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Biology

मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से इम्यूनोफेनोटाइप्ड मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की एकल-कोशिका छंटाई

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/65723
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एकल-सेल सॉर्टिंग विधि का उपयोग करके मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के उपयोग का वर्णन करता है। विशेष रूप से, एकल-सेल सॉर्टिंग का उपयोग एक विषम आबादी से इम्यूनोफेनोटाइपकोशिकाओं की 99% शुद्धता प्राप्त कर सकता है जब एक मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जाता है।

Abstract

एक जीव के मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) में शरीर में वयस्क कोशिकाओं के कई वंशों में अंतर करने की असाधारण क्षमता होती है और वे अपने इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और विरोधी भड़काऊ गुणों के लिए जाने जाते हैं। इन स्टेम कोशिकाओं का उपयोग पुनर्योजी जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए एक वरदान है, लेकिन साथ ही, उनके साथ जुड़े कई सेलुलर अस्पष्टताओं के कारण पुनर्योजी चिकित्सा और चिकित्सीय के लिए एक अभिशाप है। ये अस्पष्टताएं इन स्टेम कोशिकाओं के स्रोत में विविधता और उनकी इन विट्रो विकास स्थितियों से उत्पन्न हो सकती हैं, जिनमें से दोनों उनकी कार्यात्मक विषमता को दर्शाती हैं।

यह चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एमएससी की शुद्ध, सजातीय आबादी प्रदान करने के तरीकों की गारंटी देता है। फ्लो साइटोमेट्री के क्षेत्र में प्रगति ने एक मल्टीपैरामीट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करके एकल-कोशिका आबादी का पता लगाने में सक्षम बनाया है। यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति-सहायता प्राप्त एकल-कोशिका छंटाई के माध्यम से मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों (एसएचईडी) से स्टेम कोशिकाओं की पहचान और शुद्धिकरण करने का एक तरीका बताता है। सतह मार्करों की एक साथ अभिव्यक्ति, अर्थात्, सीडी 90-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी), सीडी 73-पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन (पेरसीपी-साइ 5.5), सीडी 105-एलोफिकोसाइनिन (एपीसी), और सीडी 44-वी 450 ने मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एमएससी के "उज्ज्वल", सकारात्मक-एक्सप्रेसर्स की पहचान की। हालांकि, इन सकारात्मक मार्करों के चौगुनी अभिव्यक्तियों के प्रतिशत में 7 वें मार्ग से बाद के अंशों तक एक महत्वपूर्ण गिरावट देखी गई।

इम्यूनोफेनोटाइप्ड उप-आबादी को एकल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था जहां केवल दो सकारात्मक और एक नकारात्मक मार्कर ने समावेश मानदंड का गठन किया था। इस पद्धति ने क्रमबद्ध आबादी की सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित की और छंटाई के बाद सेल प्रसार को बनाए रखा। इस तरह की छंटाई के लिए डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन का उपयोग गेटेड उप-आबादी के लिए वंश-विशिष्ट भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। अलगाव की स्थिति में सुधार करने और कई सेल सतह मार्कर जानकारी प्राप्त करने के लिए इस दृष्टिकोण को अन्य एकल-सेल प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को सेल-आधारित उपचारों के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के एक स्केलेबल स्रोत के रूप में माना जा सकता है और इसे पुनर्योजी चिकित्सा में स्वर्ण मानक प्रणाली माना जा सकता है। इन कोशिकाओं को विभिन्न ऊतक उत्पत्ति के साथ शरीर में विभिन्न स्रोतों से अलग किया जासकता है। उनके स्रोत ऊतक के आधार पर, प्रत्येक प्रकार का एमएससी एक अस्पष्ट इन विट्रो व्यवहारप्रदर्शित करता है। यह उनके रूपात्मक औरकार्यात्मक गुणों में अच्छी तरह से देखा जाता है। कई अध्ययनों ने आयामों में इंट्रा-क्लोनल भिन्नता दिखाई है, जिसमें वयस्क ऊतक भेदभाव, जीनोमिक स्थिति और एमएससी 2,4 के चयापचय और सेलुलर वास्तुकला शामिल हैं।

कोशिकाओं की इम्यूनोफेनोटाइपिंग स्टेम कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्री का एक सामान्य अनुप्रयोग रहा है और इसका उपयोग 2006 में इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेल एंड जीन थेरेपी (आईएससीटी) द्वारा एमएससी के रूप में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए न्यूनतम मानदंडों की एक सूची निर्धारित करने के लिए किया गया था। इसमें कहा गया है कि प्लास्टिक पालन और विट्रो में तीन वंशों (ओस्टोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और एडिपोजेनिक) में अंतर करने की क्षमता के साथ, ≥95% सेल आबादी को सीडी 105, सीडी 73, सीडी 90 व्यक्त करना चाहिए, और इन कोशिकाओं में सीडी 34, सीडी 45, सीडी 11 बी, सीडी 14 और एचएलए-डीआर की अभिव्यक्ति (≤2% सकारात्मक) की कमी होनी चाहिए, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री5 द्वारा मापा जाता है।. यद्यपि एमएससी को आईएससीटी के न्यूनतम मानदंडों के तहत बायोमाकर्स के एक सेट द्वारा परिभाषित किया गया था, लेकिन उनके प्रतिरक्षा गुणों को इन बायोमाकर्स के साथ बेंचमार्क नहीं किया जा सकता था और क्रॉस-स्टडी तुलना और क्लोनल विविधताओंको निर्धारित करना आसान बनाने के लिए इन मानदंडों से परे अधिक की आवश्यकता थी।

आईएससीटी द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के बावजूद, एमएससी पर व्यापक शोध से पता चला है कि इस आबादी में विषमता मौजूद है, जो कई कारकों के कारण उत्पन्न हो सकती है, मुख्य रूप से एमएससी दाताओं6, ऊतक स्रोत7, क्लोनल आबादी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं8, और संस्कृति की स्थिति2,9 के बीच उत्पन्न होने वाली विषमता की सर्वव्यापी प्रकृति के कारण, 10. गुणवत्ता और सेल भाग्य सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न ऊतक स्रोतों से इन प्राथमिक कोशिकाओं का लक्षण वर्णन और शुद्धि उनके उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम हैं। जनसंख्या के बीच प्रदर्शित भिन्नताओं को समझने की आवश्यकता के लिए इसे उप-आबादी में हल करने के लिए एक कुशल विधि की आवश्यकता होती है जिसे विभाजित किया जा सकता है और अलग से एकत्र किया जा सकताहै। एकल-कोशिका स्तर विश्लेषण सेल-सेल भिन्नता की चुनौतियों को दूर करने में मदद करते हैं, विषम आबादी से उत्पन्न जैविक शोर को कम करते हैं, औरदुर्लभ कोशिकाओं की जांच और विशेषता की क्षमता प्रदान करते हैं।

उद्देश्य और चुने हुए मापदंडों के आधार पर, चयनित आबादी को क्रमबद्ध और समृद्ध करने के लिए कई तरीकों को नियोजित किया जा सकता है। सेल-सॉर्टिंग तकनीकों में थोक सॉर्टिंग और सिंगल-सेल सॉर्टिंग दोनों विधियां शामिल हो सकती हैं। जबकि थोक छंटाई चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) 13, फ्रैक्शनेशन 14, और एल्यूट्रिएशन15 के माध्यम से लक्षित आबादी को समृद्ध कर सकती है, एकल-सेल सॉर्टिंग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 11 के माध्यम से अधिक सजातीय आबादी को समृद्ध कर सकती है। इन विधियों में से प्रत्येक का अपने फायदे और नुकसान के सेट के साथ तुलनात्मक विश्लेषण तालिका 1 में हाइलाइट किया गया है।

तालिका 1: विभिन्न तकनीकों का तुलनात्मक विश्लेषण: एमएसीएस, फ्रैक्शनेशन, एल्यूट्रिएशन और एफएसीएस उनके सिद्धांत में अंतर और किसी विशेष तकनीक को दूसरे पर चुनने के फायदे और नुकसान को उजागर करते हैं। संक्षेप: एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तकनीक के आगमन के बाद से, एकल-कोशिका प्रवाह साइटोमेट्री ने एक विषम नमूना17 में एक विशिष्ट सेल आबादी की गणना16, पता लगाने और लक्षण वर्णन में एक प्रमुख भूमिका निभाई है। 2006 में हेविट एट अल ने विभेदित मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) 18 के समरूप पूल के अलगाव को बढ़ाने के लिए स्वचालित सेल सॉर्टिंग पद्धति की नींव रखी। एकल-कोशिका छंटाई ने जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड एचईएससी की आबादी को आनुवंशिक रूप से संशोधित क्लोनों के अलगाव की सुविधा प्रदान की, जिसने नैदानिक अनुसंधान में एक नया आयाम खोला। सॉर्ट दक्षता में सुधार करने के लिए, आम तौर पर दो दृष्टिकोण लिए गए हैं; या तो क्रमबद्ध आबादी के संग्रह मीडिया को पोस्ट-सॉर्टेड सेल19 की व्यवहार्यता और प्रसार को बनाए रखने के लिए संशोधित किया जाता है या सेल-सॉर्टिंग एल्गोरिदम / सॉफ्टवेयर को उचित रूपसे संशोधित किया जाता है।

