפלואורוכרומים עבור אף אחד מהתעלות בצינורות המעורבים.
  3. איסוף נתונים
    1. רשום 10,000 תאים בכל צינור משלב 4.3. ו-4.4 לאסוף נתונים לניתוח האימונופנוטיפ של התאים.
  4. הכנת מכשירי האיסוף
    1. בהתאם למטרה של אוכלוסיות התאים הממוינות, בחר בין לוחות 6-well, 24-well, 48-well, או 96-well.
    2. מצפים את הבארות עם 200-500 μL של FBS ולשמור את הצלחות ללא הפרעה במשך 2 שעות.
    3. לאחר 2 שעות, להסיר את FBS השיורי ולהוסיף 200-500 μL של 10% MSC תרבית מדיה.
  5. מיון תאים במצב מיון של תא בודד
    1. הפעל צינור מעורב 1 (משלב 4.5), ורשום 10,000 אירועים כדי להציב את השערים על האוכלוסייה המעניינת שיש למיין, תוך שימוש באסטרטגיית ה- gating המתאימה.
    2. טען לוחית איסוף והגדר מספרי תאי יעד בין 2,500 ל- 5,000 תאים/באר ובחר את מסיכת טוהר המיון של תא יחיד.
    3. אספו את האוכלוסיות הממוינות במכשיר האיסוף ושמרו אותן על קרח עד סוף ניסוי המיון.
    4. לאחר שתסיים, העבר את הצלחות לחממה 5% CO2 כדי לשמור על התרביות ב 37 ° C.
      הערה: לאחר הרכישה, קובצי נתונים גולמיים יוצאו כתבנית קובץ .fcs (v.3.0. ואילך). דוחות המיון שנוצרו לאחר כל ניסוי תיעדו את מספר האירועים/תאים שמוינו לכל באר שהוקצתה והצביעו על מספר הקונפליקטים שבוטלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ה-SHEDs התאפיינו במבחני אימונופלואורסנציה סטנדרטיים שהראו ביטוי של וימנטין (אדום, חוטי ביניים מסוג III), חוטי אקטין (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (איור 1A). כדי להעריך את יכולות ההתרבות ויצירת המושבות שלהם, בוצעו בדיקות סטנדרטיות לגידול תאים לטווח קצר. עלייה של פי 14.3 בקצב ההתפשטות מהיום השני ליום ה-8 הודגמה באיור 1B. התכונות הקלונוגניות של הסככות נקבעו ממבחני CFU-F המוצגים באיור 1C-E. בהתאם לקריטריונים של ISCT, MSCs הרב-חזקים הצליחו להתמיין לשלוש השושלות הנגזרות מזודרמליות. צביעה ציטוכימית עם שמן אדום O שימשה לזיהוי טיפות השמן באדיפוציטים המובחנים (איור 1F); צביעת פון קוסה שימשה להכתמת משקעי הסידן שנמצאו במטריצה של האוסטאובלסטים המובחנים (איור 1G); והאגרקנים בתרבות התלת-ממדית הוכתמו בכחול אלקיאני בכונדרובלסטים המובחנים (איור 1H).

כדי לאפיין את האימונופנוטיפ של ה- SHEDs, נקבעו מבחני ציטומטריה של זרימה רב-פרמטרית. הניסויים בוצעו יחד עם שימוש בארבעה סוגים של בקרות ניסוי, כלומר בקרות פיצוי (טבלה 4), בקרות FMO ואיזוטיפ (טבלה 5), ובקרות לא מוכתמות. האיזוטיפים של כל נוגדני MSC ו-HSC שבהם נעשה שימוש נוספו יחד עם צינורות ה-FMO כדי להבחין בין אותות חיוביים לעומת שליליים לבין ביטוי אנטיגן גבוה לעומת עמום. איור 2A מראה את ההתפלגות של פקדי ה-FMO והאיזוטיפ שבהם נעשה שימוש בכל ניסוי. תרשימי הצפיפות המייצגים לא הראו ביטוי לאיזוטיפ FITC של נוגדני CD90 FITC. באופן דומה, שכבות-העל של ההיסטוגרמה (איור 2B) השוו את רמות הביטוי של הדגימות המוכתמות יחד עם הבקרות שלהן בערוצים המתאימים של FITC, PerCP, Cy5.5 ו-PE. ביטוי חיובי של הסמנים CD90 ו- CD73 (היסטוגרמות אדומות) וביטוי שלילי של CD45 דומים לזה של פקדי ה- FMO וה- FMO הלא מוכתמים שלהם (היסטוגרמות כחולות ושחורות, בהתאמה).

