Summary
Данный протокол описывает использование флуоресцентно-активированной сортировки мезенхимальных стволовых клеток человека методом одноклеточной сортировки. В частности, использование сортировки отдельных клеток позволяет достичь 99% чистоты иммунофенотипированных клеток из гетерогенной популяции в сочетании с многопараметрическим подходом, основанным на проточной цитометрии.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) организма обладают необычайной способностью дифференцироваться в несколько линий взрослых клеток в организме и известны своими иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами. Использование этих стволовых клеток является благом для области регенеративной биологии, но в то же время проклятием для регенеративной медицины и терапии из-за многочисленных клеточных двусмысленностей, связанных с ними. Эти неясности могут возникать из-за разнообразия в источнике этих стволовых клеток и условий их роста in vitro , что отражается на их функциональной гетерогенности.
Это обуславливает необходимость разработки методик получения очищенных, однородных популяций МСК для терапевтического применения. Достижения в области проточной цитометрии позволили обнаружить популяции одиночных клеток с использованием многопараметрического подхода. В этом протоколе описывается способ идентификации и очистки стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека (SHED) с помощью флуоресцентной сортировки отдельных клеток. Одновременная экспрессия поверхностных маркеров, а именно CD90-флуоресцеина изотиоцианата (FITC), CD73-перидинин-хлорофилла-белка (PerCP-Cy5.5), CD105-аллофикоцианина (APC) и CD44-V450, позволила идентифицировать «яркие» положительные экспрессоры МСК с помощью мультипараметрической проточной цитометрии. Тем не менее, наблюдалось значительное снижение процентного соотношения четырехкратных экспрессоров этих положительных маркеров, начиная с пассажа 7 и далее.
Иммунофенотипированные субпопуляции сортировали с использованием режима одноклеточной сортировки, где только два положительных и один отрицательный маркер составляли критерии включения. Эта методология обеспечивала жизнеспособность клеток отсортированных популяций и поддерживала пролиферацию клеток после сортировки. Нисходящее приложение для такой сортировки может быть использовано для оценки линейно-специфической дифференциации для закрытых субпопуляций. Этот подход может быть применен к другим одноклеточным системам для улучшения условий изоляции и получения информации о множественных маркерах клеточной поверхности.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) можно рассматривать как масштабируемый источник клеток, пригодных для клеточной терапии, и можно считать золотым стандартом системы в регенеративной медицине. Эти клетки могут быть выделены из различных источников в организме с различным тканевым происхождением1. В зависимости от исходной ткани каждый тип МСК демонстрирует неоднозначное поведение in vitro 2. Это хорошо видно по их морфологическим и функциональнымсвойствам 3. Многочисленные исследования показали внутриклональную изменчивость размеров, включая дифференцировку тканей взрослого человека, состояние генома, метаболическую и клеточную архитектуру МСК 2,4.
Иммунофенотипирование клеток является распространенным применением проточной цитометрии для идентификации стволовых клеток, и это было использовано Международным обществом клеточной и генной терапии (ISCT) в 2006 году для назначения списка минимальных критериев для идентификации клеток как МСК. Было установлено, что наряду с пластической приверженностью и способностью дифференцироваться на три линии (остеогенную, хондрогенную и адипогенную) in vitro, ≥95% клеточной популяции должны экспрессировать CD105, CD73, CD90, и эти клетки должны отсутствовать экспрессия (≤2% положительная) CD34, CD45, CD11b, CD14 и HLA-DR, измеренная с помощью проточной цитометрии5. Несмотря на то, что МСК определялись набором биомаркеров в соответствии с минимальными критериями ISCT, их иммунные свойства не могли быть сопоставлены с этими биомаркерами, и возникла необходимость в большем, чем эти критерии, чтобы облегчить количественнуюоценку перекрестных сравнений и клональных вариаций.
Несмотря на руководящие принципы, установленные ISCT, обширные исследования МСК показали, что в этой популяции существует гетерогенность, которая может возникнуть из-за множества факторов, в основном из-за повсеместного характера гетерогенности, возникающей между донорами МСК6, тканевыми источниками7, отдельными клетками в клональной популяции8 и условиями культивирования 2,9. 10. См. Характеристика и очистка этих первичных клеток из различных тканевых источников для обеспечения качества и судьбы клеток являются ключевыми этапами их производства. Необходимость понимания отображаемых вариаций среди генеральной совокупности требует эффективного метода разложения ее на субпопуляции, которые могут быть разделены и собраны по отдельности11. Анализ на уровне отдельных клеток помогает преодолеть проблемы, связанные с межклеточной изменчивостью, уменьшить биологический шум, возникающий в гетерогенной популяции, и дает возможность исследовать и характеризовать редкие клетки12.
В зависимости от цели и выбранных параметров можно использовать несколько методов сортировки и обогащения выбранных популяций. Методы сортировки клеток могут включать в себя как массовую сортировку, так и сортировку отдельных клеток. В то время как массовая сортировка может обогатить целевые популяции с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS)13, фракционирования14 и элютриации 15, сортировка отдельных клеток может обогатить более однородные популяции с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)11. Сравнительный анализ каждого из этих методов со своим набором преимуществ и недостатков выделен в таблице 1.
Таблица 1: Сравнительный анализ различных методов: MACS, фракционирование, элютриация и FACS, подчеркивающий различия в их принципе, а также преимущества и недостатки выбора одного метода по сравнению с другим. Сокращения: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
С момента появления этого метода одноклеточная проточная цитометрия играла важную роль в перечислении16, обнаружении и характеристике специфической клеточной популяции в гетерогенной выборке17. В 2006 году Hewitt et al. заложили основу методологии автоматизированной сортировки клеток для улучшения выделения гомогенных пулов дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК)18. Одноклеточная сортировка обогатила популяцию трансдуцированных GFP чЭСК, способствуя выделению генетически модифицированных клонов, что открыло новое измерение в клинических исследованиях. Для повышения эффективности сортировки обычно используются два подхода; Либо среда для сбора отсортированных популяций модифицируется для поддержания жизнеспособности и пролиферации постсортированных клеток19 , либо алгоритм/программное обеспечение сортировки клеток соответствующим образом модифицируется12.
С развитием технологий коммерческие проточные цитометры и сортировщики клеток смогли помочь решить проблемы, которые были решены при асептической сортировке хрупких и редких клеточных популяций, особенно стволовых клеток различного происхождения. Одной из основных проблем, стоящих перед биологами стволовых клеток, является клональная изоляция плюрипотентных стволовых клеток человека в соответствии с протоколами трансфекции, требуемымив исследованиях редактирования генов. Эта проблема была решена путем сортировки отдельных клеток по 96-луночным планшетам, которые были покрыты мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) вместе с добавками и коммерческими низкомолекулярными ингибиторами ROCK. Тем не менее, стратегии выделения клеток могут быть в значительной степени усовершенствованы с использованием индексной сортировки, функции алгоритма сортировки, которая идентифицирует иммунофенотип отдельныхотсортированных клеток. Этот усовершенствованный метод сортировки отдельных клеток помог не только повысить эффективность сортировки стволовых клеток, особенно в отношении редких популяций гемопоэтических стволовых клеток, но и эффективно связать одноклеточные клоны с их последующими функциональными анализами20.
Данная работа посвящена одноклеточной сортировке иммунофенотипированных стволовых клеток из отслоившихся молочных зубов человека (SHEDs) для обогащения субпопуляций с целью изучения их функциональной дифференцировочной способности. Используя комбинацию двух МСК-положительных маркеров, CD90 и CD73, и отрицательного гемопоэтического маркера CD45, МСК были иммунофенотипированы и идентифицированы тусклые и нулевые экспрессоры. На основании иммунофенотипа субпопуляции были идентифицированы как чистые МСК, одиночные положительные и двойные отрицательные популяции. Они были отсортированы с использованием режима одноклеточной сортировки для получения чистых и обогащенных субпопуляций для дальнейших функциональных исследований, чтобы определить, является ли дифференциальная экспрессия маркеров артефактом условий культивирования in vitro или она также оказывает какое-либо влияние на функциональные свойства. Клетки, которые не были однородными экспрессорами «положительных маркеров МСК», были отсортированы для изучения их функциональных свойств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое одобрение и согласие на участие: Образцы отслоившейся пульпы молочных зубов были получены после получения информированного согласия и полного этического одобрения Стоматологического колледжа и больницы Шри Раджива Ганди (SRGCDS) отделения полости рта и челюстно-лицевой области, Бангалор, в соответствии со стандартами, установленными Комитетом по этическому разрешению больниц, SRGCDS. После этого выделение, культивирование, поддержание и применение SHED были одобрены и в соответствии с рекомендациями, рекомендованными Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR) при Институте регенеративной медицины Манипала, МАЭ - Бангалор. Подробную информацию обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Приготовление реагентов и буферов
- Для поддержания культуры
- Готовят питательные среды для клеток МСК (10%), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% L-глютамин и 1% пенициллин-стрептомицин (Пен-стрептококк) (табл. 2).
- Готовят питательные среды для клеток МСК (20%), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 20% FBS, 1% L-глютамина и 1% стрептококка (табл. 2).
- Готовят нейтрализующие среды, используя базальную среду для недифференцированных чЭСК, 1% L-глютамина и 1% антибиотик-антимикотик (Анти-Анти) (табл. 2).
- Для проточного цитометрического анализа и сортировки
- Приготовьте буфер для окрашивания, используя 2% FBS в фосфатно-солевом буфере (PBS).
- Приготовьте исходный раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл), добавив 1 мкл в 1 мл PBS
- Для линейной дифференциации МСК
- Готовят дифференцировочные среды для остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки в соответствии с составом, описанным в таблице 3. Приготовленные аликвоты хранят при температуре 4 °C в течение всего эксперимента.
- Готовят среде с сывороточным голоданием (2% среды), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 2% FBS, 1% L-глютамина и 1% стрептококка (табл. 2).
| ТИП НОСИТЕЛЯ | НАЗНАЧЕНИЕ СМИ | СОСТАВ НА 50 мл | ||||||||
| ФБС | Стрептококк | L-глютамин | БАЗАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ЧЭСК | |||||||
| 10% СМИ | Культура и обслуживание MSC | 5 мл | 500 мкл | 500 мкл | 44 мл | |||||
| 20% медиа | Анализ КОЕ-Ф | 10 мл | 500 мкл | 500 мкл | 39 мл | |||||
| Сывороточный голодание (2%) СМИ | Среды для контрольных скважин в протоколе дифференциации | 1 мл | 500 мкл | 500 мкл | 48 мл | |||||
| Нейтрализующая среда | Среда для нейтрализации клеточной суспензии после трипсинизации | - | 500 мкл | 500 мкл | 49 мл | |||||
Таблица 2: Питательные среды для культивирования и анализа культур. Сокращения: МСК = мезенхимальная стволовая клетка; КОЕ-F = колониеобразующая единица-фибробласт.
| КОМПОНЕНТЫ | ОСТЕОГЕННЫЕ СРЕДЫ | ХОНДРОГЕННАЯ СРЕДА | АДИПОГЕННЫЕ СРЕДЫ |
| Базальная среда | 90 мл | 90 мл | 90 мл |
| Индукционные среды | 10 мл | 10 мл | 10 мл |
| Общий объем | 100 мл | 100 мл | 100 мл |
Таблица 3: Дифференциационные среды для трилинейной дифференциации SHEDs.
2. Культивирование и уход за сараями
- Поддерживайте клетки в 10% питательной среде МСК и меняйте среду каждые 2 дня или по мере необходимости.
- Трипсинизация клеток при слиянии 95% с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА.
- Нейтрализуют клетки после трипсинизации с помощью нейтрализующей среды.
- Центрифугируют пробирку при 300 × г в течение 6 мин при комнатной температуре до получения клеточной гранулы.
- Декантируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в 10% питательной среде МСК.
- Высевают клетки в свежеприготовленные чашки для клеточных культур, содержащие 10% питательных сред МСК для дальнейших экспериментов или субкультивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность высева для SHED составляет 0,2 × 10 6 ячеек в чашке 100 мм и 0,8 × 10 6 ячеек в колбе Т-75, для получения 1,5 × 10 6 ячеек и 4 × 10 6 ячеек соответственно при слиянии 90-100%.
3. Характеристика МСК
- Краткосрочный анализ роста клеток
- Посев 4 × 10по 4 клетки/лунка в трех экземплярах в 6-луночные планшеты в 10% питательной среде МСК.
- Инкубируйте планшеты в течение 7 дней при температуре 37 °C и меняйте среду каждые 2 дня.
- Собирают клетки на 2-й, 4-й и 8-й день, используя 0,25% трипсин, и промывают питательной средой.
- Центрифугируют клетки при 300 г в течение 6 мин при комнатной температуре и ресуспендируют гранулы в 1 мл среды.
- Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра и определяют их жизнеспособность методом исключения трипанового синего.
- Рассчитайте скорость пролиферации, используя уравнение (1):
(1)
- Анализ колониеобразующей единицы фибробластов (КОЕ-F)
- Высевают 10 000 клеток в 100-миллиметровую чашку и культивируют их в 20% питательных средах МСК.
- Инкубируйте планшеты в течение 14 дней при температуре 37 °C и меняйте среду каждые 3 дня.
- Через 14 дней промойте колонии ПБС, зафиксируйте их кристаллическим фиолетовым красителем в метаноле и снова промойте ПБС, чтобы удалить остаточное пятно.
- Подсчитывайте и изображайте колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитывайте колонии с >50 клеток. Эффективность колониеобразования рассчитывается как количество колониеобразующих единиц.
- Иммунофлуоресцентный анализ
- Высевают МСК на посуду диаметром 35 мм и дают им вырасти до слияния 80-90%.
- Удалите фильтрующий материал и ополосните посуду PBS один раз.
- Зафиксируйте клетки 1 мл 4% параформальдегида (PFA) путем инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
- После фиксации промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте 0,3% Triton X-100 в PBST (0,05% раствор Tween 20 в PBS) для пермеабилизации клеток. Держите его на коромысле в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) для блокировки и держите на коромысле в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте 800 мкл раствора 1:500 мышиного антивиментина, подержите на коромысле в течение 1 ч при комнатной температуре и перенесите планшет на 4 °C для ночной инкубации.
- На следующий день удалить первичные антитела и промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте 800 мкл разведения 1:1000 козьего вторичного антитела антимышиного IgG (H+L), Alexa Fluor 555, и держите его в течение 3 часов при комнатной температуре на коромысле.
- Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте фаллоидиновые зонды Alexa fluor 488 240 мкл в 1 000 мкл PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут на коромысле.
- Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
- Добавьте 700 мкл монтанта DAPI и понаблюдайте за клетками под микроскопом.
- Дифференциация по линии
- Дифференциация в соответствии с культурой 2D
- Возьмите две 48-луночные пластины и обозначьте их как остеогенную и адипогенную линии соответственно.
- Высевают 15 000 клеток на лунку в четыре лунки каждой пластины и культивируют их в 10% питательных средах МСК.
- После того, как монослой клеток достигнет 90% слияния, пометьте первые две лунки как «Контрольные» и замените существующую среду средой с нехваткой сыворотки (2% среды). В последних двух лунках, помеченных как «Тест», добавьте дифференцирующую среду любой из двух линий, адипогенной или остеогенной. Отметьте это как День 0.
- Аккуратно заменяйте фильтрующий материал каждые три дня, чтобы избежать отслаивания, и будьте осторожны, чтобы избежать загрязнения.
- Поддерживайте эти условия до двадцать первого дня; Затем обработайте для эксперимента по окрашиванию.
- Дифференциация в соответствии с 3D-культурой
- Возьмите две пробирки по 15 мл для проведения хондрогенной дифференцировки с помощью 3D пеллетной культуры.
- Переложите 1 × 106 клеток в каждую пробирку и центрифугируйте при 300 × г в течение 6 мин до образования гранулы. Пометьте одну пробирку как «Контрольная» и добавьте в нее 10% питательной среды МСК; Другую пробирку обозначьте как «Тест» и добавьте хондрогенную дифференцировочную среду. Аккуратно поместите пробирки в инкубатор, неплотно закрутив крышки. Отметьте это как День 0.
- Осторожно меняйте фильтрующий материал каждые три дня, чтобы не сместить/не разрушить гранулы во время смены среды.
- Поддерживайте эти условия до двадцати первого дня, а затем обработайте клетки для дальнейших экспериментов.
- Дифференциация в соответствии с культурой 2D
- Цитохимическое окрашивание по линии
- Для 2D-культур используйте дифференцированные (тестовые) и недифференцированные МСК (контрольные) планшеты (из шага 3.4.1.5.) для окрашивания, а сначала удалите среду и дважды промойте PBS. Зафиксируйте клетки с помощью 4% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре, удалите надосадочную жидкость и промойте один раз PBS. Выполните окрашивание для каждой линии следующим образом.
- Для получения линии адипоцитов добавьте раствор пермеабилизации из набора и инкубируйте планшет в течение 5 минут при комнатной температуре. Приготовьте и добавьте 1 мл рабочего раствора Oil red O и выдержите 10 минут. Удалите пятно и дайте пять стирок дистиллированной воде.
- Для получения остеоцитов добавьте 5% свежеприготовленной селитры серебра (в дистиллированной воде) в каждую лунку и держите планшет под ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Удалите раствор и добавьте 2,5% тиосульфата натрия для удаления непрореагировавшего серебра; Держать 5 минут. Удалите пятно, дважды промойте дистиллированной водой и осмотрите окрашенные клетки под микроскопом.
- Для 3D-культур собирают гранулу после окончания периода дифференцировки с шага 3.4.2.3 и получают криосрезы дифференцированной ткани в виде гранулы. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе и нагреться до комнатной температуры, прежде чем приступать к окрашиванию.
- Для хондроцитарной линии следуйте указаниям набора для окрашивания, чтобы добавить достаточное количество промывочного раствора, удалить его, добавить фиксирующий раствор и инкубировать в течение 30 минут. Промыть дистиллированной водой, добавить красящий раствор и выдержать 30 мин. Трижды промыть 0,1 Н соляной кислотой; Добавьте дистиллированную воду, чтобы нейтрализовать кислотность. Понаблюдайте за окрашенными клетками под светлопольным микроскопом.
- Для 2D-культур используйте дифференцированные (тестовые) и недифференцированные МСК (контрольные) планшеты (из шага 3.4.1.5.) для окрашивания, а сначала удалите среду и дважды промойте PBS. Зафиксируйте клетки с помощью 4% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре, удалите надосадочную жидкость и промойте один раз PBS. Выполните окрашивание для каждой линии следующим образом.
(1)4. Окрашивание клеточной поверхности для иммунофенотипирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемыми планшетами для клеточных культур для получения оптимального количества клеток на шагах 4.2-4.5 являются чашки диаметром 100 мм или колбы Т75.
- Подготовка клеток к проточным цитометрическим экспериментам
- Трипсинизацию и сбор клеток из протекающей чашки/колбы и центрифуги при 300 × г в течение 6 мин до получения клеточной гранулы.
- Ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды и определите количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра по методу исключения трипанового синего.
- После подсчета снова центрифугируют клеточную суспензию и дают грануле еще две промывки 1 мл окрашивающего буфера.
- Выбросьте надосадочную жидкость и, наконец, повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме буфера для окрашивания в зависимости от протокола (см. шаги 4.2–4.5).
- Подготовка компенсационных контролей
- Возьмите семь пробирок FACS и пометьте их как Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 и APC.
- Ресуспендируйте готовую гранулу в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1.), сохраняя плотность клеток 0,5 × 106 клеток на 50 мкл на пробирку для пробирок Unstained и DAPI.
- Подготовьте одноокрашенные трубки к компенсации, как описано в таблице 4.
- После подготовки аккуратно встряхните каждую пробирку и инкубируйте в темноте в течение 30 минут.
- После инкубации проводят две промывки, добавляя в каждую пробирку по 1 мл окрашивающего буфера, после чего проводят кратковременное вихрирование и центрифугирование при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите ее в сторону до получения.
- Для пробирки DAPI выполните обработку тепловым шоком, инкубируя ее на водяной бане с температурой 60 °C в течение 5 минут, а затем 15 минут на льду. Добавьте 5 мкл DAPI в суспензию и держите ее в темноте до получения результата.
- Подготовка контроля флуоресценции минус один (FMO)
- Суспендант готовой гранулы помещают в буфер для окрашивания (см. шаг 4.1), сохраняя плотность клеток 0,5 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
- Возьмите пять пробирок FACS и обозначьте их как изотип CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, изотип CD73-PerCP Cy5.5 и изотип CD105-APC.
- Приготовьте суспензию клеток и антител в соответствии с таблицей 5.
- Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите ее до получения.
- Подготовка образцов к анализу
- Ресуспендант готовой гранулы в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1), поддерживая плотность клеток 0,5 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
- Возьмите две пробирки FACS и обозначьте их как Смешанные пробирки 1 и 2.
- Готовят клеточную и антителовую суспензию в соответствии с таблицей 6.
- Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите до получения.
- Подготовка образцов для одноклеточной сортировки
- Возьмите две пробирки FACS, добавьте 1 мл FBS и раскатайте пробирку до образования ровного слоя FBS на внутренней стороне каждой пробирки. Выдерживают его в течение 1-2 ч, одновременно обрабатывая образец для окрашивания. Обозначьте эти пробирки как Смешанные трубки 1 и 2.
- Ресуспендант готовой гранулы в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1), сохраняя плотность клеток 2-3 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
- Готовят суспензию клеток и антител в смешанных пробирках 1 и 2 в соответствии с таблицей 7.
- Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера для окрашивания и отложите в сторону. Добавьте 5 мкл DAPI за 15 минут до сортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что для экспериментов по сортировке рекомендуется более высокая плотность клеток на пробирку.
| Тип трубки | Бусины Positive Comp* | Отрицательные бусины* | Клетки | Добавлены антитела | |
| Трубка FITC | 1 капля | 1 капля | – | Античеловеческий CD90-FITC (2 мкл) | |
| Трубка V450 | 1 капля | 1 капля | – | Античеловеческий CD44-V450 (2 мкл) | |
| Трубка PerCP-Cy 5.5 | 1 капля | 1 капля | – | Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5,5 (2 мкл) | |
| Полиэтиленовая трубка | 1 капля | 1 капля | – | Античеловеческий CD45-PE (2 мкл) | |
| Трубка APC | 1 капля | 1 капля | – | Античеловеческий CD105-APC (2 мкл) | |
| Трубка DAPI | – | – | 50 мкл | – | |
| Неокрашенная трубка | – | – | 50 мкл | – | |
| *1 капля = 60 мкл суспензии шарика | |||||
Таблица 4: Компенсационные контрольные выборки. Аббревиатуры: Comp = компенсация; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.
| ТИП ТРУБКИ | АНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл) | АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл) | ДОБАВЛЕНЫ ИЗОТИПНЫЕ АНТИТЕЛА (2 мкл) | ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ | ||
| Трубка CD90-FITC FMO | - Античеловеческий CD44-V450 | Античеловеческий CD45-PE | Изотип IgG1 FITC | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | ||
| - Античеловеческий CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||||
| Трубка CD73-PerCP Cy5.5 FMO | - Античеловеческий CD44-V450 | Античеловеческий CD45-PE | Изотип PerCP Cy 5.5 IgG1 | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | ||
| - Античеловеческий CD90-FITC | ||||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||||
| Лампа CD44-V450 FMO | - Античеловеческий CD90-FITC | Античеловеческий CD45-PE | Изотип V450 IgG1 | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | ||
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||||
| FMO-лампа CD105-APC | - Античеловеческий CD44-V450 | Античеловеческий CD45-PE | Изотип APC IgG1 | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | ||
| - Античеловеческий CD90-FITC | ||||||||
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| Трубка CD45-PE FMO | - Античеловеческий CD44-V450 | - | Изотип PE IgG1 | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | ||
| - Античеловеческий CD90-FITC | ||||||||
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||||
Таблица 5: Контрольные образцы ФМО. Сокращения: FMO = флуоресценция минус единица; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.
| ТИП ТРУБКИ | АНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл) | АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл) | ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ | |
| Смешанная трубка 1 | - Античеловеческий CD44-V450 | Античеловеческий CD45-PE | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | |
| - Античеловеческий CD90-FITC | ||||||
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||
| Смешанная трубка 2 | - Античеловеческий CD44-V450 | Античеловеческий CD45-PE | 10 мкл | 50 мкл | 40 мкл | |
| - Античеловеческий CD90-FITC | ||||||
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Античеловеческий CD105-APC | ||||||
Таблица 6: Пробирки для многоцветного иммунофенотипирования SHEDs. Сокращения: SHEDs = стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека; ПЭ = фикоэритрин.
| ТИП ТРУБКИ | АНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (3 мкл) | АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (3 МКЛ) | ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ | ДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ПЯТЕН | |
| Смешанная трубка 1 | - Античеловеческий CD90-FITC | Античеловеческий CD45-PE | 9 мкл | 50 мкл | 41 мкл | |
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Смешанная трубка 2 | - Античеловеческий CD90-FITC | Античеловеческий CD45-PE | 9 мкл | 50 мкл | 41 мкл | |
| - Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Таблица 7: Одноклеточные реакционные пробирки для сортировки. Сокращения: FITC = флуоресцеин изотиоцианат; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.
5. Одноячеечная сортировка
- Подготовка клеточного сортировщика
- Установите в сортировщик сопло 100 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр соответствующего сопла должен быть как минимум в пять раз больше диаметра сортируемой частицы. Жидкость оболочки, которая будет использоваться для сортировки, должна быть определена в зависимости от типа образца и чувствительности эксперимента; Для этого эксперимента была использована запатентованная жидкость для оболочки. - Выполняйте ежедневную проверку качества прибора (QC) и настраивайте сортировщик для эксперимента. Обратитесь к руководству по прибору для получения подробного руководства по настройке прибора.
- Установите в сортировщик сопло 100 мкм.
- Настройка матрицы компенсаций
- Установите компенсационную матрицу с помощью компенсационных трубок с одним пятном, как показано в шаге 4.2.
- В проприетарном программном обеспечении выберите «Эксперимент» на панели инструментов и нажмите «Настройка компенсации». Откройте Создание элементов управления компенсациями.
- Проверьте маркеры и подтвердите. Добавляется новый образец с именем «Компенсация», при котором программное обеспечение автоматически добавляет новые пробирки, называемые маркерными элементами управления.
- Выберите трубку Unstained и запустите ее, чтобы записать 5 000 событий. Перетащите гейт на заполнение ячеек и примените его ко всем элементам управления компенсацией. Это необходимо для установки напряжений и отрицательного затвора для каждого флуоресцентного параметра.
- Точно так же загрузите трубки для компенсации одиночных пятен отдельно, а также запишите и сохраните данные. Выберите ворота, разграничивающие интересующую совокупность, и примените их ко всем элементам управления компенсациями. Это необходимо для установки положительных вентилей для каждого флуоресцентного параметра.
- Выберите «Эксперимент» на панели инструментов и нажмите «Рассчитать значения компенсации | ссылка и сохранить».
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как матрица автокомпозиции сгенерирована с помощью программного обеспечения, параметры напряжения флуорохромов не могут быть изменены ни для одного из каналов в смешанных лампах.
- Сбор данных
- Запишите 10 000 клеток в каждую пробирку, начиная с шага 4.3. 4.4 для сбора данных для анализа иммунофенотипа клеток.
- Подготовка устройств для сбора
- В зависимости от назначения отсортированных клеточных популяций можно выбрать 6-луночные, 24-луночные, 48-луночные или 96-луночные планшеты.
- Смажьте лунки 200-500 мкл FBS и держите планшеты нетронутыми в течение 2 ч.
- Через 2 ч удаляют остатки ФБС и добавляют 200-500 мкл 10% питательных сред МСК.
- Сортировка ячеек в режиме сортировки по одной ячейке
- Запустите смешанную трубку 1 (начиная с шага 4.5) и запишите 10 000 событий, чтобы установить шлюзы для интересующей нас популяции для сортировки, используя соответствующую стратегию стробирования.
- Загрузите сборную пластину и установите целевые номера ячеек в диапазоне от 2 500 до 5 000 ячеек на лунку и выберите маску чистоты сортировки одной ячейки.
- Соберите отсортированные популяции в устройство сбора и держите их на льду до конца эксперимента по сортировке.
- После этого перенесите планшеты в инкубатор с 5%CO2 для поддержания культуры при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора необработанные файлы данных экспортировались в формате .fcs (v.3.0. и выше). Отчеты о сортировке, создаваемые после каждого эксперимента, записывали количество событий/ячеек, отсортированных по заданной скважине, и указывали количество конфликтов, которые были прерваны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHED были охарактеризованы стандартными иммунофлуоресцентными анализами, показывающими экспрессию виментина (красные, промежуточные нити III типа), актиновых филаментов (фаллоидиновые зонды Alexa fluor 488) и ядер, окрашенных DAPI (рис. 1A). Для оценки их пролиферативной и колониеобразующей способности были проведены стандартные краткосрочные анализы роста клеток. На рисунке 1В показано увеличение скорости пролиферации в 14,3 раза со 2-го по 8-й день. Клоногенные свойства SHED были определены по анализу КОЕ-F, показанному на рисунке 1C-E. В соответствии с критериями ISCT мультипотентные МСК смогли дифференцироваться в три линии мезодермального происхождения. Цитохимическое окрашивание Oil Red O использовалось для обнаружения капель масла в дифференцированных адипоцитах (рис. 1F); Для окрашивания кальциевых отложений, обнаруженных в матриксе дифференцированных остеобластов, использовали окрашивание по фон Коссе (рис. 1G); а аггреканы в 3D-культуре были окрашены в алсийский синий цвет в дифференцированных хондробластах (рис. 1H).
Для характеристики иммунофенотипа SHEDs были установлены мультипараметрические анализы проточной цитометрии. Эксперименты проводились с использованием четырех типов экспериментального контроля: компенсационного контроля (табл. 4), FMO и изотипного контроля (табл. 5) и неокрашенного контроля. Изотипы всех использованных антител к МСК и ГСК были добавлены вместе с пробирками FMO для различения положительных и отрицательных сигналов и высокой и тусклой экспрессии антигена. На рисунке 2А показано распределение контрольных показателей FMO и изотипов, используемых для каждого эксперимента. Графики репрезентативной плотности показали отсутствие экспрессии изотипа FITC антител CD90 к FITC. Аналогичным образом, с помощью наложений гистограмм (рис. 2B) сравнивались уровни экспрессии окрашенных образцов вместе с их контролем в соответствующих каналах FITC, PerCP Cy5.5 и PE. Положительная экспрессия маркеров CD90 и CD73 (красные гистограммы) и отрицательная экспрессия CD45 сопоставимы с таковой у их неокрашенных и контрольных ФМО (синяя и черная гистограммы соответственно).
Характеристика иммунофенотипов методом проточной цитометрии показала распределение маркеров из одного из ранних пассажей (P6) SHED (рис. 3A-H). Как рекомендованные ISCT маркеры, так и CD44 определяли родительские популяции как МСК. Тетрапозитивная популяция, продемонстрированная на графиках плотности, показала ≥98% экспрессии маркеров CD90+CD73+CD105+CD44+ и ≤2% экспрессии маркеров CD45. Более пяти независимых экспериментов показали аналогичные результаты. Для одноклеточной сортировки высоких и тусклых экспрессоров были выбраны поздние SHED (P12), которые показали дифференциальную экспрессию положительных маркеров (рис. 4A-H). В соответствии со стратегией стробирования (рис. 4H) синглеты→ живые клетки→ не-ГСК→ популяции с двойным положительным CD73+CD90+ и одиночным положительным CD73+CD90- сортировали с использованием режима одноклеточной сортировки. Отсортированные популяции были собраны в 96-луночных/48-луночных/6-луночных планшетах с различным количеством посева на лунку (Дополнительный файл 1). Было предпринято три последовательные попытки в одной фазе экспериментов по сортировке, и выживаемость клеток после сортировки (в дважды положительных экспрессорах: CD90+CD73+) в эксперименте составила 100%. Было проведено три независимых этапа экспериментов. Мы сопоставили количество клеток, которые росли на одну скважину после сортировки, с количеством ячеек, отсортированных на скважину.
На рисунке 5A показано, что постсортированные клетки CD90+CD73+ , собранные в 96-луночном планшете, показали адгезию и пролиферацию, как и их родительская популяция. Было замечено, что отсортированные клетки достигают 70-80% слияния на шестой день после сортировки. Адгезивные и пролиферирующие постсортированные клетки дифференцировали в присутствии адипогенных факторов роста, а затем окрашивали после 15-го дня Oil Red O, используя соответствующие постсортированные контрольные (недифференцированные) клетки (рис. 5B, C).
Рисунок 1: Характеристика стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает, что изолированные МСК экспрессируют виментин (красные, промежуточные филаменты III типа), актиновые филаменты (фаллоидиновые зонды Alexa fluor 488) и DAPI (синие, ядра). Микрофотография получена при оригинальном увеличении 20х. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Краткосрочный анализ роста клеток SHED демонстрирует их высокую пролиферативную способность, о чем свидетельствует значительное увеличение количества клеток в культуре ко 2-му дню и 14,3-кратное увеличение скорости пролиферации к концу 8-го дня (n = 3, p-значение<0,01). Показаны столбцы погрешности стандартного отклонения. (К-Э) Анализ КОЕ-Ф и окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом подтверждают колониеобразующую способность SHEDs; (C) ожидается, что после 14 дней культивирования образуются несколько колоний; (D) одиночная клоногенная колония, происходящая из одной клетки; (E) Одиночная колония SHED, окрашенная в кристаллический фиолетовый цвет, демонстрирует типичную фибробластоподобную морфологию клеток. (Ф-Х) Ожидается, что МСК в соответствующих условиях in vitro подвергнутся дифференцировке на адипогенную, остеогенную и хондрогенную линии к 21-му дню. Цитохимическое окрашивание показывает (F) масляно-красный O (на врезке показано 40-кратное изображение адипоцита с масляными каплями), (G) окрашивание по Коссе и (H) окрашивание алсийским синим для адипогенной, остеогенной и хондрогенной линий соответственно на 22-й день. Микрофотографии получены при оригинальном увеличении 20х. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: МСК = мезенхимальные стволовые клетки; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; SHEDs = стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека; КОЕ-F = колониеобразующая единица-фибробласт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Отрицательный контроль, используемый в мультипараметрическом эксперименте . (A) Контрольные элементы флуоресценции минус один были отображены в табличной форме, где контрольные элементы FMO были заменены их специфическими изотипами. На графиках репрезентативной плотности (слева направо) показан неокрашенный контрольный элемент (слева), FMO CD90 FITC (в центре) со всеми антителами, кроме CD90 FITC, с добавлением изотипа CD90 FITC и полностью окрашенный образец со всеми антителами панели (справа). (B) Наложение гистограммы представляет собой сравнение трех типов образцов, черный цвет представляет FMO, синий — неокрашенные, а красный — полностью окрашенные образцы в соответствующих каналах. Сокращения: FMO = флуоресценция минус один; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок; ПЭ = фикоэритрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мультипараметрическое иммунофенотипирование SHEDs (P6). (A) SSC-A в сравнении с FSC-A: В зависимости от свойств бокового и прямого рассеяния интересующие ячейки находятся на стробах и отделены от обломков; (B) FSC-H в сравнении с FSC-A и (C) SSC-H в сравнении с SSC-A: Эти два графика используются для дискриминации дублетов, что позволяет выбирать синглеты, исключая агрегаты, которые могут генерировать ложноположительные сигналы; (D) SSC-A в сравнении с CD45 ПЭ: Стробирование исключения позволяет отбирать популяцию CD45- из синглетов; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 в сравнении с CD90 FITC: Из CD45- живых синглетов CD90+CD73+ клетки являются стробными; (F) CD44 V450 в сравнении с CD105 APC: популяция CD90+CD73+ дополнительно подготавливается для определения тетрапозитивных клеток CD90+CD73+CD44+CD105+; (G) SSC-A в зависимости от времени (времени): На графике показано стабильное получение данных во времени (секундах) и то, что ни одно событие не вызывало колебаний давления во время захвата; (H) Стробная иерархия. Сокращения: SHEDs = стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных SHED (P12). (A-F) Пошаговая стратегия стробирования на основе исключения для сортировки чистых МСК в следующем последовательном порядке: клетки для singlets_1, singlets_2, DAPI - живые клетки, CD45 - негемопоэтические клетки и, наконец, CD90+CD73+ клетки. Зависимые популяции, показанные на рисунке (F), были отсортированы с использованием режима сортировки одной ячейки. (G) График зависимости SSC-A от времени (времени) описывает непрерывную сортировку образцов. (H) Стробная иерархия. (n=3, Эффективность сортировки = 100%). Сокращения: SHEDs = стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека; МСК = мезенхимальные стволовые клетки; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Морфологическая и функциональная характеристика постсортированных SHED. (A) Фазово-контрастные изображения постсортированных популяций были собраны в 96-луночную планшет на 6-й день при первоначальном увеличении 10x, масштабная линейка = 10 мкм (на врезке показано 20-кратное изображение, изображающее отсортированные одиночные клетки, изменяющие морфологию в фибробластоподобные МСК). Цитохимическое окрашивание для адипогенной дифференцировки с использованием масляного красного O, наблюдаемое в (B) недифференцированной (контроль) и (C) дифференцированной популяции после сортировки при исходном увеличении 20x, масштабная линейка = 10 мкм (на врезке показано 40-кратное изображение, изображающее наблюдаемые капли масла). Аббревиатуры: SHEDs = стволовые клетки из отслоившихся молочных зубов человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: скомпилированные отчеты о сортировке, созданные для каждого эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S1: Оптическая конфигурация BD FACSAria Fusion. Аббревиатуры: LP = длинный проход; ФЭУ = фотоумножитель; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В области тканевой инженерии и регенеративной медицины, среди постнатальных источников, МСК, полученные из пероральных тканей, вызвали глубокий интерес из-за их минимальных этических обязательств и значительного многолинейного дифференциального потенциала21. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) из пораженного третьего моляра и SHED привлекли наибольшее внимание среди стоматологических МСК в связи с их терапевтическим потенциалом при нейродегенеративных и травматических заболеваниях22. Протокол, описанный в этой рукописи, помогает характеризовать SHED с помощью мультипараметрического подхода и далее сортировать интересующие популяции с помощью одноклеточного подхода. Однако применение этого протокола не ограничивается только пероральными МСК, но также может быть использовано для иммунофенотипирования и сортировки МСК из тканей других источников в организме человека23.
Здесь необходимо обсудить несколько важнейших шагов в этом протоколе для его успешной реализации для решения рассматриваемой биологической проблемы. Ключом к каждому протоколу сортировки является проверка двух важных компонентов: его биологического контроля и экспериментального контроля. Во-первых, поддержание чистоты культуры гарантирует, что используемый образец не будет скомпрометирован во время сортировки. Жизнеспособность клеток при предварительной сортировке одноклеточной суспензии должна гарантировать, что будет получено более 70% жизнеспособных клеточных популяций с последующим анализом и сортировкой здоровых субпопуляций. Буфер для окрашивания, используемый в одноклеточной суспензии, должен содержать 2% FBS, а эксперименты лучше проводить при комнатной температуре. Выбор правильного слияния этих первичных клеток (80-85% слияния) позволяет избежать нарушения их жизнеспособности и снижает вероятность образования крупных агрегатов. Кроме того, использование маркера «живой/мертвый» (DAPI в этом протоколе) имеет важное значение для каждого эксперимента по сортировке. В этом исследовании, поскольку в качестве образцов использовались МСК приблизительного диаметра 20-35 мкм, был выбран размер сопла 100 мкм для их сортировки при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм на BD FACSAria Fusion. Это позволило проводить сортировку клеток без ущерба для жизнеспособности клеток во время процесса при более низком давлении оболочки. Для получения подробной информации об условиях настройки сортировки рекомендуется обратиться к руководству по программному обеспечению BD FACSDiva24.
Существенной предпосылкой для проведения многоцветных экспериментов в проточной цитометрии является необходимость соответствующего контроля; Здесь используются четыре основных типа контроля: автофлуоресценция, изотипы, FMO и компенсационные контроли. Матрица автокомпенсации позволяла проводить точную компенсацию, предотвращая спектральное просачивание в детекторах, и использовала для этого как компенсационные шарики, так и ячейки. Неокрашенный образец устанавливал порог автофлуоресценции МСК. Смешанные пробирки со всеми четырьмя антителами включают изотип и FMO каждого используемого антитела. Компенсационный контроль DAPI осуществлялся с помощью МСК, которые обрабатывались отдельно (с тепловым шоком). Используемая здесь панель антител (как указано в таблице 8) специально разработана для МСК на основе критериев, установленных ISCT, и конфигурации прибора сортировщика клеток BD FACSAria Fusion (см. Дополнительную таблицу S1). Это очень важно при планировании экспериментов по многопараметрической проточной цитометрии. Панель характеристик, используемая для иммунофенотипирования, состоит из четырех положительных маркеров МСК (CD90, CD105, CD73 и CD44) и одного отрицательного маркера (CD45). В отличие от этого, панель для эксперимента по сортировке содержит два положительных маркера (CD90 и CD73), один отрицательный маркер (CD45) и активный/мертвый маркер (DAPI) для обеспечения высокого количества живых МСК.
| Антитела/маркер | Флуорохром | Профиль поверхности hMSC | Длина волны лазера (нм) | Пик возбуждения (нм) | Пик выбросов (нм) |
| КД44 | В450 | Следует выражать; >95% | 405 | 405 | 450 |
| КД90 | ФИТК | 488 | 495 | 519 | |
| КД73 | ПерСР-ЦИ5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| КД105 | БТР | 640 | 650 | 660 | |
| КД45 | ПЭ | Не следует выражать; <2% | 561 | 566 | 574 |
| ДАПИ | - | Маркер мертвых клеток | 405 | 358 | 461 |
Таблица 8: Многоцветная панель, предназначенная для характеризации и сортировки ДЭП методом проточной цитометрии. Сокращения: FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.
Выбор сортовой маски чистоты
Учитывая непредсказуемость клеточной гетерогенности в МСК, массовая сортировка не обязательно может достичь уровня чистоты среди отсортированных популяций. В этом исследовании мы оптимизировали протокол сортировки отдельных клеток, чтобы идентифицировать одноклеточные клоны и отслеживать их функциональные свойства после сортировки с точки зрения эффективности. Одноячеистая сортировка проводилась на BD FACSAria Fusion, который обладал следующими гибкими настройками: выбор сопла 100 мкм, давление оболочки 20 фунтов на квадратный дюйм, регулируемый расход (поддерживаемый на уровне 20 мкл/мин) и пороговая скорость 380 событий/с. Шансы выбрать две целевые ячейки вместо одной в этом методе минимальны. Как правило, алгоритм выбирает режим сортировки одной ячейки, который может разрешить сортировку чистых популяций целевых клеток и определить, сколько капель будет отсортировано в выбранном устройстве сбора. Режим Точность в конечном итоге должен быть выбран таким образом, чтобы он мог комбинировать маски, доступные в алгоритмах сортировки, и создавать строгие условия сортировки для сортировки наиболее чистых интересующих популяций. Режим сортировки по одной ячейке не ставит под угрозу целевую ячейку, если она агрегируется в нецелевую ячейку во время сортировки, и это позволяет достичь уровня чистоты, которого мы ожидаем в этом подходе. Это был модуль, выбранный в этом протоколе, и отсортированные ячейки были собраны в 96-луночных, 48-луночных, 24-луночных и 6-луночных планшетах.
В этом исследовании мы отсортировали субпопуляции на основе их дифференциального иммунофенотипа, а именно CD90+CD73+CD45-. Как в протоколах характеризации, так и в протоколах сортировки наша стратегия стробирования (как показано на рисунке 3 и рисунке 4) была основана на исключении стробирования из популяции CD45-, чтобы получить негемопоэтическую популяцию (поскольку они были проверены и охарактеризованы ранее с помощью маркеров, предписанных ISCT) после идентификации синглетов. В конце концов, МСК были идентифицированы в популяции CD45- с использованием положительных маркеров ISCT. Здесь стоит отметить, что нет большой разницы в процентном соотношении сначала положительных экспрессоров маркеров ISCT, а затем отрицательных экспрессоров CD45. Однако, поскольку целью этой сортировки было выявление клеток, демонстрирующих измененную экспрессию известных маркеров МСК, мы завершили наш анализ графиками положительной экспрессии.
На репрезентативных рисунках 97% CD45-клеток являются МСК, но при количественной оценке экспрессии антигена мы увидели, что 75% клеток являются дважды положительными экспрессорами двух маркеров CD90 и CD73, в то время как есть несколько популяций, которые являются одноположительными экспрессорами тех же маркеров (показаны на рисунке 3F), и несколько клеток, которые не экспрессируют маркеры вообще.
В ходе характеристики этих клеток мы идентифицировали субпопуляции как тетрапозитивные МСК, трижды положительные и дважды отрицательные популяции. Эта дифференциальная экспрессия маркеров МСК расширяется с увеличением пассажей, и поэтому возникает необходимость изучения и корреляции этой разницы с их функциональными свойствами. Конечная цель сортировки МСК в нашем исследовании состоит в том, чтобы провести сравнительный анализ между идентифицированными субпопуляциями и определить, имеет ли дифференциальная экспрессия положительных маркеров функциональное значение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.
Acknowledgments
Мы благодарим Центр проточных ячеек в Центре передовых научных исследований им. Джавахарлала Неру (Бангалор, Индия) за использование основной установки проточной цитометрии. Криосекционирование гранульной культуры дифференцированных клеток проводили в референс-лаборатории Neuberg Anand, Бангалор, Индия. Эта работа была поддержана Академией высшего образования Манипала (MAHE), Индия. AG благодарит за поддержку стипендию доктора Т. М. А. Пая от MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
