Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

فرز الخلية الواحدة للخلايا الجذعية الوسيطة المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65723
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام فرز الخلايا المنشطة بالتألق للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية باستخدام طريقة فرز الخلية الواحدة. على وجه التحديد ، يمكن أن يحقق استخدام الفرز أحادي الخلية نقاء 99٪ من الخلايا المناعية من مجموعة غير متجانسة عند دمجها مع نهج قائم على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات.

Abstract

تمتلك الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) للكائن الحي قدرة غير عادية على التمايز إلى سلالات متعددة من الخلايا البالغة في الجسم وهي معروفة بخصائصها المناعية والمضادة للالتهابات. يعد استخدام هذه الخلايا الجذعية نعمة لمجال البيولوجيا التجديدية ، ولكنه في الوقت نفسه لعنة على الطب التجديدي والعلاجات بسبب الغموض الخلوي المتعدد المرتبط بها. قد ينشأ هذا الغموض من التنوع في مصدر هذه الخلايا الجذعية ومن ظروف نموها في المختبر ، وكلاهما ينعكس على عدم تجانسها الوظيفي.

وهذا يستدعي منهجيات لتوفير مجموعات نقية ومتجانسة من MSCs للتطبيقات العلاجية. مكن التقدم في مجال قياس التدفق الخلوي من اكتشاف مجموعات الخلية المفردة باستخدام نهج متعدد المعلمات. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد وتنقية الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) من خلال فرز الخلية المفردة بمساعدة الفلورة. حدد التعبير المتزامن للعلامات السطحية ، وهي CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC) ، CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5) ، CD105-allophycocyanin (APC) ، و CD44-V450 ، التعبيرات الإيجابية "الساطعة" ل MSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. ومع ذلك ، لوحظ انخفاض كبير في النسب المئوية للتعبيرات الرباعية لهذه العلامات الموجبة من المقطع 7 فصاعدا إلى المقاطع اللاحقة.

تم فرز المجموعات السكانية الفرعية ذات النمط المناعي باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية حيث شكلت علامتان موجبتان وعلامة سلبية واحدة فقط معايير التضمين. ضمنت هذه المنهجية صلاحية الخلية للسكان الذين تم فرزهم وحافظت على تكاثر الخلايا بعد الفرز. يمكن استخدام تطبيق المصب لمثل هذا الفرز لتقييم التمايز الخاص بالنسب للمجموعات السكانية الفرعية المسورة. يمكن تطبيق هذا النهج على أنظمة الخلية المفردة الأخرى لتحسين ظروف العزل والحصول على معلومات علامات سطح الخلية المتعددة.

Introduction

يمكن اعتبار الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا المناسبة للعلاجات القائمة على الخلايا ويمكن اعتبارها نظاما قياسيا ذهبيا في الطب التجديدي. يمكن عزل هذه الخلايا من مجموعة متنوعة من المصادر في الجسم بأصول أنسجة مختلفة1. اعتمادا على أنسجة المصدر ، يعرض كل نوع من أنواع MSC سلوكا غامضا في المختبر 2. ويلاحظ هذا بشكل جيد في خصائصها المورفولوجية والوظيفية3. أظهرت دراسات متعددة تباينا داخل النسيل في الأبعاد ، بما في ذلك تمايز الأنسجة البالغة ، والحالة الجينومية ، والبنية الأيضية والخلوية ل MSCs 2,4.

كان التنميط المناعي للخلايا تطبيقا شائعا لقياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا الجذعية ، وقد تم استخدام ذلك من قبل الجمعية الدولية للعلاج بالخلايا والجينات (ISCT) في عام 2006 لوصف قائمة بالمعايير الدنيا لتحديد الخلايا على أنها MSCs. وذكر أنه إلى جانب الالتصاق البلاستيك والقدرة على التمايز إلى ثلاث سلالات (عظمية المنشأ ، غضروفية ، ودهنية) في المختبر ، يجب أن يعبر ≥95٪ من سكان الخلايا عن CD105 و CD73 و CD90 ، ويجب أن تفتقر هذه الخلايا إلى التعبير (≤2٪ إيجابي) ل CD34 و CD45 و CD11b و CD14 و HLA-DR ، كما تم قياسها بواسطة قياس التدفقالخلوي 5. على الرغم من أن MSCs تم تعريفها بواسطة مجموعة من المؤشرات الحيوية بموجب الحد الأدنى من معايير ISCT ، إلا أنه لا يمكن قياس خصائصها المناعية باستخدام هذه المؤشرات الحيوية وكانت هناك حاجة إلى المزيد من هذه المعايير لجعل المقارنات عبر الدراسة والاختلافات النسيلية أسهل في القياس الكمي2.

على الرغم من المبادئ التوجيهية التي وضعتها ISCT ، فقد أظهرت الأبحاث المكثفة حول MSCs أن عدم التجانس موجود في هذه الفئة من السكان ، والذي يمكن أن ينشأ بسبب العديد من العوامل ، ويرجع ذلك أساسا إلى الطبيعة المنتشرة في كل مكان لعدم التجانس الذي ينشأ بين الجهات المانحة MSC6 ، ومصادر الأنسجة7 ، والخلايا الفردية داخل السكان النسيلي8 ، وظروف الثقافة 2,9 ، 10. يعد توصيف وتنقية هذه الخلايا الأولية من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة لضمان الجودة ومصير الخلايا خطوات أساسية في إنتاجها. تتطلب الحاجة إلى فهم الاختلافات المعروضة بين السكان طريقة فعالة لحلها إلى مجموعات فرعية يمكن تقسيمها وجمعها بشكل منفصل11. تساعد تحليلات مستوى الخلية الواحدة في التغلب على تحديات الاختلاف بين الخلية والخلية ، وتقليل الضوضاء البيولوجية الناشئة عن مجموعة غير متجانسة ، وتوفر القدرة على التحقيق في الخلايا النادرة وتوصيفها12.

بناء على الغرض والمعلمات المختارة ، يمكن استخدام عدة طرق لفرز وإثراء المجموعات السكانية المختارة. يمكن أن تشتمل تقنيات فرز الخلايا على طرق فرز بالجملة وفرز خلية واحدة. في حين أن الفرز بالجملة يمكن أن يثري السكان المستهدفين من خلال فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) 13 ، والتجزئة 14 ، والتطهير 15 ، فإن الفرز أحادي الخلية يمكن أن يثري مجموعات أكثر تجانسا عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 11. ويسلط الجدول 1 الضوء على التحليلات المقارنة لكل طريقة من هذه الطرق مع مجموعة المزايا والعيوب الخاصة بها.

الجدول 1: تحليلات مقارنة للتقنيات المختلفة: MACS ، والتجزئة ، والتطهير ، و FACS مع إبراز الاختلافات في مبدأها ومزايا وعيوب اختيار تقنية معينة على أخرى. الاختصارات: MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

منذ ظهور هذه التقنية ، لعب قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية دورا رئيسيا في التعداد16 ، والكشف ، وتوصيف مجموعة خلايا معينة في عينة غير متجانسة17. وضع هيويت وآخرون في عام 2006 الأساس لمنهجية فرز الخلايا الآلية لتعزيز عزل المجمعات المتجانسة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs)18. أدى الفرز أحادي الخلية إلى إثراء مجموعة hESCs المحولة بواسطة GFP مما يسهل عزل المستنسخة المعدلة وراثيا ، مما فتح بعدا جديدا في البحث السريري. لتحسين كفاءة الفرز ، تم اتباع نهجين بشكل عام ؛ إما أن يتم تعديل وسائط جمع المجموعات السكانية التي تم فرزها للحفاظ على صلاحية وتكاثر الخلايا بعد الفرز19 أو يتم تعديل خوارزمية / برنامج فرز الخلايا بشكل مناسب12.

مع تقدم التكنولوجيا ، تمكنت أجهزة قياس التدفق الخلوي التجارية وأجهزة فرز الخلايا من المساعدة في مواجهة التحديات التي تمت مواجهتها أثناء فرز مجموعات الخلايا الهشة والنادرة بشكل معقم ، وخاصة الخلايا الجذعية من أصول مختلفة. كان أحد التحديات الرئيسية لعلماء بيولوجيا الخلايا الجذعية هو العزلة النسيلية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باتباع بروتوكولات النقل المطلوبة في دراسات تحرير الجينات19. تمت معالجة ذلك عن طريق فرز الخلايا المفردة إلى 96 لوحة جيدة تم تغليفها بالخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) جنبا إلى جنب مع المكملات الغذائية ومثبطات ROCK التجارية الصغيرة. ومع ذلك ، يمكن تحسين استراتيجيات عزل الخلايا إلى حد كبير باستخدام فرز المؤشر ، وهي سمة من سمات خوارزمية الفرز التي تحدد النمط المناعي للخلايا الفردية التي تم فرزها12. ساعدت هذه الطريقة المكررة في فرز الخلية الواحدة ليس فقط في تعزيز كفاءة الفرز للخلايا الجذعية ، خاصة فيما يتعلق بمجموعات الخلايا الجذعية المكونة للدم النادرة ، ولكن أيضا ربط المستنسخة أحادية الخلية بكفاءة بمقايساتها الوظيفيةالنهائية 20.

تركز هذه الورقة على فرز الخلايا الجذعية أحادية الخلية للخلايا الجذعية المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية (SHEDs) لإثراء المجموعات الفرعية لدراسة قدراتها على التمايز الوظيفي. باستخدام مزيج من علامتين إيجابيتين ل MSC ، CD90 و CD73 ، وعلامة مكونة للدم سلبية CD45 ، تم تحديد MSCs ذات النمط المناعي وتم تحديد التعبيرات الخافتة والصفرية. بناء على النمط المناعي الخاص بهم ، تم تحديد المجموعات السكانية الفرعية على أنها MSCs نقية ، مجموعات إيجابية واحدة وسلبية مزدوجة. تم فرزها باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية للحصول على مجموعات فرعية نقية وغنية لمزيد من الدراسات الوظيفية لتحديد ما إذا كان التعبير التفاضلي للعلامات هو قطعة أثرية لظروف الاستزراع في المختبر أو ما إذا كان له أي تأثير على الخصائص الوظيفية أيضا. تم فرز الخلايا التي لم تكن معبرات متجانسة من "علامات MSC الإيجابية" لدراسة خصائصها الوظيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة: تم استلام عينات لب الأسنان المتساقطة المقشرة البشرية بعد الحصول على الموافقة المستنيرة والموافقة الأخلاقية الكاملة من قبل كلية ومستشفى سري راجيف غاندي لطب الأسنان (SRGCDS) قسم الفم والوجه والفكين ، بنغالورو ، وفقا للمعايير التي وضعتها لجنة التخليص الأخلاقي بالمستشفى ، SRGCDS. بعد ذلك تمت الموافقة على عزل وثقافة وصيانة وتطبيق SHEDs من قبل وامتثالا للإرشادات التي أوصت بها اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) في معهد مانيبال للطب التجديدي ، MAHE - بنغالورو. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة

  1. للحفاظ على الثقافة
    1. تحضير وسائط زراعة الخلايا MSC (10٪) باستخدام الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة ، 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ L-glutamine ، و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (Pen-strep) (الجدول 2).
    2. تحضير وسائط زراعة الخلايا MSC (20٪) باستخدام الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة ، 20٪ FBS ، 1٪ L-glutamine ، و 1٪ Pen-strep (الجدول 2).
    3. تحضير الوسائط المعادلة باستخدام الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة ، 1٪ L-glutamine ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي (مضاد للطخار) (الجدول 2).
  2. لتحليل التدفق الخلوي والفرز
    1. تحضير محلول التلوين باستخدام 2٪ FBS في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    2. قم بإعداد محلول مخزون من 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) (1 ميكروغرام / مل) عن طريق إضافة 1 ميكرولتر في 1 مل من PBS
  3. للتمايز الخاص بالنسب ل MSCs
    1. تحضير وسائط التمايز للتمايز العظمي ، الغضروفي ، والأديبوجيني وفقا للتكوين الموصوف في الجدول 3. قم بتخزين الحصص المحضرة في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال مدة التجربة.
    2. تحضير الوسائط المتعطشة للمصل (2٪ وسط) باستخدام الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة ، 2٪ FBS ، 1٪ L-glutamine ، و 1٪ Pen-strep (الجدول 2).
نوع الوسائط الغرض من وسائل الإعلام تكوين ل 50 مل
إف بي إس قلم بكتيريا إل-جلوتامين الوسط القاعدي ل hESCs غير المتمايزة
10٪ وسائط ثقافة MSC وصيانتها 5 مل 500 ميكرولتر 500 ميكرولتر 44 مل
20٪ وسائط مقايسة CFU-F 10 مل 500 ميكرولتر 500 ميكرولتر 39 مل
مصل جائع (2٪) وسائل الإعلام وسائط لآبار التحكم في بروتوكول التمايز 1 مل 500 ميكرولتر 500 ميكرولتر 48 مل
تحييد الوسائط وسائل الإعلام لتحييد تعليق الخلية بعد التربسين - 500 ميكرولتر 500 ميكرولتر 49 مل

الجدول 2: وسائط زراعة الخلايا لصيانة الثقافة ومقايساتها. الاختصارات: MSC = الخلايا الجذعية الوسيطة. CFU-F = وحدة تشكيل مستعمرة الخلايا الليفية.

مكونات الوسائط العظمية المنشأ وسائل الإعلام الغضروفية الوسائط الأديبوجينية
وسائل الإعلام القاعدية 90 مل 90 مل 90 مل
الوسائط التعريفية 10 مل 10 مل 10 مل
الحجم الكلي 100 مل 100 مل 100 مل

الجدول 3: وسائط التمايز لتمايز النسب الثلاثية ل SHEDs.

2. ثقافة وصيانة الحظائر

  1. الحفاظ على الخلايا في وسائط ثقافة MSC 10٪ وإجراء تغييرات الوسائط كل 2 أيام أو حسب الحاجة.
  2. خلايا التربسين عند التقاء 95٪ باستخدام 0.25٪ تربسين-EDTA.
  3. تحييد الخلايا بعد التربسين باستخدام وسائط التحييد.
  4. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات خلوية.
  5. صب المادة الطافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10٪ وسائط ثقافة MSC.
  6. خلايا البذور في أطباق زراعة الخلايا الطازجة التي تحتوي على 10٪ وسائط زراعة MSC لمزيد من التجارب أو الزراعة الفرعية.
    ملاحظة: كثافة البذر المثلى للحظائر هي 0.2 × 10 6 خلايا في طبق 100 مم و 0.8 × 10 6 خلايا في دورق T-75 ، للحصول على 1.5 × 10 6 خلايا و 4 × 10 6 خلايا ، على التوالي ، عند التقاء 90-100٪.

