Summary
Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.
Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os "brilhantes", expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.
As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado genômico e arquitetura metabólica e celular dasCTMs 2,4.
A imunofenotipagem de células tem sido uma aplicação comum da citometria de fluxo para a identificação de células-tronco e foi utilizada pela Sociedade Internacional de Terapia Celular e Gênica (ISCT) em 2006 para prescrever uma lista de critérios mínimos para identificar células como CTMs. Afirmou que, juntamente com a aderência plástica e a capacidade de diferenciação in vitro em três linhagens (osteogênica, condrogênica e adipogênica), ≥95% da população celular deve expressar CD105, CD73, CD90, e essas células não devem ter a expressão (≤2% positiva) de CD34, CD45, CD11b, CD14 e HLA-DR, medida por citometria de fluxo5. Embora as CTMs tenham sido definidas por um conjunto de biomarcadores sob os critérios mínimos do ISCT, suas propriedades imunológicas não puderam ser comparadas com esses biomarcadores e houve uma necessidade de mais além desses critérios para tornar as comparações entre estudos e variações clonais mais fáceis de quantificar2.
Apesar das diretrizes estabelecidas pelo ISCT, uma extensa pesquisa sobre CTMs tem mostrado que existe heterogeneidade nessa população, que pode surgir devido a uma infinidade de fatores, principalmente devido à natureza ubíqua da heterogeneidade que surge entre doadores de CTM6, fontes de tecido7, células individuais dentro de uma população clonal8 e condições de cultura2,9, 10º. A caracterização e purificação dessas células primárias a partir de uma variedade de fontes de tecido para garantir a qualidade e o destino celular são etapas fundamentais em sua produção. A necessidade de compreender as variações apresentadas entre a população requer um método eficiente para resolvê-las em subpopulações que podem ser divididas e coletadas separadamente11. Análises em nível de célula única ajudam a superar os desafios da variação célula-célula, reduzem o ruído biológico proveniente de uma população heterogênea e oferecem a capacidade de investigar e caracterizar células raras12.
Com base na finalidade e nos parâmetros escolhidos, vários métodos podem ser empregados para classificar e enriquecer as populações selecionadas. As técnicas de classificação de células podem incluir métodos de classificação em massa e de célula única. Enquanto a triagem em massa pode enriquecer populações-alvo por meio da classificação celular ativada por fluorescência (MACS)13, fracionamento14 e elutriação 15, a triagem de células únicas pode enriquecer populações mais homogêneas por meio da classificação celular ativada por fluorescência (FACS)11. Uma análise comparativa de cada um desses métodos com seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens é destacada na Tabela 1.
Tabela 1: Análises comparativas de diferentes técnicas: MACS, Fracionamento, Elutriação e FACS, destacando as diferenças em seu princípio e as vantagens e desvantagens da escolha de uma determinada técnica em detrimento de outra. Abreviações: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Classificação celular ativada por fluorescência. Clique aqui para baixar esta tabela.
Desde o advento da técnica, a citometria de fluxo unicelular tem desempenhado um papel importante naenumeração16, detecção e caracterização de uma população celular específica em uma amostra heterogênea17. Hewitt et al., em 2006, lançaram as bases da metodologia de classificação celular automatizada para melhorar o isolamento de pools homogêneos de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs)18. A triagem unicelular enriqueceu a população de hESCs transduzidas por GFP, facilitando o isolamento de clones geneticamente modificados, o que abriu uma nova dimensão na pesquisa clínica. Para melhorar a eficiência da classificação, duas abordagens foram geralmente adotadas; Ou os meios de coleta das populações triadas são modificados para sustentar a viabilidade e proliferação de células pós-trificadas19 ou o algoritmo/software de classificação celular é modificado adequadamente12.
Com o avanço da tecnologia, citômetros de fluxo comerciais e classificadores de células foram capazes de ajudar a enfrentar desafios que foram enfrentados ao classificar assepticamente populações de células frágeis e raras, especialmente células-tronco de diferentes origens. Um dos grandes desafios dos biólogos de células-tronco tem sido o isolamento clonal de células-tronco pluripotentes humanas seguindo protocolos de transfecção exigidos em estudos de edição gênica19. Isso foi resolvido classificando células únicas em placas de 96 poços que foram revestidas com fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), juntamente com suplementos e inibidores comerciais de pequenas moléculas de ROCK. No entanto, as estratégias de isolamento celular poderiam ser amplamente refinadas com o uso da classificação por índice, uma característica do algoritmo de classificação que identifica o imunofenótipo de células individuais classificadas12. Essa modalidade refinada na classificação de células únicas ajudou não apenas a aumentar a eficiência da classificação de células-tronco, especialmente no que diz respeito a populações raras de células-tronco hematopoéticas, mas também ligou eficientemente clones de célula única a seus ensaios funcionais a jusante20.
Este artigo enfoca a triagem unicelular de células-tronco imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) para o enriquecimento de subpopulações para estudar suas capacidades de diferenciação funcional. Utilizando a combinação de dois marcadores CTM positivos, CD90 e CD73, e um marcador hematopoiético negativo CD45, as CTMs foram imunofenotipadas e os expressores dim e null foram identificados. Com base em seu imunofenótipo, as subpopulações foram identificadas como CTMs puras, populações positivas simples e duplas negativas. Eles foram classificados usando o modo de classificação unicelular para obter subpopulações puras e enriquecidas para estudos funcionais posteriores para identificar se a expressão diferencial de marcadores era um artefato de condições de cultivo in vitro ou se também tem algum efeito sobre as propriedades funcionais. As células que não eram expressores homogêneos dos "marcadores MSC positivos" foram selecionadas para estudar suas propriedades funcionais.
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Protocol
Aprovação ética e consentimento para participar: Amostras de polpa dentária decídua esfoliada humana foram recebidas após a obtenção de consentimento informado e aprovação ética completa pelo Departamento Oral e Maxilofacial do Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Liberação Ética Hospitalar, SRGCDS. Em seguida, o isolamento, o cultivo, a manutenção e a aplicação de SHEDs foram aprovados e em conformidade com as diretrizes recomendadas pelo Comitê Institucional para Pesquisa em Células-Tronco (IC-SCR) do Instituto Manipal de Medicina Regenerativa, MAHE - Bengaluru. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.
1. Preparação de reagentes e tampões
- Para manutenção da cultura
- Preparar meios de cultura de células CTM (10%) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-strep) (Tabela 2).
- Preparar meios de cultura celular CTM (20%) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, 20% FBS, 1% L-glutamina e 1% Pen-strep (Tabela 2).
- Preparar meios neutralizantes usando meio basal para hESCs indiferenciadas, L-glutamina a 1% e antibiótico-antimicótico a 1% (Anti-Anti) (Tabela 2).
- Para análise e classificação por citometria de fluxo
- Preparar tampão de coloração usando FBS a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Preparar uma solução-mãe de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) adicionando 1 μL em 1 mL de PBS
- Para diferenciação linhagem específica de CTMs
- Preparar meios de diferenciação para diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica de acordo com a composição descrita na Tabela 3. Conservar as alíquotas preparadas a 4 °C durante a experiência.
- Preparar meios sem soro (2% de meio) usando meio basal para hESCs indiferenciadas, SFB a 2%, L-glutamina a 1% e Pen-strep a 1% (Tabela 2).
| TIPO DE MÍDIA | FINALIDADE DA MÍDIA | COMPOSIÇÃO PARA 50 mL | ||||||||
| FBS | Caneta-Strep | L-Glutamina | MEIO BASAL PARA HESCs indiferenciadas | |||||||
| 10% mídia | Cultura e manutenção MSC | 5 mL | 500 μL | 500 μL | 44 mL | |||||
| 20% mídia | Ensaio UFC-F | 10 mL | 500 μL | 500 μL | 39 mL | |||||
| Meios com carência de soro (2%) | Meios para Controle de Poços em Protocolo de Diferenciação | 1 mL | 500 μL | 500 μL | 48 mL | |||||
| Meios neutralizantes | Meios para neutralização da suspensão celular após tripsinização | - | 500 μL | 500 μL | 49 mL | |||||
Tabela 2: Meios de cultura celular para manutenção e ensaios de cultura. Abreviações: CTM = células-tronco mesenquimais; UFC-F = unidade formadora de colônia-fibroblasto.
| COMPONENTES | MEIOS OSTEOGÊNICOS | MEIOS CHONDROGÊNICOS | MEIOS ADIPOGÊNICOS |
| Mídia Basal | 90 mL | 90 mL | 90 mL |
| Meios de indução | 10 mL | 10 mL | 10 mL |
| Total Volume | 100 mL | 100 mL | 100 mL |
Tabela 3: Meios de diferenciação para diferenciação de trilinhagens de SHEDs.
2. Cultura e manutenção de galpões
- Manter as células em meio de cultura MSC a 10% e realizar trocas de meios a cada 2 dias ou conforme necessário.
- Tripsinizar células em 95% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA.
- Neutralizar as células após tripsinização usando meios neutralizantes.
- Centrifugar o tubo a 300 × g durante 6 min à temperatura ambiente para obter um pellet celular.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de cultura MSC a 10%.
- Células de sementes em placas de cultura celular recém-preparadas contendo 10% de meio de cultura MSC para experimentos posteriores ou subcultivo.
NOTA: A densidade de semeadura ideal para SHEDs é de 0,2 × 10 6 células em uma placa de 100 mm e 0,8 × 10 6 células em um frasco T-75, para obter 1,5 × 10 6 células e 4 × 10 6 células, respectivamente, com 90-100% de confluência.
3. Caracterização das CTMs
- Ensaio de crescimento celular a curto prazo
- Sementes de 4 × 104 células/poço em triplicata, em placas de 6 poços em meio de cultura MSC a 10%.
- Incubar as placas por 7 dias a 37 °C e realizar trocas de meios a cada 2 dias.
- Colher as células nos dias 2, 4 e 8 com tratamento com tripsina a 0,25% e lavar com meios de cultura.
- Centrifugar as células a 300 g por 6 min à temperatura ambiente e ressuspender o pellet em 1 mL de meio.
- Contar as células usando um hemocitômetro e determinar sua viabilidade pelo método de exclusão do azul de tripano.
- Calcule a taxa de proliferação usando a equação (1):
(1º)
- Ensaio de unidade formadora de colônia-fibroblasto (UFC-F)
- Semeando 10.000 células em uma placa de 100 mm e cultivando-as em meios de cultura MSC a 20%.
- Incubar as placas por 14 dias a 37 °C e realizar trocas de meios a cada 3 dias.
- Após 14 dias, enxaguar as colônias com PBS, fixá-las com corante violeta cristal em metanol e enxaguar novamente com PBS para remover a mancha residual.
- Conte e imagine as colônias.
NOTA: Contar colônias com >50 células. A eficiência de formação de colônias é calculada como números de unidades formadoras de colônias.
- Ensaio de imunofluorescência
- Semeando as CTMs em placas de 35 mm e deixe-as crescer até 80-90% de confluência.
- Retire o meio e enxágue a louça com PBS uma vez.
- Fixar as células com 1 ml de paraformaldeído (PFA) a 4%, incubando durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Após a fixação, lavar os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicionar Triton X-100 a 0,3% em PBST (solução de Tween 20 a 0,05% em PBS) para permeabilizar as células. Mantenha-o no balancim por 15 min à temperatura ambiente.
- Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicionar 3% de albumina de soro bovino (BSA) para bloqueio e mantê-lo no balancim por 1 h à temperatura ambiente.
- Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicionar 800 μL de diluição 1:500 de anti-vimentina de rato, mantê-lo no balancim durante 1 h à temperatura ambiente e transferir a placa para 4 °C para incubação durante a noite.
- No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicionar 800 μL de diluição 1:1.000 do anticorpo secundário de cabra anti-camundongo IgG (H+L), Alexa Fluor 555, e mantê-lo por 3 h à temperatura ambiente no balancim.
- Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicione Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL em 1.000 μL de PBS e incube à temperatura ambiente por 60 min no balancim.
- Lave os poços com PBST por 3 x 5 min no balancim.
- Adicionar 700 μL de DAPI mountant e observar as células sob um microscópio.
- Diferenciação específica da linhagem
- Diferenciação seguindo a cultura 2D
- Pegue duas placas de 48 poços e rotule-as como linhagens osteogênicas e adipogênicas, respectivamente.
- Semeando 15.000 células/poço em quatro poços de cada placa e cultivando-as em meio de cultura MSC a 10%.
- Uma vez que a monocamada de células tenha atingido 90% de confluência, rotule os dois primeiros poços como "Controle" e substitua o meio existente por meios sem soro (2% de meios). Nos dois últimos poços rotulados como 'Teste', adicionar meios de diferenciação de qualquer uma das duas linhagens, adipogênico ou osteogênico. Marque isso como Dia 0.
- Substitua suavemente os meios a cada três dias para contornar o peeling e tenha cuidado para evitar contaminação.
- Manter essas condições até o vigésimo primeiro dia; em seguida, processo para o experimento de coloração.
- Diferenciação seguindo a cultura 3D
- Tomar dois tubos de 15 mL para realizar a diferenciação condrogênica usando cultura de pellets 3D.
- Transfira 1 × 10 6 células para cada tubo e centrifuga a 300 × g por6 min para formar um pellet. Rotular um tubo como 'Controle' e adicionar 10% de meio de cultura MSC a ele; rotular o outro tubo como "Teste" e adicionar meios de diferenciação condrogênicos. Coloque os tubos cuidadosamente na incubadora com suas tampas frouxamente rosqueadas. Marque isso como Dia 0.
- Troque a mídia a cada três dias com cuidado, para não deslocar/desintegrar a pelota durante as trocas de mídia.
- Mantenha essas condições até o vigésimo primeiro dia e, em seguida, processe as células para novos experimentos.
- Diferenciação seguindo a cultura 2D
- Coloração citoquímica específica da linhagem
- Para culturas 2D, utilizar as placas de CTMs diferenciadas (teste) e indiferenciadas (controle) (da etapa 3.4.1.5.) para coloração e, primeiro, retirar o meio e lavar duas vezes com PBS. Fixar as células usando PFA 4% por 30 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e lavar uma vez com PBS. Execute a coloração para cada linhagem da seguinte maneira.
- Para a linhagem de adipócitos, adicionar solução de permeabilização do kit e incubar a placa por 5 min à temperatura ambiente. Preparar e adicionar 1 mL de solução de trabalho Oil red O e mantê-lo por 10 min. Retire a mancha e faça cinco lavagens com água destilada.
- Para a linhagem de osteócitos, adicionar 5% de nitrato de prata recém-preparado (em água destilada) a cada poço e manter a placa sob UV por 1 h. Retire a solução e adicione 2,5% de tiossulfato de sódio para remover a prata não reagida; guarde-o por 5 min. Remova a mancha, lave duas vezes com água destilada e observe as células coradas ao microscópio.
- Para culturas 3D, coletar o pellet após o término do período de diferenciação da etapa 3.4.2.3 e obter criossecções do tecido diferenciado na forma do pellet. Deixe as lâminas secarem ao ar e fiquem em temperatura ambiente antes de proceder à coloração.
- Para a linhagem de condrócitos, siga as instruções do kit de coloração para adicionar um volume suficiente de solução de lavagem, removê-la, adicionar a solução de fixação e incubar por 30 min. Lave com água destilada, adicione a solução corante e incube por 30 min. Lavar três vezes com ácido clorídrico 0,1 N; Adicione água destilada para neutralizar a acidez. Observe as células coradas sob um microscópio de campo claro.
- Para culturas 2D, utilizar as placas de CTMs diferenciadas (teste) e indiferenciadas (controle) (da etapa 3.4.1.5.) para coloração e, primeiro, retirar o meio e lavar duas vezes com PBS. Fixar as células usando PFA 4% por 30 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e lavar uma vez com PBS. Execute a coloração para cada linhagem da seguinte maneira.
(1º)4. Coloração da superfície celular para imunofenotipagem
NOTA: As placas de cultura celular recomendadas para obter um número ideal de células nas etapas 4.2-4.5 são placas de 100 mm ou frascos T75.
- Preparação celular para experimentos de citometria de fluxo
- Tripsinizar e coletar as células de uma placa/frasco confluente e centrifugar a 300 × g por 6 min para obter o pellet celular.
- Ressuspender o pellet em 1 mL de meio e determinar a contagem de células viáveis usando um hemocitômetro seguindo o método de exclusão do azul de tripano.
- Centrifugar novamente a suspensão celular após a contagem e dar mais duas lavagens ao pellet com 1 mL de tampão corante.
- Eliminar o sobrenadante e, finalmente, voltar a suspender o pellet num volume adequado do tampão de coloração, dependendo do protocolo (ver passos 4.2 a 4.5).
- Elaboração de controles de remuneração
- Pegue sete tubos FACS e rotule-os como Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 e APC.
- Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1.) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL por tubo para os tubos não corados e DAPI.
- Preparar os tubos de coloração única para compensação conforme descrito na Tabela 4.
- Vórtice suavemente cada tubo após a preparação e incube no escuro por 30 min.
- Após a incubação, administrar duas lavagens adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo, seguidas de breve vórtice e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão corante e reserve-o até a aquisição.
- Para o tubo DAPI, realizar o tratamento de choque térmico incubando-o em banho-maria a 60 °C por 5 min seguido de 15 min no gelo. Adicionar 5 μL de DAPI à suspensão e mantê-la no escuro até a aquisição da corrida.
- Preparação de controles de fluorescência menos um (FMO)
- Ressuspender o pellet final em tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
- Pegue cinco tubos FACS e rotule-os como isotipo CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, isotipo CD73-PerCP Cy5.5 e isotipo CD105-APC.
- Preparar a suspensão celular e de anticorpos de acordo com a Tabela 5.
- Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão corante e reserve-o até a aquisição.
- Preparação de amostras para análise
- Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 0,5 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
- Pegue dois tubos FACS e rotule-os como tubos mistos 1 e 2.
- Preparar a suspensão celular e de anticorpos de acordo com a Tabela 6.
- Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
- Eliminar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 500 μL de tampão corante e separar até a aquisição.
- Preparação de amostras para triagem unicelular
- Pegue dois tubos FACS, adicione 1mL de FBS e role o tubo até que uma camada uniforme de FBS seja formada no interior de cada tubo. Incubar por 1-2 h enquanto processa a amostra para coloração. Rotule esses tubos como tubos mistos 1 e 2.
- Ressuspender o pellet final no tampão de coloração (ver passo 4.1) mantendo uma densidade celular de 2-3 × 106 células por 50 μL para cada tubo.
- Preparar a suspensão de células e anticorpos em tubos mistos 1 e 2 de acordo com a Tabela 7.
- Vórtice os tubos suavemente e incube-os por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.
- Após a incubação, administrar duas lavagens com 1 mL de tampão de coloração em cada tubo, seguidas de vórtice breve e centrifugação a 200 g por 10 min à temperatura ambiente.
- Eliminar o sobrenadante, voltar a suspender o pellet em 500 μL de tampão corante e reservar. Adicionar 5 μL de DAPI 15 min antes da classificação.
NOTA: Observe que para experimentos de classificação é recomendada maior densidade celular por tubo.
| Tipo de tubo | Contas Comp Positivas* | Contas Comp negativas* | Células | Anticorpos adicionados | |
| Tubo FITC | 1 gota | 1 gota | – | CD90-FITC anti-humano (2 μL) | |
| Tubo V450 | 1 gota | 1 gota | – | CD44-V450 anti-humano (2 μL) | |
| Tubo PerCP-Cy 5.5 | 1 gota | 1 gota | – | Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL) | |
| Tubo de PE | 1 gota | 1 gota | – | CD45-PE anti-humano (2 μL) | |
| Tubo APC | 1 gota | 1 gota | – | CD105-APC anti-humano (2 μL) | |
| Tubo DAPI | – | – | 50 μL | – | |
| Tubo sem manchas | – | – | 50 μL | – | |
| *1 gota= 60 μL de suspensão de contas | |||||
Tabela 4: Amostras de controle de compensação. Abreviações: Comp = compensação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.
| TIPO DE TUBO | ANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (2 μL) | ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (2 μL) | ANTICORPOS ISOTÍPICOS ADICIONADOS (2 μL) | VOLUME TOTAL DE ANTICORPOS | VOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADO | VOLUME DO TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO | ||
| Tubo FMO CD90-FITC | - Anti-humano CD44-V450 | CD45-PE anti-humano | Isotipo FITC IgG1 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humano CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||||
| Tubo CD73-PerCP Cy5.5 FMO | - Anti-humano CD44-V450 | CD45-PE anti-humano | Isotipo PerCP Cy 5.5 IgG1 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humano CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||||
| Tubo FMO CD44-V450 | - Anti-humano CD90-FITC | CD45-PE anti-humano | Isotipo V450 IgG1 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||||
| Tubo FMO CD105-APC | - Anti-humano CD44-V450 | CD45-PE anti-humano | Isotipo IgG1 APC | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humano CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| Tubo FMO CD45-PE | - Anti-humano CD44-V450 | - | Isotipo PE IgG1 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humano CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||||
Tabela 5: Amostras de controle FMO. Abreviaturas: FMO = fluorescência menos um; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.
| TIPO DE TUBO | ANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (2 μL) | ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (2 μL) | VOLUME TOTAL DE ANTICORPOS | VOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADO | VOLUME DO TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO | |
| Tubo misto 1 | - Anti-humano CD44-V450 | CD45-PE anti-humano | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-humano CD90-FITC | ||||||
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||
| Tubo misto 2 | - Anti-humano CD44-V450 | CD45-PE anti-humano | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-humano CD90-FITC | ||||||
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-humano CD105-APC | ||||||
Tabela 6: Tubos amostrais para imunofenotipagem multicolor de SHEDs. Abreviações: SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos; PE = ficoeritrina.
| TIPO DE TUBO | ANTICORPO CONTRA MARCADOR POSITIVO (3 μL) | ANTICORPO CONTRA MARCADOR NEGATIVO (3 μL) | VOLUME TOTAL DE ANTICORPOS | VOLUME DE SUSPENSÃO CELULAR ADICIONADO | VOLUME DE TAMPÃO DE COLORAÇÃO ADICIONADO | |
| Tubo misto 1 | - Anti-humano CD90-FITC | CD45-PE anti-humano | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Tubo misto 2 | - Anti-humano CD90-FITC | CD45-PE anti-humano | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-humano CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tabela 7: Tubos de reação de classificação unicelular. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.
5. Classificação de célula única
- Preparação do classificador de células
- Instale um bocal de 100 μm no classificador.
NOTA: O bocal apropriado tem pelo menos cinco vezes o diâmetro da partícula a ser classificada. O fluido da bainha a ser usado para a triagem precisa ser decidido com base no tipo de amostra e na sensibilidade do experimento; Para este experimento, foi utilizado fluido de bainha patenteado. - Realize a verificação diária da qualidade do instrumento (CQ) e configure o classificador para o experimento. Consulte o manual do instrumento para obter um guia detalhado da configuração do instrumento.
- Instale um bocal de 100 μm no classificador.
- Montagem da matriz de remuneração
- Defina a matriz de compensação usando tubos de compensação de mancha única da etapa 4.2.
- No software proprietário, selecione Experimentar na barra de ferramentas e clique em Configuração de compensação. Abra Criar controles de compensação.
- Confira os marcadores e confirme. Um novo espécime é adicionado chamado "Compensação" sob o qual novos tubos chamados de controles de marcador são adicionados automaticamente pelo software.
- Selecione o tubo sem manchas e execute-o, para gravar 5.000 eventos. Arraste o portão para a população de células e aplique-o a todos os controles de compensação. Isto é para definir as tensões e porta negativa para cada parâmetro fluorescente.
- Da mesma forma, carregue os tubos de compensação de mancha única separadamente e registre e salve os dados. Selecione o portão que demarca a população de interesse e aplique a todos os controles de remuneração. Isso é para definir as portas positivas para cada parâmetro fluorescente.
- Selecione Experimentar na barra de ferramentas e clique em Calcular valores de compensação | vincular e salvar.
NOTA: Uma vez que a matriz auto-comp é gerada usando o software, os parâmetros de tensão dos fluorocromos não podem ser alterados para nenhum dos canais nos tubos mistos.
- Aquisição de dados
- Registre 10.000 células em cada tubo a partir das etapas 4.3. e 4.4 coletar dados para análise do imunofenótipo das células.
- Preparação dos dispositivos de coleta
- Dependendo da finalidade das populações de células classificadas, escolha entre placas de 6 poços, 24 poços, 48 poços ou 96 poços.
- Revestir os poços com 200-500 μL de FBS e manter as placas intactas por 2 h.
- Após 2 h, remover o FBS residual e adicionar 200-500 μL de meio de cultura MSC a 10%.
- Classificação de células no modo de classificação de célula única
- Execute o tubo misto 1 (a partir da etapa 4.5) e registre 10.000 eventos para definir as portas sobre a população de interesse a ser classificada, usando a estratégia de fechamento apropriada.
- Carregue uma placa de coleta e defina números de célula de destino entre 2.500 e 5.000 células/poço e selecione a máscara de pureza de classificação de célula única.
- Coletar as populações classificadas no dispositivo de coleta e mantê-las no gelo até o final do experimento de triagem.
- Uma vez feito, transferir as placas para a incubadora de 5% CO2 para manter as culturas a 37 °C.
NOTA: Após a aquisição, os arquivos de dados brutos foram exportados como formato de arquivo .fcs (v.3.0. em diante). Os relatórios de classificação gerados após cada experimento registraram o número de eventos/células classificados por poço atribuído e indicaram o número de conflitos que foram abortados.
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Representative Results
Os SHEDs foram caracterizados com ensaios de imunofluorescência padrão mostrando a expressão de vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e núcleos corados com DAPI (Figura 1A). Para estimar suas capacidades proliferativas e formadoras de colônias, ensaios padrão de crescimento celular de curta duração foram realizados. Um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação do dia 2 para o dia 8 foi mostrado na Figura 1B. As propriedades clonogênicas dos SHEDs foram determinadas a partir dos ensaios de UFC-F mostrados na Figura 1C-E. De acordo com os critérios da ISCT, as CTMs multipotentes foram capazes de se diferenciar nas três linhagens derivadas de mesoderme. A coloração citoquímica com Oil Red O foi utilizada para detectar as gotículas de óleo nos adipócitos diferenciados (Figura 1F); A coloração de von Kossa foi utilizada para corar os depósitos de cálcio encontrados na matriz dos osteoblastos diferenciados (Figura 1G); e os agrecanos na cultura 3D foram corados para Alcian Blue nos condroblastos diferenciados (Figura 1H).
Para caracterizar o imunofenótipo dos SHEDs, foram realizados ensaios multiparamétricos de citometria de fluxo. Os experimentos foram realizados juntamente com a utilização de quatro tipos de controles experimentais: controles de compensação (Tabela 4), controles de FMO e isotipos (Tabela 5) e controles não corados. Os isotipos de todos os anticorpos MSC e HSC utilizados foram adicionados juntamente com os tubos FMO para discriminar sinais positivos versus negativos e expressão antigênica alta versus fraca. A Figura 2A mostra a distribuição dos controles FMO e isotípico utilizados por experimento. Os gráficos de densidade representativos não mostraram expressão do isotipo FITC de anticorpos CD90 FITC. Da mesma forma, as sobreposições de histograma (Figura 2B) compararam os níveis de expressão das amostras coradas juntamente com seus controles nos respectivos canais de FITC, PerCP Cy5.5 e PE. A expressão positiva dos marcadores CD90 e CD73 (histogramas vermelhos) e a expressão negativa de CD45 são comparáveis às de seus controles não corados e FMO (histogramas azul e preto, respectivamente).
A caracterização dos imunofenótipos por citometria de fluxo mostrou a distribuição dos marcadores a partir de uma das passagens iniciais (P6) dos SHEDs (Figura 3A-H). Tanto os marcadores recomendados pelo ISCT quanto o CD44 determinaram as populações parentais como CTMs. A população tetrapositiva demonstrada nos gráficos de densidade apresentou ≥98% de expressão de CD90+CD73+CD105+CD44+ e ≤2% de expressão de marcadores CD45. Mais de cinco experimentos independentes mostraram resultados semelhantes. Os SHEDs de passagem tardia (P12), que apresentaram expressão diferencial dos marcadores positivos, foram escolhidos para a triagem unicelular dos expressores alto e fraco (Figura 4A-H). Seguindo a estratégia de gating (Figura 4H), as populações singletas→ Células vivas→ Não-HSCs→ CD73+CD90+ duplo-positivo e CD73+CD90- positivo único foram classificadas usando o modo de classificação de célula única. As populações selecionadas foram coletadas em placas de 96 poços/48 poços/6 poços com diferentes contagens de semeadura por poço (Arquivo Suplementar 1). Três tentativas consecutivas foram feitas em uma única fase de experimentos de triagem e a capacidade de sobrevivência das células pós-classificação (nos expressores duplo-positivos: CD90+CD73+) por experimento foi de 100%. Três fases independentes de experimentos foram conduzidas. Combinamos o número de células que cresceram por poço pós-classificação com o número de células classificadas por poço.
A Figura 5A mostra que as células CD90+CD73+ pós-selecionadas coletadas na placa de 96 poços mostraram aderência e proliferação como sua população de origem. Observou-se que as células classificadas atingem 70-80% de confluência no sexto dia após a triagem. As células pós-trificadas aderidas e proliferantes foram diferenciadas na presença de fatores de crescimento adipogênicos e, em seguida, coradas após o 15º dia com óleo vermelho O usando células controle pós-selecionadas apropriadas (indiferenciadas) (Figura 5B,C).
Figura 1: Caracterização das células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos. (A) A coloração por imunofluorescência confirma que as CTMs isoladas expressam vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e DAPI (núcleos azuis). Fotomicrografia obtida em aumento original de 20x. Barra de escala = 10 μm. (B) O ensaio de crescimento celular de SHEDs em curto prazo exibe sua alta capacidade proliferativa, como observado pelo aumento significativo no número de células em cultura até o dia 2 e um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação no final do dia 8 (n = 3, p-valor<0,01). Foram mostradas barras de erro de desvio padrão. (C-E) O ensaio de UFC-F e a coloração violeta de cristal confirmam a capacidade de formação de colônias dos SHEDs; (C) espera-se a formação de múltiplas colônias após 14 dias de cultivo; (D) colônia clonogênica única originária de uma única célula; (E) A colônia única de SHEDs corada com violeta cristalina exibe a morfologia típica de fibroblastos das células. (F-H) Espera-se que as CTMs em condições in vitro apropriadas sofram diferenciação em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas até o dia 21. A coloração citoquímica mostra (F) Oil Red O (inset mostra imagem de 40x de adipócitos mostrando gotículas de óleo), (G) von Kossa e (H) Alcian Blue para linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas, respectivamente, no Dia 22. As fotomicrografias são obtidas em um aumento original de 20x. Barra de escala = 10 μm. Abreviações: CTMs = células-tronco mesenquimais; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos; UFC-F = unidade formadora de colônia-fibroblasto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Controles negativos utilizados no experimento multiparamétrico . (A) Os controles de fluorescência menos um foram exibidos em uma forma tabular, onde os controles FMO foram substituídos por seus isotipos específicos. Os gráficos de densidade representativa (da esquerda para a direita) mostram o controle não corado (esquerda), FMO de CD90 FITC (meio) com todos os anticorpos adicionados, exceto CD90 FITC, juntamente com a adição do isotipo CD90 FITC, e amostra totalmente corada com todos os anticorpos do painel adicionados (direita). (B) A sobreposição de histograma representa a comparação de três tipos de amostras, o preto representa FMO, o azul representa as amostras não coradas e o vermelho representa as amostras totalmente coradas em seus respectivos canais. Abreviações: FMO = fluorescência menos um; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PerCP = peridinina-clorofila-proteína; PE = ficoeritrina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunofenotipagem multiparamétrica dos SHEDs (P6). (A) SSC-A versus FSC-A: Com base em suas propriedades de dispersão lateral e posterior, as células de interesse são fechadas e separadas dos detritos; (B) FSC-H versus FSC-A e (C) SSC-H versus SSC-A: Os dois gráficos são empregados para discriminação de duplos, o que permite a seleção de singlets enquanto elimina agregados que podem gerar sinais falso-positivos; (D) SSC-A versus CD45 PE: O limiar de exclusão permite a seleção da população CD45- dos singletes; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 versus CD90 FITC: Dos singlets CD45- vivos, as células CD90+CD73+ são gated; (F) CD44 V450 versus CD105 APC: A população CD90+CD73+ é ainda limitada para definir as células tetrapositivas CD90+CD73+CD44+CD105+; (G) SSC-A versus Tempo(s): O gráfico mostra a aquisição estável ao longo do tempo (segundos) e que nenhum evento causou flutuações de pressão durante a aquisição; (H) Hierarquia de gating. Abreviações: SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína; SSC-A = área do pico de dispersão lateral; FSC-A = área do pico de dispersão anterior; FSC-H = altura do pico de dispersão para frente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Triagem unicelular de SHEDs imunofenotipados (P12). (A-F) Uma estratégia de agrupamento passo a passo baseada em exclusão para classificar as CTMs puras na seguinte ordem sequencial: Células para singlets_1, para singlets_2, para DAPI- células vivas, para células CD45- não hematopoiéticas e, finalmente, para células CD90+CD73+. As populações fechadas mostradas em (F) foram ordenadas usando o modo de classificação unicelular. (G) O gráfico SSC-A versus Time(s) descreve a classificação ininterrupta das amostras. (H) Hierarquia de gating. (n=3, Eficiência de ordenação = 100%). Abreviações: SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos; CTMs = células-tronco mesenquimais; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína; SSC-A = área do pico de dispersão lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caracterização morfológica e funcional dos SHEDs pós-triados. (A) Imagens de contraste de fase de populações pós-selecionadas foram coletadas em uma placa de 96 poços no Dia 6 em um aumento original de 10x, barra de escala = 10 μm (inset mostra uma imagem de 20x mostrando as células únicas classificadas mudando a morfologia para CTMs semelhantes a fibroblastos). Coloração citoquímica para diferenciação adipogênica usando Oil Red O observada em (B) população pós-classificação indiferenciada (controle) e (C) diferenciada em um aumento original de 20x, barra de escala = 10 μm (inset mostra uma imagem de 40x mostrando as gotículas de óleo observadas). Abreviações: SHEDs = células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: relatórios de classificação compilados gerados por experimento. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Configuração óptica do BD FACSAria Fusion. Abreviações: LP = passe longo; TPM = tubo fotomultiplicador; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traumáticas22. O protocolo descrito neste manuscrito ajuda a caracterizar SHEDs usando uma abordagem multiparamétrica e ordenar populações de interesse usando a abordagem de classificação unicelular. No entanto, a aplicação desse protocolo não se limita apenas às CTMs orais, mas também pode ser utilizada para imunofenotipagem e triagem de CTMs de outros tecidos fontes do corpo humano23.
Várias etapas críticas deste protocolo precisam ser discutidas aqui para sua implementação bem-sucedida para o problema biológico abordado. A chave para cada protocolo de triagem é verificar dois componentes importantes: seus controles biológicos e os controles experimentais. Para começar, a manutenção da cultura limpa garante que a amostra usada não seja comprometida durante a triagem. A viabilidade celular na pré-triagem da suspensão de célula única deve assegurar o início de mais de 70% das populações de células viáveis, seguida da análise e triagem das subpopulações saudáveis. O tampão de coloração usado na suspensão de célula única deve conter 2% de SFB e os experimentos são melhor feitos à temperatura ambiente. A seleção da confluência correta dessas células primárias (80-85% de confluência) evita o comprometimento de sua viabilidade celular e reduz as chances de grandes agregados. Além disso, o uso de um marcador vivo/morto (DAPI neste protocolo) é essencial para todos os experimentos de triagem. Neste estudo, como as amostras utilizadas foram CTMs com diâmetro aproximado de 20-35 μm, o tamanho do bico escolhido foi de 100 μm para classificá-las a uma pressão de 20 psi sobre o BD FACSAria Fusion. Isso permitiu a triagem celular sem comprometer a viabilidade celular durante o processo com menor pressão na bainha. Para obter condições detalhadas de configuração de classificação, recomenda-se consultar o guia do software BD FACSDiva24.
Um pré-requisito essencial para experimentos multicoloridos em citometria de fluxo é a necessidade de controles apropriados; há quatro tipos principais de controles usados aqui: autofluorescência, isotipos, FMO e controles de compensação. A matriz de autocompensação permitiu uma compensação precisa, evitando sangramento espectral nos detectores, e utilizou tanto esferas de compensação quanto células para esse fim. A amostra não corada definiu o limiar para autofluorescência das CTMs. Os tubos mistos com os quatro anticorpos incluem o isotipo e os FMOs de cada anticorpo utilizado. O controle de compensação do DAPI foi realizado por meio de CTMs, as quais foram processadas separadamente (com choque térmico). O painel de anticorpos (conforme indicado na Tabela 8) usado aqui é projetado especificamente para hMSCs com base nos critérios declarados pelo ISCT e na configuração do instrumento do classificador de células BD FACSAria Fusion (consulte a Tabela Suplementar S1). Isso é muito crucial durante o planejamento de experimentos multiparamétricos de citometria de fluxo. O painel de caracterização utilizado para imunofenotipagem consiste de quatro marcadores MSC positivos (CD90, CD105, CD73 e CD44) e um marcador negativo (CD45). Em contraste, o painel para o experimento de classificação contém dois marcadores positivos (CD90 e CD73), um marcador negativo (CD45) e um marcador vivo/morto (DAPI) para garantir uma alta contagem de CTMs vivas.
| Anticorpo/marcador | Fluorochrome | Perfil de superfície hMSC | Comprimento de onda do laser (nm) | Pico de excitação (nm) | Pico de emissão (nm) |
| CD44 | V450 | Deve expressar; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 | FITC | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 | PE | NÃO deve expressar; <2% | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Marcador de células mortas | 405 | 358 | 461 |
Tabela 8: Painel multicolorido projetado para caracterização e classificação de SHEDs por citometria de fluxo. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; PerCP = peridinina-clorofila-proteína.
Seleção da máscara de pureza de classificação
Considerando a imprevisibilidade da heterogeneidade celular nas CTMs, a triagem em massa pode não necessariamente atingir o nível de pureza entre as populações classificadas. Otimizamos o protocolo de classificação de célula única neste estudo para identificar os clones de célula única e rastrear suas propriedades funcionais pós-classificação em termos de potência. A triagem unicelular foi realizada em um BD FACSAria Fusion, que teve a flexibilidade das seguintes configurações: escolha de bico de 100 μm, pressão de bainha de 20 psi, taxa de fluxo ajustável (mantida em 20 μL/min) e taxa de limiar em 380 eventos/s. As chances de selecionar duas células de destino em vez de uma são mínimas neste método. Normalmente, o modo de classificação de célula única do algoritmo é selecionado que pode resolver a classificação de populações puras de células-alvo e considerar quantas gotas serão classificadas no dispositivo de coleta de escolha. O modo Precisão, em última análise, deve ser escolhido com precisão para que possa combinar as máscaras disponíveis nos algoritmos de classificação e criar uma condição de classificação rigorosa para classificar as populações mais puras de interesse. O modo de classificação de célula única não compromete uma célula de destino se ela for agregada a uma célula não de destino durante a classificação e atingir o nível de pureza que esperamos nessa abordagem. Este foi o módulo selecionado neste protocolo e as células selecionadas foram coletadas em dispositivos de placas de 96 poços, 48 poços, 24 poços e 6 poços.
Neste estudo, classificamos as subpopulações com base em seu imunofenótipo diferencial, ou seja, CD90+CD73+CD45-. Tanto nos protocolos de caracterização quanto de triagem, nossa estratégia de gating (como mostrado na Figura 3 e Figura 4) tem sido baseada no gating de exclusão da população CD45- para nos dar a população não hematopoiética (pois estes foram validados e caracterizados previamente com os marcadores prescritos pela ISCT), após a identificação dos singletes. Eventualmente, as CTMs foram identificadas a partir da população CD45- usando os marcadores ISCT positivos. Vale a pena notar aqui que não há muita diferença nas porcentagens no primeiro gating dos expressores positivos dos marcadores ISCT seguidos dos expressores negativos de CD45. No entanto, como o objetivo desta classificação tem sido identificar células que apresentam expressão alterada dos marcadores conhecidos das CTM, concluímos nossa análise com os gráficos de expressão positiva.
Nas figuras representativas, 97% das células CD45- são CTMs, mas durante a quantificação das expressões antigênicas, vimos que 75% das células são expressores duplo-positivos dos dois marcadores CD90 e CD73, enquanto há várias populações que são expressores single-positivos dos mesmos marcadores (mostrados na Figura 3F) e poucas células que não expressam os marcadores.
Durante a caracterização dessas células, identificamos as subpopulações como CTMs tetrapositivas, triplo-positivas e duplas-negativas. Essa expressão diferencial dos marcadores das CTM expande-se com o aumento das passagens e, assim, surge a necessidade de estudar e correlacionar essa diferença com suas propriedades funcionais. O objetivo final da classificação das CTMs em nosso estudo é criar uma análise comparativa entre as subpopulações identificadas e determinar se as expressões diferenciais de marcadores positivos têm implicações funcionais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses referente à publicação deste artigo.
Acknowledgments
Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
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