אפיון מבוסס ציטומטריה של זרימה של האימונופנוטיפים הראה את התפלגות הסמן מאחד המעברים המוקדמים (P6) סככות (איור 3A-H). הן הסמנים המומלצים על ידי ISCT והן CD44 קבעו את אוכלוסיות האב כ- MSC. אוכלוסיית הטטרה-חיובי שהודגמה בחלקות הצפיפות הראתה ביטוי של ≥98% של CD90+CD73+CD105+CD44+ ו-≤2% של סמני CD45. יותר מחמישה ניסויים עצמאיים הראו תוצאות דומות. סככות המעבר המאוחרות (P12), שהראו ביטוי דיפרנציאלי של הסמנים החיוביים, נבחרו למיון חד-תאי של מבטעים גבוהים ועמומים. בהתאם לאסטרטגיית ה-gating (איור 4H), אוכלוסיות סינגלים→ תאים חיים→ אוכלוסיות שאינן HSC→ CD73+CD90+ חיוביות כפולות ו-CD73+CD90 חיוביות בודדות מוינו באמצעות מצב מיון של תא יחיד. האוכלוסיות הממוינות נאספו בפריסות לוחות של 96 בארות/48 בארות/6 בארות עם ספירות זריעה שונות לכל באר (קובץ משלים 1). שלושה ניסיונות רצופים נעשו בשלב אחד של ניסויי מיון ושרידות התאים לאחר מיון (במבטאים החיוביים הכפולים: CD90+CD73+) לכל ניסוי הייתה 100%. נערכו שלושה שלבים עצמאיים של ניסויים. התאמנו את מספר התאים שגדלו לכל באר לאחר מיון למספר התאים שמוינו לכל באר.

איור 5A מראה שהתאים שלאחר מיון CD90+CD73+ שנאספו בלוח של 96 בארות הראו היצמדות והתפשטות כמו אוכלוסיית האם שלהם. התאים הממוינים נצפו מגיעים למפגש של 70-80% ביום השישי שלאחר המיון. התאים שהודבקו והתרבו לאחר מיון התמינו בנוכחות גורמי גדילה אדיפוגניים, ולאחר מכן הוכתמו לאחר היום ה-15 בשמן אדום O באמצעות תאי בקרה מתאימים לאחר מיון (לא ממוינים) גם כן (איור 5B,C).

Figure 1
איור 1: אפיון תאי גזע משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי. (A) צביעה אימונופלואורסצנטית מאשרת שה-MSCs המבודדים מבטאים וימנטין (אדום, חוטי ביניים מסוג III), סיבי אקטין (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) ו-DAPI (כחול, גרעינים). פוטומיקרוגרף המתקבל בהגדלה מקורית של פי 20. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) בדיקת גדילת תאים לטווח קצר של SHEDs מציגה את יכולת ההתרבות הגבוהה שלהם, כפי שנצפה על ידי הגידול המשמעותי במספר התאים בתרבית ביום 2 ועלייה של פי 14.3 בקצב ההתרבות בסוף יום 8 (n = 3, p-value<0.01). הוצגו קווי שגיאה של סטיית תקן. (ג-ה) בדיקת CFU-F וצביעה סגולה קריסטלית מאשרות את יכולת יצירת המושבה של SHEDs; (ג) מושבות מרובות צפויות להיווצר לאחר 14 יום בתרבות; (D) מושבה קלונוגנית יחידה שמקורה בתא יחיד; (E) מושבה בודדת מוכתמת בסגול של SHEDs מציגה את המורפולוגיה דמוית הפיברובלסט הטיפוסית של התאים. (פ-ח) MSCs בתנאי מבחנה מתאימים צפויים לעבור התמיינות לשושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות עד היום ה-21. צביעה ציטוכימית מראה (F) שמן אדום O (שיבוץ מראה תמונה של 40x של אדיפוציט המראה טיפות שמן), (G) פון קוסה, ו-(H) צביעה בצבע כחול אלקיאני עבור שושלות אדיפוגניות, אוסטאוגניות וכונדרוגניות, בהתאמה, ביום ה-22. פוטומיקרוגרפים מתקבלים בהגדלה מקורית של פי 20. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: MSCs = תאי גזע מזנכימליים; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; נשרים = תאי גזע משיניים נשירות אנושיות שעברו קילוף; CFU-F = יחידה יוצרת מושבה-פיברובלסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בקרות שליליות ששימשו בניסוי רב-פרמטרי . (A) פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד הוצגו בצורה טבלאית, שבה פקדי FMO הוחלפו באיזוטיפים הספציפיים שלהם. תרשימי הצפיפות המייצגים (משמאל לימין) מראים את הבקרה הבלתי מוכתמת (משמאל), FMO של CD90 FITC (באמצע) עם כל הנוגדנים שנוספו למעט CD90 FITC יחד עם תוספת של איזוטיפ CD90 FITC, ודגימה מוכתמת במלואה עם כל הנוגדנים של הפאנל שנוספו (מימין). (B) שכבת היסטוגרמה מייצגת השוואה בין שלושה סוגי דגימות, שחור מייצג FMO, כחול מייצג דגימות לא מוכתמות ואדום מייצג דגימות מוכתמות לחלוטין בערוצים שלהן. קיצורים: FMO = פלואורסצנטיות פחות אחת; FITC = isothiocyanate fluorescein; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון; PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אימונופנוטיפ רב-פרמטרי של SHEDs (P6). (A) SSC-A לעומת FSC-A: בהתבסס על תכונות הפיזור הצידי והקדמי שלהם, התאים המעניינים מגודרים ומופרדים מהפסולת; (B) FSC-H לעומת FSC-A ו-(C) SSC-H לעומת SSC-A: שתי החלקות משמשות להפליה כפולה, המאפשרת בחירת סינגלים תוך ביטול אגרגטים העלולים ליצור אותות חיוביים כוזבים; (D) SSC-A לעומת CD45 PE: הדרה מאפשרת בחירה של אוכלוסיית CD45 מהסינגלים; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 לעומת CD90 FITC: מתוך CD45- סינגלים חיים, תאי CD90+CD73+ מגולים; (F) CD44 V450 לעומת CD105 APC: אוכלוסיית CD90+CD73+, מגודרת עוד יותר כדי להגדיר את תאי CD90+CD73+CD44+CD105+ חיוביים לטטרה; (G) SSC-A לעומת Time(s): העלילה מתארת את הרכישה היציבה לאורך זמן (שניות) וכי שום אירועים לא גרמו לתנודות לחץ בעת הרכישה; (H) היררכיית גאטינג. קיצורים: SHEDs = תאי גזע משיניים נשירות אנושיות שעברו קילוף; FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיון חד-תאי של SHEDs אימונופנוטיפיים (P12). (A-F) אסטרטגיית gating מבוססת אימונופנוטיפ שלב אחר שלב למיון MSCs טהורים בסדר הרציף הבא: תאים ל- singlets_1, ל- singlets_2, ל- DAPI- תאים חיים, לתאים CD45- שאינם המטופויטיים, ולבסוף לתאי CD90+CD73+. האוכלוסיות המגודרות המוצגות ב-(F) מוינו באמצעות מצב מיון של תא יחיד. (G) תרשים SSC-A לעומת Time(s) מתאר מיון רצוף של הדגימות. (H) היררכיית גאטינג. (n=3, יעילות מיון = 100%). קיצורים: SHEDs = תאי גזע משיניים נשירות אנושיות שעברו קילוף; MSCs = תאי גזע מזנכימליים; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון; SSC-A = אזור פיזור-שיא צד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אפיון מורפולוגי ופונקציונלי של סככות לאחר מיון. (A) תמונות ניגודיות פאזה של אוכלוסיות לאחר מיון נאספו בלוח של 96 בארות ביום 6 בהגדלה מקורית של פי 10, סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (הכניסה מציגה תמונה של 20x המתארת את התאים הבודדים הממוינים המשנים את המורפולוגיה ל- MSCs דמויי פיברובלסטים). צביעה ציטוכימית להתמיינות אדיפוגנית באמצעות O אדום שמן שנצפה ב-(B) אוכלוסייה לא ממוינת (בקרה) ו-(C) מובחנת לאחר מיון בהגדלה מקורית של פי 20, סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (הכניסה מציגה תמונה של 40x המתארת את טיפות השמן שנצפו). קיצורים: נשירה = תאי גזע משיני נשירים שעברו קילוף אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: דוחות מיון שנאספו לכל ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: תצורה אופטית של היתוך BD FACSAria. קיצורים: LP = מעבר ארוך; PMT = צינור מכפיל אור; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בתחום הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, בין המקורות שלאחר הלידה, MSCs שמקורם ברקמת הפה משכו עניין רב בגלל מחויבויותיהם האתיות המינימליות ופוטנציאל התמיינות רב-שושלתי בולט21. תאי גזע של מוך השן (DPSCs) מהטוחנת השלישית שנפגעה זכו לתשומת הלב הרבה ביותר בקרב MSCs דנטליים בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהם במחלות נוירודגנרטיביות וטראומטיות22. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מסייע לאפיין SHEDs בגישה רב-פרמטרית ולמיין אוכלוסיות מעניינות באמצעות גישת המיון החד-תאי. עם זאת, היישום של פרוטוקול זה אינו מוגבל רק MSCs אוראלי, אלא גם יכול לשמש עבור immunophenotyping ומיון של MSCs מרקמות מקור אחרים בגוף האדם23.

