Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering van menselijke mesenchymale stamcellen met behulp van de single-cell sorteermethode. In het bijzonder kan het gebruik van eencellige sortering een zuiverheid van 99% van de immunofenogetypeerde cellen uit een heterogene populatie bereiken in combinatie met een op multiparametrische flowcytometrie gebaseerde benadering.
Abstract
De mesenchymale stamcellen (MSC's) van een organisme bezitten een buitengewoon vermogen om te differentiëren in meerdere afstammingslijnen van volwassen cellen in het lichaam en staan bekend om hun immunomodulerende en ontstekingsremmende eigenschappen. Het gebruik van deze stamcellen is een zegen voor het gebied van regeneratieve biologie, maar tegelijkertijd een vloek voor regeneratieve geneeskunde en therapieën vanwege de vele cellulaire dubbelzinnigheden die ermee gepaard gaan. Deze ambiguïteiten kunnen voortkomen uit de diversiteit in de bron van deze stamcellen en uit hun in vitro groeiomstandigheden, die beide een weerspiegeling zijn van hun functionele heterogeniteit.
Dit garandeert methodologieën om gezuiverde, homogene populaties van MSC's te leveren voor therapeutische toepassingen. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie heeft de detectie van eencellige populaties mogelijk gemaakt met behulp van een multiparametrische benadering. Dit protocol schetst een manier om stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED's) te identificeren en te zuiveren door middel van fluorescentie-ondersteunde eencellige sortering. Gelijktijdige expressie van oppervlaktemarkers, namelijk CD90-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), CD73-peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP-Cy5.5), CD105-allofycocyanine (APC) en CD44-V450, identificeerde de "heldere", positieve uitdrukkers van MSC's met behulp van multiparametrische flowcytometrie. Er werd echter een significante daling waargenomen in het percentage viervoudige uitdrukkers van deze positieve markers vanaf passage 7 tot de latere passages.
De immunofenogetypeerde subpopulaties werden gesorteerd met behulp van de eencellige sorteermodus, waarbij slechts twee positieve en één negatieve marker de inclusiecriteria vormden. Deze methodologie zorgde voor de levensvatbaarheid van de cellen van de gesorteerde populaties en handhaafde de celproliferatie na het sorteren. De stroomafwaartse toepassing voor een dergelijke sortering kan worden gebruikt om afstammingsspecifieke differentiatie voor de gated subpopulaties te evalueren. Deze aanpak kan worden toegepast op andere eencellige systemen om de isolatieomstandigheden te verbeteren en voor het verkrijgen van informatie over markers op het oppervlak van meerdere cellen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden beschouwd als een schaalbare bron van cellen die geschikt zijn voor celgebaseerde therapieën en kunnen worden beschouwd als een gouden standaardsysteem in de regeneratieve geneeskunde. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen in het lichaam met verschillende weefseloorsprongen1. Afhankelijk van het bronweefsel vertoont elk type MSC een dubbelzinnig in vitro gedrag2. Dit is goed te zien aan hun morfologische en functionele eigenschappen3. Meerdere studies hebben intraklonale variatie in dimensies aangetoond, waaronder differentiatie van volwassen weefsel, genomische toestand en metabole en cellulaire architectuur van MSC's 2,4.
Immunofenotypering van cellen is een veel voorkomende toepassing van flowcytometrie voor de identificatie van stamcellen en dit werd in 2006 door de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) gebruikt om een lijst met minimale criteria voor te schrijven om cellen als MSC's te identificeren. Het verklaarde dat samen met plastische adherence en het vermogen om in vitro te differentiëren in drie afstammingslijnen (osteogeen, chondrogenisch en adipogeen), ≥95% van de celpopulatie CD105, CD73, CD90 tot expressie moet brengen, en dat deze cellen de expressie (≤2% positief) van CD34, CD45, CD11b, CD14 en HLA-DR moeten missen, zoals gemeten met flowcytometrie5. Hoewel de MSC's werden gedefinieerd door een reeks biomarkers volgens de minimale criteria van de ISCT, konden hun immuuneigenschappen niet worden gebenchmarkt met deze biomarkers en was er behoefte aan meer dan deze criteria om vergelijkingen tussen studies en klonale variaties gemakkelijker tekwantificeren 2.
Ondanks de richtlijnen van ISCT heeft uitgebreid onderzoek naar MSC's aangetoond dat er heterogeniteit bestaat in deze populatie, die kan ontstaan als gevolg van een veelheid aan factoren, voornamelijk als gevolg van de alomtegenwoordige aard van heterogeniteit die ontstaat tussen MSC-donoren6, weefselbronnen7, individuele cellen binnen een klonale populatie8 en kweekomstandigheden2,9, 10. okt. Karakterisering en zuivering van deze primaire cellen uit verschillende weefselbronnen om de kwaliteit en het lot van de cellen te waarborgen, zijn belangrijke stappen in hun productie. De noodzaak om de getoonde variaties onder de populatie te begrijpen, vereist een efficiënte methode om deze op te lossen in subpopulaties die afzonderlijk kunnen worden onderverdeeld en verzameld11. Analyses op celniveau helpen de uitdagingen van celvariatie te overwinnen, biologische ruis te verminderen die voortkomt uit een heterogene populatie en bieden de mogelijkheid om zeldzame cellen te onderzoeken en te karakteriseren12.
Op basis van het doel en de gekozen parameters kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de geselecteerde populaties te sorteren en te verrijken. Celsorteertechnieken kunnen zowel bulksortering als single-cell sorteermethoden omvatten. Terwijl bulksortering doelpopulaties kan verrijken door middel van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)13, fractionering 14 en elutriatie15, kan eencellige sortering meer homogene populaties verrijken door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)11. Tabel 1 geeft een vergelijkende analyse van elk van deze methoden met zijn eigen voor- en nadelen.
Tabel 1: Vergelijkende analyses van verschillende technieken: MACS, fractionering, elutriatie en FACS, waarbij de verschillen in hun principe en de voor- en nadelen van het kiezen van een bepaalde techniek boven een andere worden benadrukt. Afkortingen: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Sinds de komst van de techniek heeft single-cell flowcytometrie een belangrijke rol gespeeld bij het opsommen16, de detectie en karakterisering van een specifieke celpopulatie in een heterogeen monster17. Hewitt et al. legden in 2006 de basis voor een geautomatiseerde celsorteermethode om de isolatie van homogene pools van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESC's) te verbeteren18. Single-cell sortering verrijkte de populatie van GFP-getransduceerde hESC's waardoor de isolatie van genetisch gemodificeerde klonen werd vergemakkelijkt, wat een nieuwe dimensie in klinisch onderzoek opende. Om de sorteerefficiëntie te verbeteren, zijn over het algemeen twee benaderingen gevolgd; Ofwel worden de verzamelmedia van de gesorteerde populaties aangepast om de levensvatbaarheid en proliferatie van nagesorteerde cellente behouden 19 , ofwel wordt het algoritme/de software voor het sorteren van cellen op passende wijze aangepast12.
Met de vooruitgang van de technologie zijn commerciële flowcytometers en celsorteerders in staat geweest om uitdagingen aan te pakken die werden aangegaan bij het aseptisch sorteren van fragiele en zeldzame celpopulaties, met name stamcellen van verschillende oorsprong. Een van de grootste uitdagingen van stamcelbiologen is de klonale isolatie van menselijke pluripotente stamcellen volgens transfectieprotocollen die vereist zijn in genbewerkingsstudies19. Dit werd aangepakt door afzonderlijke cellen te sorteren in platen met 96 putjes die werden gecoat met Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF's), samen met supplementen en commerciële ROCK-remmers met kleine moleculen. Celisolatiestrategieën kunnen echter grotendeels worden verfijnd met behulp van indexsortering, een kenmerk van het sorteeralgoritme dat het immunofenotype van individuele gesorteerde cellen identificeert12. Deze verfijnde modaliteit bij het sorteren van eencellige cellen hielp niet alleen bij het verbeteren van de sorteerefficiëntie voor stamcellen, vooral met betrekking tot zeldzame hematopoëtische stamcelpopulaties, maar koppelde ook efficiënt eencellige klonen aan hun stroomafwaartse functionele assays20.
Dit artikel richt zich op het sorteren van eencellige cellen van immunofenogetypeerde stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden (SHED's) voor de verrijking van subpopulaties om hun functionele differentiatiecapaciteiten te bestuderen. Met behulp van een combinatie van twee MSC-positieve markers, CD90 en CD73, en een negatieve hematopoëtische marker CD45, werden de MSC's immunofenotypeerd en werden de dim- en null-expressoren geïdentificeerd. Op basis van hun immunofenotype werden de subpopulaties geïdentificeerd als zuivere MSC's, enkelvoudige positieve en dubbelnegatieve populaties. Ze werden gesorteerd met behulp van de single-cell sorteringsmodus om zuivere en verrijkte subpopulaties te verkrijgen voor verdere functionele studies om vast te stellen of de differentiële expressie van markers een artefact was van in vitro kweekomstandigheden of dat het ook enig effect heeft op de functionele eigenschappen. Cellen die geen homogene expressie waren van de "positieve MSC-markers" werden gesorteerd om hun functionele eigenschappen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen: Menselijke geëxfolieerde bladverliezende tandpulpmonsters werden ontvangen na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming en volledige ethische goedkeuring door Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, in overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Waarna isolatie, kweek, onderhoud en toepassing van SHED's werden goedgekeurd door en in overeenstemming met de richtlijnen die worden aanbevolen door het Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) van het Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. Bereiding van reagentia en buffers
- Voor cultuuronderhoud
- Bereid MSC-celkweekmedia (10%) met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine (pen-streptomycine) (tabel 2).
- Bereid MSC-celkweekmedia (20%) voor met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 20% FBS, 1% L-glutamine en 1% Pen-strep (Tabel 2).
- Bereid neutraliserende media voor met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 1% L-glutamine en 1% antibioticum-antimycoticum (anti-anti) (tabel 2).
- Voor flowcytometrische analyse en sortering
- Bereid kleuringsbuffer voor met 2% FBS in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bereid een stockoplossing van 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1 μg/ml) door 1 μl aan 1 ml PBS toe te voegen
- Voor afstammingsspecifieke differentiatie van MSC's
- Bereid differentiatiemedia voor osteogene, chondrogene en adipogene differentiatie voor volgens de in tabel 3 beschreven samenstelling. Bewaar de bereide aliquots bij 4 °C voor de duur van het experiment.
- Bereid serum-uitgehongerde media (2% media) met behulp van basaal medium voor ongedifferentieerde hESC's, 2% FBS, 1% L-glutamine en 1% Pen-strep (tabel 2).
| SOORT MEDIA | DOEL VAN DE MEDIA | SAMENSTELLING VOOR 50 ml | ||||||||
| FBS (FBS) | Pen-Streptokokken | L-Glutamine | BASAAL MEDIUM VOOR ONGEDIFFERENTIEERDE hESC's | |||||||
| 10% media | MSC-cultuur en onderhoud | 5 ml | 500 μL | 500 μL | 44 ml | |||||
| 20% media | CFU-F-test | 10 ml | 500 μL | 500 μL | 39 ml | |||||
| Serum uitgehongerd (2%) media | Media voor controleputten in differentiatieprotocol | 1 ml | 500 μL | 500 μL | 48 ml | |||||
| Neutraliserende media | Media voor het neutraliseren van de celsuspensie na trypsinisatie | - | 500 μL | 500 μL | 49 ml | |||||
Tabel 2: Celkweekmedia voor kweekonderhoud en assays. Afkortingen: MSC = mesenchymale stamcel; CFU-F = kolonievormende eenheid-fibroblast.
| ONDERDELEN | OSTEOGENE MEDIA | CHONDROGENE MEDIA | ADIPOGENE MEDIA |
| Basale media | 90 ml | 90 ml | 90 ml |
| Inductie media | 10 ml | 10 ml | 10 ml |
| Totaal volume | 100 ml | 100 ml | 100 ml |
Tabel 3: Differentiatiemedia voor trilineaire differentiatie van SHED's.
2. Kweek en onderhoud van SHED's
- Onderhoud cellen in 10% MSC-kweekmedia en voer mediawissels uit om de 2 dagen of indien nodig.
- Trypsiniseer cellen bij 95% confluentie met 0,25% trypsine-EDTA.
- Neutraliseer cellen na trypsinisatie met behulp van neutraliserende media.
- Centrifugeer de buis bij 300 × g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen.
- Decanteer het supernatans en resuspendeer de celpellet in 10% MSC-kweekmedia.
- Zaadcellen in vers bereide celkweekschaaltjes met 10% MSC-kweekmedia voor verdere experimenten of subkweek.
OPMERKING: De optimale zaaidichtheid voor SHED's is 0,2 × 10 6 cellen in een schaal van 100 mm en 0,8 × 10 6 cellen in een T-75-kolf, om respectievelijk 1,5 × 10 6 cellen en 4 × 10 6 cellen te verkrijgen bij 90-100% confluentie.
3. Karakterisering van MSC's
- Celgroeitest op korte termijn
- Zaad 4 × 104 cellen/putje in drievoud in platen met 6 putjes in 10% MSC-kweekmedia.
- Incubeer de platen gedurende 7 dagen bij 37 °C en ververs de media om de 2 dagen.
- Oogst de cellen op dag 2, 4 en 8 met 0,25% trypsinebehandeling en was ze met kweekmedia.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de pellet in 1 ml media.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bepaal hun levensvatbaarheid met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode.
- Bereken de proliferatiesnelheid met behulp van vergelijking (1):
(1)
- Kolonievormende eenheid-fibroblast (CFU-F) test
- Zaai 10.000 cellen in een schaaltje van 100 mm en kweek ze op in 20% MSC-kweekmedia.
- Incubeer de platen gedurende 14 dagen bij 37 °C en ververs de media om de 3 dagen.
- Spoel de kolonies na 14 dagen af met PBS, fixeer ze met kristalviolette kleurstof in methanol en spoel ze opnieuw met PBS om de resterende vlek te verwijderen.
- Tel en breng de kolonies in beeld.
OPMERKING: Tel kolonies met >50 cellen. De efficiëntie van kolonievorming wordt berekend als het aantal kolonievormende eenheden.
- Immunofluorescentie-test
- Zaai de MSC's op schaaltjes van 35 mm en laat ze groeien tot 80-90% samenvloeiing.
- Verwijder de media en spoel de vaat één keer met PBS.
- Fixeer de cellen met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) door ze 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C te laten incuberen.
- Was na fixatie de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
- Voeg 0,3% Triton X-100 toe in PBST (0,05% Tween 20-oplossing in PBS) voor permeabilisatie van de cellen. Bewaar het 15 minuten op kamertemperatuur op de wipstoel.
- Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
- Voeg 3% runderserumalbumine (BSA) toe voor blokkering en houd het 1 uur op kamertemperatuur op de rocker.
- Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
- Voeg 800 μL 1:500 verdunning van muisanti-vimentine toe, bewaar het 1 uur op kamertemperatuur op de wip en breng de plaat over naar 4 °C voor een nacht incubatie.
- Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam en was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 minuten op de wipstoel.
- Voeg 800 μL 1:1.000 verdunning van geit anti-muis IgG (H+L) kruislings geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 555, toe en bewaar dit gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op de wipstoel.
- Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
- Voeg Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL toe in 1.000 μL PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten op de wipstoel.
- Was de putjes met PBST gedurende 3 x 5 min op de wipstoel.
- Voeg 700 μL DAPI-montant toe en observeer de cellen onder een microscoop.
- Afstammingsspecifieke differentiatie
- Differentiatie volgens 2D-cultuur
- Neem twee platen met 48 putjes en label ze als respectievelijk osteogene en adipogene afstammingslijnen.
- Zaai 15.000 cellen/putje in vier putjes van elke plaat en kweek ze in 10% MSC-kweekmedia.
- Zodra de monolaag van cellen 90% samenvloeiing heeft bereikt, labelt u de eerste twee putjes als 'Controle' en vervangt u de bestaande media door serumuitgehongerde media (2% media). Voeg in de laatste twee putten met het label 'Test' differentiatiemedia toe van een van de twee afstammingslijnen, adipogeen of osteogeen. Markeer dit als Dag 0.
- Vervang de media voorzichtig om de drie dagen om peeling te voorkomen en zorg ervoor dat u verontreiniging voorkomt.
- Handhaaf deze voorwaarden tot de eenentwintigste dag; Verwerk vervolgens voor het kleuringsexperiment.
- Differentiatie volgens 3D-cultuur
- Neem twee buisjes van 15 ml voor het uitvoeren van chondrogene differentiatie met behulp van 3D-pelletcultuur.
- Breng 1 × 10 6 cellen over in elke buis en centrifugeer gedurende6 minuten bij 300 × g om een pellet te vormen. Label een tube als 'Control' en voeg er 10% MSC-kweekmedia aan toe; label de andere buis als 'Test' en voeg chondrogene differentiatiemedia toe. Plaats de buisjes voorzichtig in de couveuse met de doppen losjes vastgeschroefd. Markeer dit als Dag 0.
- Vervang de media om de drie dagen zorgvuldig, om te voorkomen dat de pellet losraakt/desintegreert tijdens het wisselen van media.
- Handhaaf deze omstandigheden tot de eenentwintigste dag en verwerk dan de cellen voor verdere experimenten.
- Differentiatie volgens 2D-cultuur
- Afstammingsspecifieke cytochemische kleuring
- Gebruik voor 2D-culturen de gedifferentieerde (test) en ongedifferentieerde MSC's (controleplaten) (uit stap 3.4.1.5.) voor het kleuren, verwijder eerst de media en was tweemaal met PBS. Fixeer de cellen met 4% PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en was eenmaal met PBS. Voer de kleuring voor elke afstamming als volgt uit.
- Voeg voor de afstamming van adipocyten permeabilisatie-oplossing uit de kit toe en incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid en voeg 1 ml Oil red O werkoplossing toe en bewaar dit gedurende 10 minuten. Verwijder de vlek en geef vijf wasbeurten met gedestilleerd water.
- Voeg voor de afstamming van osteocyten 5% vers bereid zilvernitraat (in gedestilleerd water) toe aan elk putje en houd de plaat 1 uur onder UV. Verwijder de oplossing en voeg 2,5% natriumthiosulfaat toe om het niet-gereageerde zilver te verwijderen; Houd het 5 minuten aan. Verwijder de vlek, was twee keer met gedestilleerd water en observeer de gekleurde cellen onder een microscoop.
- Voor 3D-culturen wordt de pellet verzameld na het einde van de differentiatieperiode van stap 3.4.2.3 en worden cryosecties van het gedifferentieerde weefsel in de vorm van de pellet verkregen. Laat de glaasjes aan de lucht drogen en op kamertemperatuur zijn voordat u doorgaat met het kleuren.
- Volg voor de afstamming van chondrocyten de aanwijzingen van de kleurset om voldoende wasoplossing toe te voegen, verwijder deze, voeg de fixeeroplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten. Wassen met gedestilleerd water, de kleuroplossing toevoegen en 30 minuten incuberen. Driemaal wassen met 0,1 N zoutzuur; Voeg gedestilleerd water toe om de zuurgraad te neutraliseren. Observeer de gekleurde cellen onder een helderveldmicroscoop.
- Gebruik voor 2D-culturen de gedifferentieerde (test) en ongedifferentieerde MSC's (controleplaten) (uit stap 3.4.1.5.) voor het kleuren, verwijder eerst de media en was tweemaal met PBS. Fixeer de cellen met 4% PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en was eenmaal met PBS. Voer de kleuring voor elke afstamming als volgt uit.
(1)4. Kleuring van het celoppervlak voor immunofenotypering
OPMERKING: Aanbevolen celkweekplaten voor het verkrijgen van een optimaal aantal cellen in stappen 4.2-4.5 zijn schalen van 100 mm of T75-kolven.
- Celvoorbereiding voor flowcytometrische experimenten
- Trypsiniseer en verzamel de cellen uit een confluente schaal/kolf en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 300 × g om de celpellet te verkrijgen.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml media en bepaal het levensvatbare celgetal met behulp van een hemocytometer volgens de trypanblauwe uitsluitingsmethode.
- Centrifugeer de celsuspensie na het tellen opnieuw en spoel de pellet nog twee keer met 1 ml kleurbuffer.
- Gooi het supernatans weg en breng de pellet ten slotte opnieuw in een geschikt volume van de kleuringsbuffer, afhankelijk van het protocol (zie stappen 4.2 tot 4.5).
- Voorbereiding van compensatiecontroles
- Neem zeven FACS-buizen en label ze als Ongekleurd, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 en APC.
- Resuspendeer de laatste pellet in de kleurbuffer (zie stap 4.1.) met behoud van een celdichtheid van 0,5 × 10,6 cellen per 50 μL per buisje voor de Ongekleurde en DAPI buisjes.
- Bereid de enkelvoudig gekleurde buizen voor op compensatie zoals beschreven in tabel 4.
- Draai elke buis na bereiding voorzichtig in een draaikolk en incubeer gedurende 30 minuten in het donker.
- Na de incubatie twee wasbeurten geven door 1 ml kleurbuffer aan elke tube toe te voegen, gevolgd door een korte vortex en centrifugeren bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleurbuffer en zet deze opzij tot de acquisitie.
- Voer voor de DAPI-buis een warmteschokbehandeling uit door deze gedurende 5 minuten in een waterbad van 60 °C te incuberen, gevolgd door 15 minuten op ijs. Voeg 5 μL DAPI toe aan de suspensie en bewaar deze in het donker tot de run-acquisitie.
- Voorbereiding van fluorescentie min één (FMO) controles
- Resuspendeer de laatste pellet in kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 0,5 ×10,6 cellen per 50 μL voor elk buisje.
- Neem vijf FACS-buizen en label ze als CD44-V450-isotype, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5-isotype en CD105-APC-isotype.
- Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor volgens tabel 5.
- Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleuringsbuffer en zet deze opzij tot hij wordt verkregen.
- Voorbereiding van monsters voor analyse
- Resuspendeer de laatste pellet in de kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 0,5 × 106 cellen per 50 μl voor elke buis.
- Neem twee FACS-buizen en label ze als gemengde buizen 1 en 2.
- Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor volgens tabel 6.
- Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleuringsbuffer en zet opzij tot het wordt verkregen.
- Voorbereiding van monsters voor eencellige sortering
- Neem twee FACS-buisjes, voeg 1 ml FBS toe en rol het buisje rond tot er een gelijkmatige laag FBS is gevormd aan de binnenkant van elk buisje. Incubeer dit gedurende 1-2 uur terwijl u het monster verwerkt voor kleuring. Label deze buizen als Gemengde buizen 1 en 2.
- Resuspendeer de laatste pellet in de kleuringsbuffer (zie stap 4.1) met een celdichtheid van 2-3 × 106 cellen per 50 μL voor elke buis.
- Bereid de cel- en antilichaamsuspensie voor in gemengde buisjes 1 en 2 volgens tabel 7.
- Draai de buizen voorzichtig en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Geef na incubatie twee wasbeurten met 1 ml kleurbuffer aan elke buis, gevolgd door een korte vortex en centrifugatie bij 200 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 500 μL kleurbuffer en zet opzij. Voeg 15 minuten voor het sorteren 5 μL DAPI toe.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat voor sorteerexperimenten een hogere celdichtheid per buis wordt aanbevolen.
| Type buis | Positieve Comp kralen* | Negatieve Comp kralen* | Cellen | Antilichaam toegevoegd | |
| FITC-buis | 1 druppel | 1 druppel | – | Anti-humaan CD90-FITC (2 μL) | |
| V450 buis | 1 druppel | 1 druppel | – | Anti-humaan CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5.5 buis | 1 druppel | 1 druppel | – | Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL) | |
| PE-buis | 1 druppel | 1 druppel | – | Anti-humaan CD45-PE (2 μL) | |
| APC-buis | 1 druppel | 1 druppel | – | Anti-humaan CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI buis | – | – | 50 μL | – | |
| Ongekleurde buis | – | – | 50 μL | – | |
| *1 druppel = 60 μL parelsuspensie | |||||
Tabel 4: Controlemonsters voor compensatie. Afkortingen: Comp = compensatie; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.
| BUIS TYPE | ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (2 μL) | ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (2 μL) | ISOTYPE ANTILICHAMEN TOEGEVOEGD (2 μL) | TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN | VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD | VOLUME VAN DE TOEGEVOEGDE KLEURINGSBUFFER | ||
| CD90-FITC FMO buis | - Anti-menselijke CD44-V450 | Anti-humaan CD45-PE | FITC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menselijk CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO-buis | - Anti-menselijke CD44-V450 | Anti-humaan CD45-PE | PerCP Cy 5.5 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menselijk CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO buis | - Anti-menselijk CD90-FITC | Anti-humaan CD45-PE | V450 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO-buis | - Anti-menselijke CD44-V450 | Anti-humaan CD45-PE | APC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menselijk CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| CD45-PE FMO-buis | - Anti-menselijke CD44-V450 | - | PE IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menselijk CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-humaan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||||
Tabel 5: FMO-controlemonsters. Afkortingen: FMO = fluorescentie min één; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.
| BUIS TYPE | ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (2 μL) | ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (2 μL) | TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN | VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD | VOLUME VAN DE TOEGEVOEGDE KLEURINGSBUFFER | |
| Gemengde buis 1 | - Anti-menselijke CD44-V450 | Anti-humaan CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-menselijk CD90-FITC | ||||||
| - Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||
| Gemengde buis 2 | - Anti-menselijke CD44-V450 | Anti-humaan CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-menselijk CD90-FITC | ||||||
| - Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-menselijk CD105-APC | ||||||
Tabel 6: Monsterbuisjes voor meerkleurige immunofenotypering van SHED's. Afkortingen: SHEDs = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden; PE = fycoerythrine.
| BUIS TYPE | ANTILICHAAM TEGEN POSITIEVE MARKER (3 μL) | ANTILICHAAM TEGEN NEGATIEVE MARKER (3 μL) | TOTAAL VOLUME ANTILICHAMEN | VOLUME VAN CELSUSPENSIE TOEGEVOEGD | VOLUME VAN VLEKBUFFER TOEGEVOEGD | |
| Gemengde buis 1 | - Anti-menselijk CD90-FITC | Anti-humaan CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Gemengde buis 2 | - Anti-menselijk CD90-FITC | Anti-humaan CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-menselijk CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tabel 7: Eencellige sorteerreactiebuisjes. Afkortingen: FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.
5. Sorteren in één cel
- Voorbereiding van de celsorteerder
- Installeer een mondstuk van 100 μm in de sorteerder.
OPMERKING: Het juiste mondstuk is ten minste vijf keer de diameter van het te sorteren deeltje. De voor het sorteren te gebruiken omhulselvloeistof moet worden bepaald op basis van het type monster en de gevoeligheid van het experiment; Voor dit experiment is gepatenteerde omhulselvloeistof gebruikt. - Voer de dagelijkse kwaliteitscontrole van het instrument (QC) uit en stel de sorteerder in voor het experiment. Raadpleeg de handleiding van het instrument voor een gedetailleerde handleiding voor het instellen van het instrument.
- Installeer een mondstuk van 100 μm in de sorteerder.
- Opstellen van de compensatiematrix
- Stel de compensatiematrix in met behulp van enkelvoudige compensatiebuisjes uit stap 4.2.
- Selecteer in de propriëtaire software Experiment in de werkbalk en klik op Compensatie instellen. Open Compensatiebesturingselementen maken.
- Controleer de markeringen en bevestig. Er wordt een nieuw preparaat toegevoegd met de naam "Compensatie", waarbij nieuwe buisjes, de markercontroles genaamd, automatisch door de software worden toegevoegd.
- Selecteer de Onbevlekte buis en voer deze uit om 5.000 gebeurtenissen op te nemen. Sleep de poort naar de celpopulatie en pas deze toe op alle compensatiebesturingselementen. Dit is om de spanningen en negatieve poort voor elke fluorescerende parameter in te stellen.
- Laad op dezelfde manier de compensatiebuizen voor één vlek afzonderlijk en registreer en bewaar de gegevens. Selecteer de poort die de populatie van belang afbakent en pas deze toe op alle compensatiecontroles. Dit is om de positieve poorten voor elke fluorescerende parameter in te stellen.
- Selecteer Experiment in de werkbalk en klik op Compensatiewaarden berekenen | link en opslaan.
NOTITIE: Zodra de auto-comp-matrix is gegenereerd met behulp van de software, kunnen de spanningsparameters van de fluorochromen niet worden gewijzigd voor een van de kanalen in de gemengde buizen.
- Data-acquisitie
- Noteer 10.000 cellen in elke buis uit stap 4.3. en 4.4 om gegevens te verzamelen voor analyse van het immunofenotype van de cellen.
- Voorbereiding van de inzamelingsapparaten
- Afhankelijk van het doel van de gesorteerde celpopulaties, kunt u kiezen tussen platen met 6 putjes, 24 putjes, 48 putjes of 96 putjes.
- Smeer de putjes in met 200-500 μL FBS en houd de platen 2 uur ongemoeid.
- Verwijder na 2 uur de resterende FBS en voeg 200-500 μL 10% MSC-kweekmedia toe.
- Cellen sorteren in de sorteermodus voor één cel
- Voer Mixed tube 1 uit (vanaf stap 4.5) en noteer 10.000 gebeurtenissen om de poorten in te stellen op de populatie van belang die moet worden gesorteerd, met behulp van de juiste poortstrategie.
- Laad een verzamelplaat en stel het aantal doelcellen in tussen 2.500 en 5.000 cellen/put en selecteer het eencellige sorteerzuiverheidsmasker.
- Verzamel de gesorteerde populaties in het verzamelapparaat en bewaar ze op ijs tot het einde van het sorteerexperiment.
- Als u klaar bent, brengt u de platen over naar de 5% CO2 -incubator om de culturen op 37 °C te houden.
OPMERKING: Na de acquisitie werden onbewerkte gegevensbestanden geëxporteerd als .fcs-bestandsindeling (v.3.0. en hoger). De sorteerrapporten die na elk experiment werden gegenereerd, registreerden het aantal gebeurtenissen/cellen, gesorteerd op toegewezen put, en gaven het aantal conflicten aan dat werd afgebroken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De SHED's werden gekarakteriseerd met standaard immunofluorescentietesten die de expressie van vimentine (rode, type III intermediaire filamenten), actinefilamenten (Alexa fluor 488 phalloidine probes) en kernen gekleurd met DAPI (Figuur 1A) aantoonden. Om hun proliferatieve en kolonievormende capaciteiten te schatten, werden standaard kortetermijncelgroeitesten uitgevoerd. Een 14,3-voudige toename van de proliferatiesnelheid van dag 2 tot dag 8 is aangetoond in figuur 1B. De clonogene eigenschappen van de SHED's werden bepaald aan de hand van de CFU-F-assays die in figuur 1C-E worden getoond. Volgens de ISCT-criteria waren de multipotente MSC's in staat om te differentiëren in de drie mesodermale afgeleide afstammingslijnen. Cytochemische kleuring met Oil Red O werd gebruikt om de oliedruppels in de gedifferentieerde adipocyten te detecteren (Figuur 1F); von Kossa-kleuring werd gebruikt om de calciumafzettingen in de matrix van de gedifferentieerde osteoblasten te kleuren (figuur 1G); en de aggrecanen in de 3D-cultuur werden gekleurd voor Alcian Blue in de gedifferentieerde chondroblasten (Figuur 1H).
Om het immunofenotype van de SHED's te karakteriseren, werden multiparametrische flowcytometrietests ingesteld. De experimenten werden uitgevoerd samen met het gebruik van vier soorten experimentele controles, namelijk compensatiecontroles (tabel 4), FMO- en isotypecontroles (tabel 5) en ongekleurde controles. De isotypen van alle gebruikte MSC- en HSC-antilichamen werden samen met de FMO-buisjes toegevoegd om onderscheid te maken tussen positieve versus negatieve signalen en hoge versus zwakke antigeenexpressie. Figuur 2A toont de verdeling van de gebruikte FMO- en isotypecontroles per experiment. De representatieve dichtheidsgrafieken toonden geen expressie van het FITC-isotype van CD90 FITC-antilichamen. Evenzo vergeleken de histogramoverlays (figuur 2B) de expressieniveaus van de gekleurde monsters samen met hun controles in de respectievelijke kanalen van FITC, PerCP Cy5.5 en PE. De positieve expressie van de markers CD90 en CD73 (rode histogrammen) en de negatieve expressie van CD45 zijn vergelijkbaar met die van hun ongekleurde en FMO-controles (respectievelijk blauwe en zwarte histogrammen).
Op flowcytometrie gebaseerde karakterisering van de immunofenotypes heeft de markerverdeling van een van de vroege passages (P6) SHED's aangetoond (Figuur 3A-H). Zowel de door ISCT aanbevolen markers als CD44 bepaalden de ouderpopulaties als MSC's. De tetra-positieve populatie die in de dichtheidsgrafieken werd aangetoond, vertoonde ≥98% expressie van CD90+CD73+CD105+CD44+ en ≤2% expressie van CD45-markers. Meer dan vijf onafhankelijke experimenten lieten vergelijkbare resultaten zien. De SHED's met late passage (P12), die differentiële expressie van de positieve markers vertoonden, werden gekozen voor eencellige sortering van hoge en zwakke expressoren (Figuur 4A-H). Volgens de gating-strategie (Figuur 4H) werden singlets→ levende cellen→ niet-HSC's→ dubbelpositieve CD73+CD90+ en enkelvoudige positieve CD73+CD90-populaties gesorteerd met behulp van de sorteermodus voor één cel. De gesorteerde populaties werden verzameld in plaatlay-outs met 96 putjes/48 putjes/6 putten met verschillende zaaitellingen per put (aanvullend bestand 1). Er werden drie opeenvolgende pogingen gedaan in een enkele fase van sorteerexperimenten en de overlevingskansen van cellen na het sorteren (in de dubbel-positieve uitdrukkers: CD90+CD73+) per experiment was 100%. Er zijn drie onafhankelijke fasen van experimenten uitgevoerd. We hebben het aantal cellen dat per put groeide, gekoppeld aan het aantal cellen dat per put werd gesorteerd.
Figuur 5A laat zien dat de CD90+CD73+ nagesorteerde cellen die in de plaat met 96 putjes waren verzameld, net als hun ouderpopulatie hechting en proliferatie vertoonden. Er is waargenomen dat de gesorteerde cellen op de zesde dag na het sorteren 70-80% confluentie bereiken. De verkleefde en prolifererende nagesorteerde cellen werden gedifferentieerd in aanwezigheid van adipogene groeifactoren en vervolgens na dag 15 gekleurd met Oil Red O met behulp van geschikte nagesorteerde controlecellen (ongedifferentieerde) (figuur 5B,C).
Figuur 1: Karakterisering van stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden. (A) Immunofluorescentiekleuring bevestigt dat de geïsoleerde MSC's vimentine (rode, type III intermediaire filamenten), actinefilamenten (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) en DAPI (blauw, kernen) tot expressie brengen. Microfoto verkregen bij originele vergroting van 20x. Schaalbalk = 10 μm. (B) De kortetermijncelgroeitest van SHED's vertoont hun hoge proliferatieve capaciteit, zoals blijkt uit de significante toename van het aantal cellen in kweek op dag 2 en een 14,3-voudige toename van de proliferatiesnelheid aan het einde van dag 8 (n = 3, p-waarde<0,01). Er zijn foutbalken met standaarddeviatie weergegeven. (C-E) CFU-F-assay en kristalvioletkleuring bevestigen het kolonievormende vermogen van SHED's; (C) er wordt verwacht dat zich na 14 dagen in cultuur meerdere kolonies zullen vormen; D) één enkele clonogene kolonie die afkomstig is van één enkele cel; (E) Kristalviolet gekleurde enkele kolonie van SHED's vertoont de typische fibroblastachtige morfologie van de cellen. (F-H) MSC's zullen naar verwachting onder geschikte in vitro omstandigheden tegen dag 21 differentiatie ondergaan in adipogene, osteogene en chondrogene afstammingslijnen. Cytochemische kleuring toont (F) Oil Red O (inzet toont 40x afbeelding van adipocyt met oliedruppels), (G) von Kossa en (H) Alcian Blue-kleuring voor respectievelijk adipogene, osteogene en chondrogene afstammingslijnen op dag 22. Microfoto's worden verkregen met een originele vergroting van 20x. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: MSC's = mesenchymale stamcellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; SHED's = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden; CFU-F = kolonievormende eenheid-fibroblast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Negatieve controles gebruikt in multiparametrisch experiment . (A) Fluorescentie minus één controles zijn weergegeven in tabelvorm, waarbij FMO-controles zijn vervangen door hun specifieke isotypen. De representatieve dichtheidsgrafieken (van links naar rechts) tonen de ongekleurde controle (links), FMO van CD90 FITC (midden) met alle antilichamen toegevoegd behalve CD90 FITC samen met de toevoeging van CD90 FITC-isotype, en volledig gekleurd monster met alle antilichamen van het panel toegevoegd (rechts). (B) Histogramoverlay vertegenwoordigt de vergelijking van drie soorten monsters, zwart staat voor FMO, blauw staat voor niet-gekleurd en rood staat voor volledig gekleurde monsters in hun respectievelijke kanalen. Afkortingen: FMO = Fluorescentie min één; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit; PE = fycoerythrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Multiparametrische immunofenotypering van SHED's (P6). (A) SSC-A versus FSC-A: Op basis van hun zijwaartse en voorwaartse verstrooiingseigenschappen zijn cellen van belang omheind en gescheiden van het puin; (B) FSC-H versus FSC-A en (C) SSC-H versus SSC-A: De twee waarnemingspunten worden gebruikt voor doubletdiscriminatie, waardoor enkelingen kunnen worden geselecteerd en aggregaten die vals-positieve signalen kunnen genereren, worden geëlimineerd; (D) SSC-A versus CD45 PE: Exclusion gating maakt selectie van de CD45-populatie uit de singlets mogelijk; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 versus CD90 FITC: Van de CD45-levende singlets zijn CD90+CD73+-cellen gegated; (F) CD44 V450 versus CD105 APC: De CD90+CD73+-populatie wordt verder omheind om de tetra-positieve CD90+CD73+CD44+CD105+-cellen te definiëren; (G) SSC-A versus tijd(en): De plot toont de stabiele acquisitie in de loop van de tijd (seconden) en dat er geen gebeurtenissen zijn die drukschommelingen veroorzaakten tijdens acquisitie; (H) Hiërarchie van poorten. Afkortingen: SHEDs = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit; SSC-A = zijwaarts verstrooiingspiekgebied; FSC-A = voorwaarts verstrooiingspiekgebied; FSC-H = voorwaartse strooipiekhoogte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Eencellige sortering van immunofenogetypeerde SHED's (P12). (A-F) Een stapsgewijze, op uitsluiting gebaseerde poortstrategie om zuivere MSC's in de volgende volgorde te sorteren: cellen naar singlets_1, naar singlets_2, naar DAPI-levende cellen, naar CD45- niet-hematopoëtische cellen en tenslotte naar CD90+CD73+-cellen. De gated populaties die in (F) worden weergegeven, zijn gesorteerd met behulp van de sorteermodus met één cel. (G) De grafiek SSC-A versus tijd(en) beschrijft de ononderbroken sortering van de monsters. (H) Hiërarchie van poorten. (n=3, sorteerefficiëntie = 100%). Afkortingen: SHEDs = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden; MSC's = mesenchymale stamcellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit; SSC-A = zijwaarts verstrooiingspiekgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Morfologische en functionele karakterisering van nagesorteerde SHED's. (A) Fasecontrastbeelden van nagesorteerde populaties werden verzameld in een plaat met 96 putjes op dag 6 bij een oorspronkelijke vergroting van 10x, schaalbalk = 10 μm (inzet toont een 20x-afbeelding van de gesorteerde afzonderlijke cellen die de morfologie veranderen in fibroblastachtige MSC's). Cytochemische kleuring voor adipogene differentiatie met behulp van Oil Red O waargenomen in (B) ongedifferentieerde (controle) en (C) gedifferentieerde postsort-populatie bij een oorspronkelijke vergroting van 20x, schaalbalk = 10 μm (inzet toont een 40x afbeelding van de waargenomen oliedruppels). Afkortingen: SHEDs = stamcellen van menselijke geëxfolieerde melktanden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Gecompileerde sorteerrapporten die per experiment zijn gegenereerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Optische configuratie van BD FACSAria Fusion. Afkortingen: LP = long pass; PMT = fotomultiplicatorbuis; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op het gebied van weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde, onder de postnatale bronnen, hebben MSC's afkomstig van oraal weefsel grote belangstelling gewekt vanwege hun minimale ethische verplichtingen en opmerkelijk differentiatiepotentieel voor meerdere afstammingslijnen21. Tandpulpstamcellen (DPSC's) van de getroffen derde kies en SHED's hebben de meeste aandacht gekregen onder tandheelkundige MSC's vanwege hun therapeutisch potentieel bij neurodegeneratieve en traumatischeziekten22. Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, helpt bij het karakteriseren van SHED's met behulp van een multiparametrische benadering en het verder sorteren van populaties van belang met behulp van de single-cell sort-benadering. De toepassing van dit protocol is echter niet alleen beperkt tot orale MSC's, maar kan ook worden gebruikt voor immunofenotypering en sortering van MSC's uit andere bronweefsels in het menselijk lichaam23.
Verschillende cruciale stappen in dit protocol moeten hier worden besproken voor een succesvolle implementatie voor het behandelde biologische probleem. De sleutel tot elk sorteerprotocol is het controleren van twee belangrijke componenten: de biologische controles en de experimentele controles. Om te beginnen zorgt schoon cultuuronderhoud ervoor dat het gebruikte monster niet wordt aangetast tijdens het sorteren. De levensvatbaarheid van de cellen in de eencellige voorsortering van suspensie moet ervoor zorgen dat met meer dan 70 % levensvatbare celpopulaties wordt begonnen, gevolgd door analyse en sortering van gezonde subpopulaties. De vlekbuffer die in de eencellige suspensie wordt gebruikt, moet 2% FBS bevatten en experimenten kunnen het beste bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Selectie van de juiste samenvloeiing van deze primaire cellen (80-85% samenvloeiing) voorkomt dat hun cellevensvatbaarheid in gevaar komt en vermindert de kans op grote aggregaten. Bovendien is het gebruik van een levende/dode marker (DAPI in dit protocol) essentieel voor elk sorteerexperiment. In deze studie, aangezien de gebruikte monsters MSC's waren met een geschatte diameter van 20-35 μm, was de gekozen nozzle-grootte 100 μm om ze te sorteren bij een druk van 20 psi op de BD FACSAria Fusion. Dit maakte het mogelijk om cellen te sorteren zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen tijdens het proces bij een lagere manteldruk. Voor gedetailleerde voorwaarden voor het instellen van de sortering wordt aanbevolen om de software BD FACSDiva guide24 te raadplegen.
Een essentiële voorwaarde voor meerkleurige experimenten in flowcytometrie is de behoefte aan geschikte controles; er zijn vier belangrijke soorten controles die hier worden gebruikt: autofluorescentie, isotypen, FMO en compensatieregelingen. De auto-compensatiematrix maakte nauwkeurige compensatie mogelijk, waardoor spectrale doorbloeding in de detectoren werd voorkomen, en gebruikte hiervoor zowel compensatieparels als cellen. Het ongekleurde monster bepaalde de drempelwaarde voor autofluorescentie van de MSC's. De gemengde buisjes met alle vier de antilichamen bevatten het isotype en de FMO's van elk gebruikt antilichaam. De DAPI-compensatieregeling werd uitgevoerd met behulp van MSC's, die afzonderlijk werden verwerkt (met hitteschok). Het antilichaampanel (zoals aangegeven in tabel 8) dat hier wordt gebruikt, is specifiek ontworpen voor hMSC's op basis van de criteria die zijn vermeld door de ISCT en de instrumentconfiguratie van de BD FACSAria Fusion-celsorteerder (zie aanvullende tabel S1). Dit is zeer cruciaal tijdens de planning van multiparametrische flowcytometrie-experimenten. Het karakteriseringspanel dat wordt gebruikt voor immunofenotypering bestaat uit vier positieve MSC-markers (CD90, CD105, CD73 en CD44) en één negatieve marker (CD45). Het paneel voor het sorteerexperiment bevat daarentegen twee positieve markers (CD90 en CD73), een negatieve marker (CD45) en een levende/dode marker (DAPI) om een hoog aantal levende MSC's te garanderen.
| Antilichaam/marker | Fluorochroom | hMSC Oppervlakte Profiel | Laser golflengte (nm) | Excitatie piek (nm) | Emissiepiek (nm) |
| CD44 | V450 | Moet uitdrukken; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 | FITC | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 | PE | Mag NIET uitdrukken; <2% | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Dode cel marker | 405 | 358 | 461 |
Tabel 8: Meerkleurig paneel ontworpen voor karakterisering en sortering van SHED's door middel van flowcytometrie. Afkortingen: FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; APC = allofycocyanine; PE = fycoerythrine; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit.
Selectie van het masker van de soortzuiverheid
Gezien de onvoorspelbaarheid van cellulaire heterogeniteit in MSC's, is het mogelijk dat bulksortering niet noodzakelijkerwijs het zuiverheidsniveau van de gesorteerde populaties bereikt. We hebben het single-cell sorteerprotocol in deze studie geoptimaliseerd om de single-cell klonen te identificeren en hun functionele eigenschappen na het sorteren te volgen in termen van potentie. Eencellige sortering werd uitgevoerd op een BD FACSAria Fusion, die de flexibiliteit had van de volgende instellingen: keuze uit 100 μm mondstuk, 20 psi manteldruk, een debiet dat instelbaar is (gehandhaafd op 20 μL/min) en drempelsnelheid bij 380 gebeurtenissen/s. De kans om twee doelcellen te selecteren in plaats van één is bij deze methode minimaal. Normaal gesproken wordt de sorteermodus voor één cel van het algoritme geselecteerd die het sorteren van zuivere populaties van doelcellen kan oplossen en kan overwegen hoeveel druppels zullen worden gesorteerd in het verzamelapparaat van uw keuze. De precisiemodus moet uiteindelijk nauwkeurig worden gekozen, zodat deze de maskers die beschikbaar zijn in de sorteeralgoritmen kan combineren en een strikte sorteervoorwaarde kan creëren om de zuiverste populaties van belang te sorteren. De sorteermodus voor één cel doet geen concessies aan een doelcel als deze tijdens het sorteren wordt samengevoegd tot een niet-doelcel en dat het zuiverheidsniveau bereikt waar we naar uitkijken in deze aanpak. Dit was de module die in dit protocol was geselecteerd en de gesorteerde cellen werden verzameld in plaatapparaten met 96 putjes, 48 putjes, 24 putjes en 6 putjes.
In deze studie hebben we subpopulaties gesorteerd op basis van hun differentiële immunofenotype, namelijk CD90+CD73+CD45-. In zowel karakteriserings- als sorteerprotocollen is onze gatingstrategie (zoals weergegeven in figuur 3 en figuur 4) gebaseerd op uitsluiting van de CD45-populatie om ons de niet-hematopoëtische populatie te geven (zoals deze eerder zijn gevalideerd en gekarakteriseerd met de door ISCT voorgeschreven markers), na de identificatie van singlets. Uiteindelijk werden de MSC's geïdentificeerd uit de CD45-populatie met behulp van de positieve ISCT-markers. Het is vermeldenswaard dat er niet veel verschil in percentages is bij het eerst afschermen van de positieve uitdrukkers van ISCT-markers, gevolgd door de negatieve uitverdelers van CD45. Omdat het doel van deze sortering echter was om cellen te identificeren die een veranderde expressie van de bekende MSC-markers vertonen, hebben we onze analyse afgesloten met de positieve expressieplots.
In de representatieve cijfers zijn 97% van de CD45-cellen MSC's, maar tijdens de kwantificering van de antigeenexpressies hebben we gezien dat 75% van de cellen dubbel-positieve expressoren zijn van de twee markers CD90 en CD73, terwijl er verschillende populaties zijn die single-positieve expressoren zijn van dezelfde markers (weergegeven in figuur 3F) en enkele cellen die de markers helemaal niet tot expressie brengen.
Tijdens de karakterisering van deze cellen hebben we de subpopulaties geïdentificeerd als tetra-positieve MSC's, triple-positieve en dubbel-negatieve populaties. Deze differentiële expressie van MSC-markers breidt zich uit met toenemende passages en dus ontstaat de noodzaak om dit verschil te bestuderen en te correleren met hun functionele eigenschappen. Het uiteindelijke doel van het sorteren van MSC's in onze studie is om een vergelijkende analyse te maken tussen de geïdentificeerde subpopulaties en te bepalen of de differentiële expressies van positieve markers functionele implicaties hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Acknowledgments
We danken de Flow Cell Facility van het Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, India, voor het gebruik van de kernfaciliteit voor flowcytometrie. De cryo-sectie van de pelletcultuur van gedifferentieerde cellen werd uitgevoerd in het Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, India. Dit werk werd ondersteund door de intramurale financiering van UC van de Manipal Academy of Higher Education (MAHE), India. AG is dankbaar voor de steun van de Dr. T. M. A. Pai Scholarship van MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