3. توصيف MSCs

  1. مقايسة نمو الخلايا على المدى القصير
    1. البذور 4 × 104 خلايا / بئر في ثلاث نسخ إلى ألواح 6 آبار في وسائط ثقافة MSC بنسبة 10٪.
    2. احتضان لوحات لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية، وإجراء تغييرات وسائل الإعلام كل 2 أيام.
    3. احصد الخلايا في الأيام 2 و 4 و 8 باستخدام علاج التربسين بنسبة 0.25٪ واغسلها بوسائط الثقافة.
    4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الوسائط.
    5. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وحدد صلاحيتها بطريقة استبعاد التريبان الأزرق.
    6. احسب معدل الانتشار باستخدام المعادلة (1):
      Equation 1(1)
  2. مقايسة الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة (CFU-F)
    1. بذر 10000 خلية في طبق 100 مم واستزراعها في 20٪ من وسائط زراعة MSC.
    2. احتضان الأطباق لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية ، وقم بإجراء تغييرات الوسائط كل 3 أيام.
    3. بعد 14 يوما ، شطف المستعمرات مع PBS ، وتثبيتها بصبغة الكريستال البنفسجي في الميثانول ، وشطف مرة أخرى مع PBS لإزالة وصمة عار المتبقية.
    4. عد وصور المستعمرات.
      ملاحظة: عد المستعمرات التي تحتوي على >50 خلية. يتم حساب كفاءة تشكيل المستعمرة كأرقام وحدات تشكيل مستعمرة.
  3. مقايسة التألق المناعي
    1. بذر MSCs على أطباق 35 مم واتركها تنمو حتى التقاء 80-90٪.
    2. قم بإزالة الوسائط وشطف الأطباق باستخدام برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
    3. ثبت الخلايا ب 1 مل من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) إما عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. بعد التثبيت ، اغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    5. أضف 0.3٪ Triton X-100 في PBST (0.05٪ محلول Tween 20 في PBS) لتخلل الخلايا. احتفظ بها على الروك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. اغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    7. أضف 3٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) للحجب واحتفظ به على الروك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. اغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    9. أضف 800 ميكرولتر من تخفيف 1: 500 من مضاد الفأر ، واحتفظ به على الروك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وانقل اللوحة إلى 4 درجات مئوية للحضانة طوال الليل.
    10. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    11. أضف 800 ميكرولتر من تخفيف 1: 1,000 من الجسم المضاد الثانوي المتقاطع IgG (H + L) المضاد للفأر ، Alexa Fluor 555 ، واحتفظ به لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة على الروك.
    12. اغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    13. أضف Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL في 1000 ميكرولتر من PBS واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على الروك.
    14. اغسل الآبار باستخدام PBST لمدة 3 × 5 دقائق على الروك.
    15. أضف 700 ميكرولتر من مركب DAPI وراقب الخلايا تحت المجهر.
  4. التمايز الخاص بالنسب
    1. التمايز بعد ثقافة 2D
      1. خذ لوحين من 48 بئرا وقم بتسميتهما على أنهما سلالات عظمية ودهنية المنشأ ، على التوالي.
      2. قم بزرع 15000 خلية / بئر في أربعة آبار من كل لوحة واستزراعها في 10٪ من وسائط الاستزراع MSC.
      3. بمجرد أن تصل الطبقة الأحادية للخلايا إلى التقاء 90٪ ، قم بتسمية أول بئرين على أنهما "تحكم" واستبدل الوسائط الحالية بوسائط متعطشة للمصل (2٪ وسائط). في البئرين الأخيرين المسمى "اختبار" ، أضف وسائط تمايز لأي من السلالتين ، دهنية المنشأ أو عظمية. ضع علامة على هذا على أنه اليوم 0.
      4. استبدل الوسائط برفق كل ثلاثة أيام للتحايل على التقشير وكن حذرا لتجنب التلوث.
      5. الحفاظ على هذه الشروط حتى اليوم الحادي والعشرين ؛ ثم عملية لتجربة تلطيخ.
    2. التمايز بعد ثقافة 3D
      1. خذ أنبوبين سعة 15 مل لأداء التمايز الغضروفي باستخدام ثقافة الحبيبات ثلاثية الأبعاد.
      2. نقل 1 × 10 6 خلايا إلى كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة6 دقائق لتشكيل بيليه. قم بتسمية أنبوب واحد على أنه "تحكم" وأضف 10٪ من وسائط ثقافة MSC إليه ؛ قم بتسمية الأنبوب الآخر باسم "اختبار" وأضف وسائط تمايز غضروفية المنشأ. ضع الأنابيب بعناية في الحاضنة مع أغطيةها مشدودة بشكل فضفاض. ضع علامة على هذا على أنه اليوم 0.
      3. قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة أيام بعناية ، حتى لا يتم إزاحة / تفكك الحبيبات أثناء تغييرات الوسائط.
      4. حافظ على هذه الظروف حتى اليوم الحادي والعشرين ثم قم بمعالجة الخلايا لمزيد من التجارب.
  5. تلطيخ كيميائي خلوي خاص بالنسب
    1. بالنسبة للثقافات ثنائية الأبعاد ، استخدم لوحات MSCs (التحكم) المتباينة (الاختبار) وغير المتمايزة (من الخطوة 3.4.1.5.) للتلطيخ ، وأولا ، قم بإزالة الوسائط واغسلها مرتين باستخدام PBS. ثبت الخلايا باستخدام 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. أداء تلطيخ لكل سلالة على النحو التالي.
      1. بالنسبة لنسب الخلايا الشحمية ، أضف محلول النفاذية من المجموعة واحتضان اللوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحضير وإضافة 1 مل من محلول عمل Oil red O والاحتفاظ به لمدة 10 دقائق. إزالة وصمة عار وإعطاء خمس غسلات بالماء المقطر.
      2. بالنسبة لنسب الخلايا العظمية ، أضف 5٪ من نترات الفضة الطازجة (في الماء المقطر) إلى كل بئر واحتفظ باللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة. إزالة الحل وإضافة 2.5 ٪ من ثيوسلفات الصوديوم لإزالة الفضة غير المتفاعلة. احتفظ بها لمدة 5 دقائق. إزالة وصمة عار ، وغسل مرتين بالماء المقطر ، ومراقبة الخلايا الملطخة تحت المجهر.
    2. بالنسبة للمزارع ثلاثية الأبعاد ، اجمع الحبيبات بعد نهاية فترة التمايز من الخطوة 3.4.2.3 واحصل على عمليات الاستئصال المبرد للأنسجة المتمايزة في شكل الحبيبات. اترك الشرائح تجف في الهواء وتكون في درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في التلطيخ.
      1. بالنسبة لسلالة الخلايا الغضروفية ، اتبع إرشادات مجموعة التلوين لإضافة كمية كافية من محلول الغسيل ، وإزالته ، وإضافة محلول التثبيت ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة. يغسل بالماء المقطر ، ويضاف محلول التلوين ، ويحتضن لمدة 30 دقيقة. اغسل ثلاث مرات بحمض الهيدروكلوريك 0.1 نيوتن ؛ أضف الماء المقطر لتحييد الحموضة. مراقبة الخلايا الملطخة تحت المجهر برايتفيلد.

4. تلطيخ سطح الخلية للتنميط المناعي

ملاحظة: لوحات زراعة الخلايا الموصى بها للحصول على العدد الأمثل من الخلايا في الخطوات 4.2-4.5 هي أطباق 100 مم أو قوارير T75.

  1. تحضير الخلايا لتجارب قياس التدفق الخلوي
    1. التربسين وجمع الخلايا من طبق / قارورة متقاربة وأجهزة طرد مركزي في 300 × غرام لمدة 6 دقائق للحصول على بيليه الخلية.
    2. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسائط وحدد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم باتباع طريقة استبعاد التريبان الأزرق.
    3. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى بعد العد وإعطاء غسلتين أخريين للحبيبات مع 1 مل من العازلة تلطيخ.
    4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات أخيرا في حجم مناسب من المخزن المؤقت للتلطيخ اعتمادا على البروتوكول (انظر الخطوات من 4.2 إلى 4.5).
  2. إعداد ضوابط التعويض
    1. خذ سبعة أنابيب FACS وقم بتسميتها على أنها غير ملوثة و DAPI و V450 و FITC و PE و PerCP-Cy 5.5 و APC.
    2. أعد تعليق الحبيبات النهائية في المخزن المؤقت للتلطيخ (انظر الخطوة 4.1.) مع الحفاظ على كثافة خلية 0.5 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر لكل أنبوب لأنابيب غير ملوثة و DAPI.
    3. تحضير الأنابيب أحادية اللون للتعويض كما هو موضح في الجدول 4.
    4. دوامة بلطف كل أنبوب بعد التحضير واحتضانها في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    5. بعد الحضانة ، أعط غسلتين بإضافة 1 مل من محلول التلوين إلى كل أنبوب ، متبوعا بدوامة قصيرة وطرد مركزي عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، وضعها جانبا حتى عملية الاستحواذ.
    7. بالنسبة لأنبوب DAPI ، قم بإجراء معالجة الصدمة الحرارية عن طريق احتضانه في حمام مائي بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعا ب 15 دقيقة على الجليد. أضف 5 ميكرولتر من DAPI إلى التعليق واحتفظ به في الظلام حتى الاستحواذ على التشغيل.
  3. تحضير عناصر التحكم الفلورية ناقص واحد (FMO)
    1. أعد تعليق الحبيبات النهائية في محلول تلطيخ (انظر الخطوة 4.1) مع الحفاظ على كثافة خلية تبلغ 0.5 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر لكل أنبوب.
    2. خذ خمسة أنابيب FACS ، وقم بتسميتها على أنها النمط المتماثل CD44-V450 ، CD90-FITC ، CD45-PE ، النمط المتماثل CD73-PerCP Cy5.5 ، والنمط المتماثل CD105-APC.
    3. تحضير تعليق الخلية والأجسام المضادة وفقا للجدول 5.
    4. دوامة الأنابيب بلطف واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. بعد الحضانة ، أعط غسلتين مع 1 مل من محلول التلوين لكل أنبوب متبوعا بدوامة قصيرة وطرد مركزي عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، وضعها جانبا حتى يتم الحصول عليها.
  4. تحضير العينات للتحليل
    1. أعد تعليق الحبيبات النهائية في المخزن المؤقت للتلطيخ (انظر الخطوة 4.1) مع الحفاظ على كثافة خلية 0.5 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر لكل أنبوب.
    2. خذ أنبوبين FACS وقم بتسميتهما على أنهما أنبوبان مختلطان 1 و 2.
    3. تحضير تعليق الخلية والأجسام المضادة وفقا للجدول 6.
    4. دوامة الأنابيب بلطف واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. بعد الحضانة ، أعط غسلتين مع 1 مل من محلول التلوين لكل أنبوب متبوعا بدوامة قصيرة وطرد مركزي عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، واتركها جانبا حتى يتم الحصول عليها.
  5. تحضير العينات للفرز أحادي الخلية
    1. خذ أنبوبين FACS ، أضف 1 مل من FBS ، ولف الأنبوب حتى تتشكل طبقة متساوية من FBS داخل كل أنبوب. احتضان هذا لمدة 1-2 ساعات أثناء معالجة العينة للتلطيخ. قم بتسمية هذه الأنابيب على أنها أنابيب مختلطة 1 و 2.
    2. أعد تعليق الحبيبات النهائية في المخزن المؤقت للتلطيخ (انظر الخطوة 4.1) مع الحفاظ على كثافة خلية من 2-3 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر لكل أنبوب.
    3. تحضير تعليق الخلية والأجسام المضادة في الأنابيب المختلطة 1 و 2 وفقا للجدول 7.
    4. دوامة الأنابيب بلطف واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. بعد الحضانة ، أعط غسلتين مع 1 مل من محلول التلوين لكل أنبوب متبوعا بدوامة قصيرة وطرد مركزي عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ، واتركها جانبا. أضف 5 ميكرولتر من DAPI قبل 15 دقيقة من الفرز.
      ملاحظة: لاحظ أنه بالنسبة لتجارب الفرز ، يوصى بكثافة خلايا أعلى لكل أنبوب.
نوع الأنبوب حبات شركات إيجابية * حبات شركات سلبية * خلايا وأضاف الجسم المضاد
أنبوب FITC 1 قطرة 1 قطرة – CD90-FITC المضاد للإنسان (2 ميكرولتر)
أنبوب V450 1 قطرة 1 قطرة – CD44-V450 المضاد للإنسان (2 ميكرولتر)
أنبوب PerCP-Cy 5.5 1 قطرة 1 قطرة – مضاد للإنسان CD73-PerCP Cy 5.5 (2 ميكرولتر)
أنبوب PE 1 قطرة 1 قطرة – CD45-PE المضاد للإنسان (2 ميكرولتر)
أنبوب APC 1 قطرة 1 قطرة – CD105-APC المضاد للإنسان (2 ميكرولتر)
أنبوب دابي – – 50 ميكرولتر –
أنبوب غير ملوث – – 50 ميكرولتر –
* 1 قطرة = 60 ميكرولتر من تعليق حبة

الجدول 4: عينات مراقبة التعويض. الاختصارات: شركات = تعويض; DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل.

نوع الأنبوب الأجسام المضادة ضد علامة إيجابية (2 ميكرولتر) الأجسام المضادة ضد علامة سلبية (2 ميكرولتر) الأجسام المضادة للنمط المتماثل المضافة (2 ميكرولتر) الحجم الكلي للأجسام المضادة حجم تعليق الخلية المضافة حجم تلطيخ العازلة المضافة
CD90-FITC FMO أنبوب - مكافحة الإنسان CD44-V450 مكافحة الإنسان CD45-PE النمط المتماثل FITC IgG1 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
-- مكافحة الإنسان CD73 PerCP Cy 5.5
- مكافحة الإنسان CD105-APC
CD73-PerCP Cy5.5 FMO أنبوب - مكافحة الإنسان CD44-V450 مكافحة الإنسان CD45-PE PerCP Cy 5.5 IgG1 isotype 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
- مكافحة الإنسان CD90-FITC
- مكافحة الإنسان CD105-APC
CD44-V450 FMO أنبوب - مكافحة الإنسان CD90-FITC مكافحة الإنسان CD45-PE النمط المتماثل V450 IgG1 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP سي 5.5
- مكافحة الإنسان CD105-APC
أنبوب FMO CD105-APC - مكافحة الإنسان CD44-V450 مكافحة الإنسان CD45-PE النمط المتماثل APC IgG1 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
- مكافحة الإنسان CD90-FITC
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP سي 5.5
أنبوب CD45-PE FMO - مكافحة الإنسان CD44-V450 - النمط المتماثل PE IgG1 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
- مكافحة الإنسان CD90-FITC
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP سي 5.5
- مكافحة الإنسان CD105-APC

الجدول 5: عينات مراقبة FMO. الاختصارات: FMO = مضان ناقص واحد ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل.

نوع الأنبوب الأجسام المضادة ضد علامة إيجابية (2 ميكرولتر) الأجسام المضادة ضد علامة سلبية (2 ميكرولتر) الحجم الكلي للأجسام المضادة حجم تعليق الخلية المضافة حجم تلطيخ العازلة المضافة
أنبوب مختلط 1 - مكافحة الإنسان CD44-V450 مكافحة الإنسان CD45-PE 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
- مكافحة الإنسان CD90-FITC
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP Cy5.5
- مكافحة الإنسان CD105-APC
أنبوب مختلط 2 - مكافحة الإنسان CD44-V450 مكافحة الإنسان CD45-PE 10 ميكرولتر 50 ميكرولتر 40 ميكرولتر
- مكافحة الإنسان CD90-FITC
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP Cy5.5
- مكافحة الإنسان CD105-APC

الجدول 6: أنابيب عينة للتنميط المناعي متعدد الألوان ل SHEDs. الاختصارات: SHEDs = الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية. PE = فيكوريثرين.

نوع الأنبوب الأجسام المضادة ضد علامة إيجابية (3 ميكرولتر) الأجسام المضادة ضد علامة سلبية (3 ميكرولتر) الحجم الكلي للأجسام المضادة حجم تعليق الخلية المضافة حجم المخزن المؤقت للبقع المضافة
أنبوب مختلط 1 - مكافحة الإنسان CD90-FITC مكافحة الإنسان CD45-PE 9 ميكرولتر 50 ميكرولتر 41 ميكرولتر
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP Cy5.5
أنبوب مختلط 2 - مكافحة الإنسان CD90-FITC مكافحة الإنسان CD45-PE 9 ميكرولتر 50 ميكرولتر 41 ميكرولتر
-- مكافحة الإنسان CD73 - بيرCP Cy5.5

الجدول 7: أنابيب تفاعل الفرز أحادية الخلية. الاختصارات: FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل.

5. فرز الخلية الواحدة

  1. إعداد فارز الخلية
    1. قم بتركيب فوهة 100 ميكرومتر في الفارز.
      ملاحظة: الفوهة المناسبة لا يقل عن خمسة أضعاف قطر الجسيم المراد فرزه. يجب تحديد سائل الغمد الذي سيتم استخدامه للفرز بناء على نوع العينة وحساسية التجربة ؛ لهذه التجربة ، تم استخدام سائل غمد الملكية.
    2. قم بإجراء فحص جودة الأداة اليومي (QC) وقم بإعداد فارز التجربة. ارجع إلى دليل الأجهزة للحصول على دليل مفصل لإعداد الجهاز.
  2. إعداد مصفوفة التعويض
    1. اضبط مصفوفة التعويض باستخدام أنابيب تعويض أحادية البقعة من الخطوة 4.2.
    2. في البرنامج الاحتكاري ، حدد تجربة من شريط الأدوات وانقر فوق إعداد التعويض. افتح إنشاء عناصر تحكم في التعويض.
    3. تحقق من العلامات وقم بالتأكيد. تمت إضافة عينة جديدة تسمى "التعويض" والتي بموجبها يتم إضافة أنابيب جديدة تسمى عناصر التحكم في العلامة تلقائيا بواسطة البرنامج.
    4. حدد الأنبوب غير الملوث وقم بتشغيله لتسجيل 5000 حدث. اسحب البوابة إلى مجتمع الخلايا وقم بتطبيقها على جميع عناصر التحكم في التعويض. هذا لضبط الفولتية والبوابة السالبة لكل معلمة فلورسنت.
    5. وبالمثل ، قم بتحميل أنابيب التعويض أحادية البقعة بشكل منفصل ، وقم بتسجيل البيانات وحفظها. حدد البوابة التي تحدد السكان المعنيين وتنطبق على جميع ضوابط التعويض. هذا لتعيين البوابات الموجبة لكل معلمة فلورسنت.
    6. حدد تجربة من شريط الأدوات وانقر على حساب قيم التعويض | رابط وحفظ.
      ملاحظة: بمجرد إنشاء مصفوفة auto-comp باستخدام البرنامج ، لا يمكن تغيير معلمات الجهد للفلوروكرومات لأي من القنوات في الأنابيب المختلطة.
  3. الحصول على البيانات
    1. سجل 10000 خلية في كل أنبوب من الخطوة 4.3. و 4.4 لجمع البيانات لتحليل النمط المناعي للخلايا.
  4. تحضير أجهزة التجميع
    1. اعتمادا على الغرض من مجموعات الخلايا التي تم فرزها ، اختر بين 6 آبار أو 24 بئرا أو 48 بئرا أو 96 بئرا.
    2. قم بتغطية الآبار ب 200-500 ميكرولتر من FBS وحافظ على الألواح دون إزعاج لمدة 2 ساعة.
    3. بعد 2 ساعة ، قم بإزالة FBS المتبقي وإضافة 200-500 ميكرولتر من وسائط ثقافة MSC بنسبة 10٪.
  5. فرز الخلايا في وضع فرز الخلية الواحدة
    1. قم بتشغيل الأنبوب المختلط 1 (من الخطوة 4.5) ، وسجل 10000 حدث لتعيين البوابات على السكان المهمين ليتم فرزهم ، باستخدام استراتيجية البوابة المناسبة.
    2. قم بتحميل لوحة تجميع وقم بتعيين أرقام الخلايا المستهدفة بين 2500 و 5000 خلية / بئر وحدد قناع نقاء الفرز أحادي الخلية.
    3. اجمع المجموعات التي تم فرزها في جهاز التجميع واحتفظ بها على الجليد حتى نهاية تجربة الفرز.
    4. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الألواح إلى حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: بعد الحصول ، تم تصدير ملفات البيانات الأولية بتنسيق ملف .fcs (الإصدار 3.0. وما بعده). سجلت تقارير الفرز التي تم إنشاؤها بعد كل تجربة عدد الأحداث / الخلايا التي تم فرزها لكل بئر معين وأشارت إلى عدد التعارضات التي تم إجهاضها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تميزت SHEDs بمقايسات التألق المناعي القياسية التي تظهر التعبير عن vimentin (خيوط وسيطة من النوع الثالث) ، وخيوط الأكتين (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) ، والنوى الملطخة ب DAPI (الشكل 1 أ). لتقدير قدراتها التكاثرية وتشكيل المستعمرات ، تم إجراء فحوصات نمو الخلايا القياسية على المدى القصير. وقد تبين زيادة قدرها 14.3 ضعفا في معدل الانتشار من اليوم 2 إلى اليوم 8 في الشكل 1 باء. تم تحديد الخصائص المستنسخة ل SHEDs من فحوصات CFU-F الموضحة في الشكل 1C-E. وفقا لمعايير ISCT ، تمكنت MSCs متعددة القدرات من التمايز إلى السلالات الثلاثة المشتقة من الأديم المتوسط. تم استخدام التلوين الكيميائي الخلوي باستخدام Oil Red O للكشف عن قطرات الزيت في الخلايا الشحمية المتمايزة (الشكل 1F) ؛ تم استخدام تلطيخ فون كوسا لتلطيخ رواسب الكالسيوم الموجودة في مصفوفة بانيات العظم المتمايزة (الشكل 1G) ؛ وتم تلطيخ aggrecans في ثقافة 3D ل Alcian Blue في الأرومات الغضروفية المتباينة (الشكل 1H).

لتوصيف النمط المناعي ل SHEDs ، تم تعيين مقايسات قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. تم إجراء التجارب جنبا إلى جنب مع استخدام أربعة أنواع من الضوابط التجريبية ، وهي ضوابط التعويض (الجدول 4) ، وضوابط FMO والنمط المتماثل (الجدول 5) ، والضوابط غير الملوثة. تمت إضافة الأنماط المتماثلة لجميع الأجسام المضادة MSC و HSC المستخدمة جنبا إلى جنب مع أنابيب FMO للتمييز بين الإشارات الإيجابية مقابل السلبية والتعبير العالي مقابل المستضد الخافت. يوضح الشكل 2 أ توزيع ضوابط FMO والنمط المتماثل المستخدمة في كل تجربة. لم تظهر مخططات الكثافة التمثيلية أي تعبير عن النمط المتماثل FITC للأجسام المضادة CD90 FITC. وبالمثل ، قارنت تراكبات الرسم البياني (الشكل 2B) مستويات التعبير للعينات الملطخة جنبا إلى جنب مع عناصر التحكم الخاصة بها في القنوات المعنية من FITC و PerCP Cy5.5 و PE. التعبير الإيجابي للعلامات CD90 و CD73 (الرسوم البيانية الحمراء) والتعبير السلبي ل CD45 قابلة للمقارنة مع عناصر التحكم غير الملوثة و FMO (الرسوم البيانية الزرقاء والسوداء ، على التوالي).

أظهر التوصيف القائم على قياس التدفق الخلوي للأنماط المناعية توزيع العلامات من أحد الممرات المبكرة (P6) SHEDs (الشكل 3A-H). حددت كل من العلامات الموصى بها من ISCT و CD44 السكان الأصليين على أنهم MSCs. أظهر السكان المصابون بالرباعي الموضح في مخططات الكثافة تعبيرا بنسبة ≥98٪ عن CD90 + CD73 + CD105 + CD44 + وتعبير ≤2٪ عن علامات CD45. أظهرت أكثر من خمس تجارب مستقلة نتائج مماثلة. تم اختيار حظائر المرور المتأخر (P12) ، والتي أظهرت تعبيرا تفاضليا للعلامات الإيجابية ، لفرز الخلية الواحدة للتعبيرات العالية والخافتة (الشكل 4A-H). باتباع استراتيجية البوابات (الشكل 4H) ، تم فرز المفردات → الخلايا الحية → غير HSCs → CD73 + CD90 + الموجبة المزدوجة و CD73 + CD90- الإيجابية المفردة باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية. تم جمع المجموعات التي تم فرزها في تخطيطات 96 بئرا / 48 بئرا / 6 آبار مع أعداد مختلفة من البذر لكل بئر (الملف التكميلي 1). تم إجراء ثلاث محاولات متتالية في مرحلة واحدة من تجارب الفرز وكانت قابلية بقاء الخلايا بعد الفرز (في التعبيرات الإيجابية المزدوجة: CD90 + CD73 +) لكل تجربة 100٪. تم إجراء ثلاث مراحل مستقلة من التجارب. قمنا بمطابقة عدد الخلايا التي نمت لكل بئر بعد الفرز مع عدد الخلايا التي تم فرزها لكل بئر.

يوضح الشكل 5 أ أن خلايا CD90 + CD73 + التي تم فرزها بعد الفرز والتي تم جمعها في صفيحة 96 بئرا أظهرت الالتصاق والانتشار مثل السكان الأصليين. وقد لوحظ أن الخلايا التي تم فرزها تصل إلى التقاء 70-80٪ في اليوم السادس بعد الفرز. تم تمييز الخلايا الملتصقة والمكاثرة بعد الفرز في وجود عوامل نمو دهنية المنشأ ثم تلطيخها بعد اليوم 15 بالزيت الأحمر O باستخدام خلايا التحكم المناسبة بعد الفرز (غير المتمايزة) أيضا (الشكل 5B ، C).

Figure 1
الشكل 1: توصيف الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة للإنسان. (أ) يؤكد تلطيخ التألق المناعي أن MSCs المعزولة تعبر عن vimentin (خيوط وسيطة من النوع الأحمر والثالث) وخيوط الأكتين (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) و DAPI (أزرق ، نوى). صورة مجهرية تم الحصول عليها عند التكبير الأصلي 20x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) يظهر فحص نمو الخلايا على المدى القصير ل SHEDs قدرتها التكاثرية العالية ، كما لوحظ من الزيادة الكبيرة في عدد الخلايا في المزرعة بحلول اليوم 2 وزيادة 14.3 ضعفا في معدل الانتشار في نهاية اليوم 8 (n = 3 ، قيمة p<0.01). تم عرض أشرطة خطأ الانحراف المعياري. (جيم - ه) يؤكد فحص CFU-F وتلطيخ الكريستال البنفسجي قدرة تشكيل مستعمرة SHEDs ؛ (ج) من المتوقع أن تتشكل مستعمرات متعددة بعد 14 يوما في الثقافة ؛ (د) مستعمرة استنساخ وحيدة تنشأ من خلية واحدة؛ (ه) تعرض مستعمرة مفردة من SHEDs ذات اللون البنفسجي البلوري مورفولوجيا الخلايا النموذجية الشبيهة بالخلايا الليفية. (ف-ح) من المتوقع أن تخضع MSCs في ظل الظروف المناسبة في المختبر للتمايز إلى سلالات دهنية المنشأ وعظمية المنشأ وكوندروجينيك بحلول اليوم 21. يظهر التلوين الكيميائي الخلوي (F) Oil Red O (يظهر الجزء الداخلي صورة 40x للخلايا الشحمية تظهر قطرات الزيت) ، (G) von Kossa ، و (H) تلطيخ Alcian Blue للسلالات الدهنية والعظمية والغضروفية ، على التوالي ، في اليوم 22. يتم الحصول على الصور المجهرية عند التكبير الأصلي 20x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: MSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ SHEDs = الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية ؛ CFU-F = وحدة تشكيل مستعمرة الخلايا الليفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الضوابط السالبة المستخدمة في التجربة متعددة المعلمات . (أ) تم عرض عناصر التحكم الفلورية ناقص واحد في شكل جدول ، حيث تم استبدال ضوابط FMO بأنماطها المتماثلة المحددة. تظهر مخططات الكثافة التمثيلية (من اليسار إلى اليمين) التحكم غير الملوث (يسار) ، FMO ل CD90 FITC (وسط) مع إضافة جميع الأجسام المضادة باستثناء CD90 FITC جنبا إلى جنب مع إضافة النمط المتماثل CD90 FITC ، وعينة ملطخة بالكامل مع إضافة جميع الأجسام المضادة للوحة (يمين). (ب) يمثل تراكب الرسم البياني مقارنة بين ثلاثة أنواع من العينات، ويمثل اللون الأسود FMO، ويمثل اللون الأزرق العينات غير المصبوغة، ويمثل اللون الأحمر العينات الملطخة بالكامل في قنواتها الخاصة. الاختصارات: FMO = مضان ناقص واحد ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل ؛ PE = فيكوريثرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التنميط المناعي متعدد المعلمات ل SHEDs (P6). (أ) SSC-A مقابل FSC-A: استنادا إلى خصائص التشتت الجانبية والأمامية ، يتم إغلاق الخلايا ذات الأهمية وفصلها عن الحطام؛ (ب) FSC-H مقابل FSC-A و (C) SSC-H مقابل SSC-A: يتم استخدام المخططين للتمييز المزدوج ، مما يمكن من اختيار المفردات مع إزالة المجاميع التي قد تولد إشارات إيجابية خاطئة ؛ (د) SSC-A مقابل CD45 PE: تسمح بوابة الاستبعاد باختيار مجموعة CD45 من المفردات ؛ (ه) CD73 PerCP-Cy5.5 مقابل CD90 FITC: من CD45- المفردات الحية ، يتم بوابات خلايا CD90 + CD73 + ؛ (و) CD44 V450 مقابل CD105 APC: مجموعة CD90 + CD73 + ، هي بوابات أخرى لتحديد خلايا CD90 + CD73 + CD44 + CD105 + الموجبة الرباعية ؛ (ز) SSC-A مقابل الوقت (الأوقات): يصور المخطط الاستحواذ المستقر بمرور الوقت (بالثواني) وأنه لم تتسبب أي أحداث في تقلبات الضغط أثناء الاستحواذ ؛ (ح) التسلسل الهرمي للبوابات. الاختصارات: SHEDs = الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية. FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: فرز الخلية الواحدة لحظائر النمط المناعي (P12). (أ-و) استراتيجية بوابات قائمة على الاستبعاد خطوة بخطوة لفرز MSCs النقية بالترتيب التسلسلي التالي: الخلايا إلى singlets_1 ، إلى singlets_2 ، إلى DAPI - الخلايا الحية ، إلى CD45- الخلايا غير المكونة للدم ، وأخيرا إلى خلايا CD90 + CD73 +. تم فرز المجموعات السكانية المسورة الموضحة في (F) باستخدام وضع الفرز أحادي الخلية. (ز) يصف مخطط SSC-A مقابل الوقت (الأوقات) الفرز المتواصل للعينات. (ح) التسلسل الهرمي للبوابات. (ن = 3 ، كفاءة الفرز = 100٪). الاختصارات: SHEDs = الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية. MSCs = الخلايا الجذعية الوسيطة. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التوصيف المورفولوجي والوظيفي ل SHEDs بعد الفرز. (أ) تم جمع صور تباين الطور للمجموعات التي تم فرزها بعد الفرز في لوحة 96 بئرا في اليوم 6 بتكبير أصلي قدره 10x ، شريط المقياس = 10 ميكرومتر (يظهر الجزء الداخلي صورة 20x تصور الخلايا المفردة المصنفة التي تغير التشكل إلى MSCs تشبه الخلايا الليفية). التلوين الكيميائي الخلوي للتمايز الشحمي باستخدام Oil Red O لوحظ في (B) غير متمايزة (التحكم) و (C) متباينة بعد الفرز عند تكبير أصلي قدره 20x ، شريط المقياس = 10 ميكرومتر (يظهر الجزء الداخلي صورة 40x تصور قطرات الزيت المرصودة). الاختصارات: SHEDs = الخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: تقارير الفرز المجمعة التي تم إنشاؤها لكل تجربة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: التكوين البصري لاندماج BD FACSAria. الاختصارات: LP = تمرير طويل. PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، من بين مصادر ما بعد الولادة ، جذبت MSCs المشتقة من الأنسجة الفموية اهتماما عميقا بسبب الحد الأدنى من التزاماتها الأخلاقية وإمكانية التمايز الملحوظة متعددة السلالات21. حازت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الضرس الثالث المتأثر و SHEDs على أكبر قدر من الاهتمام بين MSCs للأسنان لإمكاناتها العلاجية في الأمراض التنكسية العصبية والصدمة22. يساعد البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة في توصيف SHEDs باستخدام نهج متعدد المعلمات وفرز المجموعات ذات الأهمية باستخدام نهج الفرز أحادي الخلية. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذا البروتوكول لا يقتصر فقط على MSCs عن طريق الفم ولكن يمكن استخدامه أيضا للتنميط المناعي وفرز MSCs من أنسجة المصدر الأخرى في جسم الإنسان23.

يجب مناقشة العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هنا من أجل تنفيذه الناجح للمشكلة البيولوجية التي تمت معالجتها. مفتاح كل بروتوكول فرز هو التحقق من مكونين مهمين: ضوابطه البيولوجية والضوابط التجريبية. بادئ ذي بدء ، تضمن صيانة الثقافة النظيفة عدم تعرض العينة المستخدمة للخطر أثناء فرزها. يجب أن تضمن صلاحية الخلية في الفرز المسبق للتعليق أحادي الخلية بدء أكثر من 70٪ من مجموعات الخلايا القابلة للحياة ، متبوعة بتحليل وفرز المجموعات السكانية الفرعية الصحية. يجب أن يحتوي المخزن المؤقت للبقع المستخدم في التعليق أحادي الخلية على 2٪ FBS ومن الأفضل إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة. إن اختيار الالتقاء الصحيح لهذه الخلايا الأولية (التقاء 80-85٪) يتجنب المساس بصلاحية خلاياها ويقلل من فرص وجود مجاميع كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد استخدام علامة حية / ميتة (DAPI في هذا البروتوكول) أمرا ضروريا لكل تجربة فرز. في هذه الدراسة ، نظرا لأن العينات المستخدمة كانت MSCs بقطر تقريبي 20-35 ميكرومتر ، كان حجم الفوهة المختار 100 ميكرومتر لفرزها عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة على BD FACSAria Fusion. سمح ذلك بفرز الخلايا دون المساس بصلاحية الخلية أثناء العملية عند ضغط غمد أقل. للحصول على شروط إعداد الفرز التفصيلية ، يوصى بالرجوع إلى دليل BD FACSDiva24.

الشرط الأساسي للتجارب متعددة الألوان في قياس التدفق الخلوي هو الحاجة إلى الضوابط المناسبة. هناك أربعة أنواع رئيسية من عناصر التحكم المستخدمة هنا: التألق الذاتي ، والأنماط المتساوية ، و FMO ، وضوابط التعويض. سمحت مصفوفة التعويض التلقائي بالتعويض الدقيق ، ومنع النزيف الطيفي في أجهزة الكشف ، واستخدمت كل من حبات التعويض والخلايا لهذا الغرض. حددت العينة غير الملوثة عتبة التألق الذاتي ل MSCs. تشمل الأنابيب المختلطة مع جميع الأجسام المضادة الأربعة النمط المتماثل و FMOs لكل جسم مضاد مستخدم. تم إجراء التحكم في تعويض DAPI باستخدام MSCs ، والتي تمت معالجتها بشكل منفصل (مع صدمة حرارية). تم تصميم لوحة الأجسام المضادة (كما هو موضح في الجدول 8) المستخدمة هنا خصيصا ل hMSCs بناء على المعايير المنصوص عليها في ISCT وتكوين الأداة لفارز خلايا BD FACSAria Fusion (راجع الجدول التكميلي S1). هذا أمر بالغ الأهمية أثناء التخطيط لتجارب قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. تتكون لوحة التوصيف المستخدمة في التنميط المناعي من أربع علامات MSC إيجابية (CD90 و CD105 و CD73 و CD44) وعلامة سلبية واحدة (CD45). في المقابل ، تحتوي لوحة تجربة الفرز على علامتين موجبة (CD90 و CD73) ، وعلامة سلبية واحدة (CD45) ، وعلامة حية / ميتة (DAPI) لضمان ارتفاع عدد MSCs الحية.

الأجسام المضادة / علامة فلوروكروم ملف تعريف سطح hMSC الطول الموجي بالليزر (نانومتر) ذروة الإثارة (نانومتر) ذروة الانبعاثات (نانومتر)
سي دي 44 في 450 يجب أن تعبر ؛ >95٪ 405 405 450
سي دي 90 فيتك 488 495 519
سي دي 73 بيرCP-Cy5.5 488 488 695
سي دي 105 ايه بي سي 640 650 660
سي دي 45 بى لا ينبغي التعبير عنها ؛ <2٪ 561 566 574
دابي - علامة الخلية الميتة 405 358 461

الجدول 8: لوحة متعددة الألوان مصممة لتوصيف وفرز SHEDs عن طريق قياس التدفق الخلوي. الاختصارات: FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. APC = الوفيكوسيانين ؛ PE = فيكوريثرين. PerCP = بروتين بيريدينين كلوروفيل.

اختيار قناع نقاء الفرز
بالنظر إلى عدم القدرة على التنبؤ بعدم التجانس الخلوي في MSCs ، قد لا يحقق الفرز بالجملة بالضرورة مستوى النقاء بين المجموعات التي تم فرزها. لقد قمنا بتحسين بروتوكول الفرز أحادي الخلية في هذه الدراسة لتحديد المستنسخة أحادية الخلية وتتبع خصائصها الوظيفية بعد الفرز من حيث الفاعلية. تم إجراء الفرز أحادي الخلية على BD FACSAria Fusion ، والذي كان يتمتع بمرونة الإعدادات التالية: اختيار فوهة 100 ميكرومتر ، وضغط غمد 20 رطل لكل بوصة مربعة ، ومعدل تدفق قابل للتعديل (يتم الحفاظ عليه عند 20 ميكرولتر / دقيقة) ، ومعدل عتبة عند 380 حدثا / ثانية. فرص اختيار خليتين مستهدفتين بدلا من خلية واحدة ضئيلة في هذه الطريقة. عادة ، يتم تحديد وضع الفرز أحادي الخلية للخوارزمية الذي يمكنه حل فرز المجموعات النقية للخلايا المستهدفة والنظر في عدد القطرات التي سيتم فرزها في جهاز التجميع الذي تختاره. يجب اختيار وضع الدقة في النهاية بدقة بحيث يمكنه الجمع بين الأقنعة المتوفرة في خوارزميات الفرز وإنشاء حالة فرز صارمة لفرز أنقى المجموعات ذات الاهتمام. لا يتنازل وضع الفرز أحادي الخلية عن الخلية المستهدفة إذا تم تجميعها في خلية غير مستهدفة أثناء الفرز وهذا يحقق مستوى النقاء الذي نتطلع إليه في هذا النهج. كانت هذه هي الوحدة المختارة في هذا البروتوكول وتم جمع الخلايا التي تم فرزها في أجهزة ذات 96 بئرا و 48 بئرا و 24 بئرا و 6 آبار.

في هذه الدراسة ، قمنا بفرز المجموعات السكانية الفرعية بناء على النمط المناعي التفاضلي ، وهي CD90 + CD73 + CD45-. في كل من بروتوكولات التوصيف والفرز ، استندت استراتيجية البوابات الخاصة بنا (كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4) إلى بوابات الاستبعاد من مجموعة CD45 لتزويدنا بالسكان غير المكونة للدم (حيث تم التحقق من صحتها وتوصيفها مسبقا باستخدام العلامات الموصوفة من ISCT) ، بعد تحديد المفردات. في النهاية ، تم تحديد MSCs من مجتمع CD45 باستخدام علامات ISCT الإيجابية. تجدر الإشارة هنا إلى أنه لا يوجد فرق كبير في النسب المئوية في البوابات الأولى للتعبيرات الموجبة لعلامات ISCT متبوعة بالتعبيرات السلبية ل CD45. ومع ذلك ، نظرا لأن الغرض من هذا الفرز هو تحديد الخلايا التي تظهر تعبيرا متغيرا لعلامات MSC المعروفة ، فقد اختتمنا تحليلنا بمخططات التعبير الموجبة.

في الأشكال التمثيلية ، 97٪ من خلايا CD45 هي MSCs ، ولكن أثناء القياس الكمي لتعبيرات المستضد ، رأينا 75٪ من الخلايا عبارة عن تعبيرات مزدوجة موجبة للعلامتين CD90 و CD73 ، في حين أن هناك العديد من المجموعات السكانية التي هي تعبيرات أحادية موجبة لنفس العلامات (كما هو موضح في الشكل 3F) وعدد قليل من الخلايا التي لا تعبر عن العلامات على الإطلاق.

أثناء توصيف هذه الخلايا ، حددنا المجموعات السكانية الفرعية على أنها MSCs إيجابية رباعية ، ومجموعات ثلاثية إيجابية وسلبية مزدوجة. يتوسع هذا التعبير التفاضلي لعلامات MSC مع زيادة المقاطع وبالتالي تأتي الحاجة إلى دراسة هذا الاختلاف وربطه بخصائصها الوظيفية. الغرض النهائي من فرز MSCs في دراستنا هو إنشاء تحليل مقارن بين المجموعات السكانية الفرعية المحددة وتحديد ما إذا كانت التعبيرات التفاضلية للعلامات الإيجابية لها آثار وظيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

Acknowledgments

نشكر مرفق خلايا التدفق في مركز جواهر لال نهرو للبحوث العلمية المتقدمة ، بنغالورو ، الهند ، على استخدام المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي. تم إجراء التقسيم بالتبريد لثقافة الحبيبات للخلايا المتمايزة في مختبر نيوبيرج أناند المرجعي ، بنغالورو ، الهند. تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الداخلي لجامعة كاليفورنيا من أكاديمية مانيبال للتعليم العالي (MAHE) ، الهند. AG ممتنة لدعم منحة الدكتور T. M. A. PAI من MAHE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue Stain HiMedia CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)  Gibco by ThermoFisher 15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set BD Biosciences 560497
BD FACS Accudrop Beads  BD Biosciences 345249 Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer BD Biosciences ---
BD FACS Diva 9.4 BD Biosciences ---
BD FACS Sheath Fluid BD Biosciences 342003 Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 BD Biosciences 561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560374 CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 BD Biosciences 562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555751 CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution BD Biosciences 564907 DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 BD Biosciences 555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555748 CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD Biosciences 555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749 CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 BD Biosciences 561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 550795 CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin BD Biosciences 550513
Bovine serum albumin Hi-Media  TC548-5G
Crystal violet Nice chemical pvt ltd  C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-aldrich   D5652-50L dPBS used for culture work and maintenance. 
Ethanol  --- --- Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum  Gibco by ThermoFisher  10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific  A-21422
KO-DMEM Gibco by ThermoFisher  10829018 Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x) Gibco by ThermoFisher 25030-081
Methanol, for Molecular Biology  Hi-Media  MB113
Oil red O HiMedia  CCK013-1KT
Paraformaldehyde  loba chemie 30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x) Gibco by ThermoFisher  15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) Invitrogen  R37110
Silver Nitrate HiMedia  MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate Chemport 10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm BD Biosciences 556291
Staining buffer  Prepared in MIRM  ---- It was prepared using 2% FBS in PBS 
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10410-01 Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10065-01 Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10064-01 Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10066-01 Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10069-01 Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100 Hi-Media  MB031
Trypan Blue  Gibco by life technologies  15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x Hi-media  TCL049
Tween-20  MERCK  9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
  3. Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
  4. McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
  5. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  6. Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
  7. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  8. Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
  9. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
  10. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
  11. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
  12. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
  13. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
  15. Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
  16. Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
  17. Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
  18. Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
  19. Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
  20. Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  21. Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
  22. Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
  23. Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
  24. FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 201 ، الخلايا الجذعية الوسيطة ، SHEDs ، فرز الخلية الواحدة ، التنميط المناعي
فرز الخلية الواحدة للخلايا الجذعية الوسيطة المناعية من الأسنان اللبنية المقشرة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, A., Mukhopadhyay, R.,… More

Gupta, A., Mukhopadhyay, R., Khandelwal, H., Nala, N., Chakraborty, U. Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. J. Vis. Exp. (201), e65723, doi:10.3791/65723 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter