Summary
이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.
Abstract
유기체의 중간엽 줄기세포(MSC)는 체내에서 여러 계통의 성체 세포로 분화할 수 있는 특별한 능력을 가지고 있으며 면역 조절 및 항염증 특성으로 알려져 있습니다. 이러한 줄기 세포의 사용은 재생 생물학 분야에 도움이 되지만 동시에 이와 관련된 여러 세포 모호성으로 인해 재생 의학 및 치료제에 골칫거리가 됩니다. 이러한 모호성은 줄기세포의 출처의 다양성과 체외 성장 조건에서 발생할 수 있으며, 둘 다 기능적 이질성을 반영합니다.
이는 치료 응용 분야를 위해 정제된 균질한 MSC 집단을 제공하는 방법론을 보증합니다. 유세포 분석 분야의 발전으로 다중 파라미터 접근법을 사용하여 단일 세포 집단을 검출할 수 있게 되었습니다. 이 프로토콜은 형광 보조 단일 세포 분류를 통해 인간 박리 낙엽 치아(SHED)에서 줄기 세포를 식별하고 정제하는 방법을 설명합니다. 표면 마커, 즉 CD90-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), CD73-페리디닌-엽록소-단백질(PerCP-Cy5.5), CD105-알로피코시아닌(APC) 및 CD44-V450의 동시 발현은 다중 파라미터 유세포 분석을 사용하여 MSC의 "밝은" 양성 발현체를 식별했습니다. 그러나 7번 구절부터 이후 구절까지 이러한 양성 마커의 4중 표현자의 비율이 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다.
면역표현형 하위집단은 2개의 양성 마커와 1개의 음성 마커만 포함 기준을 구성하는 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. 이 방법론은 분류된 집단의 세포 생존력을 보장하고 분류 후 세포 증식을 유지했습니다. 이러한 분류를 위한 다운스트림 응용 프로그램은 제어된 하위 모집단에 대한 계통별 분화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 분리 조건을 개선하고 다중 세포 표면 마커 정보를 획득하기 위해 다른 단일 세포 시스템에 적용될 수 있습니다.
Introduction
중간엽 줄기 세포(MSC)는 세포 기반 치료에 적합한 확장 가능한 세포 공급원으로 간주될 수 있으며 재생 의학의 황금 표준 시스템으로 간주될 수 있습니다. 이 세포는 조직 기원이 다른 신체의 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다1. 소스 조직에 따라 각 유형의 MSC는 모호한 in vitro 거동을 나타낸다 2. 이것은 형태학적, 기능적 특성에서 잘 관찰된다3. 여러 연구에서 MSC2,4의 성인 조직 분화, 게놈 상태, 대사 및 세포 구조를 포함한 차원의 클론 내 변이가 나타났습니다.
세포의 면역표현형은 줄기세포 식별을 위한 유세포 분석의 일반적인 응용 분야였으며 2006년 국제 세포 및 유전자 치료 학회(ISCT)에서 세포를 MSC로 식별하기 위한 최소 기준 목록을 처방하는 데 활용되었습니다. 이 연구는 체 외에서 플라스틱 부착 및 세 가지 계통(골형성, 연골형성, 지방형성)으로 분화할 수 있는 능력과 함께 세포 집단의 ≥95%가 CD105, CD73, CD90을 발현해야 하며, 이러한 세포는 유세포분석으로 측정한 CD34, CD45, CD11b, CD14 및 HLA-DR의 발현(≤2% 양성)이 부족해야 한다고 밝혔습니다 5. MSC는 ISCT의 최소 기준에 따라 일련의 바이오마커로 정의되었지만, 이러한 바이오마커로 면역 특성을 벤치마킹할 수 없었으며, 연구 간 비교 및 클론 변이를 더 쉽게 정량화하기 위해 이러한 기준을 넘어서는 것이 필요했습니다2.
ISCT가 정한 지침에도 불구하고, MSC에 대한 광범위한 연구는 이 집단에 이질성이 존재한다는 것을 보여주었으며, 이는 주로 MSC 공여체6, 조직 공급원7,클론 집단 내의 개별 세포8 및 배양 조건 2,9 사이에서 발생하는 이질성의 유비쿼터스 특성으로 인해 발생할 수 있는 다양한 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 10. 다양한 조직 공급원에서 이러한 일차 세포의 특성 분석 및 정제를 통해 품질과 세포 운명을 보장하는 것이 생산의 핵심 단계입니다. 모집단 간에 나타난 변이를 이해하기 위해서는 이를 별도로 나누고 수집할 수 있는 하위 모집단으로 해석하는 효율적인 방법이 필요하다11. 단일 세포 수준 분석은 세포 간 변이의 문제를 극복하고, 이질적인 집단에서 발생하는 생물학적 노이즈를 줄이며, 희귀 세포를 조사하고 특성화할 수 있는 기능을 제공합니다12.
목적과 선택한 매개변수에 따라 선택한 모집단을 정렬하고 보강하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 세포 분류 기술은 벌크 분류 및 단일 세포 분류 방법 모두를 포함할 수 있습니다. 벌크 분류는 자기 활성화 세포 분류(MACS)13, 분획14 및 용출15을 통해 표적 집단을 농축할 수 있는 반면, 단일 세포 분류는 형광 활성화 세포 분류(FACS)11를 통해 보다 균질한 집단을 농축할 수 있습니다. 이러한 각 방법의 장점과 단점을 비교 분석한 것이 표 1에 강조 표시되어 있습니다.
표 1: 다양한 기법의 비교 분석: MACS, 분획, 용출 및 FACS는 원리의 차이점과 특정 기법을 다른 기법보다 선택할 때의 장단점을 강조합니다. 약어: MACS = 자기 활성화 세포 분류; FACS = 형광 활성화 세포 분류. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
이 기법의 출현 이후로, 단세포 유세포분석법은 이종 샘플(17)에서 특정 세포 집단의 열거(enumeration)16, 검출 및 특성화(characterization)에 중요한 역할을 해왔다. 2006년 Hewitt et al.은 분화된 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 균질한 풀의 분리를 강화하기 위해 자동화된 세포 분류 방법론의 토대를 마련했습니다18. 단일 세포 분류는 GFP 형질도입 hESC의 집단을 풍부하게 하여 유전자 변형 클론의 분리를 촉진하여 임상 연구의 새로운 차원을 열었습니다. 정렬 효율성을 개선하기 위해 일반적으로 두 가지 접근 방식이 취해졌습니다. 분류된 집단의 수집 배지가 후-분류된 세포(19 )의 생존 및 증식을 유지하기 위해 변형되거나, 세포-분류 알고리즘/소프트웨어가 적절하게 변형되거나(12).
기술의 발전으로 상용 유세포 분석기와 세포 분류기는 깨지기 쉬운 희귀 세포 집단, 특히 기원이 다른 줄기 세포를 무균 분류하는 동안 발생하는 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있었습니다. 줄기세포 생물학자들의 주요 과제 중 하나는 유전자 편집 연구에서 요구되는 형질주입 프로토콜에 따라 인간 만능 줄기세포의 클론 분리였다19. 이 문제는 단일 세포를 보충제 및 상업용 저분자 ROCK 억제제와 함께 마우스 배아 섬유아세포(MEF)로 코팅된 96웰 플레이트로 분류하여 해결되었습니다. 그러나, 세포 분리 전략은 분류된 개별 세포의 면역표현형을 식별하는 분류 알고리즘의 특징인 색인 분류(index sorting)의 사용으로 크게 개선될 수 있다12. 단세포 분류의 이러한 정교한 양식은 특히 희귀 조혈모세포 집단과 관련하여 줄기세포의 분류 효율을 향상시키는 데 도움이 되었을 뿐만 아니라 단세포 클론을 다운스트림 기능 분석에 효율적으로 연결하는 데 도움이 되었습니다20.
이 논문은 기능적 분화 능력을 연구하기 위해 하위 집단의 농축을 위해 인간 박리 낙엽 치아(SHED)에서 면역 표현형 줄기 세포의 단일 세포 분류에 중점을 둡니다. 두 개의 MSC 양성 마커인 CD90 및 CD73과 음성 조혈 마커인 CD45의 조합을 사용하여 MSC를 면역표현형으로 변환하고 dim 및 null 발현자를 식별했습니다. 면역 표현형에 따라 하위 집단은 순수 MSC, 단일 양성 및 이중 음성 집단으로 식별되었습니다. 이들은 마커의 차등 발현이 시험관 내 배양 조건의 인공물인지 또는 기능적 특성에도 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위한 추가 기능 연구를 위해 순수하고 농축된 하위 집단을 얻기 위해 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. "양성 MSC 마커"의 균질한 발현체가 아닌 세포를 분류하여 기능적 특성을 연구했습니다.
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Protocol
윤리 승인 및 참여 동의: 인간 박리 낙엽 치수 샘플은 병원 윤리 승인 위원회(SRGCDS)에서 정한 표준에 따라 벵갈루루의 Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital(SRGCDS) 구강악안면과에서 정보에 입각한 동의와 완전한 윤리적 승인을 받은 후 받았습니다. 그 후 SHED의 분리, 배양, 유지 관리 및 적용은 MAHE - 벵갈루루에 있는 Manipal Institute of Regenerative Medicine의 Institutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)에서 권장하는 지침에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 시약 및 완충액의 준비
- 배양 유지용
- 미분화 hESC, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-strep)(Pen-strep)에 대한 기초 배지를 사용하여 MSC 세포 배양 배지(10%)를 준비합니다(표 2).
- 미분화 hESC, 20% FBS, 1% L-글루타민 및 1% Pen-strep에 대한 기초 배지를 사용하여 MSC 세포 배양 배지(20%)를 준비합니다(표 2).
- 미분화 hESC, 1% L-글루타민 및 1% 항생제-항진균제(Anti-Anti)에 대한 기초 배지를 사용하여 중화 배지를 준비합니다(표 2).
- 유세포 분석 및 분류용
- 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% FBS를 사용하여 염색 완충액을 준비합니다.
- PBS 1mL에 1μL를 첨가하여 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(1μg/mL)의 원액을 준비합니다.
- MSC의 계통별 차별화용
- 표 3에 기재된 조성에 따라 골형성(osteogenic), 연골형성(chondrogenic) 및 지방형성(adipogenic) 분화를 위한 분화 배지를 준비한다. 준비된 부분 표본을 실험 기간 동안 4°C에서 보관합니다.
- 미분화 hESC, 2% FBS, 1% L-글루타민 및 1% Pen-strep에 대한 기초 배지를 사용하여 혈청 결핍 배지(2% 배지)를 준비합니다(표 2).
| 미디어 유형 | 미디어의 목적 | 50 mL의 조성 | ||||||||
| 증권 시세 표시기 | 펜-스트렙 | L-글루타민 | 미분화 hESC를 위한 기초 배지 | |||||||
| 미디어 10% | MSC 문화 및 유지 관리 | 5 mL | 500 마이크로리터 | 500 마이크로리터 | 44 mL | |||||
| 미디어 20% | CFU-F 분석 | 10mL | 500 마이크로리터 | 500 마이크로리터 | 39 mL | |||||
| 혈청 결핍(2%) 배지 | 분화 의정서에 있는 통제 우물을 위한 매체 | 1mL | 500 마이크로리터 | 500 마이크로리터 | 48 mL | |||||
| 중화 매체 | 트립신화 후 세포 현탁액을 중화하기 위한 배지 | - | 500 마이크로리터 | 500 마이크로리터 | 49 mL | |||||
표 2: 배양 유지 및 분석을 위한 세포 배양 배지. 약어: MSC = 중간엽 줄기 세포; CFU-F = 콜로니 형성 단위-섬유아세포.
| 구성 요소 | 골형성 배지 | 연골 배지 | 지방유발 매체 |
| 기초 배지 | 90mL | 90mL | 90mL |
| 유도 매체 | 10mL | 10mL | 10mL |
| Total Volume(총 볼륨) | 100mL | 100mL | 100mL |
표 3: SHED의 trilineage 분화를 위한 분화 매체.
2. SHED의 문화 및 유지 관리
- 10% MSC 배양 배지에서 세포를 유지하고 2일마다 또는 필요에 따라 배지 교체를 수행합니다.
- 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 95% 밀도의 세포를 트립신화합니다.
- 중화 배지를 사용하여 트립신화 후 세포를 중화합니다.
- 튜브를 300 × g 에서 실온에서 6분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
- 상층액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 10% MSC 배양 배지에 재현탁시킵니다.
- 추가 실험 또는 하위 배양을 위해 10% MSC 배양 배지가 포함된 신선하게 준비된 세포 배양 접시에 세포를 파종합니다.
참고 : SHED의 최적 파종 밀도는 100mm 접시에서 0.2 × 10 6 셀, T-75 플라스크에서 0.8 × 10 6 셀이며, 90-100 % 밀도에서 각각 1.5 × 10 6 셀 및 4 × 10 6 셀을 얻습니다.
3. MSC의 특성화
- 단기 세포 성장 분석
- 4 × 104 세포/웰을 10% MSC 배양 배지의 6웰 플레이트에 3번 파종합니다.
- 플레이트를 37°C에서 7일 동안 배양하고 2일마다 배지 교체를 수행합니다.
- 0.25% 트립신 처리를 사용하여 2일, 4일, 8일에 세포를 수확하고 배양 배지로 세척합니다.
- 실온에서 300g에서 6분 동안 세포 를 원심분리하고 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁시킵니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 트리판 블루 배제 방법으로 생존율을 결정합니다.
- 방정식 (1)을 사용하여 증식 속도를 계산합니다.
(1)
- 콜로니 형성 단위 섬유아세포(CFU-F) 분석
- 100mm 접시에 10,000개의 세포를 파종하고 20% MSC 배양 배지에서 배양합니다.
- 플레이트를 37°C에서 14일 동안 배양하고 3일마다 배지 교체를 수행합니다.
- 14 일 후, PBS로 콜로니를 헹구고 메탄올의 크리스탈 바이올렛 염료로 고정하고 PBS로 다시 헹구어 잔류 얼룩을 제거합니다.
- 군체를 세고 이미지화합니다.
참고: >50개의 셀이 있는 콜로니를 계산합니다. 콜로니 형성 효율은 콜로니 형성 단위 수로 계산됩니다.
- 면역형광 분석
- 35mm 접시에 MSC를 뿌리고 80-90% 밀도가 될 때까지 자랍니다.
- 미디어를 제거하고 PBS로 접시를 한 번 헹굽니다.
- 실온에서 1시간 동안 배양하거나 4°C에서 밤새 배양하여 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL로 세포를 고정합니다.
- 고정 후 PBST로 로커에서 3 x 5분 동안 우물을 씻습니다.
- 세포를 투과시키기 위해 PBST에 0.3% Triton X-100(PBS의 0.05% Tween 20 용액)을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 로커에 두십시오.
- 로커에서 PBST로 3 x 5분 동안 우물을 씻습니다.
- 차단을 위해 3% 소 혈청 알부민(BSA)을 추가하고 실온에서 1시간 동안 로커에 보관합니다.
- 로커에서 PBST로 3 x 5분 동안 우물을 씻습니다.
- 800μL의 1:500 희석액의 마우스 항비멘틴을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 로커에 보관한 다음 플레이트를 4°C로 옮겨 하룻밤 배양합니다.
- 다음날 1차 항체를 제거하고 로커에서 PBST로 웰을 3 x 5분 동안 세척합니다.
- 염소 항마우스 IgG(H+L) 교차흡착 2차 항체인 Alexa Fluor 555를 1:1,000 희석액 800μL를 넣고 로커의 실온에서 3시간 동안 보관합니다.
- 로커에서 PBST로 3 x 5분 동안 우물을 씻습니다.
- 1,000 μL의 PBS에 Alexa fluor 488 Phalloidin Pros 240 μL를 넣고 로커에서 60분 동안 실온에서 배양합니다.
- 로커에서 PBST로 3 x 5분 동안 우물을 씻습니다.
- 700μL의 DAPI 마운턴트를 추가하고 현미경으로 세포를 관찰합니다.
- 혈통별 차별화
- 2D 문화에 따른 차별화
- 두 개의 48웰 플레이트를 가져와서 각각 골형성 및 지방형성 계통으로 라벨을 붙입니다.
- 각 플레이트의 4개 웰에 15,000개의 세포/웰을 파종하고 10% MSC 배양 배지에서 배양합니다.
- 세포의 단층이 90% 밀도에 도달하면 처음 두 웰을 '대조군'으로 라벨링하고 기존 배지를 혈청 결핍 배지(2% 배지)로 교체합니다. 'Test'로 표시된 마지막 두 개의 웰에 지방형성 또는 골형성의 두 계통 중 하나의 분화 배지를 추가합니다. 이를 Day 0으로 표시합니다.
- 벗겨짐을 피하고 오염을 방지하기 위해 3일에 한 번씩 배지를 부드럽게 교체하십시오.
- 21일째 되는 날까지 이 상태를 유지하라. 그런 다음 염색 실험을 처리합니다.
- 3D 문화에 따른 차별화
- 3D 펠릿 배양을 사용하여 연골 분화를 수행하기 위해 2개의 15mL 튜브를 사용합니다.
- 1 × 106 세포를 각 튜브에 옮기고 300 × g 에서 6분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 하나의 튜브에 'Control'이라는 라벨을 붙이고 10% MSC 배양 배지를 추가합니다. 다른 튜브에 'Test'라는 라벨을 붙이고 연골 분화 배지를 추가합니다. 캡을 느슨하게 조인 상태에서 튜브를 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 이를 Day 0으로 표시합니다.
- 매체 교체 중에 펠릿이 빠지거나 분해되지 않도록 3일마다 매체를 조심스럽게 교체하십시오.
- 21일까지 이 상태를 유지한 다음 추가 실험을 위해 세포를 처리합니다.
- 2D 문화에 따른 차별화
- 계통 특이적 세포화학적 염색
- 2D 배양의 경우 염색을 위해 분화된(테스트) 및 미분화된 MSC(대조군) 플레이트(3.4.1.5단계)를 사용하고 먼저 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 실온에서 30분 동안 4% PFA를 사용하여 세포를 고정하고 상층액을 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 다음과 같이 각 계통에 대해 염색을 수행합니다.
- 지방 세포 계통의 경우 키트에서 투과화 용액을 추가하고 실온에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 오일 레드 O 작업 용액 1mL를 준비하고 추가하고 10분 동안 유지합니다. 얼룩을 제거하고 증류수로 5 회 씻으십시오.
- 골세포 계통의 경우 갓 준비한 질산은(증류수)을 각 웰에 5% 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 UV 아래에 유지합니다. 용액을 제거하고 티오황산나트륨 2.5%를 첨가하여 미반응 은을 제거합니다. 5분 동안 그대로 두십시오. 얼룩을 제거하고 증류수로 두 번 씻은 다음 현미경으로 염색된 세포를 관찰합니다.
- 3D 배양의 경우 3.4.2.3 단계의 분화 기간이 끝난 후 펠릿을 수집하고 펠릿 형태로 분화된 조직의 동결 절편을 얻습니다. 염색을 진행하기 전에 슬라이드를 공기 중에서 건조시키고 실온에 두십시오.
- 연골세포 계통의 경우 염색 키트의 지시에 따라 충분한 양의 세척액을 추가하고 제거하고 고정 용액을 추가하고 30분 동안 배양합니다. 증류수로 세척하고 염색액을 넣고 30분 동안 배양합니다. 0.1N 염산으로 세 번 씻으십시오. 산도를 중화하기 위해 증류수를 첨가하십시오. 명시야 현미경으로 염색된 세포를 관찰합니다.
- 2D 배양의 경우 염색을 위해 분화된(테스트) 및 미분화된 MSC(대조군) 플레이트(3.4.1.5단계)를 사용하고 먼저 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 실온에서 30분 동안 4% PFA를 사용하여 세포를 고정하고 상층액을 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 다음과 같이 각 계통에 대해 염색을 수행합니다.
(1)4. 면역표현형을 위한 세포 표면 염색
참고: 4.2-4.5단계에서 최적의 세포 수를 얻기 위해 권장되는 세포 배양 플레이트는 100mm 접시 또는 T75 플라스크입니다.
- 유세포 분석 실험을 위한 세포 준비
- 트립신화하고 합류 접시/플라스크에서 세포를 수집하고 300× g 에서 6분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다.
- 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁시키고 트리판 블루 배제 방법에 따라 혈구측정기를 사용하여 생존 가능한 세포 수를 측정합니다.
- 계수 후 세포 현탁액을 다시 원심분리하고 1mL의 염색 완충액으로 펠릿을 2회 더 세척합니다.
- 상층액을 버리고 프로토콜에 따라 적절한 부피의 염색 완충액에 펠릿을 재현탁시킵니다(4.2 - 4.5단계 참조).
- 보상 제어 준비
- 7개의 FACS 튜브를 가져와서 Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 및 APC로 라벨을 붙입니다.
- 염색되지 않은 튜브 및 DAPI 튜브의 경우 튜브당 50μL당 0.5 × 10 6개의 세포를 0.56 개의 세포 밀도를 유지하면서 염색 완충액에 최종 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 표 4에 설명된 대로 보정을 위해 단일 염색 튜브를 준비합니다.
- 준비 후 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 각 튜브에 염색 완충액 1mL를 추가하여 두 번 세척한 다음 실온에서 10 분 동안 200g에서 짧은 와류 및 원심분리를 수행합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 염색 완충액에 재현탁시킨 다음 획득할 때까지 따로 보관합니다.
- DAPI 튜브의 경우 60°C 수조에서 5분 동안 배양한 다음 얼음에서 15분 동안 배양하여 열충격 처리를 수행합니다. 현탁액에 5μL의 DAPI를 추가하고 실행이 획득될 때까지 어두운 곳에 보관합니다.
- 형광 마이너스 1(FMO) 대조군 준비
- 각 튜브에 대해 50μL당 0.5 × 106 개의 세포의 세포 밀도를 유지하면서 염색 완충액에 최종 펠릿을 재현탁시킵니다(4.1단계 참조).
- 5개의 FACS 튜브를 CD44-V450 아이소타입, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5 아이소타입 및 CD105-APC 아이소타입으로 라벨링합니다.
- 표 5에 따라 세포 및 항체 현탁액을 준비한다.
- 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 1mL의 염색 완충액으로 각 튜브에 2회 세척한 후 실온에서 10분 동안 200g에서 짧은 볼텍싱 및 원심 분리를 수행합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 염색 완충액에 재현탁시킨 다음 획득할 때까지 따로 보관합니다.
- 분석을 위한 시료 준비
- 염색 완충액에 최종 펠릿을 재현탁시키고(단계 4.1 참조) 세포 밀도를 0.5 × 각 튜브당 50 μL 당 106 세포로 유지합니다.
- 두 개의 FACS 튜브를 가져와서 혼합 튜브 1과 2로 레이블을 지정합니다.
- 표 6에 따라 세포 및 항체 현탁액을 준비한다.
- 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 1mL의 염색 완충액으로 각 튜브에 2회 세척한 후 실온에서 10분 동안 200g에서 짧은 볼텍싱 및 원심 분리를 수행합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 염색 완충액에 재현탁시킨 다음 획득할 때까지 따로 보관합니다.
- 단일 세포 분류를 위한 시료 준비
- 두 개의 FACS 튜브를 가져다가 FBS 1mL를 넣고 각 튜브 내부에 FBS의 균일한 층이 형성될 때까지 튜브를 굴립니다. 염색을 위해 샘플을 처리하는 동안 1-2시간 동안 배양합니다. 이 튜브에 혼합 튜브 1과 2로 라벨을 붙입니다.
- 염색 완충액에 최종 펠릿을 재현탁시키고(단계 4.1 참조) 각 튜브에 대해 50μL당 2-3 × 106 개의 세포를 유지합니다.
- 표 7에 따라 혼합 튜브 1 및 2에서 세포 및 항체 현탁액을 준비합니다.
- 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 1mL의 염색 완충액으로 각 튜브에 2회 세척한 후 실온에서 10분 동안 200g에서 짧은 볼텍싱 및 원심 분리를 수행합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 염색 완충액에 재현탁시킨 다음 따로 보관합니다. 분류하기 15분 전에 5μL의 DAPI를 추가합니다.
참고: 정렬 실험의 경우 튜브당 더 높은 셀 밀도가 권장됩니다.
| 튜브 유형 | 포지티브 콤프 비드* | 네거티브 콤프 비드* | 셀 | 항체 첨가 | |
| FITC 튜브 | 1 방울 | 1 방울 | – | 항 인간 CD90-FITC (2 μL) | |
| V450 튜브 | 1 방울 | 1 방울 | – | 항 인간 CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5.5 튜브 | 1 방울 | 1 방울 | – | 항 인간 CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL) | |
| PE 튜브 | 1 방울 | 1 방울 | – | 항 인간 CD45-PE (2 μL) | |
| APC 튜브 | 1 방울 | 1 방울 | – | 항 인간 CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI 튜브 | – | – | 50 μL | – | |
| 염색되지 않은 튜브 | – | – | 50 μL | – | |
| *1 알갱이=60μL의 비드 현탁액 | |||||
표 4: 보상 제어 샘플. 약어: Comp = 보상; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질.
| 튜브 유형 | 양성 마커에 대한 항체 (2 ΜL) | 음성 마커에 대한 항체 (2 ΜL) | ISOTYPE 항체 첨가 (2 ΜL) | 항체의 총 부피 | VOLUME OF CELL SUSPENSION ADDED(셀 현탁액 추가됨) | 추가된 염색 완충액의 부피 | ||
| CD90-FITC FMO 튜브 | - 항인간 CD44-V450 | 항인적 CD45-PE | FITC IgG1 아이소타입 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 항인간 CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO 튜브 | - 항인간 CD44-V450 | 항인적 CD45-PE | PerCP Cy 5.5 IgG1 이소타입 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 항인간 CD90-FITC | ||||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO 튜브 | - 항인간 CD90-FITC | 항인적 CD45-PE | V450 IgG1 아이소타입 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 항인간 CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO 튜브 | - 항인간 CD44-V450 | 항인적 CD45-PE | APC IgG1 아이소타입 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 항인간 CD90-FITC | ||||||||
| - 항인간 CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| CD45-PE FMO 튜브 | - 항인간 CD44-V450 | - | PE IgG1 아이소타입 | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 항인간 CD90-FITC | ||||||||
| - 항인간 CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||||
표 5: FMO 제어 샘플. 약어: FMO = 형광 마이너스 1; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질.
| 튜브 유형 | 양성 마커에 대한 항체 (2 ΜL) | 음성 마커에 대한 항체 (2 ΜL) | 항체의 총 부피 | VOLUME OF CELL SUSPENSION ADDED(셀 현탁액 추가됨) | 추가된 염색 완충액의 부피 | |
| 혼합 튜브 1 | - 항인간 CD44-V450 | 항인적 CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - 항인간 CD90-FITC | ||||||
| - 항인간 CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||
| 혼합 튜브 2 | - 항인간 CD44-V450 | 항인적 CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - 항인간 CD90-FITC | ||||||
| - 항인간 CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - 항인간 CD105-APC | ||||||
표 6: SHED의 다색 면역표현형을 위한 샘플 튜브. 약어: SHED = 인간 박리 낙엽치의 줄기 세포; PE = 피코에리트린.
| 튜브 유형 | 양성 마커에 대한 항체 (3 ΜL) | 음성 마커에 대한 항체 (3 ΜL) | 항체의 총 부피 | VOLUME OF CELL SUSPENSION ADDED(셀 현탁액 추가됨) | 추가된 얼룩 완충액의 부피 | |
| 혼합 튜브 1 | - 항인간 CD90-FITC | 항인적 CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - 항인간 CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| 혼합 튜브 2 | - 항인간 CD90-FITC | 항인적 CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - 항인간 CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
표 7: 단일 세포 분류 반응 튜브. 약어: FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질.
5. 단일 셀 분류
- 세포 분류기 준비
- 분류기에 100μm 노즐을 설치합니다.
알림: 적절한 노즐은 분류할 입자 직경의 최소 5배입니다. 분류에 사용할 피복 유체는 샘플 유형과 실험의 민감도에 따라 결정해야 합니다. 이 실험에는 독점적인 피복 유체가 사용되었습니다. - 일일 기기 품질 검사(QC)를 수행하고 실험을 위한 분류기를 설정합니다. 기기 설정에 대한 자세한 안내는 기기 설명서를 참조하십시오.
- 분류기에 100μm 노즐을 설치합니다.
- 보정 매트릭스 설정
- 4.2 단계의 단일 염색 보정 튜브를 사용하여 보정 매트릭스를 설정합니다.
- 독점 소프트웨어의 도구 모음에서 Experiment(실험 )를 선택하고 Compensation setup(보상 설정)을 클릭합니다. 보정 컨트롤 만들기를 엽니다.
- 마커를 확인하고 확인합니다. "Compensation"이라는 새 시편이 추가되고, 그 아래에 마커 컨트롤이라는 새 튜브가 소프트웨어에 의해 자동으로 추가됩니다.
- 염색되지 않은 튜브를 선택하고 실행하여 5,000개의 이벤트를 기록합니다. 게이트를 세포의 모집단으로 끌어서 모든 보정 컨트롤에 적용합니다. 이것은 각 형광등 매개변수에 대한 전압과 음극 게이트를 설정하기 위한 것입니다.
- 마찬가지로, 단일 염색 보정 튜브를 별도로 로드하고 데이터를 기록하고 저장합니다. 관심 모집단을 구분하는 게이트를 선택하고 모든 보정 제어에 적용합니다. 이것은 각 형광 매개변수에 대한 포지티브 게이트를 설정하기 위한 것입니다.
- 툴바에서 Experiment(실험 )를 선택하고 Calculate compensation values(보상 값 계산) | link and save(링크 및 저장)를 클릭합니다.
알림: 소프트웨어를 사용하여 자동 보정 매트릭스가 생성되면 형광 색소의 전압 매개변수는 혼합 튜브의 모든 채널에 대해 변경할 수 없습니다.
- 데이터 수집
- 4.3단계에서 각 튜브에 10,000개의 세포를 기록합니다. 및 4.4 세포의 면역 표현형 분석을 위한 데이터를 수집합니다.
- 수집 장치 준비
- 분류된 세포 집단의 목적에 따라 6-웰, 24-웰, 48-웰 또는 96-웰 플레이트 중에서 선택할 수 있습니다.
- 200-500 μL의 FBS로 웰을 코팅하고 플레이트를 2 시간 동안 방해받지 않고 유지하십시오.
- 2시간 후 잔류 FBS를 제거하고 200-500μL의 10% MSC 배양 배지를 추가합니다.
- 단일 셀 정렬 모드에서 셀 정렬
- 혼합 튜브 1(4.5단계)을 실행하고 10,000개의 이벤트를 기록하여 적절한 게이트 전략을 사용하여 정렬할 관심 모집단의 게이트를 설정합니다.
- 수집 플레이트를 로드하고 2,500 - 5,000 cells/well 사이에서 목표 세포 수를 설정하고 단일 세포 분류 순도 마스크를 선택합니다.
- 수집 장치에서 분류된 모집단을 수집하고 분류 실험이 끝날 때까지 얼음 위에 보관합니다.
- 완료되면 플레이트를 5% CO2 인큐베이터로 옮겨 배양액을 37°C로 유지합니다.
참고: 획득 후 원시 데이터 파일은 .fcs 파일 형식(v.3.0 이상)으로 내보내졌습니다. 모든 실험 후 생성된 정렬 보고서는 할당된 웰당 정렬된 이벤트/셀의 수를 기록하고 중단된 충돌 수를 표시했습니다.
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Representative Results
SHED는 비멘틴(빨간색, 유형 III 중간 필라멘트), 액틴 필라멘트(Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) 및 DAPI로 염색된 핵의 발현을 보여주는 표준 면역형광 분석으로 특성화되었습니다(그림 1A). 이들의 증식 및 콜로니 형성 능력을 추정하기 위해, 표준 단기 세포 성장 분석을 수행했습니다. 2일차에서 8일차까지 확산률이 14.3배 증가한 것이 그림 1B에 나와 있습니다. SHEDs의 clonogenic 재산은 숫자 1C-E에서 보인 CFU-F 분석실험에서 결정되었습니다. ISCT 기준에 따라, 다분화능 MSC는 3개의 중배엽 유래 계통으로 분화할 수 있었습니다. 분화된 지방 세포에서 오일 방울을 검출하기 위해 Oil Red O를 사용한 세포화학적 염색을 사용했습니다(그림 1F). von Kossa 염색은 분화된 조골세포의 매트릭스에서 발견되는 칼슘 침전물을 염색하는 데 사용되었습니다(그림 1G). 3D 배양물의 아그레칸은 분화된 연골아세포에서 Alcian Blue에 대해 염색되었습니다(그림 1H).
SHED의 면역 표현형을 특성화하기 위해 다중 파라미터 유세포 분석 분석을 설정했습니다. 실험은 4가지 유형의 실험 대조군, 즉 보상 대조군(표 4), FMO 및 등형 대조군(표 5), 염색되지 않은 대조군을 사용하여 수행되었습니다. 사용된 모든 MSC 및 HSC 항체의 동형은 FMO 튜브와 함께 추가되어 양성 신호와 음성 신호 및 높은 항원 발현과 희미한 항원 발현을 구별했습니다. 그림 2A 는 실험당 사용된 FMO 및 isotype 대조군의 분포를 보여줍니다. 대표적인 밀도 플롯은 CD90 FITC 항체의 FITC 동형의 발현을 나타내지 않았습니다. 마찬가지로, 히스토그램 오버레이(그림 2B)는 FITC, PerCP Cy5.5 및 PE의 각 채널에서 대조군과 함께 염색된 샘플의 발현 수준을 비교했습니다. 마커 CD90 및 CD73의 양성 발현(빨간색 히스토그램)과 CD45의 음성 발현은 염색되지 않은 대조군 및 FMO 대조군(각각 파란색 및 검은색 히스토그램)의 발현과 비슷합니다.
면역표현형의 유세포 분석 기반 특성 분석은 초기 통로(P6) SHED 중 하나의 마커 분포를 보여주었습니다(그림 3A-H). ISCT 권장 마커와 CD44 모두 모집단을 MSC로 결정했습니다. 밀도 플롯에서 입증된 테트라 양성 모집단은 CD90+CD73+CD105+CD44+의 ≥98% 발현과 CD45 마커의 ≤2% 발현을 보여주었습니다. 5개 이상의 독립적인 실험에서도 비슷한 결과가 나왔다. 양성 마커의 차등 발현을 보인 후기 통로 SHED(P12)는 높고 희미한 발현체의 단일 세포 분류를 위해 선택되었습니다(그림 4A-H). 게이팅 전략(그림 4H)에 따라 단일항→ 살아있는 세포→ 비HSC→ 이중 양성 CD73+CD90+ 및 단일 양성 CD73+CD90- 집단은 단일 세포 정렬 모드를 사용하여 분류되었습니다. 분류된 개체군은 웰당 파종 수가 다른 96-well/48-well/6-well 플레이트 레이아웃에서 수집되었습니다(보충 파일 1). 분류 실험의 단일 단계에서 3회 연속 시도가 이루어졌으며 실험당 분류 후 세포의 생존율(이중 양성 발현자: CD90+CD73+)은 100%였습니다. 세 단계의 독립적인 실험이 수행되었습니다. 웰 정렬 후 웰당 증가한 세포의 수를 웰당 정렬된 세포의 수와 일치시켰습니다.
그림 5A 는 96웰 플레이트에서 수집된 CD90+CD73+ 사후 분류된 세포가 모집단과 마찬가지로 부착 및 증식을 보였다는 것을 보여줍니다. 분류된 세포는 분류 후 6일째에 70-80%의 밀도에 도달하는 것으로 관찰되었습니다. 부착 및 증식하는 분류 후 세포는 지방 생성 성장 인자의 존재 하에서 분화된 다음 적절한 분류 후 대조군(미분화) 세포를 사용하여 15일 후에 Oil Red O로 염색했습니다(그림 5B, C).
그림 1: 박리된 인간 낙엽치의 줄기 세포 특성 분석. (A) 면역형광 염색을 통해 분리된 MSC가 비멘틴(적색, III형 중간 필라멘트), 액틴 필라멘트(Alexa fluor 488 Phalloidin Probe) 및 DAPI(청색, 핵)를 발현하는 것을 확인할 수 있습니다. 20x의 원래 배율로 얻은 현미경 사진. 스케일 바 = 10 μm. (B) SHED의 단기 세포 성장 분석은 2일째까지 배양 중인 세포 수가 크게 증가하고 8일째 말에 증식률이 14.3배 증가하는 것으로 관찰된 바와 같이 높은 증식 능력을 나타냅니다(n = 3, p-값<0.01). 표준 편차 오차 막대가 표시되었습니다. (씨-E) CFU-F 분석 및 크리스탈 바이올렛 염색은 SHED의 콜로니 형성 능력을 확인합니다. (C) 배양 후 14일 후에 여러 군체가 형성될 것으로 예상된다. (D) 단일 세포에서 유래하는 단일 클론 형성 콜로니; (E) SHED의 결정 보라색으로 염색된 단일 콜로니는 세포의 전형적인 섬유아세포와 같은 형태를 나타냅니다. (FH) 적절한 시험관 조건 하의 MSC는 21일까지 지방성, 골형성 및 연골형성 계통으로 분화될 것으로 예상됩니다. 세포화학적 염색은 22일째에 각각 지방성, 골형성 및 연골형성 계통에 대한 (F) Oil Red O(삽입 삽입은 기름 방울을 보여주는 지방세포의 40x 이미지를 나타냄), (G) von Kossa 및 (H) Alcian Blue 염색을 보여줍니다. 현미경 사진은 원래 배율 20배로 얻을 수 있습니다. 눈금 막대 = 10μm. 약어: MSC = 중간엽 줄기 세포; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; SHEDs = 인간 박리 낙엽 치아의 줄기 세포; CFU-F = 콜로니 형성 단위-섬유아세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다중 모수 실험에 사용된 음성 대조군 . (A) 형광 마이너스 원 컨트롤은 표 형식으로 표시되었으며, FMO 컨트롤은 특정 아이소타입으로 대체되었습니다. 대표적인 밀도 플롯(왼쪽에서 오른쪽으로)은 CD90 FITC를 제외한 모든 항체와 CD90 FITC 아이소타입이 추가된 CD90 FITC의 비염색 대조군(왼쪽), FMO(가운데), 패널의 모든 항체가 추가된 완전히 염색된 샘플(오른쪽)을 보여줍니다. (B) 히스토그램 오버레이는 세 가지 유형의 샘플 비교를 나타내며, 검은색은 FMO, 파란색은 염색되지 않음, 빨간색은 해당 채널에서 완전히 염색된 샘플을 나타냅니다. 약어: FMO = 형광 마이너스 1; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질; PE = 피코에리트린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SHED의 다중파라미터 면역표현형(P6). (A) SSC-A 대 FSC-A: 측면 및 전방 산란 특성에 따라 관심 세포가 게이트되고 파편에서 분리됩니다. (B) FSC-H 대 FSC-A 및 (C) SSC-H 대 SSC-A: 두 플롯은 이중항 판별에 사용되며, 이를 통해 위양성 신호를 생성할 수 있는 응집체를 제거하면서 단일항을 선택할 수 있습니다. (D) SSC-A 대 CD45 PE: 제외 게이팅을 통해 단일항에서 CD45- 집단을 선택할 수 있습니다. (E) CD73 PerCP-Cy5.5 대 CD90 FITC: CD45- 살아있는 단일항에서 CD90+CD73+ 세포가 게이트됩니다. (F) CD44 V450 대 CD105 APC: CD90+CD73+ 집단은 테트라 양성 CD90+CD73+CD44+CD105+ 세포를 정의하기 위해 추가로 게이트됩니다. (G) SSC-A 대 시간: 플롯은 시간(초)에 따른 안정적인 획득을 나타내며 획득하는 동안 압력 변동을 유발하는 이벤트가 없음을 나타냅니다. (H) 게이팅 계층. 약어: SHED = 인간 박리 낙엽치의 줄기 세포; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질; SSC-A = 측면 산란 피크 영역; FSC-A = 순방향 산란 피크 영역; FSC-H = 순방향 산란 피크 높이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역표현형 SHED의 단일 세포 분류(P12). (A-F) 순수 MSC를 singlets_1, singlets_2, DAPI- 살아있는 세포, CD45- 비조혈 세포, 마지막으로 CD90+CD73+ 세포의 순차적 순서로 분류하는 단계별 배제 기반 게이팅 전략. (F)에 표시된 게이트 모집단은 단일 셀 정렬 모드를 사용하여 정렬되었습니다. (G) SSC-A 대 시간 플롯은 샘플의 중단 없는 분류를 설명합니다. (H) 게이팅 계층. (n=3, 정렬 효율 = 100%). 약어: SHED = 인간 박리 낙엽치의 줄기 세포; MSC = 중간엽 줄기 세포; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질; SSC-A = 측면 산란 피크 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 사후 분류된 SHED의 형태학적 및 기능적 특성 분석. (A) 사후 분류된 집단의 위상차 이미지는 6일차에 96웰 플레이트에서 10배, 스케일 막대 = 10μm의 원래 배율로 수집되었습니다(삽입 사진은 분류된 단일 세포가 섬유아세포와 유사한 MSC로 형태를 변화시키는 것을 보여주는 20x 이미지를 보여줍니다). 원래 배율 20x, Scale bar = 10 μm에서 (B) 미분화(대조군) 및 (C) 분화된 분류 후 모집단에서 관찰된 Oil Red O를 사용한 지방 분화를 위한 세포화학적 염색(삽입은 관찰된 오일 방울을 묘사하는 40x 이미지를 나타냄). 약어: SHED = 인간 박리 낙엽치에서 추출한 줄기세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 실험당 생성된 컴파일된 정렬 보고서. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: BD FACSAria Fusion의 광학 구성. 약어: LP = 롱 패스; PMT = 광전자 증배관; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
조직 공학 및 재생 의학 분야에서, 출생 후 소스 중 구강 조직 유래 MSC는 최소한의 윤리적 의무와 주목할 만한 다중 계통 분화 가능성으로 인해 깊은 관심을 끌었다21. 영향을 받은 제3대구치와 SHED의 치수 줄기세포(DPSC)는 신경퇴행성 및 외상성 질환에 대한 치료 잠재력으로 인해 치과 MSC들 사이에서 가장 주목을 받고 있다22. 이 원고에 설명된 프로토콜은 다중 모수 접근법을 사용하여 SHED를 특성화하고 단일 세포 정렬 접근법을 사용하여 관심 있는 모집단을 추가로 분류하는 데 도움이 됩니다. 그러나, 이 프로토콜의 응용은 경구 MSC에 한정될 뿐만 아니라, 인체 내의 다른 소스 조직으로부터 MSC의 면역표현형 분석 및 분류에 사용될 수 있다(23).
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 다루어진 생물학적 문제에 대한 성공적인 구현을 위해 여기에서 논의되어야 합니다. 모든 분류 프로토콜의 핵심은 생물학적 대조군과 실험적 대조군이라는 두 가지 중요한 구성 요소를 확인하는 것입니다. 우선, 깨끗한 배양 유지 관리는 사용된 샘플이 분류되는 동안 손상되지 않도록 합니다. 단일 세포 현탁액 사전 분류에서 세포 생존율은 70% 이상의 생존 가능한 세포 집단이 시작되고 건강한 하위 집단의 분석 및 분류가 뒤따르도록 해야 합니다. 단일 셀 현탁액에 사용되는 염색 완충액은 2% FBS를 함유해야 하며 실험은 실온에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 이러한 일차 세포의 올바른 합류점(80-85% 밀도)을 선택하면 세포 생존력 저하를 방지하고 대규모 응집체의 가능성을 줄일 수 있습니다. 또한 라이브/데드 마커(이 프로토콜의 DAPI)를 사용하는 것은 모든 선별 실험에 필수적입니다. 이 연구에서 사용된 샘플은 대략 직경이 20-35 μm인 MSC였기 때문에 BD FACSAria Fusion에서 20 psi의 압력으로 분류하기 위해 선택한 노즐 크기는 100 μm였습니다. 이를 통해 더 낮은 피복 압력에서 공정 중에 세포 생존력을 손상시키지 않고 세포 분류가 가능했습니다. 자세한 정렬 설정 조건은 소프트웨어 BD FACSDiva 가이드24를 참조하는 것이 좋습니다.
유세포 분석에서 multicolor 실험의 필수 전제 조건은 적절한 제어가 필요하다는 것입니다. 여기에 사용되는 제어에는 자가형광, isotype, FMO 및 보정 제어의 네 가지 주요 유형이 있습니다. 자동 보정 매트릭스는 정확한 보정을 허용하여 검출기의 스펙트럼 블리드스루를 방지하고 이를 위해 보정 비드와 셀을 모두 사용했습니다. 염색되지 않은 샘플은 MSC의 자가형광에 대한 임계값을 설정했습니다. 4개의 항체가 모두 포함된 혼합 튜브에는 사용된 각 항체의 동형과 FMO가 포함됩니다. DAPI 보상 제어는 MSC를 사용하여 수행되었으며, MSC는 별도로 처리되었습니다(열 충격 포함). 여기에 사용된 항체 패널(표 8 참조)은 ISCT에서 명시한 기준 및 BD FACSAria Fusion cell sorter의 기기 구성( 보충 표 S1 참조)에 따라 hMSC를 위해 특별히 설계되었습니다. 이는 다중 파라미터 유세포 분석 실험을 계획하는 동안 매우 중요합니다. 면역표현형에 사용되는 특성화 패널은 4개의 양성 MSC 마커(CD90, CD105, CD73 및 CD44)와 1개의 음성 마커(CD45)로 구성됩니다. 대조적으로, 선별 실험용 패널에는 2개의 양성 마커(CD90 및 CD73), 1개의 음성 마커(CD45) 및 1개의 활성/데드 마커(DAPI)가 포함되어 있어 높은 수의 살아있는 MSC를 보장합니다.
| 항체/마커 | 형광 색소 | hMSC 표면 프로파일 | 레이저 파장 (nm) | 여기 피크(nm) | 방출 피크 (nm) |
| CD44 시리즈 | V450 시리즈 | 표현해야 합니다. >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 시리즈 | (주)피티씨 | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 시리즈 | 재질 보기 PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 시리즈 | 증권 시세 표시기 | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 시리즈 | 체육 | 표현하지 말아야 합니다. <2% | 561 | 566 | 574 |
| 다피 | - | 데드 셀 마커 | 405 | 358 | 461 |
표 8: 유세포 분석에 의한 SHED의 특성화 및 분류를 위해 설계된 다색 패널. 약어: FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린; PerCP = 페리디닌-엽록소-단백질.
정렬 순도 마스크 선택
MSC에서 세포 이질성의 예측 불가능성을 고려할 때, 벌크 분류가 분류된 집단 간의 순도 수준을 반드시 달성하지는 못할 수 있습니다. 이 연구에서 단일 세포 분류 프로토콜을 최적화하여 단일 세포 클론을 식별하고 효능 측면에서 분류 후 기능적 특성을 추적했습니다. 단일 셀 분류는 BD FACSAria Fusion에서 수행되었으며, 100 μm 노즐 선택, 20 psi 피복 압력, 조정 가능한 유량(20 μL/min으로 유지) 및 380 events/s의 임계값 속도의 유연성을 가졌습니다. 이 방법에서는 하나 대신 두 개의 표적 세포를 선택할 가능성이 최소화됩니다. 일반적으로, 표적 세포의 순수 모집단의 정렬을 해석할 수 있는 알고리즘의 단일 세포 정렬 모드가 선택되고, 얼마나 많은 방울이 선택의 수집 장치로 분류될 것인지를 고려한다. 정밀도 모드는 궁극적으로 정렬 알고리즘에서 사용할 수 있는 마스크를 결합하고 가장 순수한 관심 모집단을 정렬하기 위해 엄격한 정렬 조건을 만들 수 있도록 정확하게 선택해야 합니다. 단일 세포 정렬 모드는 분류하는 동안 표적 세포가 비표적 세포로 응집되고 이 접근 방식에서 기대하는 수준의 순도를 달성하는 경우 표적 세포를 손상시키지 않습니다. 이것은 이 프로토콜에서 선택된 모듈이었고 분류된 세포는 96-웰, 48-웰, 24-웰 및 6-웰 플레이트 장치에서 수집되었습니다.
이 연구에서는 차등 면역표현형, 즉 CD90+CD73+CD45-를 기준으로 하위 집단을 분류했습니다. 특성화 및 분류 프로토콜 모두에서 당사의 게이팅 전략(그림 3 및 그림 4 참조)은 단일항 식별 후 비조혈 인구(ISCT 처방 마커로 이전에 검증 및 특성화됨)를 제공하기 위해 CD45- 집단에서 제외 게이팅을 기반으로 했습니다. 결국, MSC는 양성 ISCT 마커를 사용하여 CD45- 집단에서 식별되었습니다. 여기서 주목할 점은 먼저 ISCT 마커의 양성 발현자를 게이팅한 다음 CD45의 음성 발현자를 게이팅하는 데 백분율에 큰 차이가 없다는 것입니다. 그러나 이 분류의 목적이 알려진 MSC 마커의 변형된 발현을 나타내는 세포를 식별하는 것이었기 때문에 양성 발현 플롯으로 분석을 완료했습니다.
대표적인 그림에서 CD45- 세포의 97%는 MSC이지만, 항원 발현을 정량화하는 동안 세포의 75%가 두 마커 CD90 및 CD73의 이중 양성 발현자인 반면, 동일한 마커의 단일 양성 발현자인 여러 집단( 그림 3F 참조)과 마커를 전혀 발현하지 않는 세포는 거의 없습니다.
이러한 세포의 특성 분석 중에 하위 집단을 테트라 양성 MSC, 삼중 양성 및 이중 음성 집단으로 식별했습니다. MSC 마커의 이러한 차별적 발현은 통로가 증가함에 따라 확장되므로 이러한 차이를 연구하고 기능적 특성과 연관시킬 필요가 있습니다. 본 연구에서 MSC를 분류하는 궁극적인 목적은 식별된 하위 집단 간의 비교 분석을 생성하고 양성 마커의 차등 발현이 기능적 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
인도 벵갈루루에 있는 Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research의 Flow Cell Facility에 유세포 분석 핵심 시설을 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 분화된 세포의 펠릿 배양물의 동결 절편은 인도 벵갈루루에 있는 Neuberg Anand Reference Laboratory에서 수행되었습니다. 이 작업은 인도 MAHE(Manipal Academy of Higher Education)의 UC 교내 자금 지원을 받았습니다. AG는 MAHE의 Dr. T. M. A. Pai 장학금의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
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