יש לדון כאן במספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה ליישומו המוצלח של הבעיה הביולוגית המטופלת. המפתח לכל פרוטוקול מיון הוא לבדוק שני מרכיבים חשובים: הבקרה הביולוגית שלו והבקרות הניסיוניות. ראשית, תחזוקת תרבית נקייה מבטיחה שהמדגם שבו נעשה שימוש לא ייפגע בזמן המיון. יכולת הקיום של התא בתרחיף החד-תאי לפני המיון תבטיח כי יותר מ-70% מאוכלוסיות התאים בנות קיימא יתחילו עם, ולאחר מכן ניתוח ומיון של תת-אוכלוסיות בריאות. חיץ הכתם המשמש בתרחיף התא הבודד צריך להכיל 2% FBS והניסויים נעשים בצורה הטובה ביותר בטמפרטורת החדר. בחירת המפגש הנכון של תאים ראשוניים אלה (מפגש של 80-85%) מונעת פגיעה בכדאיות התא שלהם ומפחיתה את הסיכויים לצברים גדולים. בנוסף, השימוש בסמן חי/מת (DAPI בפרוטוקול זה) חיוני לכל ניסוי מיון. במחקר זה, מכיוון שהדגימות ששימשו היו MSCs בקוטר משוער של 20-35 מיקרומטר, גודל הזרבובית שנבחר היה 100 מיקרומטר כדי למיין אותן בלחץ של 20 psi על BD FACSAria Fusion. זה איפשר מיון תאים מבלי לפגוע בכדאיות התא במהלך התהליך בלחץ נדן נמוך יותר. לקבלת תנאי הגדרת מיון מפורטים, מומלץ לעיין במדריך התוכנה BD FACSDiva24.

תנאי מוקדם חיוני לניסויים צבעוניים בציטומטריית זרימה הוא הצורך בבקרות מתאימות; ישנם ארבעה סוגים עיקריים של בקרות בשימוש כאן: autofluorescence, איזוטיפים, FMO, ובקרות פיצוי. מטריצת הפיצוי האוטומטי אפשרה פיצוי מדויק, מניעת דימום ספקטרלי בגלאים, והשתמשה הן בחרוזי פיצוי והן בתאים למטרה זו. הדגימה הבלתי מוכתמת קבעה את הסף עבור autofluorescence של MSCs. הצינורות המעורבים עם כל ארבעת הנוגדנים כוללים את האיזוטיפ וה- FMOs של כל נוגדן בשימוש. בקרת פיצוי DAPI בוצעה באמצעות MSCs, אשר עובדו בנפרד (עם הלם חום). לוח הנוגדנים (כפי שמצוין בטבלה 8) המשמש כאן תוכנן במיוחד עבור hMSCs בהתבסס על הקריטריונים שצוינו על ידי ISCT ותצורת המכשיר של ממיין תאי BD FACSAria Fusion (עיין בטבלה משלימה S1). זה חיוני מאוד במהלך התכנון של ניסויים ציטומטריה זרימה multiparametric. לוח האפיון המשמש לאימונופנוטיפ מורכב מארבעה סמנים חיוביים של MSC (CD90, CD105, CD73 ו-CD44) וסמן שלילי אחד (CD45). לעומת זאת, הפאנל לניסוי המיון מכיל שני סמנים חיוביים (CD90 ו-CD73), סמן שלילי אחד (CD45) וסמן חי/מת (DAPI) כדי להבטיח ספירה גבוהה של MSC חיים.

נוגדן/סמן פלואורוכרום פרופיל פני השטח של hMSC אורך גל לייזר (nm) שיא עירור (nm) שיא פליטה (ננומטר)
CD44 V450 צריך לבטא; >95% 405 405 450
CD90 FITC 488 495 519
CD73 PerCP-Cy5.5 488 488 695
CD105 נגמ"ש 640 650 660
CD45 PE לא צריך לבטא; <2% 561 566 574
דאפי - סמן תא מת 405 358 461

טבלה 8: לוח צבעוני המיועד לאפיון ומיון של סככות לפי ציטומטריית זרימה. קיצורים: FITC = isothiocyanate fluorescein; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = פרידינין-כלורופיל-חלבון.

בחירת מסיכת טוהר המיון
בהתחשב בחוסר היכולת לחזות את ההטרוגניות התאית ב- MSCs, מיון בתפזורת לא בהכרח ישיג את רמת הטוהר בקרב האוכלוסיות הממונות. ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול המיון של תא בודד במחקר זה כדי לזהות את השיבוטים של התא הבודד ולעקוב אחר התכונות הפונקציונליות שלהם לאחר המיון במונחים של עוצמה. מיון תא בודד בוצע על BD FACSAria Fusion, אשר היה גמישות של ההגדרות הבאות: בחירה של זרבובית 100 מיקרומטר, לחץ נדן 20 psi, קצב זרימה מתכוונן (נשמר על 20 μL / min), וקצב סף ב 380 אירועים / s. הסיכויים לבחור שני תאי יעד במקום אחד הם מינימליים בשיטה זו. בדרך כלל, נבחר מצב המיון של תא בודד של האלגוריתם שיכול לפתור את המיון של אוכלוסיות טהורות של תאי יעד ולשקול כמה טיפות ימוינו למכשיר האיסוף הנבחר. בסופו של דבר יש לבחור במדויק את מצב הדיוק כך שיוכל לשלב את המסכות הזמינות באלגוריתמי המיון וליצור תנאי מיון מחמיר כדי למיין את האוכלוסיות הטהורות ביותר המעניינות. מצב מיון של תא בודד אינו מתפשר על תא יעד אם הוא נצבר לתא שאינו תא יעד בזמן המיון, וזה משיג את רמת הטוהר שאנו מצפים לה בגישה זו. זה היה המודול שנבחר בפרוטוקול זה והתאים הממוינים נאספו בהתקני לוחות 96 באר, 48 באר, 24 באר ו -6 בארות.

במחקר זה מיינו תת-אוכלוסיות בהתבסס על האימונופנוטיפ הדיפרנציאלי שלהן, כלומר CD90+CD73+CD45-. הן בפרוטוקולי האפיון והן בפרוטוקולי המיון, אסטרטגיית ה-gating שלנו (כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4) התבססה על הרחקת gating מאוכלוסיית CD45 כדי לתת לנו את האוכלוסייה הלא-המטופויטית (כפי שאלה אומתו ואופיינו בעבר עם הסמנים שנקבעו על ידי ISCT), לאחר זיהוי סינגלטים. בסופו של דבר, MSCs זוהו מאוכלוסיית CD45 באמצעות סמני ISCT חיוביים. ראוי לציין כאן כי אין הבדל רב באחוזים בביטוי החיובי הראשון של סמני ISCT ואחריו המבטאים השליליים של CD45. עם זאת, מכיוון שמטרת מיון זה הייתה לזהות תאים המראים ביטוי שונה של סמני MSC הידועים, סיימנו את הניתוח שלנו עם תרשימי הביטוי החיובי.

בנתונים המייצגים 97% מתאי CD45 הם MSC, אולם במהלך כימות ביטויי האנטיגן ראינו ש-75% מהתאים הם מבטאים חיוביים כפולים של שני הסמנים CD90 ו-CD73, בעוד שישנן מספר אוכלוסיות שהן מבטאות חיוביות בודדות של אותם סמנים (מוצגות באיור 3F) ומעט תאים שאינם מבטאים את הסמנים כלל.

במהלך אפיון תאים אלה, זיהינו את תת-האוכלוסיות כ-MSCs חיוביים טטרה, אוכלוסיות חיוביות משולשות ושליליות כפולות. ביטוי דיפרנציאלי זה של סמני MSC מתרחב עם מעברים הולכים וגדלים ולכן מגיע הצורך ללמוד ולקשר הבדל זה עם התכונות הפונקציונליות שלהם. המטרה הסופית של מיון MSCs במחקר שלנו היא ליצור ניתוח השוואתי בין תת-האוכלוסיות שזוהו ולקבוע אם לביטויים הדיפרנציאליים של סמנים חיוביים יש השלכות תפקודיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

Acknowledgments

אנו מודים למתקן תאי הזרימה במרכז ג'וואהרלל נהרו למחקר מדעי מתקדם, בנגלור, הודו, על השימוש במתקן ליבת ציטומטריית הזרימה. החתך הקריו-חתך של תרבית הכדוריות של תאים ממוינים בוצע במעבדת הייחוס של נויברג אנאנד, בנגלור, הודו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון פנימי של UC מהאקדמיה להשכלה גבוהה Manipal (MAHE), הודו. AG אסירת תודה על תמיכתה במלגת ד"ר T. M. A. Pai מ- MAHE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue Stain HiMedia CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)  Gibco by ThermoFisher 15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set BD Biosciences 560497
BD FACS Accudrop Beads  BD Biosciences 345249 Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer BD Biosciences ---
BD FACS Diva 9.4 BD Biosciences ---
BD FACS Sheath Fluid BD Biosciences 342003 Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 BD Biosciences 561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560374 CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 BD Biosciences 562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555751 CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution BD Biosciences 564907 DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 BD Biosciences 555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555748 CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD Biosciences 555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749 CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 BD Biosciences 561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 550795 CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin BD Biosciences 550513
Bovine serum albumin Hi-Media  TC548-5G
Crystal violet Nice chemical pvt ltd  C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-aldrich   D5652-50L dPBS used for culture work and maintenance. 
Ethanol  --- --- Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum  Gibco by ThermoFisher  10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific  A-21422
KO-DMEM Gibco by ThermoFisher  10829018 Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x) Gibco by ThermoFisher 25030-081
Methanol, for Molecular Biology  Hi-Media  MB113
Oil red O HiMedia  CCK013-1KT
Paraformaldehyde  loba chemie 30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x) Gibco by ThermoFisher  15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) Invitrogen  R37110
Silver Nitrate HiMedia  MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate Chemport 10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm BD Biosciences 556291
Staining buffer  Prepared in MIRM  ---- It was prepared using 2% FBS in PBS 
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10410-01 Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10065-01 Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10064-01 Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10066-01 Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10069-01 Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100 Hi-Media  MB031
Trypan Blue  Gibco by life technologies  15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x Hi-media  TCL049
Tween-20  MERCK  9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
  3. Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
  4. McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
  5. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  6. Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
  7. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  8. Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
  9. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
  10. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
  11. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
  12. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
  13. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
  15. Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
  16. Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
  17. Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
  18. Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
  19. Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
  20. Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  21. Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
  22. Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
  23. Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
  24. FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 201 תאי גזע מזנכימליים SHEDs מיון תאים בודדים אימונופנוטיפ
מיון חד-תאי של תאי גזע מזנכימליים אימונופנוטיפיים משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, A., Mukhopadhyay, R.,… More

Gupta, A., Mukhopadhyay, R., Khandelwal, H., Nala, N., Chakraborty, U. Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. J. Vis. Exp. (201), e65723, doi:10.3791/65723 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter