Summary
Denne protokol beskriver brugen af fluorescensaktiveret cellesortering af humane mesenkymale stamceller ved hjælp af enkeltcellesorteringsmetoden. Specifikt kan brugen af enkeltcellesortering opnå 99% renhed af de immunofænotypede celler fra en heterogen population, når den kombineres med en multiparametrisk flowcytometribaseret tilgang.
Abstract
De mesenkymale stamceller (MSC'er) i en organisme besidder en ekstraordinær evne til at differentiere sig til flere linjer af voksne celler i kroppen og er kendt for deres immunmodulerende og antiinflammatoriske egenskaber. Brugen af disse stamceller er en velsignelse for området for regenerativ biologi, men samtidig en bane for regenerativ medicin og terapi på grund af de mange cellulære tvetydigheder, der er forbundet med dem. Disse tvetydigheder kan opstå som følge af mangfoldigheden i kilden til disse stamceller og deres in vitro vækstbetingelser, som begge afspejler deres funktionelle heterogenitet.
Dette garanterer metoder til at tilvejebringe rensede, homogene populationer af MSC'er til terapeutiske anvendelser. Fremskridt inden for flowcytometri har muliggjort påvisning af enkeltcellepopulationer ved hjælp af en multiparametrisk tilgang. Denne protokol skitserer en måde at identificere og rense stamceller fra humane eksfolierede løvfældende tænder (SHED'er) gennem fluorescensassisteret enkeltcellesortering. Samtidig ekspression af overflademarkører, nemlig CD90-fluoresceinisothiocyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofylprotein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC) og CD44-V450, identificerede de "lyse", positive ekspressorer af MSC'er ved hjælp af multiparametrisk flowcytometri. Imidlertid blev der observeret et signifikant fald i procentdele af firedobbelte eksprestorer af disse positive markører fra passage 7 og fremefter til de senere passager.
De immunfænotypede subpopulationer blev sorteret ved hjælp af enkeltcellesorteringstilstanden, hvor kun to positive og en negativ markør udgjorde inklusionskriterierne. Denne metode sikrede cellelevedygtigheden af de sorterede populationer og opretholdt celleproliferation efter sortering. Downstream-applikationen til en sådan sortering kan bruges til at evaluere afstamningsspecifik differentiering for de lukkede delpopulationer. Denne fremgangsmåde kan anvendes på andre enkeltcellesystemer for at forbedre isolationsforholdene og for at erhverve flere celleoverflademarkøroplysninger.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC'er) kan betragtes som en skalerbar kilde til celler, der er egnede til cellebaserede terapier og kan betragtes som et guldstandardsystem inden for regenerativ medicin. Disse celler kan isoleres fra en række forskellige kilder i kroppen med forskellig vævsoprindelse1. Afhængigt af deres kildevæv udviser hver type MSC en tvetydig in vitro-adfærd 2. Dette er godt observeret i deres morfologiske og funktionelle egenskaber3. Flere undersøgelser har vist intraklonal variation i dimensioner, herunder voksen vævsdifferentiering, genomisk tilstand og metabolisk og cellulær arkitektur af MSC 2,4.
Immunofænotypning af celler har været en almindelig anvendelse af flowcytometri til identifikation af stamceller, og dette blev brugt af International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) i 2006 til at ordinere en liste over minimale kriterier for at identificere celler som MSC'er. Det erklærede, at sammen med plastisk adhærens og evnen til at differentiere i tre slægter (osteogen, kondrogen og adipogen) in vitro, skal ≥95% af cellepopulationen udtrykke CD105, CD73, CD90, og disse celler skal mangle ekspressionen (≤2% positiv) af CD34, CD45, CD11b, CD14 og HLA-DR, målt ved flowcytometri5. Selvom MSC'erne blev defineret af et sæt biomarkører under ISCT's minimumskriterier, kunne deres immunegenskaber ikke benchmarkes med disse biomarkører, og der var behov for mere ud over disse kriterier for at gøre sammenligninger på tværs af studier og klonale variationer lettere at kvantificere2.
På trods af retningslinjerne fra ISCT har omfattende forskning i MSC'er vist, at heterogenitet findes i denne population, som kan opstå på grund af en lang række faktorer, hovedsageligt på grund af den allestedsnærværende karakter af heterogenitet, der opstår mellem MSC-donorer6, vævskilder7, individuelle celler inden for en klonal population8 og dyrkningsbetingelser2,9, 10. Karakterisering og oprensning af disse primære celler fra en række vævskilder for at sikre kvalitet og celleskæbne er vigtige trin i deres produktion. Behovet for at forstå de viste variationer blandt populationen kræver en effektiv metode til at omsætte det til delpopulationer, der kan opdeles og indsamles separat11. Analyser på enkeltcelleniveau hjælper med at overvinde udfordringerne ved celle-cellevariation, reducerer biologisk støj fra en heterogen population og giver mulighed for at undersøge og karakterisere sjældne celler12.
Baseret på formålet og valgte parametre kan flere metoder anvendes til at sortere og berige de udvalgte populationer. Cellesorteringsteknikker kan omfatte både bulksortering og enkeltcellesorteringsmetoder. Mens massesortering kan berige målgrupper gennem magnetisk aktiveret cellesortering (MACS)13, fraktionering 14 og elutriering 15, kan enkeltcellesortering berige mere homogene populationer ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)11. En sammenlignende analyse af hver af disse metoder med sit eget sæt fordele og ulemper er fremhævet i tabel 1.
Tabel 1: Komparative analyser af forskellige teknikker: MACS, fraktionering, elutriering og FACS, der fremhæver forskellene i deres princip og fordele og ulemper ved at vælge en bestemt teknik frem for en anden. Forkortelser: MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; FACS = Fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at downloade denne tabel.
Siden fremkomsten af teknikken har enkeltcelleflowcytometri spillet en vigtig rolle i optælling16, påvisning og karakterisering af en specifik cellepopulation i en heterogen prøve17. Hewitt et al. lagde i 2006 grunden til automatiserede cellesorteringsmetoder for at forbedre isoleringen af homogene puljer af differentierede humane embryonale stamceller (hESC'er)18. Enkeltcellesortering berigede populationen af GFP-transducerede hESC'er, hvilket lettede isoleringen af genetisk modificerede kloner, hvilket åbnede en ny dimension i klinisk forskning. For at forbedre sorteringseffektiviteten er der generelt valgt to tilgange; Enten ændres indsamlingsmediet for de sorterede populationer for at opretholde levedygtigheden og spredningen af postsorterede celler19 , eller også ændres cellesorteringsalgoritmen/softwaren på passende vis12.
Med teknologiens fremskridt har kommercielle flowcytometre og cellesorteringsanlæg været i stand til at hjælpe med at løse udfordringer, der blev mødt under aseptisk sortering af skrøbelige og sjældne cellepopulationer, især stamceller af forskellig oprindelse. En af stamcellebiologernes største udfordringer har været den klonale isolering af humane pluripotente stamceller efter transfektionsprotokoller, der kræves i genredigeringsstudier19. Dette blev løst ved at sortere enkeltceller i 96-brøndplader, der blev belagt med museembryonale fibroblaster (MEF'er) sammen med kosttilskud og kommercielle små molekyle ROCK-hæmmere. Imidlertid kunne celleisoleringsstrategier stort set raffineres ved brug af indekssortering, et træk ved sorteringsalgoritmen, der identificerer immunofænotypen af individuelle celler sorteret12. Denne raffinerede modalitet i enkeltcellesortering hjalp ikke kun med at forbedre sorteringseffektiviteten for stamceller, især med hensyn til sjældne hæmatopoietiske stamcellepopulationer, men også effektivt forbundet enkeltcellekloner til deres nedstrøms funktionelle assays20.
Dette papir fokuserer på enkeltcellesortering af immunofænotypede stamceller fra humane eksfolierede løvfældende tænder (SHED'er) til berigelse af underpopulationer for at studere deres funktionelle differentieringskapacitet. Ved hjælp af en kombination af to MSC-positive markører, CD90 og CD73, og en negativ hæmatopoietisk markør CD45, blev MSC'erne immunfænotypede, og dim- og null-ekspressorerne blev identificeret. Baseret på deres immunfænotype blev subpopulationerne identificeret som rene MSC'er, enkelt positive og dobbelt negative populationer. De blev sorteret ved hjælp af enkeltcellesorteringstilstanden for at opnå rene og berigede subpopulationer til yderligere funktionelle undersøgelser for at identificere, om differentiel ekspression af markører var en artefakt af in vitro-kulturbetingelser , eller om det også har nogen effekt på de funktionelle egenskaber. Celler, der ikke var homogene udtryksorer for de "positive MSC-markører", blev sorteret for at studere deres funktionelle egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkendelse og samtykke til at deltage: Human eksfolierede løvfældende tandmasseprøver blev modtaget efter at have opnået informeret samtykke og fuld etisk godkendelse af Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, i overensstemmelse med de standarder, der er fastlagt af Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Hvorefter isolering, dyrkning, vedligeholdelse og anvendelse af SHED'er blev godkendt af og i overensstemmelse med de retningslinjer, der blev anbefalet af Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) ved Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. Fremstilling af reagenser og buffere
- Til vedligeholdelse af kultur
- Forbered MSC-cellekulturmedier (10%) ved hjælp af basalmedium til udifferentierede hESC'er, 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin (Pen-strep) (tabel 2).
- Forbered MSC-cellekulturmedier (20%) ved hjælp af basalmedium til udifferentierede hESC'er, 20% FBS, 1% L-glutamin og 1% Pen-strep (tabel 2).
- Forbered neutraliserende medier ved hjælp af basalmedium til udifferentierede hESC'er, 1% L-glutamin og 1% antibiotika-antimykotisk (Anti-Anti) (tabel 2).
- Til flowcytometrisk analyse og sortering
- Forbered farvningsbuffer ved hjælp af 2% FBS i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Der fremstilles en stamopløsning af 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 μg/ml) ved tilsætning af 1 μl i 1 ml PBS
- Til afstamningsspecifik differentiering af MSC'er
- Forbered differentieringsmedier til osteogen, kondrogen og adipogen differentiering i henhold til sammensætningen beskrevet i tabel 3. De tilberedte delprøver opbevares ved 4 °C under hele forsøget.
- Forbered serum-sultede medier (2% medier) ved hjælp af basalmedium til udifferentierede hESC'er, 2% FBS, 1% L-glutamin og 1% Pen-strep (tabel 2).
| TYPE MEDIER | FORMÅL MED MEDIER | SAMMENSÆTNING TIL 50 ml | ||||||||
| FBS | Pen-Strep | L-glutamin | BASALMEDIUM TIL UDIFFERENTIEREDE HESC'er | |||||||
| 10% medier | MSC-kultur og vedligeholdelse | 5 ml | 500 μL | 500 μL | 44 ml | |||||
| 20% medier | CFU-F-analyse | 10 ml | 500 μL | 500 μL | 39 ml | |||||
| Serumsultne (2%) medier | Medier til kontrolbrønde i differentieringsprotokol | 1 ml | 500 μL | 500 μL | 48 ml | |||||
| Neutraliserende medier | Medier til neutralisering af cellesuspensionen efter trypsinisering | - | 500 μL | 500 μL | 49 ml | |||||
Tabel 2: Cellekulturmedier til vedligeholdelse og analyse af kulturer. Forkortelser: MSC = mesenkymal stamcelle; CFU-F = kolonidannende enhedsfibroblast.
| KOMPONENTER | OSTEOGENE MEDIER | KONEDROGENE MEDIER | ADIPOGENE MEDIER |
| Basal medier | 90 ml | 90 ml | 90 ml |
| Induktionsmedier | 10 ml | 10 ml | 10 ml |
| Samlet volumen | 100 ml | 100 ml | 100 ml |
Tabel 3: Differentieringsmedier til trilineagedifferentiering af SHED'er.
2. Kultur og vedligeholdelse af skure
- Vedligehold celler i 10 % MSC-kulturmedier, og udfør medieskift hver 2. dag eller efter behov.
- Trypsiniser celler ved 95% sammenløb ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA.
- Neutraliser celler efter trypsinisering ved hjælp af neutraliserende medier.
- Centrifuger røret ved 300 × g i 6 minutter ved stuetemperatur for at opnå en cellepille.
- Supernatanten dekanteres, og cellepelletsen resuspenderes i 10 % MSC-dyrkningsmedier.
- Frøceller i frisklavede cellekulturskåle indeholdende 10% MSC-kulturmedier til yderligere forsøg eller subdyrkning.
BEMÆRK: Optimal såtæthed for SHEDs er 0,2 × 10 6 celler i en 100 mm skål og 0,8 × 10 6 celler i en T-75 kolbe for at opnå henholdsvis 1,5 × 10 6 celler og 4 × 10 6 celler ved 90-100% sammenløb.
3. Karakterisering af MSC'er
- Kortsigtet cellevækstanalyse
- Frø 4 × 104 celler/brønd i tre eksemplarer til 6-brøndsplader i 10% MSC-kulturmedier.
- Pladerne inkuberes i 7 dage ved 37 °C, og der foretages medieskift hver 2. dag.
- Høst cellerne på dag 2, 4 og 8 ved hjælp af 0,25% trypsinbehandling og vask med dyrkningsmedier.
- Centrifuger cellerne ved 300 g i 6 minutter ved stuetemperatur og resuspender pellet i 1 ml medie.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og bestem deres levedygtighed ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode.
- Spredningshastigheden beregnes ved hjælp af ligning (1):
(1)
- Kolonidannende enhedsfibroblast (CFU-F) assay
- Frø 10.000 celler i en 100 mm skål og dyrk dem i 20% MSC kulturmedier.
- Pladerne inkuberes i 14 dage ved 37 °C, og der foretages medieskift hver 3. dag.
- Efter 14 dage skylles kolonierne med PBS, fastgøres med krystalviolet farvestof i methanol og skylles igen med PBS for at fjerne den resterende plet.
- Tæl og billede kolonierne.
BEMÆRK: Tæl kolonier med >50 celler. Kolonidannende effektivitet beregnes som kolonidannende enhedsnumre.
- Immunofluorescensanalyse
- Frø MSC'erne på 35 mm skåle og lad dem vokse indtil 80-90% sammenløb.
- Fjern mediet og skyl opvasken med PBS én gang.
- Cellerne fikseres med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) ved enten at inkubere i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Efter fiksering vaskes brøndene med PBST i 3 x 5 minutter på vipperen.
- Tilsæt 0,3% Triton X-100 i PBST (0,05% Tween 20 opløsning i PBS) til permeabilisering af cellerne. Opbevar den på vipperen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vask brøndene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsæt 3% bovin serumalbumin (BSA) til blokering og opbevar det på vippen i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask brøndene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Der tilsættes 800 μL 1:500 fortynding af anti-vimentin fra mus, opbevares på vipperen i 1 time ved stuetemperatur, og pladen overføres til 4 °C til inkubation natten over.
- Næste dag fjernes det primære antistof og vaskes med PBST i 3 x 5 minutter på vippen.
- Tilsæt 800 μL 1:1.000 fortynding af gede-anti-mus IgG (H + L) krydsadsorberet sekundært antistof, Alexa Fluor 555, og opbevar det i 3 timer ved stuetemperatur på vipperen.
- Vask brøndene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsæt Alexa fluor 488 Phalloidin Sonder 240 μL i 1.000 μL PBS og inkuber ved stuetemperatur i 60 minutter på vipperen.
- Vask brøndene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsæt 700 μL DAPI-monteringsmiddel og observer cellerne under et mikroskop.
- Afstamningsspecifik differentiering
- Differentiering efter 2D-kultur
- Tag to 48-brøndplader og mærk dem som henholdsvis osteogene og adipogene slægter.
- Der sås 15.000 celler/brønd i fire brønde på hver plade, og kulturér dem i 10 % MSC-kulturmedier.
- Når monolaget af celler har nået 90% sammenløb, mærkes de to første brønde som 'Control' og erstattes af de eksisterende medier med serum-sultede medier (2% medier). I de sidste to brønde mærket som 'Test' tilføjes differentieringsmedier af en af de to slægter, adipogene eller osteogene. Markér dette som dag 0.
- Udskift forsigtigt medier hver tredje dag for at omgå skrælning og pas på at undgå forurening.
- Oprethold disse forhold indtil den enogtyvende dag; Behandl derefter til farvningseksperimentet.
- Differentiering efter 3D-kultur
- Tag to 15 ml rør til udførelse af kondrogen differentiering ved hjælp af 3D-pelletkultur.
- Overfør 1 × 10 6 celler til hvert rør og centrifuger ved 300 × g i6 minutter for at danne en pellet. Mærk et rør som 'Control' og tilføj 10% MSC-kulturmedier til det; mærk det andet rør som 'Test' og tilføj kondrogene differentieringsmedier. Placer rørene forsigtigt i inkubatoren med deres hætter løst skruet. Markér dette som dag 0.
- Skift mediet forsigtigt hver tredje dag for ikke at løsne / opløse pelleten under medieskift.
- Oprethold disse betingelser indtil den enogtyvende dag, og behandl derefter cellerne til yderligere eksperimenter.
- Differentiering efter 2D-kultur
- Afstamningsspecifik cytokemisk farvning
- Til 2D-kulturer anvendes de differentierede (test) og udifferentierede MSC-plader (kontrolplader) (fra trin 3.4.1.5.) til farvning, og mediet fjernes først, og der vaskes to gange med PBS. Cellerne fikseres med 4 % PFA i 30 minutter ved stuetemperatur, supernatanten fjernes og vaskes én gang med PBS. Udfør farvning for hver slægt som følger.
- Til adipocytafstamning tilsættes permeabiliseringsopløsning fra sættet og inkuberer pladen i 5 minutter ved stuetemperatur. Forbered og tilsæt 1 ml olie rød O arbejdsløsning og opbevar den i 10 min. Fjern pletten og giv fem vaske med destilleret vand.
- Til osteocytafstamning tilsættes 5% frisklavet sølvnitrat (i destilleret vand) til hver brønd og holder pladen under UV i 1 time. Fjern opløsningen og tilsæt 2,5% natriumthiosulfat for at fjerne det ureagerede sølv; Opbevar det i 5 min. Fjern pletten, vask to gange med destilleret vand, og observer de farvede celler under et mikroskop.
- For 3D-kulturer opsamles pellet efter afslutningen af differentieringsperioden fra trin 3.4.2.3 og opnås kryosektioner af det differentierede væv i form af pelleten. Lad gliderne lufttørre og være ved stuetemperatur, inden du fortsætter til farvningen.
- For kondrocytafstamning skal du følge anvisningerne i farvningssættet for at tilføje et tilstrækkeligt volumen vaskeopløsning, fjerne det, tilføje fastgørelsesopløsningen og inkubere i 30 minutter. Vask med destilleret vand, tilsæt farvningsopløsningen og inkuber i 30 min. Vask tre gange med 0,1 N saltsyre; Tilsæt destilleret vand for at neutralisere surhedsgraden. Overhold de farvede celler under et brightfield-mikroskop.
- Til 2D-kulturer anvendes de differentierede (test) og udifferentierede MSC-plader (kontrolplader) (fra trin 3.4.1.5.) til farvning, og mediet fjernes først, og der vaskes to gange med PBS. Cellerne fikseres med 4 % PFA i 30 minutter ved stuetemperatur, supernatanten fjernes og vaskes én gang med PBS. Udfør farvning for hver slægt som følger.
(1)4. Farvning af celleoverflade til immunofænotypning
BEMÆRK: Anbefalede cellekulturplader til at få et optimalt antal celler i trin 4.2-4.5 er 100 mm skåle eller T75-kolber.
- Celleforberedelse til flowcytometriske eksperimenter
- Trypsinize og opsaml cellerne fra en sammenflydende skål / kolbe og centrifuger ved 300 × g i 6 minutter for at opnå cellepellet.
- Resuspender pellet i 1 ml medier og bestem det levedygtige celletal ved hjælp af et hæmocytometer efter trypanblå udelukkelsesmetoden.
- Centrifuger cellesuspensionen igen efter tælling, og giv yderligere to vaske til pelleten med 1 ml farvningsbuffer.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes til sidst i en passende mængde af farvningsbufferen afhængigt af protokollen (se trin 4.2 til 4.5).
- Forberedelse af kompensationskontrol
- Tag syv FACS-rør og mærk dem som Ufarvede, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 og APC.
- Resuspender den endelige pellet i farvningsbufferen (se trin 4.1.) og hold en celletæthed på 0,5 × 10,6 celler pr. 50 μL pr. rør for ufarvede og DAPI-rør.
- Forbered de enkeltfarvede rør til kompensation som beskrevet i tabel 4.
- Forsigtigt hvirvel hvert rør efter tilberedning og inkuber i mørke i 30 min.
- Efter inkubation gives to vaske ved at tilsætte 1 ml farvningsbuffer til hvert glas, efterfulgt af kort hvirvelstrøm og centrifugering ved 200 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, pelletpen resuspenderes i 500 μl farvningsbuffer, og den sættes til side indtil erhvervelsen.
- For DAPI-røret udføres varmechokbehandling ved at inkubere det i et 60 °C vandbad i 5 minutter efterfulgt af 15 minutter på is. Tilsæt 5 μL DAPI til suspensionen, og hold den i mørke indtil kørslen.
- Fremstilling af fluorescens minus en (FMO) kontrol
- Den endelige pellet resuspenderes i farvningsbuffer (se trin 4.1) og holder en celletæthed på 0,5 × 106 celler pr. 50 μL for hvert rør.
- Tag fem FACS-rør, og mærk dem som CD44-V450-isotype, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5-isotype og CD105-APC-isotype.
- Klargør celle- og antistofsuspensionen i henhold til tabel 5.
- Vortex rørene forsigtigt og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Efter inkubation gives to vaske med 1 ml farvningsbuffer til hvert glas efterfulgt af kort hvirvelstrøm og centrifugering ved 200 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, pelletpen opslæmmes igen i 500 μL farvningsbuffer, og den sættes til side, indtil den opsamling.
- Forberedelse af prøver til analyse
- Den endelige pellet resuspenderes i farvningsbufferen (se trin 4.1) og holdes med en celletæthed på 0,5 × 106 celler pr. 50 μL for hvert glas.
- Tag to FACS-rør og mærk dem som blandede rør 1 og 2.
- Klargør celle- og antistofsuspensionen i henhold til tabel 6.
- Vortex rørene forsigtigt og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Efter inkubation gives to vaske med 1 ml farvningsbuffer til hvert glas efterfulgt af kort hvirvelstrøm og centrifugering ved 200 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, pellets resuspenderes i 500 μl farvningsbuffer og sættes til side, indtil det anskaffes.
- Forberedelse af prøver til enkeltcellesortering
- Tag to FACS-rør, tilsæt 1 ml FBS, og rul røret rundt, indtil der dannes et jævnt lag FBS på indersiden af hvert rør. Inkuber dette i 1-2 timer, mens prøven behandles til farvning. Mærk disse rør som blandede rør 1 og 2.
- Den endelige pellet resuspenderes i farvningsbufferen (se trin 4.1) og holdes med en celletæthed på 2-3 × 106 celler pr. 50 μL for hvert glas.
- Klargør celle- og antistofsuspensionen i blandede rør 1 og 2 i henhold til tabel 7.
- Vortex rørene forsigtigt og inkuber dem i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Efter inkubation gives to vaske med 1 ml farvningsbuffer til hvert glas efterfulgt af kort hvirvelstrøm og centrifugering ved 200 g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, pelletpen resuspenderes i 500 μl farvningsbuffer, og den sættes til side. Tilsæt 5 μL DAPI 15 min før sortering.
BEMÆRK: Bemærk, at til sorteringseksperimenter anbefales højere celletæthed pr. Rør.
| Tube type | Positive Comp perler* | Negative Comp perler* | Celler | Antistof tilsat | |
| FITC-rør | 1 dråbe | 1 dråbe | – | Anti-human CD90-FITC (2 μL) | |
| V450 rør | 1 dråbe | 1 dråbe | – | Anti-human CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5,5 rør | 1 dråbe | 1 dråbe | – | Anti-human CD73-PerCP Cy 5,5 (2 μL) | |
| PE-rør | 1 dråbe | 1 dråbe | – | Anti-human CD45-PE (2 μL) | |
| APC-rør | 1 dråbe | 1 dråbe | – | Anti-human CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI-rør | – | – | 50 μL | – | |
| Ufarvet rør | – | – | 50 μL | – | |
| *1 dråbe= 60 μL perleophæng | |||||
Tabel 4: Kompensationskontrolprøver. Forkortelser: Comp = kompensation; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyl-protein.
| TUBE TYPE | ANTISTOF MOD POSITIV MARKØR (2 μL) | ANTISTOF MOD NEGATIV MARKØR (2 μL) | ISOTYPE ANTISTOFFER TILSAT (2 μL) | SAMLET VOLUMEN AF ANTISTOFFER | VOLUMEN TILSAT CELLESUSPENSION | MÆNGDE TILSAT FARVNINGSBUFFER | ||
| CD90-FITC FMO-rør | - Anti-human CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | FITC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD73 PerCP Cy 5,5 | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO-rør | - Anti-human CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | PerCP Cy 5,5 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO-rør | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | V450 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5,5 | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO-rør | - Anti-human CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | APC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5,5 | ||||||||
| CD45-PE FMO-rør | - Anti-human CD44-V450 | - | PE IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5,5 | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
Tabel 5: FMO-kontrolprøver. Forkortelser: FMO = fluorescens minus en; FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyl-protein.
| TUBE TYPE | ANTISTOF MOD POSITIV MARKØR (2 μL) | ANTISTOF MOD NEGATIV MARKØR (2 μL) | SAMLET VOLUMEN AF ANTISTOFFER | VOLUMEN TILSAT CELLESUSPENSION | MÆNGDE TILSAT FARVNINGSBUFFER | |
| Blandet rør 1 | - Anti-human CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||
| Blandet rør 2 | - Anti-human CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||
Tabel 6: Prøveglas til flerfarvet immunofænotypning af SHED'er. Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humant eksfolieret løvfældende tænder; PE = phycoerythrin.
| TUBE TYPE | ANTISTOF MOD POSITIV MARKØR (3 μL) | ANTISTOF MOD NEGATIV MARKØR (3 μL) | SAMLET VOLUMEN AF ANTISTOFFER | VOLUMEN TILSAT CELLESUSPENSION | MÆNGDE TILSAT PLETBUFFER | |
| Blandet rør 1 | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Blandet rør 2 | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tabel 7: Enkeltcelle sorteringsreaktionsrør. Forkortelser: FITC = fluoresceinisothiocyanat; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyl-protein.
5. Sortering af enkeltceller
- Fremstilling af cellesortering
- Installer en 100 μm dyse i sorteren.
BEMÆRK: Den passende dyse er mindst fem gange diameteren af den partikel, der skal sorteres. Den kappevæske, der skal anvendes til sortering, skal afgøres på grundlag af prøvetypen og eksperimentets følsomhed. Til dette eksperiment er proprietær kappevæske blevet brugt. - Udfør den daglige instrumentkvalitetskontrol (QC), og opsæt sorteringsenheden til eksperimentet. Se instrumentmanualen for en detaljeret vejledning til instrumentopsætning.
- Installer en 100 μm dyse i sorteren.
- Opsætning af kompensationsmatrixen
- Indstil kompensationsmatrixen ved hjælp af enkeltpletkompensationsrør fra trin 4.2.
- I den proprietære software skal du vælge Eksperiment fra værktøjslinjen og klikke på Kompensationsopsætning. Åbn Opret kompensationskontrolelementer.
- Kontroller markørerne, og bekræft. En ny prøve tilføjes med navnet "Kompensation", hvorunder nye rør navngivet markørkontrollerne tilføjes automatisk af softwaren.
- Vælg det ubesmittede rør, og kør det for at registrere 5.000 hændelser. Træk porten til populationen af celler, og anvend den på alle kompensationskontroller. Dette er for at indstille spændingerne og den negative port for hver fluorescerende parameter.
- På samme måde skal du indlæse enkeltpletkompensationsrørene separat og registrere og gemme dataene. Vælg den port, der afgrænser populationen af interesse, og anvend på alle kompensationskontroller. Dette er for at indstille de positive porte for hver fluorescerende parameter.
- Vælg Eksperiment fra værktøjslinjen, og klik på Beregn kompensationsværdier | link og gem.
BEMÆRK: Når auto-comp-matrixen er genereret ved hjælp af softwaren, kan spændingsparametrene for fluorkromerne ikke ændres for nogen af kanalerne i de blandede rør.
- Dataindsamling
- Optag 10.000 celler i hvert rør fra trin 4.3. og 4.4 at indsamle data til analyse af cellernes immunfænotype.
- Klargøring af opsamlingsanordningerne
- Afhængigt af formålet med de sorterede cellepopulationer skal du vælge mellem 6-brønds-, 24-brønds-, 48-brønds- eller 96-brøndplader.
- Overtræk brøndene med 200-500 μL FBS og hold pladerne uforstyrret i 2 timer.
- Efter 2 timer fjernes det resterende FBS, og der tilsættes 200-500 μL 10 % MSC-kulturmedier.
- Cellesortering i enkeltcellesorteringstilstand
- Kør blandet rør 1 (fra trin 4.5), og registrer 10.000 hændelser for at indstille portene til den population af interesse, der skal sorteres, ved hjælp af den relevante gating-strategi.
- Ilæg en opsamlingsplade, og angiv målcellenumre mellem 2.500 og 5.000 celler/brønd , og vælg renhedsmasken til sortering med en celle.
- Saml de sorterede populationer i indsamlingsenheden, og hold dem på is indtil afslutningen af sorteringseksperimentet.
- Når det er gjort, overføres pladerne til 5% CO2 -inkubatoren for at opretholde kulturerne ved 37 ° C.
BEMÆRK: Efter overtagelsen blev rådatafiler eksporteret som .fcs-filformat (v.3.0. og fremefter). De sorteringsrapporter, der blev genereret efter hvert eksperiment, registrerede antallet af hændelser/celler sorteret pr. tildelt brønd og angav antallet af konflikter, der blev afbrudt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHED'erne blev karakteriseret med standard immunofluorescensassays, der viste ekspressionen af vimentin (røde, type III mellemliggende filamenter), actinfilamenter (Alexa fluor 488 Phalloidin-prober) og kerner farvet med DAPI (figur 1A). For at estimere deres proliferative og kolonidannende kapacitet blev standard kortsigtede cellevækstassays udført. En 14,3 gange stigning i spredningshastigheden fra dag 2 til dag 8 er vist i figur 1B. SHEDs klonogene egenskaber blev bestemt ud fra CFU-F-assays vist i figur 1C-E. I henhold til ISCT-kriterierne var de multipotente MSC'er i stand til at differentiere sig til de tre mesodermale afledte slægter. Cytokemisk farvning med Oil Red O blev brugt til at detektere oliedråberne i de differentierede adipocytter (figur 1F); von Kossa-farvning blev brugt til at plette calciumaflejringerne, der findes i matrixen af de differentierede osteoblaster (figur 1G); og aggrekanerne i 3D-kulturen blev farvet for Alcian Blue i de differentierede chondroblaster (figur 1H).
For at karakterisere immunofænotypen af SHED'erne blev multiparametriske flowcytometriassays indstillet. Eksperimenterne blev udført sammen med brugen af fire typer eksperimentelle kontroller, nemlig kompensationskontrol (tabel 4), FMO- og isotypekontrol (tabel 5) og uplettede kontroller. Isotyperne af alle de anvendte MSC- og HSC-antistoffer blev tilføjet sammen med FMO-rørene for at skelne positive versus negative signaler og høj versus svag antigenekspression. Figur 2A viser fordelingen af FMO- og isotypekontrollerne anvendt pr. eksperiment. De repræsentative tæthedsdiagrammer viste ingen ekspression af FITC-isotypen af CD90 FITC-antistoffer. På samme måde sammenlignede histogramoverlejringerne (figur 2B) ekspressionsniveauerne for de farvede prøver sammen med deres kontroller i de respektive kanaler FITC, PerCP Cy5.5 og PE. Positiv ekspression af markørerne CD90 og CD73 (røde histogrammer) og negativ ekspression af CD45 er sammenlignelige med deres ufarvede og FMO-kontroller (henholdsvis blå og sorte histogrammer).
Flowcytometribaseret karakterisering af immunfænotyperne har vist markørfordelingen fra en af de tidlige passager (P6) SHED'er (figur 3A-H). Både de ISCT-anbefalede markører og CD44 bestemte moderpopulationerne som MSC'er. Den tetra-positive population demonstreret i tæthedsdiagrammerne viste ≥98% ekspression af CD90+CD73+CD105+CD44+ og ≤2% ekspression af CD45 markører. Mere end fem uafhængige eksperimenter viste lignende resultater. De sene passageskure (P12), som viste differentiel ekspression af de positive markører, blev valgt til enkeltcellesortering af høje og svage ekspressorer (figur 4A-H). Efter gating-strategien (figur 4H) blev singlets→ Live-celler→ ikke-HSC'er→ dobbeltpositive CD73+CD90+ og enkeltpositive CD73+CD90-populationer sorteret ved hjælp af enkeltcellesorteringstilstanden. De sorterede populationer blev indsamlet i 96-brønd/48-brønd/6-brønds pladelayout med forskellige såtællinger pr. brønd (supplerende fil 1). Tre på hinanden følgende forsøg blev foretaget i en enkelt fase af sorteringseksperimenter, og overlevelsesevnen for celler efter sortering (i de dobbeltpositive ekspressorer: CD90 + CD73+) pr. eksperiment var 100%. Tre uafhængige faser af eksperimenter er blevet gennemført. Vi matchede antallet af celler, der voksede pr. brøndpostsortering, med antallet af celler sorteret pr. brønd.
Figur 5A viser, at CD90+CD73+ postsorterede celler indsamlet i 96-brøndpladen viste vedhæftning og spredning ligesom deres moderpopulation. De sorterede celler er blevet observeret for at nå 70-80% sammenløb på den sjette dag efter sortering. De klæbende og prolifererende postsorterede celler blev differentieret i nærvær af adipogene vækstfaktorer og derefter farvet efter dag 15 med Oil Red O ved hjælp af passende postsorterede kontrolceller (udifferentierede) celler (figur 5B, C).
Figur 1: Karakterisering af stamceller fra humane eksfolierede løvfældende tænder. (A) Immunofluorescensfarvning bekræfter, at de isolerede MSC'er udtrykker vimentin (røde, type III mellemliggende filamenter), actinfilamenter (Alexa fluor 488 Phalloidin-sonder) og DAPI (blå, kerner). Fotomikrografi opnået ved original forstørrelse på 20x. Skalabjælke = 10 μm. (B) Korttidscellevækstanalyse af SHED'er udviser deres høje proliferative kapacitet, som observeret ved den signifikante stigning i antallet af celler i kultur på dag 2 og en 14,3 gange stigning i spredningshastigheden ved slutningen af dag 8 (n = 3, p-værdi <0,01). Standardafvigelsesfejlbjælker er blevet vist. (C-E) CFU-F-analyse og krystalviolet farvning bekræfter kolonidannende evne til skure; C) flere kolonier forventes at blive dannet efter 14 dage i kultur D) en enkelt klonogen koloni fra en enkelt celle (E) Krystalvioletfarvet enkeltkoloni af SHED'er viser cellernes typiske fibroblastlignende morfologi. (F-H) MSC'er under passende in vitro-betingelser forventes at gennemgå differentiering i adipogene, osteogene og kondrogene afstamninger på dag 21. Cytokemisk farvning viser (F) Oil Red O (indsats viser 40x billede af adipocyt, der viser oliedråber), (G) von Kossa og (H) Alcian Blue-farvning for henholdsvis adipogene, osteogene og kondrogene slægter på dag 22. Fotomikrografier opnås ved en original forstørrelse på 20x. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: MSC'er = mesenkymale stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; SKUR = stamceller fra humane, eksfolierede løvfældende tænder; CFU-F = kolonidannende enhedsfibroblast. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Negative kontroller anvendt i multiparametrisk eksperiment . (A) Fluorescens Minus One-kontroller er blevet vist i tabelform, hvor FMO-kontroller er blevet erstattet af deres specifikke isotyper. De repræsentative tæthedsplots (venstre mod højre) viser den ufarvede kontrol (venstre), FMO for CD90 FITC (midten) med alle tilsatte antistoffer undtagen CD90 FITC sammen med tilføjelsen af CD90 FITC-isotype og fuldt farvet prøve med alle antistoffer i panelet tilsat (højre). (B) Histogramoverlejring repræsenterer sammenligningen af tre typer prøver, sort repræsenterer FMO, blå repræsenterer ubefarvet, og rød repræsenterer fuldt farvede prøver i deres respektive kanaler. Forkortelser: FMO = fluorescens minus en; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PerCP = peridinin-klorofylprotein; PE = phycoerythrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Multiparametrisk immunofænotypning af SHED'er (P6). (A) SSC-A versus FSC-A: Baseret på deres side- og fremadrettede spredningsegenskaber er celler af interesse lukket og adskilt fra affaldet; (B) FSC-H versus FSC-A og (C) SSC-H versus SSC-A:De to plots anvendes til dobbelt diskrimination, hvilket gør det muligt at vælge singlets, samtidig med at aggregater, der kan generere falske positive signaler, elimineres; (D) SSC-A versus CD45 PE: Udelukkelse gating tillader udvælgelse af CD45-populationen fra singlets; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 versus CD90 FITC: Fra CD45- levende singlets er CD90 + CD73 + celler gated; (F) CD44 V450 versus CD105 APC: CD90+CD73+-populationen er yderligere lukket for at definere de tetra-positive CD90+CD73+CD44+CD105+-celler; (G) SSC-A versus tid(er): Plottet viser den stabile erhvervelse over tid (sekunder), og at ingen begivenheder forårsagede trykudsving under erhvervelsen; (H) Gating hierarki. Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humant eksfolieret løvfældende tænder; FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofylprotein; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; FSC-H = fremadrettet spredningstophøjde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Enkeltcellesortering af immunfænotypede SHED'er (P12). (A-F) En trinvis udelukkelsesbaseret gating-strategi til sortering af rene MSC'er i følgende sekventielle rækkefølge: Celler til singlets_1, til singlets_2, til DAPI-levende celler, til CD45- ikke-hæmatopoietiske celler og endelig til CD90+CD73+ celler. De lukkede populationer, der er vist i (F), blev sorteret ved hjælp af enkeltcellesorteringstilstand. G) Diagrammet SSC-A versus Time(s) beskriver den uafbrudte sortering af prøverne. (H) Gating hierarki. (n=3, sorteringseffektivitet = 100%). Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humant eksfolieret løvfældende tænder; MSC'er = mesenkymale stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofylprotein; SSC-A = side scatter-peak område. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Morfologisk og funktionel karakterisering af postsorterede skure. (A) Fasekontrastbilleder af postsorterede populationer blev indsamlet i en 96-brønds plade på dag 6 ved en oprindelig forstørrelse på 10x, skalabjælke = 10 μm (indsat viser et 20x billede, der viser de sorterede enkeltceller, der ændrer morfologi til fibroblastlignende MSC'er). Cytokemisk farvning til adipogen differentiering ved anvendelse af Oil Red O observeret i (B) udifferentieret (kontrol) og (C) differentieret postsorteringspopulation ved en oprindelig forstørrelse på 20x, skalabjælke = 10 μm (indsatsen viser et 40x billede, der viser de observerede oliedråber). Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humane eksfolierede løvfældende tænder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Kompilerede sorteringsrapporter genereret pr. eksperiment. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Optisk konfiguration af BD FACSAria Fusion. Forkortelser: LP = langt pas; PMT = fotomultiplikatorrør; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyl-protein. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inden for vævsteknik og regenerativ medicin har orale vævsafledte MSC'er blandt de postnatale kilder tiltrukket sig stor interesse på grund af deres minimale etiske forpligtelser og bemærkelsesværdige multilineagedifferentieringspotentiale21. Tandmassestamceller (DPSC'er) fra de påvirkede tredje molære og SHED'er har fået mest opmærksomhed blandt dentale MSC'er for deres terapeutiske potentiale i neurodegenerative og traumatiske sygdomme22. Protokollen beskrevet i dette manuskript hjælper med at karakterisere SHED'er ved hjælp af en multiparametrisk tilgang og yderligere sortere populationer af interesse ved hjælp af enkeltcellesorteringsmetoden. Anvendelsen af denne protokol er imidlertid ikke kun begrænset til orale MSC'er, men kan også anvendes til immunofænotypebestemmelse og sortering af MSC'er fra andre kildevæv i menneskekroppen23.
Flere kritiske trin i denne protokol skal diskuteres her for dens vellykkede gennemførelse af det biologiske problem, der behandles. Nøglen til enhver sorteringsprotokol er at kontrollere to vigtige komponenter: dens biologiske kontrol og den eksperimentelle kontrol. Til at begynde med sikrer vedligeholdelse af ren kultur, at den anvendte prøve ikke kompromitteres, mens den sorteres. Cellelevedygtigheden i forsorteringen af enkeltcellesuspensionen skal sikre, at der startes mere end 70 % levedygtige cellepopulationer efterfulgt af analyse og sortering af sunde delpopulationer. Pletbufferen, der anvendes i enkeltcellesuspensionen, skal indeholde 2% FBS, og eksperimenter udføres bedst ved stuetemperatur. Valg af den korrekte sammenløb af disse primære celler (80-85% sammenløb) undgår at kompromittere deres cellelevedygtighed og reducerer chancerne for store aggregater. Derudover er brugen af en levende / død markør (DAPI i denne protokol) afgørende for hvert sorteringseksperiment. I denne undersøgelse, da de anvendte prøver var MSC'er med en omtrentlig diameter på 20-35 μm, var den valgte dysestørrelse 100 μm for at sortere dem ved et tryk på 20 psi på BD FACSAria Fusion. Dette tillod cellesortering uden at gå på kompromis med cellelevedygtigheden under processen ved lavere kappetryk. For detaljerede sorteringsopsætningsbetingelser anbefales det at se softwaren BD FACSDiva guide24.
En væsentlig forudsætning for flerfarvede eksperimenter i flowcytometri er behovet for passende kontroller; der er fire hovedtyper af kontroller, der anvendes her: autofluorescens, isotyper, FMO og kompensationskontrol. Autokompensationsmatrixen tillod nøjagtig kompensation, hvilket forhindrede spektral gennemblødning i detektorerne og brugte både kompensationsperler og celler til dette formål. Den ufarvede prøve fastsatte tærsklen for autofluorescens af MSC'erne. De blandede rør med alle fire antistoffer inkluderer isotypen og FMO'erne for hvert anvendt antistof. DAPI-kompensationskontrol blev udført ved hjælp af MSC'er, som blev behandlet separat (med varmechok). Antistofpanelet (som angivet i tabel 8), der anvendes her, er specielt designet til hMSC'er baseret på kriterierne angivet af ISCT og instrumentkonfigurationen af BD FACSAria Fusion-cellesortereren (se supplerende tabel S1). Dette er meget afgørende under planlægningen af multiparametriske flowcytometrieksperimenter. Karakteriseringspanelet, der anvendes til immunofænotypning, består af fire positive MSC-markører (CD90, CD105, CD73 og CD44) og en negativ markør (CD45). I modsætning hertil indeholder panelet til sorteringseksperimentet to positive markører (CD90 og CD73), en negativ markør (CD45) og en levende/død markør (DAPI) for at sikre et højt antal levende MSC'er.
| Antistof/markør | Fluorochrom | hMSC Surface Profil | Laserbølgelængde (nm) | Excitation peak (nm) | Emissionstop (nm) |
| CD44 | V450 | Skal udtrykke; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 | FITC | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 | PE | Bør IKKE udtrykke; <2% | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Markør for døde celler | 405 | 358 | 461 |
Tabel 8: Flerfarvet panel designet til karakterisering og sortering af SHED'er ved flowcytometri. Forkortelser: FITC = fluoresceinisothiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyl-protein.
Valg af sorteringsrenhedsmaske
I betragtning af uforudsigeligheden af cellulær heterogenitet i MSC'er opnår bulksortering ikke nødvendigvis renhedsniveauet blandt de sorterede populationer. Vi optimerede enkeltcellesorteringsprotokollen i denne undersøgelse for at identificere enkeltcellekloner og spore deres funktionelle egenskaber efter sortering med hensyn til styrke. Enkeltcellesortering blev udført på en BD FACSAria Fusion, som havde fleksibiliteten i følgende indstillinger: valg af 100 μm dyse, 20 psi kappetryk, en strømningshastighed, der kan justeres (opretholdes ved 20 μL / min) og tærskelhastighed ved 380 hændelser / s. Chancerne for at vælge to målceller i stedet for en er minimale i denne metode. Normalt vælges algoritmens enkeltcellesorteringstilstand, der kan løse sorteringen af rene populationer af målceller og overveje, hvor mange dråber der skal sorteres i den valgte indsamlingsenhed. Precision-tilstanden skal i sidste ende vælges nøjagtigt, så den kan kombinere de masker, der er tilgængelige i sorteringsalgoritmerne, og skabe en streng sorteringsbetingelse for at sortere de reneste populationer af interesse. Enkeltcellesorteringstilstand går ikke på kompromis med en målcelle, hvis den aggregeres til en ikke-målcelle under sortering, og det opnår det renhedsniveau, vi ser frem til i denne tilgang. Dette var modulet valgt i denne protokol, og de sorterede celler blev samlet i 96-brønds-, 48-brønds-, 24-brønds og 6-brønds pladeenheder.
I dette studie sorterede vi subpopulationer baseret på deres differentiale immunfænotype, nemlig CD90+CD73+CD45-. I både karakteriserings- og sorteringsprotokoller har vores gating-strategi (som vist i figur 3 og figur 4) været baseret på udelukkelse fra CD45-populationen for at give os den ikke-hæmatopoietiske population (da disse er blevet valideret og karakteriseret forud med ISCT-foreskrevne markører) efter identifikation af singlets. Til sidst blev MSC'erne identificeret fra CD45-populationen ved hjælp af de positive ISCT-markører. Det er værd at bemærke her, at der ikke er meget forskel i procenter i først gating de positive udtryksorer af ISCT-markører efterfulgt af de negative udtryksorer af CD45. Men da formålet med denne sortering har været at identificere celler, der viser ændret ekspression af de kendte MSC-markører, har vi afsluttet vores analyse med de positive ekspressionsplot.
I de repræsentative tal er 97% af CD45-cellerne MSC'er , men under kvantificering af antigenekspressionerne har vi set, at 75% af cellerne er dobbeltpositive ekspressorer af de to markører CD90 og CD73, mens der er flere populationer, der er enkeltpositive eksprestorer af de samme markører (vist i figur 3F) og få celler, der slet ikke udtrykker markørerne.
Under karakteriseringen af disse celler har vi identificeret subpopulationerne som tetra-positive MSC'er, triple-positive og dobbelt-negative populationer. Dette differentielle udtryk for MSC-markører udvides med stigende passager, og dermed kommer behovet for at studere og korrelere denne forskel med deres funktionelle egenskaber. Det ultimative formål med at sortere MSC'er i vores undersøgelse er at skabe en komparativ analyse mellem de identificerede subpopulationer og afgøre, om differentialudtrykkene for positive markører har funktionelle implikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.
Acknowledgments
Vi takker flowcellefaciliteten ved Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Indien, for brugen af flowcytometrikernefaciliteten. Kryosnittet af pelletkulturen af differentierede celler blev udført på Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Indien. Dette arbejde blev støttet af UC's intramurale finansiering fra Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Indien. AG er taknemmelig for støtten fra Dr. T. M. A. Pai-stipendiet fra MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