प्रौद्योगिकी की प्रगति के साथ, वाणिज्यिक प्रवाह साइटोमीटर और सेल सॉर्टर उन चुनौतियों का समाधान करने में मदद करने में सक्षम रहे हैं जो नाजुक और दुर्लभ सेल आबादी, विशेष रूप से विभिन्न मूल के स्टेम कोशिकाओं को सड़ने के दौरान पूरी हुई थीं। स्टेम सेल जीवविज्ञानियों की प्रमुख चुनौतियों में से एक जीन संपादनअध्ययन में आवश्यक अभिकर्मक प्रोटोकॉल के बाद मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का क्लोनल अलगाव रहा है। इसे एकल कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में सॉर्ट करके संबोधित किया गया था जो पूरक और वाणिज्यिक छोटे अणु रॉक अवरोधकों के साथ माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) के साथ लेपित थे। हालांकि, सेल अलगाव रणनीतियों को इंडेक्स सॉर्टिंग के उपयोग के साथ काफी हद तक परिष्कृत किया जा सकता है, सॉर्टिंग एल्गोरिदम की एक विशेषता जो अलग-अलग कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइप कीपहचान करती है। एकल-कोशिका छंटाई में इस परिष्कृत साधन ने न केवल स्टेम कोशिकाओं के लिए सॉर्ट दक्षता बढ़ाने में मदद की, विशेष रूप से दुर्लभ हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल आबादी के संबंध में, बल्कि कुशलतापूर्वक एकल-सेल क्लोन को उनके डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख20 से जोड़ा।

यह पेपर उप-आबादी के संवर्धन के लिए मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों (एसएचईडी) से इम्यूनोफेनोटाइप्ड स्टेम कोशिकाओं की एकल-कोशिका छंटाई पर केंद्रित है ताकि उनकी कार्यात्मक भेदभाव क्षमताओं का अध्ययन किया जा सके। दो एमएससी-पॉजिटिव मार्करों, सीडी 90 और सीडी 73 और एक नकारात्मक हेमटोपोइएटिक मार्कर सीडी 45 के संयोजन का उपयोग करते हुए, एमएससी को इम्यूनोफेनोटाइप किया गया था और मंद और शून्य एक्सप्रेसर की पहचान की गई थी। उनके इम्यूनोफेनोटाइप के आधार पर उप-आबादी को शुद्ध एमएससी, एकल सकारात्मक और दोहरी नकारात्मक आबादी के रूप में पहचाना गया था। उन्हें आगे के कार्यात्मक अध्ययनों के लिए शुद्ध और समृद्ध उप-आबादी प्राप्त करने के लिए एकल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था ताकि यह पता लगाया जा सके कि मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति इन विट्रो कल्चर स्थितियों की एक कलाकृति थी या क्या इसका कार्यात्मक गुणों पर भी कोई प्रभाव पड़ता है। कोशिकाएं जो "सकारात्मक एमएससी मार्करों" के सजातीय एक्सप्रेसर नहीं थीं, उन्हें उनके कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए क्रमबद्ध किया गया था।

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Protocol

नैतिकता अनुमोदन और भाग लेने के लिए सहमति: अस्पताल नैतिक मंजूरी समिति, एसआरजीसीडीएस द्वारा स्थापित मानकों के अनुसार, श्री राजीव गांधी डेंटल कॉलेज एंड हॉस्पिटल (एसआरजीसीडीएस) ओरल एंड मैक्सिलोफेशियल डिपार्टमेंट, बेंगलुरु द्वारा सूचित सहमति और पूर्ण नैतिक अनुमोदन प्राप्त करने के बाद मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दंत लुगदी के नमूने प्राप्त किए गए थे। इसके बाद मणिपाल इंस्टीट्यूट ऑफ रीजेनरेटिव मेडिसिन, एमएएचई- बेंगलुरु में स्टेम सेल रिसर्च (आईसी-एससीआर) के लिए संस्थागत समिति द्वारा अनुशंसित दिशानिर्देशों के अनुपालन में एसएचईडी के अलगाव, संस्कृति, रखरखाव और आवेदन को मंजूरी दी गई। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और अभिकर्मकों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. अभिकर्मकों और बफर की तैयारी

  1. संस्कृति के रखरखाव के लिए
    1. उदासीन एचईएससी के लिए बेसल माध्यम का उपयोग करके एमएससी सेल कल्चर मीडिया (10%) तैयार करें, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एल-ग्लूटामाइन, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) (तालिका 2)।
    2. उदासीन एचईएससी, 20% एफबीएस, 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% पेन-स्ट्रेप के लिए बेसल माध्यम का उपयोग करके एमएससी सेल कल्चर मीडिया (20%) तैयार करें (तालिका 2)।
    3. अविभाजित एचईएससी, 1% एल-ग्लूटामाइन, और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (एंटी-एंटी) के लिए बेसल माध्यम का उपयोग करके मीडिया को निष्क्रिय करना तैयार करें (तालिका 2)।
  2. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और सॉर्टिंग के लिए।
    1. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 2% एफबीएस का उपयोग करके धुंधला बफर तैयार करें।
    2. पीबीएस के 1 एमएल में 1 μL जोड़कर 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) (1 μg /mL) का स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. एमएससी के वंश-विशिष्ट भेदभाव के लिए।
    1. तालिका 3 में वर्णित संरचना के अनुसार ओस्टोजेनिक, चोंड्रोजेनिक और एडिपोजेनिक भेदभाव के लिए भेदभाव मीडिया तैयार करें। प्रयोग की अवधि के लिए तैयार एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. अविभाजित एचईएससी, 2% एफबीएस, 1% एल-ग्लूटामाइन और 1% पेन-स्ट्रेप के लिए बेसल माध्यम का उपयोग करके सीरम-भूखे मीडिया (2% मीडिया) तैयार करें (तालिका 2)।
मीडिया के प्रकार मीडिया का उद्देश्य 50 एमएल के लिए संरचना
FBS पेन-स्ट्रेप एल-ग्लूटामाइन अविभाजित एचईएससी के लिए बेसल माध्यम
10% मीडिया एमएससी संस्कृति और रखरखाव 5 एमएल 500 μL 500 μL 44 एमएल
20% मीडिया सीएफयू-एफ परख 10 एमएल 500 μL 500 μL 39 एमएल
सीरम की कमी (2%) मीडिया भेदभाव प्रोटोकॉल में नियंत्रण कुओं के लिए मीडिया 1 mL 500 μL 500 μL 48 एमएल
मीडिया को निष्क्रिय करना ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद सेल निलंबन को बेअसर करने के लिए मीडिया। - 500 μL 500 μL 49 एमएल

तालिका 2: संस्कृति रखरखाव और परख के लिए सेल संस्कृति मीडिया। संक्षेप: एमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम सेल; सीएफयू-एफ = कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फाइब्रोब्लास्ट।

घटक ओस्टोजेनिक मीडिया चोंड्रोजेनिक मीडिया एडिपोजेनिक मीडिया
बेसल मीडिया 90 एमएल 90 एमएल 90 एमएल
प्रेरण मीडिया 10 एमएल 10 एमएल 10 एमएल
कुल मात्रा 100 एमएल 100 एमएल 100 एमएल

तालिका 3: एसएचईडी के त्रिवंशीय भेदभाव के लिए विभेदन मीडिया।

2. शेड की संस्कृति और रखरखाव

  1. 10% एमएससी कल्चर मीडिया में सेल बनाए रखें और हर 2 दिनों में या आवश्यकतानुसार मीडिया परिवर्तन करें।
  2. 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके 95% कॉन्फ्लुएंसी पर ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाएं।
  3. न्यूट्रलाइजिंग मीडिया का उपयोग करके ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद कोशिकाओं को बेअसर करें।
  4. सेल गोली प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाला पदार्थ हटा दें और 10% एमएससी कल्चर मीडिया में सेल गोली को फिर से निलंबित कर दें।
  6. आगे के प्रयोगों या उप-संवर्धन के लिए 10% एमएससी कल्चर मीडिया युक्त ताजा तैयार सेल कल्चर व्यंजनों में बीज कोशिकाएं।
    नोट: शेड के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व 100 मिमी डिश में 0.2 × 10 6 कोशिकाएं और टी -75 फ्लास्क में 0.8 × 10 6 कोशिकाएं हैं, जो क्रमशः 1.5 × 10 6 कोशिकाओं और 4 × 10 6 कोशिकाओं को 90-100% कंफ्लुएंसी पर प्राप्त करती हैं।

3. एमएससी का लक्षण वर्णन

  1. अल्पकालिक सेल विकास परख।
    1. बीज 4 × 104 कोशिकाओं / कुएं को 10% एमएससी कल्चर मीडिया में 6-वेल प्लेटों में तीन प्रतियों में विभाजित किया जाता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और हर 2 दिनों में मीडिया परिवर्तन करें।
    3. 0.25% ट्रिप्सिन उपचार का उपयोग करके 2, 4 और 8 दिनों में कोशिकाओं की कटाई करें और कल्चर मीडिया से धो लें।
    4. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए 300 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और 1 एमएल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि द्वारा उनकी व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    6. समीकरण (1) का उपयोग करके प्रसार दर की गणना करें:
      Equation 1(1)
  2. कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फाइब्रोब्लास्ट (सीएफयू-एफ) परख
    1. 100 मिमी डिश में 10,000 कोशिकाओं को बीज दें और उन्हें 20% एमएससी कल्चर मीडिया में कल्चर करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और हर 3 दिनों में मीडिया परिवर्तन करें।
    3. 14 दिनों के बाद, पीबीएस के साथ कॉलोनियों को कुल्ला करें, उन्हें मेथनॉल में क्रिस्टल वायलेट डाई के साथ ठीक करें, और अवशिष्ट दाग को हटाने के लिए पीबीएस के साथ फिर से कुल्ला करें।
    4. कॉलोनियों की गिनती और छवि बनाएं।
      नोट: >50 कोशिकाओं के साथ कॉलोनियों की गिनती करें। कॉलोनी बनाने की दक्षता की गणना कॉलोनी बनाने वाली इकाई संख्या के रूप में की जाती है।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख
    1. 35 मिमी व्यंजनों पर एमएससी को बीज दें और उन्हें 80-90% कंफ्लुएंसी तक बढ़ने दें।
    2. मीडिया को हटा दें और एक बार पीबीएस के साथ व्यंजन ों को धो लें।
    3. कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल के साथ या तो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए इंजेक्ट करके ठीक करें।
    4. निर्धारण के बाद, रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    5. कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए पीबीएसटी में 0.3% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस में 0.05% ट्वीन 20 समाधान) जोड़ें। इसे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए रॉकर पर रखें।
    6. रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    7. ब्लॉकिंग के लिए 3% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रॉकर पर रखें।
    8. रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    9. माउस एंटी-विमेंटिन के 1:500 कमजोर पड़ने के 800 μL जोड़ें, इसे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रॉकर पर रखें, और रात भर के इनक्यूबेशन के लिए प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    10. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    11. बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच + एल) क्रॉस-अधिशोषित द्वितीयक एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लुर 555 के 1: 1,000 कमजोर पड़ने के 800 μL जोड़ें, और इसे रॉकर पर कमरे के तापमान पर 3 घंटे तक रखें।
    12. रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    13. पीबीएस के 1,000 μL में एलेक्सा फ्लुर 488 फैलोइडिन प्रोब्स 240 μL जोड़ें और रॉकर पर 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    14. रॉकर पर 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ कुओं को धो लें।
    15. DAPI माउंटेंट के 700 μL जोड़ें और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  4. वंश-विशिष्ट भेदभाव।
    1. 2 डी संस्कृति के बाद भेदभाव
      1. दो 48-वेल प्लेटें लें और उन्हें क्रमशः ओस्टोजेनिक और एडिपोजेनिक वंश के रूप में लेबल करें।
      2. प्रत्येक प्लेट के चार कुओं में 15,000 कोशिकाओं / कुएं को बीज दें और उन्हें 10% एमएससी कल्चर मीडिया में कल्चर करें।
      3. एक बार जब कोशिकाओं का मोनोलेयर 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाता है, तो पहले दो कुओं को 'कंट्रोल' के रूप में लेबल करें और मौजूदा मीडिया को सीरम-भूखे मीडिया (2% मीडिया) के साथ बदलें। 'टेस्ट' के रूप में लेबल किए गए अंतिम दो कुओं में, दो वंशों में से किसी एक के भेदभाव मीडिया को जोड़ें, एडिपोजेनिक या ओस्टोजेनिक। इसे दिन 0 के रूप में चिह्नित करें।
      4. छीलने से बचने के लिए हर तीसरे दिन धीरे से मीडिया को बदलें और संदूषण से बचने के लिए सावधान रहें।
      5. इक्कीसवें दिन तक इन स्थितियों को बनाए रखें; फिर धुंधला प्रयोग के लिए प्रक्रिया।
    2. 3 डी संस्कृति के बाद भेदभाव
      1. 3 डी पेलेट कल्चर का उपयोग करके चोंड्रोजेनिक भेदभाव करने के लिए दो 15 एमएल ट्यूब लें।
      2. प्रत्येक ट्यूब × 10 6 कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और एक गोली बनाने के लिए6 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक ट्यूब को 'नियंत्रण' के रूप में लेबल करें और इसमें 10% एमएससी संस्कृति मीडिया जोड़ें; अन्य ट्यूब को 'टेस्ट' के रूप में लेबल करें और चोंड्रोजेनिक भेदभाव मीडिया जोड़ें। ट्यूबों को इनक्यूबेटर में सावधानी से रखें और उनकी टोपियों को ढीला कर दें। इसे दिन 0 के रूप में चिह्नित करें।
      3. हर तीसरे दिन मीडिया को सावधानी से बदलें, ताकि मीडिया में बदलाव के दौरान पेलेट को हटाया या विघटित न किया जाए।
      4. इन स्थितियों को इक्कीसवें दिन तक बनाए रखें और फिर, आगे के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को संसाधित करें।
  5. वंश-विशिष्ट साइटोकेमिकल धुंधलापन
    1. 2 डी संस्कृतियों के लिए, धुंधला करने के लिए विभेदित (परीक्षण) और उदासीन एमएससी (नियंत्रण) प्लेटों (चरण 3.4.1.5 से) का उपयोग करें, और सबसे पहले, मीडिया को हटा दें और पीबीएस से दो बार धो लें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% पीएफए का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और पीबीएस के साथ एक बार धो लें। प्रत्येक वंश के लिए निम्नानुसार धुंधला प्रदर्शन करें।
      1. एडिपोसाइट्स वंश के लिए, किट से परमेबिलाइजेशन समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। तैयार करें और 1 मिलीलीटर तेल लाल ओ वर्किंग घोल जोड़ें और इसे 10 मिनट के लिए रखें। दाग को हटा दें और आसुत जल से पांच धो दें।
      2. ओस्टियोसाइट वंश के लिए, प्रत्येक कुएं में ताजा तैयार सिल्वर नाइट्रेट (आसुत जल में) का 5% जोड़ें और प्लेट को 1 घंटे के लिए यूवी के नीचे रखें। घोल को हटा दें और अपरिवर्तित चांदी को हटाने के लिए 2.5% सोडियम थायोसल्फेट जोड़ें; इसे 5 मिनट के लिए रखें। दाग को हटा दें, आसुत जल से दो बार धो लें, और माइक्रोस्कोप के तहत दाग वाली कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    2. 3 डी संस्कृतियों के लिए, चरण 3.4.2.3 से भेदभाव अवधि के अंत के बाद गोली एकत्र करें और गोली के रूप में विभेदित ऊतक के क्रायोसेक्शन प्राप्त करें। धुंधला होने से पहले स्लाइड्स को हवा में सूखने दें और कमरे के तापमान पर रहें।
      1. चोंड्रोसाइट्स वंश के लिए, पर्याप्त मात्रा में धोने के घोल को जोड़ने के लिए धुंधला किट के निर्देशों का पालन करें, इसे हटा दें, फिक्सिंग समाधान जोड़ें, और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। आसुत जल से धो लें, धुंधला घोल जोड़ें, और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 0.1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ तीन बार धोएं; अम्लता को बेअसर करने के लिए आसुत जल जोड़ें। एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत दाग वाली कोशिकाओं का निरीक्षण करें।

4. इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए सेल की सतह धुंधला होना।

नोट: चरण 4.2-4.5 में कोशिकाओं की इष्टतम संख्या प्राप्त करने के लिए अनुशंसित सेल कल्चर प्लेटें 100 मिमी व्यंजन या टी 75 फ्लास्क हैं।

  1. फ्लो साइटोमेट्रिक प्रयोगों के लिए सेल की तैयारी।
    1. सेल गोली प्राप्त करने के लिए 6 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर 300 ग्राम पर एक कंफ्लुएंट डिश / फ्लास्क और सेंट्रीफ्यूज से कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड और इकट्ठा करें।
    2. 1 एमएल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि के बाद हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्य सेल गिनती निर्धारित करें।
    3. गिनती के बाद सेल सस्पेंशन को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें और 1 एमएल धुंधला बफर के साथ गोली को दो और वॉश दें।
    4. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और अंत में प्रोटोकॉल के आधार पर धुंधला बफर की उचित मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें (चरण 4.2 से 4.5 देखें)।
  2. मुआवजा नियंत्रण तैयार करना
    1. सात एफएसीएस ट्यूब लें और उन्हें बिना दाग वाले, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 और APC के रूप में लेबल करें।
    2. धुंधला बफर में अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें (चरण 4.1 देखें.) बिना दाग वाले और डीएपीआई ट्यूबों के लिए प्रति ट्यूब 0.5 ×10 6 कोशिकाओं प्रति 50 μL के सेल घनत्व को बनाए रखें।
    3. तालिका 4 में वर्णित मुआवजे के लिए एकल-दाग वाली ट्यूब तैयार करें।
    4. तैयारी के बाद प्रत्येक ट्यूब को धीरे से भंवर करें और 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल धुंधला बफर जोड़कर दो वॉश दें, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 ग्राम पर संक्षिप्त भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन दें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, बफर को धुंधला करने के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और अधिग्रहण तक इसे अलग रखें।
    7. DAPI ट्यूब के लिए, इसे 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में और उसके बाद बर्फ पर 15 मिनट के लिए इंजेक्ट करके हीट शॉक उपचार करें। निलंबन में DAPI के 5 μL जोड़ें और इसे रन अधिग्रहण तक अंधेरे में रखें।
  3. प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण की तैयारी
    1. प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.5 × 106 सेल प्रति 50 μL के सेल घनत्व को रखते हुए बफर को धुंधला करने में अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें (चरण 4.1 देखें)।
    2. पांच एफएसीएस ट्यूब लें और उन्हें सीडी 44-वी 450 आइसोटाइप, सीडी 90-एफआईटीसी, सीडी 45-पीई, सीडी 73-पेरसीपी साइ 5.5 आइसोटाइप और सीडी 105-एपीसी आइसोटाइप के रूप में लेबल करें।
    3. तालिका 5 के अनुसार सेल और एंटीबॉडी निलंबन तैयार करें।
    4. ट्यूबों को धीरे से भंवर करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब को 1 एमएल धुंधला बफर के साथ दो वॉश दें, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 ग्राम पर संक्षिप्त भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन दें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, बफर को धुंधला करने के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और इसे अधिग्रहण तक अलग रखें।
  4. विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करना
    1. धुंधला बफर में अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें (चरण 4.1 देखें) प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.5 × 106 सेल प्रति 50 μL का सेल घनत्व रखते हुए।
    2. दो एफएसीएस ट्यूब लें और उन्हें मिश्रित ट्यूब 1 और 2 के रूप में लेबल करें।
    3. तालिका 6 के अनुसार सेल और एंटीबॉडी निलंबन तैयार करें।
    4. ट्यूबों को धीरे से भंवर करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब को 1 एमएल धुंधला बफर के साथ दो वॉश दें, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 ग्राम पर संक्षिप्त भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन दें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, बफर को धुंधला करने के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और अधिग्रहण होने तक अलग रख दें।
  5. एकल-सेल छंटाई के लिए नमूने तैयार करना
    1. दो एफएसीएस ट्यूब लें, एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें, और ट्यूब को तब तक रोल करें जब तक कि प्रत्येक ट्यूब के अंदर एफबीएस की एक समान परत न बन जाए। धुंधला होने के लिए नमूने को संसाधित करते समय इसे 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इन ट्यूबों को मिश्रित ट्यूब 1 और 2 के रूप में लेबल करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब के लिए 2-3 × 106 सेल प्रति 50 μL के सेल घनत्व को रखते हुए धुंधला बफर में अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें (चरण 4.1 देखें)।
    3. तालिका 7 के अनुसार मिश्रित ट्यूब 1 और 2 में सेल और एंटीबॉडी निलंबन तैयार करें।
    4. ट्यूबों को धीरे से भंवर करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब को 1 एमएल धुंधला बफर के साथ दो वॉश दें, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 ग्राम पर संक्षिप्त भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन दें।
    6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, बफर को धुंधला करने के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और एक तरफ रख दें। छंटाई से 15 मिनट पहले DAPI के 5 μL जोड़ें।
      नोट: ध्यान दें कि सॉर्टिंग प्रयोगों के लिए प्रति ट्यूब उच्च सेल घनत्व की सिफारिश की जाती है।
ट्यूब का प्रकार पॉजिटिव कॉम्प बीड्स * नकारात्मक कॉम्प मोती * कोशिकाएँ एंटीबॉडी जोड़ा गया
एफआईटीसी ट्यूब 1 बूंद 1 बूंद – एंटी-ह्यूमन CD90-FITC (2 μL)
V450 ट्यूब 1 बूंद 1 बूंद – एंटी-ह्यूमन CD44-V450 (2 μL)
PerCP-Cy 5.5 ट्यूब 1 बूंद 1 बूंद – एंटी-ह्यूमन CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL)
पीई ट्यूब 1 बूंद 1 बूंद – एंटी-ह्यूमन CD45-PE (2 μL)
एपीसी ट्यूब 1 बूंद 1 बूंद – एंटी-ह्यूमन CD105-APC (2 μL)
DAPI ट्यूब – – 50 μL –
बिना दाग वाली ट्यूब – – 50 μL –
* 1 बूंद = 60 μL मोती निलंबन

तालिका 4: मुआवजा नियंत्रण नमूने। संक्षेप: कॉम्प = मुआवजा; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन।

ट्यूब का प्रकार सकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (2 μL) नकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (2 μL) आइसोटाइप एंटीबॉडी जोड़े गए (2 μL) एंटीबॉडी की कुल मात्रा सेल सस्पेंशन की मात्रा जोड़ी गई धुंधला बफर की मात्रा जोड़ी गई
CD90-FITC FMO ट्यूब - मानव विरोधी CD44-V450 मानव विरोधी CD45-PE एफआईटीसी आईजीजी1 आइसोटाइप 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD73 PerCP Cy 5.5
- मानव विरोधी CD105-APC
CD73-PerCP Cy5.5 FMO ट्यूब - मानव विरोधी CD44-V450 मानव विरोधी CD45-PE 5.5 आईजीजी1 आइसोटाइप 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD90-FITC
- मानव विरोधी CD105-APC
CD44-V450 FMO ट्यूब - मानव विरोधी CD90-FITC मानव विरोधी CD45-PE V450 IgG1 आइसोटाइप 10 μL 50 μL 40 μL
- एंटी-ह्यूमन CD73-PerCP Cy 5.5
- मानव विरोधी CD105-APC
CD105-APC FMO ट्यूब - मानव विरोधी CD44-V450 मानव विरोधी CD45-PE एपीसी आईजीजी1 आइसोटाइप 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD90-FITC
- एंटी-ह्यूमन CD73-PerCP Cy 5.5
CD45-PE FMO ट्यूब - मानव विरोधी CD44-V450 - पीई आईजीजी 1 आइसोटाइप 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD90-FITC
- एंटी-ह्यूमन CD73-PerCP Cy 5.5
- मानव विरोधी CD105-APC

तालिका 5: एफएमओ नियंत्रण नमूने। संक्षेप: एफएमओ = फ्लोरेसेंस माइनस एक; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन।

ट्यूब का प्रकार सकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (2 μL) नकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (2 μL) एंटीबॉडी की कुल मात्रा सेल सस्पेंशन की मात्रा जोड़ी गई धुंधला बफर की मात्रा जोड़ी गई
मिश्रित ट्यूब 1 - मानव विरोधी CD44-V450 मानव विरोधी CD45-PE 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD90-FITC
- मानव विरोधी CD73-PerCP Cy5.5
- मानव विरोधी CD105-APC
मिश्रित ट्यूब 2 - मानव विरोधी CD44-V450 मानव विरोधी CD45-PE 10 μL 50 μL 40 μL
- मानव विरोधी CD90-FITC
- मानव विरोधी CD73-PerCP Cy5.5
- मानव विरोधी CD105-APC

तालिका 6: एसएचईडी के मल्टीकलर इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए नमूना ट्यूब। संक्षेप: शेड = मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम सेल; पीई = फाइकोएरिथ्रिन।

ट्यूब का प्रकार सकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (3 μL) नकारात्मक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी (3 μL) एंटीबॉडी की कुल मात्रा सेल सस्पेंशन की मात्रा जोड़ी गई दाग बफर की मात्रा जोड़ी गई
मिश्रित ट्यूब 1 - मानव विरोधी CD90-FITC मानव विरोधी CD45-PE 9 μL 50 μL 41 μL
- मानव विरोधी CD73-PerCP Cy5.5
मिश्रित ट्यूब 2 - मानव विरोधी CD90-FITC मानव विरोधी CD45-PE 9 μL 50 μL 41 μL
- मानव विरोधी CD73-PerCP Cy5.5

तालिका 7: एकल-सेल सॉर्टिंग प्रतिक्रिया ट्यूब। संक्षेप: एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन।

5. सिंगल-सेल सॉर्टिंग

  1. सेल सॉर्टर की तैयारी
    1. सॉर्टर में 100 μm नोजल स्थापित करें।
      नोट: उपयुक्त नलिका क्रमबद्ध किए जाने वाले कण के व्यास का कम से कम पांच गुना है। छंटाई के लिए उपयोग किए जाने वाले शीथ द्रव को नमूना प्रकार और प्रयोग की संवेदनशीलता के आधार पर तय करने की आवश्यकता है; इस प्रयोग के लिए, मालिकाना शीथ द्रव का उपयोग किया गया है।
    2. दैनिक उपकरण गुणवत्ता जांच (क्यूसी) करें और प्रयोग के लिए सॉर्टर सेट करें। उपकरण सेटअप के लिए एक विस्तृत गाइड के लिए उपकरण मैनुअल देखें।
  2. मुआवजा मैट्रिक्स की स्थापना
    1. चरण 4.2 से एकल-दाग मुआवजा ट्यूबों का उपयोग करके मुआवजा मैट्रिक्स सेट करें।
    2. मालिकाना सॉफ़्टवेयर में, टूलबार से प्रयोग का चयन करें और मुआवजा सेटअप पर क्लिक करें। क्षतिपूर्ति नियंत्रण बनाएँ खोलें.
    3. मार्करों की जांच करें और पुष्टि करें। "मुआवजा" नामक एक नया नमूना जोड़ा जाता है जिसके तहत मार्कर नियंत्रण नामक नए ट्यूब सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से जोड़े जाते हैं।
    4. बिना दाग वाली ट्यूब का चयन करें और इसे चलाएं, 5,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करने के लिए। गेट को कोशिकाओं की आबादी पर खींचें और इसे सभी मुआवजा नियंत्रणों पर लागू करें। यह प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए वोल्टेज और नकारात्मक गेट सेट करना है।
    5. इसी तरह, एकल-दाग मुआवजा ट्यूबों को अलग से लोड करें, और डेटा रिकॉर्ड करें और सहेजें। ब्याज की आबादी का निर्धारण करने वाले गेट का चयन करें और सभी मुआवजा नियंत्रणों पर लागू हों। यह प्रत्येक फ्लोरोसेंट पैरामीटर के लिए सकारात्मक द्वार सेट करना है।
    6. टूलबार से प्रयोग का चयन करें और क्षतिपूर्ति मूल्यों की गणना करें पर क्लिक करें | लिंक और सहेजें।
      नोट: एक बार सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऑटो-कॉम्प मैट्रिक्स उत्पन्न होने के बाद, मिश्रित ट्यूबों में किसी भी चैनल के लिए फ्लोरोक्रोम के वोल्टेज पैरामीटर को बदला नहीं जा सकता है।
  3. डेटा अधिग्रहण
    1. चरण 4.3 से प्रत्येक ट्यूब में 10,000 कोशिकाओं को रिकॉर्ड करें। और 4.4 कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइप के विश्लेषण के लिए डेटा एकत्र करने के लिए।
  4. संग्रह उपकरणों की तैयारी
    1. क्रमबद्ध सेल आबादी के उद्देश्य के आधार पर, 6-वेल, 24-वेल, 48-वेल या 96-वेल प्लेटों के बीच चयन करें।
    2. कुओं को 200-500 μL FBS के साथ कोट करें और प्लेटों को 2 घंटे के लिए अबाधित रखें।
    3. 2 घंटे के बाद, अवशिष्ट एफबीएस को हटा दें और 10% एमएससी कल्चर मीडिया के 200-500 μL जोड़ें।
  5. एकल-कक्ष सॉर्ट मोड में सेल सॉर्टिंग
    1. मिश्रित ट्यूब 1 (चरण 4.5 से) चलाएं, और उपयुक्त गेटिंग रणनीति का उपयोग करके क्रमबद्ध की जाने वाली आबादी पर गेट सेट करने के लिए 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
    2. एक संग्रह प्लेट लोड करें और 2,500 और 5,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से लक्षित सेल संख्या निर्धारित करें और एकल-सेल सॉर्ट शुद्धता मास्क का चयन करें।
    3. संग्रह उपकरण में क्रमबद्ध आबादी एकत्र करें और उन्हें छंटाई प्रयोग के अंत तक बर्फ पर रखें।
    4. एक बार हो जाने के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए प्लेटों को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: अधिग्रहण के बाद, कच्चे डेटा फ़ाइलों को .fcs फ़ाइल स्वरूप (v.3.0. आगे) के रूप में निर्यात किया गया था। प्रत्येक प्रयोग के बाद उत्पन्न सॉर्ट रिपोर्ट ों में प्रति असाइन की गई घटनाओं / कोशिकाओं की संख्या को अच्छी तरह से दर्ज किया गया था और निरस्त किए गए संघर्षों की संख्या का संकेत दिया गया था।

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Representative Results

शेड को मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख ों की विशेषता थी जो विमेंटिन (लाल, प्रकार III मध्यवर्ती फिलामेंट्स), एक्टिन फिलामेंट्स (एलेक्सा फ्लुर 488 फैलोइडिन प्रोब्स), और डीएपीआई (चित्रा 1 ए) से सना नाभिक की अभिव्यक्ति दिखाते हैं। उनकी प्रोलिफेरेटिव और कॉलोनी बनाने की क्षमता का अनुमान लगाने के लिए, मानक अल्पकालिक सेल विकास परख किए गए थे। दिन 2 से दिन 8 तक प्रसार दर में 14.3 गुना वृद्धि को चित्र 1 बी में दिखाया गया है। शेड के क्लोनोजेनिक गुणों को चित्रा 1 सी-ई में दिखाए गए सीएफयू-एफ परख से निर्धारित किया गया था। आईएससीटी मानदंडों के अनुसार, मल्टीपोटेंट एमएससी तीन मेसोडर्मल-व्युत्पन्न वंशों में अंतर करने में सक्षम थे। ऑयल रेड ओ के साथ साइटोकेमिकल धुंधलापन का उपयोग विभेदित एडिपोसाइट्स में तेल की बूंदों का पता लगाने के लिए किया गया था (चित्रा 1 एफ); वॉन कोसा धुंधला का उपयोग विभेदित ओस्टियोब्लास्ट (चित्रा 1 जी) के मैट्रिक्स में पाए जाने वाले कैल्शियम जमा को दागने के लिए किया गया था; और 3 डी संस्कृति में एग्ग्रेकन को विभेदित चोंड्रोब्लास्ट्स (चित्रा 1 एच) में एल्सियन ब्लू के लिए दाग दिया गया था।

शेड के इम्यूनोफेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए, मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री परख सेट किए गए थे। प्रयोगों को चार प्रकार के प्रयोगात्मक नियंत्रणों के उपयोग के साथ किया गया था, अर्थात् मुआवजा नियंत्रण (तालिका 4), एफएमओ और आइसोटाइप नियंत्रण (तालिका 5), और बिना दाग वाले नियंत्रण। उपयोग किए गए सभी एमएससी और एचएससी एंटीबॉडी के आइसोटाइप को एफएमओ ट्यूबों के साथ जोड़ा गया था ताकि सकारात्मक बनाम नकारात्मक संकेतों और उच्च बनाम मंद एंटीजन अभिव्यक्ति में भेदभाव किया जा सके। चित्र 2ए प्रति प्रयोग उपयोग किए जाने वाले एफएमओ और आइसोटाइप नियंत्रणों के वितरण को दर्शाता है। प्रतिनिधि घनत्व वाले भूखंडों ने सीडी 90 एफआईटीसी एंटीबॉडी के एफआईटीसी आइसोटाइप की कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखाई। इसी तरह, हिस्टोग्राम ओवरले (चित्रा 2 बी) ने एफआईटीसी, पेरसीपी साइ 5.5 और पीई के संबंधित चैनलों में उनके नियंत्रण के साथ दाग वाले नमूनों के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना की। मार्कर सीडी 90 और सीडी 73 (लाल हिस्टोग्राम) की सकारात्मक अभिव्यक्ति और सीडी 45 की नकारात्मक अभिव्यक्ति उनके बिना दाग वाले और एफएमओ नियंत्रण (क्रमशः नीले और काले हिस्टोग्राम) के साथ तुलनीय हैं।

इम्यूनोफेनोटाइप्स के फ्लो साइटोमेट्री-आधारित लक्षण वर्णन ने शुरुआती मार्ग (पी 6) शेड (चित्रा 3 ए-एच) में से एक से मार्कर वितरण दिखाया है। आईएससीटी-अनुशंसित मार्कर और सीडी 44 दोनों ने एमएससी के रूप में मूल आबादी को निर्धारित किया। घनत्व भूखंडों में प्रदर्शित टेट्रा-पॉजिटिव आबादी ने सीडी 90 + सीडी 73 + सीडी 105 + सीडी 44 + की ≥98% अभिव्यक्ति और सीडी 45 मार्करों की ≤2% अभिव्यक्ति दिखाई। पांच से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों ने समान परिणाम दिखाए। देर से पारित होने वाले शेड (पी 12), जो सकारात्मक मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति दिखाते हैं, को उच्च और मंद एक्सप्रेसर्स (चित्रा 4 ए-एच) की एकल-सेल छंटाई के लिए चुना गया था। गेटिंग रणनीति (चित्रा 4 एच) के बाद, सिंगल्स→ लाइव सेल→ नॉन-एचएससी→ डबल पॉजिटिव सीडी 73 + सीडी 90 + और सिंगल पॉजिटिव सीडी 73 + सीडी 90- आबादी को सिंगल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था। क्रमबद्ध आबादी को 96-वेल/48-वेल/6-वेल प्लेट लेआउट में एकत्र किया गया था, जिसमें प्रति कुएं अलग-अलग सीडिंग काउंट थे (पूरक फ़ाइल 1)। सॉर्टिंग प्रयोगों के एक ही चरण में लगातार तीन प्रयास किए गए थे और प्रति प्रयोग (डबल-पॉजिटिव एक्सप्रेसर्स में: सीडी 90 + सीडी 73 +) प्रकार के बाद कोशिकाओं की उत्तरजीविता 100% थी। प्रयोगों के तीन स्वतंत्र चरण आयोजित किए गए हैं। हमने प्रति अच्छी तरह से क्रमबद्ध कोशिकाओं की संख्या से प्रति अच्छी तरह से क्रमबद्ध कोशिकाओं की संख्या का मिलान किया।

चित्रा 5 ए से पता चलता है कि 96-वेल प्लेट में एकत्र किए गए सीडी 90 + सीडी 73 + पोस्ट-सॉर्टेड कोशिकाओं ने अपनी मूल आबादी की तरह पालन और प्रसार दिखाया। छंटाई के बाद छठे दिन क्रमबद्ध कोशिकाओं को 70-80% प्रवाह तक पहुंचने के लिए देखा गया है। पालन और प्रसार के बाद की कोशिकाओं को एडिपोजेनिक विकास कारकों की उपस्थिति में विभेदित किया गया था और फिर 15 वें दिन के बाद उचित पोस्ट-सॉर्टेड नियंत्रण (अविभाजित) कोशिकाओं का उपयोग करके ऑयल रेड ओ के साथ दाग दिया गया था (चित्रा 5 बी, सी)।

Figure 1
चित्रा 1: मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम कोशिकाओं का लक्षण वर्णन। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से पुष्टि होती है कि पृथक एमएससी विमेंटिन (लाल, प्रकार III मध्यवर्ती फिलामेंट्स), एक्टिन फिलामेंट्स (एलेक्सा फ्लुर 488 फैलोइडिन प्रोब्स), और डीएपीआई (नीला, नाभिक) व्यक्त करते हैं। 20x के मूल आवर्धन पर प्राप्त फोटोमाइक्रोग्राफ। स्केल बार = 10 μm. (B) शेड की अल्पकालिक सेल वृद्धि परख उनकी उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता प्रदर्शित करती है, जैसा कि दिन 2 तक संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि और दिन 8 के अंत में प्रसार दर में 14.3 गुना वृद्धि (एन = 3, पी-वैल्यू<0.01) द्वारा देखा गया है। मानक विचलन त्रुटि पट्टियाँ दिखाई गई हैं. (C-E) सीएफयू-एफ परख और क्रिस्टल वायलेट धुंधला शेड की कॉलोनी बनाने की क्षमता की पुष्टि करते हैं; (ग) संस्कृति में 14 दिनों के बाद कई कॉलोनियों के बनने की उम्मीद है; (डी) एकल क्लोनोजेनिक कॉलोनी एक एकल कोशिका से उत्पन्न होती है; (ई) एसएचईडी की क्रिस्टल वायलेट-सना एकल कॉलोनी कोशिकाओं की विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करती है। (F-H) उपयुक्त इन विट्रो स्थितियों के तहत एमएससी को 21 वें दिन तक एडिपोजेनिक, ओस्टोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली में भेदभाव से गुजरने की उम्मीद है। साइटोकेमिकल धुंधलापन (एफ) ऑयल रेड ओ (इनसेट तेल की बूंदों को दिखाते हुए एडिपोसाइट्स की 40 गुना छवि दिखाता है), (जी) वॉन कोसा, और (एच) एल्सियन ब्लू स्टेनिंग क्रमशः एडिपोजेनिक, ओस्टोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली के लिए दिखाता है। फोटोमाइक्रोग्राफ 20x के मूल आवर्धन पर प्राप्त किए जाते हैं। स्केल बार = 10 μm। संक्षेप: एमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम सेल; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; शेड = मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम सेल; सीएफयू-एफ = कॉलोनी बनाने वाली इकाई-फाइब्रोब्लास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मल्टीपैरामीट्रिक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले नकारात्मक नियंत्रण। (ए) फ्लोरेसेंस माइनस वन नियंत्रण ों को एक सारणीबद्ध रूप में प्रदर्शित किया गया है, जहां एफएमओ नियंत्रणों को उनके विशिष्ट आइसोटाइप्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है। प्रतिनिधि घनत्व प्लॉट (बाएं से दाएं) बिना दाग वाले नियंत्रण (बाएं), सीडी 90 एफआईटीसी (मध्य) के एफएमओ को सीडी 90 एफआईटीसी को छोड़कर सभी एंटीबॉडी के साथ सीडी 90 एफआईटीसी आइसोटाइप को जोड़ते हैं, और पैनल के सभी एंटीबॉडी के साथ पूरी तरह से सना हुआ नमूना जोड़ते हैं (दाएं)। (बी) हिस्टोग्राम ओवरले तीन प्रकार के नमूनों की तुलना का प्रतिनिधित्व करता है, काला एफएमओ का प्रतिनिधित्व करता है, नीला बिना दाग का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल उनके संबंधित चैनलों में पूरी तरह से दाग वाले नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप: एफएमओ = फ्लोरेसेंस माइनस वन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एसएचईडी (पी 6) के मल्टीपैरामीट्रिक इम्यूनोफेनोटाइपिंग। (ए) एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए: उनके पक्ष और आगे के स्कैटर गुणों के आधार पर, रुचि की कोशिकाओं को गेट किया जाता है और मलबे से अलग किया जाता है; (बी) एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए और (सी) एसएससी-एच बनाम एसएससी-ए: दो भूखंडों को दोहरे भेदभाव के लिए नियोजित किया जाता है, जो गलत सकारात्मक संकेत उत्पन्न करने वाले समुच्चय को समाप्त करते हुए सिंगल्स के चयन को सक्षम बनाता है; (डी) एसएससी-ए बनाम सीडी 45 पीई: बहिष्करण गेटिंग एकल से सीडी 45- आबादी के चयन की अनुमति देता है; (ई) सीडी 73 परसीपी-साइ 5.5 बनाम सीडी 90 एफआईटीसी: सीडी 45- लाइव सिंगलेट्स से, सीडी 90 + सीडी 73 + कोशिकाओं को गेट किया जाता है; (एफ) सीडी 44 वी 450 बनाम सीडी 105 एपीसी: सीडी 90 + सीडी 73 + जनसंख्या, टेट्रा-पॉजिटिव सीडी 90 + सीडी 73 + सीडी 44 + सीडी 105 + कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए आगे बढ़ाया गया है; (जी) एसएससी-ए बनाम समय (एस): कथानक समय (सेकंड) के साथ स्थिर अधिग्रहण को दर्शाता है और अधिग्रहण के दौरान किसी भी घटना ने दबाव में उतार-चढ़ाव का कारण नहीं बनाया; (एच) पदानुक्रम को गति देना। संक्षेप: शेड = मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम सेल; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफेनोटाइप्ड शेड (पी 12) की एकल-सेल छंटाई। (ए-एफ) शुद्ध एमएससी को निम्नलिखित अनुक्रमिक क्रम में क्रमबद्ध करने के लिए एक चरण-दर-चरण बहिष्करण-आधारित गेटिंग रणनीति: कोशिकाओं को singlets_1 करने के लिए, singlets_2 करने के लिए, डीएपीआई-जीवित कोशिकाओं को, सीडी 45- गैर-हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के लिए, और अंत में सीडी 90 + सीडी 73 + कोशिकाओं को। (एफ) में दिखाए गए गेटेड आबादी को एकल-सेल सॉर्ट मोड का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था। (छ) एसएससी-ए बनाम समय (ओं) कथानक नमूनों की निर्बाध छंटाई का वर्णन करता है। (एच) पदानुक्रम को गति देना। (एन = 3, सॉर्ट दक्षता = 100%)। संक्षेप: शेड = मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम सेल; एमएससी = मेसेनकाइमल स्टेम सेल; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
(A) पोस्ट-सॉर्टेड शेड के फेज कंट्रास्ट चित्र 6 वें दिन 96-वेल प्लेट में 10x, स्केल बार = 10 μm के मूल आवर्धन पर एकत्र किए गए थे (इनसेट एक 20x छवि दिखाता है जो आकृति विज्ञान को फाइब्रोब्लास्ट जैसे एमएससी में बदल रही है)। ऑयल रेड ओ का उपयोग करके एडिपोजेनिक विभेदन के लिए साइटोकेमिकल धुंधलापन (बी) अविभाजित (नियंत्रण) और (सी) विभेदित पोस्ट-सॉर्ट आबादी में 20x, स्केल बार = 10 μm (इनसेट तेल की बूंदों को दर्शाते हुए 40x छवि दिखाता है) में देखा गया। संक्षेप: शेड = मानव एक्सफोलिएटेड पर्णपाती दांतों से स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: संकलित सॉर्ट रिपोर्ट प्रति प्रयोग उत्पन्न होती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: बीडी एफएसीएसरिया फ्यूजन का ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन। संक्षेप: एलपी = लंबा पास; पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में, प्रसवोत्तर स्रोतों के बीच, मौखिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी ने अपने न्यूनतम नैतिक दायित्वों और उल्लेखनीय बहुवंशीयभेदभाव क्षमता के कारण गहन रुचि आकर्षित की है। प्रभावित तीसरे दाढ़ और एसएचईडी से दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं (डीपीएससी) ने न्यूरोडीजेनेरेटिव औरदर्दनाक रोगों में अपनी चिकित्सीय क्षमता के लिए दंत एमएससी के बीच सबसे अधिक ध्यान आकर्षित किया है। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल एक मल्टीपैरामीट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करके एसएचईडी को चिह्नित करने में मदद करता है और एकल-सेल सॉर्ट दृष्टिकोण का उपयोग करके रुचि की आबादी को आगे बढ़ाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का आवेदन न केवल मौखिक एमएससी तक सीमित है, बल्किमानव शरीर में अन्य स्रोत ऊतकों से इम्यूनोफेनोटाइपिंग और एमएससी की छंटाई के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

जैविक समस्या को संबोधित करने के लिए इसके सफल कार्यान्वयन के लिए इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदमों पर यहां चर्चा करने की आवश्यकता है। प्रत्येक सॉर्टिंग प्रोटोकॉल की कुंजी दो महत्वपूर्ण घटकों की जांच करना है: इसके जैविक नियंत्रण और प्रयोगात्मक नियंत्रण। शुरू करने के लिए, स्वच्छ संस्कृति रखरखाव यह सुनिश्चित करता है कि उपयोग किए गए नमूने को क्रमबद्ध करते समय समझौता न किया जाए। एकल-सेल निलंबन प्री-सॉर्टिंग में सेल व्यवहार्यता यह सुनिश्चित करेगी कि 70% से अधिक व्यवहार्य सेल आबादी शुरू हो जाए, इसके बाद स्वस्थ उप-आबादी का विश्लेषण और छंटाई हो। सिंगल-सेल सस्पेंशन में इस्तेमाल किए जाने वाले स्टेन बफर में 2% एफबीएस होना चाहिए और प्रयोग कमरे के तापमान पर सबसे अच्छे तरीके से किए जाते हैं। इन प्राथमिक कोशिकाओं के सही संगम का चयन (80-85% कंफ्लुएंसी) उनकी सेल व्यवहार्यता से समझौता करने से बचता है और बड़े समुच्चय की संभावना को कम करता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक सॉर्टिंग प्रयोग के लिए एक जीवित / मृत मार्कर (इस प्रोटोकॉल में DAPI) का उपयोग आवश्यक है। इस अध्ययन में, जैसा कि उपयोग किए गए नमूने 20-35 μm के अनुमानित व्यास के साथ MSCs थे, चुने गए नोजल का आकार BD FACSAria फ्यूजन पर 20 psi के दबाव पर उन्हें सॉर्ट करने के लिए 100 μm था। इसने कम शीथ दबाव पर प्रक्रिया के दौरान सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना सेल सॉर्टिंग की अनुमति दी। विस्तृत सॉर्ट सेटअप स्थितियों के लिए, सॉफ़्टवेयर BD FACSDiva गाइड24 को संदर्भित करने की सिफारिश की जाती है।

फ्लो साइटोमेट्री में बहुरंगी प्रयोगों के लिए एक आवश्यक शर्त उचित नियंत्रण की आवश्यकता है; यहां चार प्रमुख प्रकार के नियंत्रण ों का उपयोग किया जाता है: ऑटोफ्लोरेसेंस, आइसोटाइप्स, एफएमओ और मुआवजा नियंत्रण। ऑटो-मुआवजा मैट्रिक्स ने सटीक मुआवजे की अनुमति दी, डिटेक्टरों में वर्णक्रमीय रक्तस्राव को रोका, और इस उद्देश्य के लिए मुआवजे के मोतियों और कोशिकाओं दोनों का उपयोग किया। बिना दाग वाले नमूने ने एमएससी के ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए सीमा निर्धारित की। सभी चार एंटीबॉडी के साथ मिश्रित ट्यूबों में उपयोग किए गए प्रत्येक एंटीबॉडी के आइसोटाइप और एफएमओ शामिल हैं। डीएपीआई मुआवजा नियंत्रण एमएससी का उपयोग करके किया गया था, जिसे अलग से संसाधित किया गया था (गर्मी के झटके के साथ)। यहां उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी पैनल (जैसा कि तालिका 8 में दर्शाया गया है) विशेष रूप से आईएससीटी द्वारा बताए गए मानदंडों और बीडी एफएसीएसरिया फ्यूजन सेल सॉर्टर के उपकरण विन्यास के आधार पर एचएमएससी के लिए डिज़ाइन किया गया है ( पूरक तालिका एस 1 देखें)। मल्टीपैरामीट्रिक फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों की योजना के दौरान यह बहुत महत्वपूर्ण है। इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लक्षण वर्णन पैनल में चार सकारात्मक एमएससी मार्कर (सीडी 90, सीडी 105, सीडी 73 और सीडी 44) और एक नकारात्मक मार्कर (सीडी 45) शामिल हैं। इसके विपरीत, छंटाई प्रयोग के लिए पैनल में दो सकारात्मक मार्कर (सीडी 90 और सीडी 73), एक नकारात्मक मार्कर (सीडी 45), और एक जीवित / मृत मार्कर (डीएपीआई) शामिल हैं ताकि लाइव एमएससी की उच्च गिनती सुनिश्चित की जा सके।

एंटीबॉडी/मार्कर फ्लोरोक्रोम एचएमएससी सरफेस प्रोफाइल लेजर तरंग दैर्ध्य (nm) उत्तेजना शिखर (एनएम) उत्सर्जन शिखर (nm)
CD44 V450 व्यक्त करना चाहिए; >95% 405 405 450
CD90 एफआईटीसी 488 495 519
CD73 PerCP-Cy5.5 488 488 695
CD105 APC 640 650 660
CD45 शारीरिक शिक्षा व्यक्त नहीं करना चाहिए; <2% 561 566 574
DAPI - मृत कोशिका मार्कर 405 358 461

तालिका 8: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एसएचईडी के लक्षण वर्णन और सॉर्टिंग के लिए डिज़ाइन किया गया मल्टीकलर पैनल। संक्षेप: एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; एपीसी = एलोफिकोसाइनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; पेरसीपी = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन।

प्रकार शुद्धता मास्क का चयन
एमएससी में सेलुलर विषमता की अप्रत्याशितता को ध्यान में रखते हुए, थोक छंटाई आवश्यक रूप से क्रमबद्ध आबादी के बीच शुद्धता के स्तर को प्राप्त नहीं कर सकती है। हमने इस अध्ययन में एकल-सेल सॉर्टिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया ताकि एकल-सेल क्लोन की पहचान की जा सके और शक्ति के संदर्भ में उनके कार्यात्मक गुणों को ट्रैक किया जा सके। एकल-सेल सॉर्टिंग एक BD FACSAria फ्यूजन पर की गई थी, जिसमें निम्नलिखित सेटिंग्स का लचीलापन था: 100 μm नोजल का विकल्प, 20 psi शीथ दबाव, एक प्रवाह दर जो समायोज्य है (20 μL / min पर बनाए रखा गया है), और थ्रेशोल्ड दर 380 घटनाओं / इस विधि में एक के बजाय दो लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करने की संभावना न्यूनतम है। आम तौर पर, एल्गोरिथ्म के एकल-सेल सॉर्ट मोड का चयन किया जाता है जो लक्ष्य कोशिकाओं की शुद्ध आबादी की छंटाई को हल कर सकता है और विचार कर सकता है कि कितनी बूंदों को पसंद के संग्रह डिवाइस में क्रमबद्ध किया जाएगा। प्रेसिजन मोड को अंततः सटीक रूप से चुना जाना चाहिए ताकि यह सॉर्टिंग एल्गोरिदम में उपलब्ध मास्क को जोड़ सके और रुचि की शुद्धतम आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए एक कठोर सॉर्टिंग स्थिति बना सके। सिंगल-सेल सॉर्ट मोड एक लक्ष्य सेल पर समझौता नहीं करता है यदि इसे सॉर्ट करते समय एक गैर-लक्ष्य सेल में एकत्रित किया जाता है और यह शुद्धता के स्तर को प्राप्त करता है जिसे हम इस दृष्टिकोण में आगे देखते हैं। यह इस प्रोटोकॉल में चुना गया मॉड्यूल था और क्रमबद्ध कोशिकाओं को 96-वेल, 48-वेल, 24-वेल और 6-वेल प्लेट उपकरणों में एकत्र किया गया था।

इस अध्ययन में, हमने उनके अंतर इम्यूनोफेनोटाइप के आधार पर उप-आबादी को क्रमबद्ध किया, अर्थात् सीडी 90 + सीडी 73 + सीडी 45-। लक्षण वर्णन और सॉर्टिंग प्रोटोकॉल दोनों में, हमारी गेटिंग रणनीति (जैसा कि चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है) हमें गैर-हेमटोपोइएटिक आबादी देने के लिए सीडी 45- आबादी से बहिष्करण पर आधारित है (क्योंकि इन्हें आईएससीटी निर्धारित मार्करों से पहले मान्य और विशेषता दी गई है), सिंगल्स की पहचान के बाद। आखिरकार, सकारात्मक आईएससीटी मार्करों का उपयोग करके सीडी 45- आबादी से एमएससी की पहचान की गई। यहां यह ध्यान देने योग्य है कि पहले आईएससीटी मार्करों के सकारात्मक एक्सप्रेसर्स को गेट करने में प्रतिशत में बहुत अंतर नहीं है, इसके बाद सीडी 45 के नकारात्मक एक्सप्रेसर्स हैं। हालांकि, जैसा कि इस छंटाई का उद्देश्य उन कोशिकाओं की पहचान करना है जो ज्ञात एमएससी मार्करों की परिवर्तित अभिव्यक्ति दिखाते हैं, हमने सकारात्मक अभिव्यक्ति भूखंडों के साथ अपना विश्लेषण समाप्त कर दिया है।

प्रतिनिधि आंकड़ों में सीडी 45- कोशिकाओं का 97% एमएससी हैं, लेकिन एंटीजन अभिव्यक्तियों के परिमाणीकरण के दौरान, हमने देखा है कि 75% कोशिकाएं दो मार्करों सीडी 90 और सीडी 73 के डबल-पॉजिटिव एक्सप्रेसर हैं, जबकि कई आबादी हैं जो समान मार्करों के एकल-सकारात्मक एक्सप्रेसर हैं ( चित्रा 3 एफ में दिखाया गया है) और कुछ कोशिकाएं जो मार्करों को बिल्कुल व्यक्त नहीं करती हैं।

इन कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के दौरान, हमने उप-आबादी को टेट्रा-पॉजिटिव एमएससी, ट्रिपल-पॉजिटिव और डबल-नकारात्मक आबादी के रूप में पहचाना है। एमएससी मार्करों की यह अंतर अभिव्यक्ति बढ़ते अंशों के साथ फैलती है और इस प्रकार उनके कार्यात्मक गुणों के साथ इस अंतर का अध्ययन और सहसंबंध करने की आवश्यकता होती है। हमारे अध्ययन में एमएससी को छांटने का अंतिम उद्देश्य पहचान की गई उप-आबादी के बीच एक तुलनात्मक विश्लेषण बनाना है और यह निर्धारित करना है कि सकारात्मक मार्करों के अंतर अभिव्यक्तियों में कार्यात्मक प्रभाव हैं या नहीं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस पत्र के प्रकाशन के संबंध में हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा के उपयोग के लिए जवाहरलाल नेहरू सेंटर फॉर एडवांस्ड साइंटिफिक रिसर्च, बेंगलुरु, भारत में फ्लो सेल सुविधा को धन्यवाद देते हैं। विभेदित कोशिकाओं की पेलेट संस्कृति का क्रायो-सेक्शनिंग न्यूबर्ग आनंद संदर्भ प्रयोगशाला, बेंगलुरु, भारत में किया गया था। इस काम को मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन (एमएएचई), भारत से यूसी के इंट्राम्यूरल फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। एजी एमएएचई से डॉ टीएमए पाई छात्रवृत्ति के समर्थन के लिए आभारी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue Stain HiMedia CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)  Gibco by ThermoFisher 15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set BD Biosciences 560497
BD FACS Accudrop Beads  BD Biosciences 345249 Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer BD Biosciences ---
BD FACS Diva 9.4 BD Biosciences ---
BD FACS Sheath Fluid BD Biosciences 342003 Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 BD Biosciences 561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560374 CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 BD Biosciences 562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555751 CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution BD Biosciences 564907 DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 BD Biosciences 555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555748 CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD Biosciences 555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749 CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 BD Biosciences 561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 550795 CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin BD Biosciences 550513
Bovine serum albumin Hi-Media  TC548-5G
Crystal violet Nice chemical pvt ltd  C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-aldrich   D5652-50L dPBS used for culture work and maintenance. 
Ethanol  --- --- Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum  Gibco by ThermoFisher  10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific  A-21422
KO-DMEM Gibco by ThermoFisher  10829018 Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x) Gibco by ThermoFisher 25030-081
Methanol, for Molecular Biology  Hi-Media  MB113
Oil red O HiMedia  CCK013-1KT
Paraformaldehyde  loba chemie 30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x) Gibco by ThermoFisher  15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) Invitrogen  R37110
Silver Nitrate HiMedia  MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate Chemport 10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm BD Biosciences 556291
Staining buffer  Prepared in MIRM  ---- It was prepared using 2% FBS in PBS 
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10410-01 Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10065-01 Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10064-01 Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement Gibco by ThermoFisher  A10066-01 Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media  Gibco by ThermoFisher  A10069-01 Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100 Hi-Media  MB031
Trypan Blue  Gibco by life technologies  15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x Hi-media  TCL049
Tween-20  MERCK  9005-64-5

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References

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Gupta, A., Mukhopadhyay, R.,… More

Gupta, A., Mukhopadhyay, R., Khandelwal, H., Nala, N., Chakraborty, U. Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. J. Vis. Exp. (201), e65723, doi:10.3791/65723 (2023).

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