Summary
Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.
Abstract
Bir organizmanın mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler), vücuttaki birden fazla yetişkin hücre soyuna farklılaşmak için olağanüstü bir kapasiteye sahiptir ve immünomodülatör ve antienflamatuar özellikleri ile bilinir. Bu kök hücrelerin kullanımı, rejeneratif biyoloji alanı için bir nimettir, ancak aynı zamanda, bunlarla ilişkili çoklu hücresel belirsizlikler nedeniyle rejeneratif tıp ve terapötikler için bir felakettir. Bu belirsizlikler, bu kök hücrelerin kaynağındaki çeşitlilikten ve her ikisi de fonksiyonel heterojenliklerini yansıtan in vitro büyüme koşullarından kaynaklanabilir.
Bu, terapötik uygulamalar için saflaştırılmış, homojen MSC popülasyonları sağlamak için metodolojileri garanti eder. Akış sitometrisi alanındaki gelişmeler, multiparametrik bir yaklaşım kullanılarak tek hücreli popülasyonların saptanmasını sağlamıştır. Bu protokol, floresan destekli tek hücreli sıralama yoluyla insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED'ler) kök hücreleri tanımlamanın ve saflaştırmanın bir yolunu ana hatlarıyla belirtir. CD90-floresein izotiyosiyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofil proteini (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikosiyanin (APC) ve CD44-V450 gibi yüzey belirteçlerinin eşzamanlı ekspresyonu, multiparametrik akış sitometrisi kullanarak MSC'lerin "parlak", pozitif ekspresörlerini tanımladı. Bununla birlikte, bu pozitif belirteçlerin dörtlü ekspresyonörlerinin yüzdelerinde 7. pasajdan sonraki pasajlara kadar önemli bir düşüş gözlendi.
İmmünfenotipli alt popülasyonlar, sadece iki pozitif ve bir negatif markörün dahil etme kriterlerini oluşturduğu tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandı. Bu metodoloji, tasnif edilen popülasyonların hücre canlılığını sağladı ve tasnif sonrası hücre proliferasyonunu sürdürdü. Bu tür bir sıralama için aşağı akış uygulaması, kapılı alt popülasyonlar için soya özgü farklılaşmayı değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izolasyon koşullarını iyileştirmek ve çoklu hücre yüzeyi işaretleyici bilgisi elde etmek için diğer tek hücreli sistemlere uygulanabilir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), hücre bazlı tedaviler için uygun, ölçeklenebilir bir hücre kaynağı olarak kabul edilebilir ve rejeneratif tıpta altın standart bir sistem olarak kabul edilebilir. Bu hücreler, vücutta farklı doku kökenlerine sahip çeşitli kaynaklardan izole edilebilir1. Kaynak dokularına bağlı olarak, her MSC tipi belirsiz bir in vitro davranış sergiler2. Bu, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinde iyi gözlenir3. Çok sayıda çalışma, yetişkin doku farklılaşması, genomik durum ve MSC'lerin metabolik ve hücresel mimarisi dahil olmak üzere boyutlarda klonal varyasyon göstermiştir 2,4.
Hücrelerin immünofenotiplemesi, kök hücrelerin tanımlanması için akış sitometrisinin yaygın bir uygulaması olmuştur ve bu, 2006 yılında Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT) tarafından hücreleri MSC'ler olarak tanımlamak için minimal kriterlerin bir listesini reçete etmek için kullanılmıştır. Plastik yapışma ve in vitro olarak üç soya (osteojenik, kondrojenik ve adipojenik) farklılaşma yeteneği ile birlikte, hücre popülasyonunun %≥95'inin CD105, CD73, CD90 eksprese etmesi gerektiğini ve bu hücrelerin akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi CD34, CD45, CD11b, CD14 ve HLA-DR ekspresyonundan (%≤2 pozitif) yoksun olması gerektiğini belirtmiştir5. MSC'ler, ISCT'nin minimal kriterleri altında bir dizi biyobelirteç tarafından tanımlanmış olsa da, bağışıklık özellikleri bu biyobelirteçlerle kıyaslanamamıştır ve çapraz çalışma karşılaştırmalarını ve klonal varyasyonları ölçmeyi kolaylaştırmak için bu kriterlerin ötesinde daha fazlasına ihtiyaç vardır2.
ISCT tarafından belirlenen yönergelere rağmen, MSC'ler üzerine yapılan kapsamlı araştırmalar, bu popülasyonda, esas olarak MSC donörleri6, doku kaynakları7, klonal popülasyon8 içindeki bireysel hücreler ve kültür koşulları 2,9 arasında ortaya çıkan heterojenliğin her yerde bulunan doğası nedeniyle ortaya çıkabilecek çok sayıda faktöre bağlı olarak ortaya çıkabilecek heterojenliğin var olduğunu göstermiştir. 10. Kaliteyi ve hücre kaderini sağlamak için bu birincil hücrelerin çeşitli doku kaynaklarından karakterizasyonu ve saflaştırılması, üretimlerinde kilit adımlardır. Popülasyon arasında sergilenen varyasyonları anlama ihtiyacı, onu ayrı ayrı bölünebilen ve toplanabilen alt popülasyonlara çözmek için etkili bir yöntem gerektirir11. Tek hücre düzeyinde analizler, hücre-hücre varyasyonunun zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olur, heterojen bir popülasyondan kaynaklanan biyolojik gürültüyü azaltır ve nadir hücreleri araştırma ve karakterize etme yeteneği sunar12.
Amaca ve seçilen parametrelere bağlı olarak, seçilen popülasyonları sıralamak ve zenginleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Hücre sıralama teknikleri, hem toplu sıralama hem de tek hücreli sıralama yöntemlerini içerebilir. Toplu sıralama, Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması (MACS)13, fraksiyonlama 14 ve elütriasyon15 yoluyla hedef popülasyonları zenginleştirebilirken, tek hücreli sıralama, floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS)11 yoluyla daha homojen popülasyonları zenginleştirebilir. Bu yöntemlerin her birinin kendi avantaj ve dezavantajları ile karşılaştırmalı bir analizi Tablo 1'de vurgulanmıştır.
Tablo 1: Farklı tekniklerin karşılaştırmalı analizleri: MACS, Fraksiyonlama, Elütriasyon ve FACS, prensiplerindeki farklılıkları ve belirli bir tekniği diğerine göre seçmenin avantaj ve dezavantajlarını vurgulamaktadır. Kısaltmalar: MACS = Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması; FACS = Floresanla aktive edilen hücre sıralaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tekniğin ortaya çıkışından bu yana, tek hücreli akış sitometrisi, heterojen bir örnekte17 belirli bir hücre popülasyonunun sayımında16, tespitinde ve karakterizasyonunda önemli bir rol oynamıştır. Hewitt ve ark. 2006 yılında, farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) homojen havuzlarının izolasyonunu geliştirmek için otomatik hücre sıralama metodolojisinin temelini attı18. Tek hücreli ayıklama, genetik olarak değiştirilmiş klonların izolasyonunu kolaylaştırarak GFP ile dönüştürülmüş hESC'lerin popülasyonunu zenginleştirdi ve bu da klinik araştırmalarda yeni bir boyut açtı. Sıralama verimliliğini artırmak için genellikle iki yaklaşım benimsenmiştir; Ya sıralanmış popülasyonların toplama ortamı, sıralanmış hücrelerin19 canlılığını ve çoğalmasını sürdürmek için değiştirilir ya da hücre sıralama algoritması/yazılımı uygun şekilde değiştirilir12.
Teknolojinin ilerlemesiyle, ticari akış sitometreleri ve hücre ayıklayıcıları, kırılgan ve nadir hücre popülasyonlarını, özellikle de farklı kökenlerden kök hücreleri aseptik olarak ayırırken karşılaşılan zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olmuştur. Kök hücre biyologlarının en büyük zorluklarından biri, gen düzenleme çalışmalarında gerekli olan transfeksiyon protokollerini takiben insan pluripotent kök hücrelerinin klonal izolasyonu olmuştur19. Bu, tek hücrelerin, takviyeler ve ticari küçük moleküllü ROCK inhibitörleri ile birlikte Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF'ler) ile kaplanmış 96 oyuklu plakalara ayrılmasıyla ele alındı. Bununla birlikte, hücre izolasyon stratejileri, sıralanan tek tek hücrelerin immünofenotipini tanımlayan sıralama algoritmasının bir özelliği olan indeks sıralaması kullanılarak büyük ölçüde rafine edilebilir12. Tek hücreli ayıklamadaki bu rafine modalite, özellikle nadir hematopoietik kök hücre popülasyonları ile ilgili olarak, yalnızca kök hücreler için sıralama verimliliğini arttırmaya yardımcı olmakla kalmadı, aynı zamanda tek hücreli klonları aşağı akış fonksiyonel tahlillerine verimli bir şekilde bağladı20.
Bu makale, fonksiyonel farklılaşma kapasitelerini incelemek için alt popülasyonların zenginleştirilmesi için insan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden (SHED'ler) immünofenotipli kök hücrelerin tek hücreli olarak sınıflandırılmasına odaklanmaktadır. İki MSC-pozitif belirteç, CD90 ve CD73 ve negatif hematopoietik belirteç CD45'in bir kombinasyonu kullanılarak, MSC'ler immünofenotiplendirildi ve loş ve boş ekspresyoncular tanımlandı. İmmünfenotiplerine göre alt popülasyonlar saf MSC'ler, tek pozitif ve çift negatif popülasyonlar olarak tanımlandı. Belirteçlerin diferansiyel ekspresyonunun in vitro kültür koşullarının bir eseri olup olmadığını veya fonksiyonel özellikler üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek için daha ileri fonksiyonel çalışmalar için saf ve zenginleştirilmiş alt popülasyonlar elde etmek için tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandılar. "Pozitif MSC belirteçlerinin" homojen ekspresörleri olmayan hücreler, fonksiyonel özelliklerini incelemek için sıralandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik onay ve katılım onayı: İnsan pul pul dökülmüş diş pulpası örnekleri, Sri Rajiv Gandhi Diş Hekimliği Koleji ve Hastanesi (SRGCDS) Ağız ve Maksillofasiyal Departmanı, Bengaluru tarafından bilgilendirilmiş onam ve tam etik onay alındıktan sonra, Hastane Etik Onay Komitesi tarafından belirlenen standartlara uygun olarak alındı. Bunu takiben, SHED'lerin izolasyonu, kültürü, bakımı ve uygulanması, MAHE - Bengaluru'daki Manipal Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ndeki Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR) tarafından önerilen kılavuzlara uygun olarak onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması
- Kültür bakımı için
- Farklılaşmamış hESC'ler için bazal besiyeri,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (Pen-strep) kullanarak MSC hücre kültürü ortamını (% 10) hazırlayın (Tablo 2).
- Farklılaşmamış hESC'ler, %20 FBS, %1 L-glutamin ve %1 Pen-strep için bazal ortam kullanarak MSC hücre kültürü ortamını (%20) hazırlayın (Tablo 2).
- Farklılaşmamış hESC'ler, %1 L-glutamin ve %1 antibiyotik-antimikotik (Anti-Anti) için bazal ortam kullanarak nötralize edici ortam hazırlayın (Tablo 2).
- Akış sitometrik analizi ve sıralaması için
- Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 FBS kullanarak boyama tamponu hazırlayın.
- 1 mL PBS'ye 1 μL ekleyerek 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) stok çözeltisi hazırlayın
- MSC'lerin kökene özgü farklılaşması için
- Tablo 3'te açıklanan bileşime göre ostejenik, kondrojenik ve adipojenik farklılaşma için farklılaşma ortamı hazırlayın. Hazırlanan alikotları deney süresince 4 °C'de saklayın.
- Farklılaşmamış hESC'ler,% 2 FBS,% 1 L-glutamin ve% 1 Pen-strep için bazal ortam kullanarak seruma aç ortam (% 2 ortam) hazırlayın (Tablo 2).
| MEDYA TÜRÜ | MEDYANIN AMACI | 50 mL İÇİN KOMPOZİSYON | ||||||||
| FBS (FBS) | Kalem-Strep | L-Glutamin | FARKLILAŞMAMIŞ hESC'ler İÇİN BAZAL ORTAM | |||||||
| %10 medya | MSC kültürü ve bakımı | 5 mL | 500 μL | 500 μL | 44 mL | |||||
| %20 medya | CFU-F testi | 10 mL | 500 μL | 500 μL | 39 mL | |||||
| Serum açlığı (% 2) ortamı | Farklılaştırma protokolünde Kontrol kuyuları için ortam | 1 mL | 500 μL | 500 μL | 48 mL | |||||
| Nötralize edici medya | Tripsinizasyondan sonra hücre süspansiyonunu nötralize etmek için ortam | - | 500 μL | 500 μL | 49 mL | |||||
Tablo 2: Kültür bakımı ve tahlilleri için hücre kültürü ortamı. Kısaltmalar: MSC = mezenkimal kök hücre; CFU-F = koloni oluşturan birim-fibroblast.
| BİLEŞEN | OSTEOJENIK MEDYA | KONDROJENIK ORTAM | ADIPOJENIK MEDYA |
| Bazal Medya | 90 mL | 90 mL | 90 mL |
| İndüksiyon ortamı | 10 mL | 10 mL | 10 mL |
| Toplam Hacim | 100 mL | 100 mL | 100 mL |
Tablo 3: SHED'lerin üç soylu farklılaşması için farklılaşma ortamı.
2. SHED'lerin kültürü ve bakımı
- Hücreleri %10 MSC kültür ortamında tutun ve her 2 günde bir veya gerektiğinde ortam değişiklikleri yapın.
- % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak% 95 birleşmede hücreleri tripnize edin.
- Nötralize edici ortam kullanarak tripsinizasyondan sonra hücreleri nötralize edin.
- Bir hücre peleti elde etmek için tüpü oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini %10 MSC kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücreleri, daha ileri deneyler veya alt kültürleme için %10 MSC kültür ortamı içeren taze hazırlanmış hücre kültürü kaplarına tohumlayın.
NOT: SHED'ler için optimum tohumlama yoğunluğu, %90-100 birleşmede sırasıyla 1,5 × 10 6 hücre ve 4 × 106 hücre elde etmek için 100 mm'lik bir şişede 0,2 ××10 6 hücre ve bir T-75 şişesinde 0,8 106 hücredir.
3. MSC'lerin Karakterizasyonu
- Kısa süreli hücre büyüme testi
- Tohum 4 × 104 hücre/kuyucuk halinde% 10 MSC kültür ortamında 6 oyuklu plakalara üç kopya halinde.
- Plakaları 37 °C'de 7 gün inkübe edin ve her 2 günde bir ortam değişimi yapın.
- Hücreleri 2., 4 ve 8. günlerde% 0.25 tripsin tedavisi kullanarak hasat edin ve kültür ortamı ile yıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin ve peleti 1 mL ortamda yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve tripan mavisi dışlama yöntemiyle canlılıklarını belirleyin.
- Denklem (1)'i kullanarak çoğalma oranını hesaplayın:
(1)
- Koloni oluşturan birim-fibroblast (CFU-F) testi
- 100 mm'lik bir tabakta 10.000 hücreyi tohumlayın ve bunları %20 MSC kültür ortamında kültürleyin.
- Plakaları 37 °C'de 14 gün inkübe edin ve her 3 günde bir ortam değişimi yapın.
- 14 gün sonra, kolonileri PBS ile durulayın, metanol içinde kristal viyole boya ile sabitleyin ve kalan lekeyi çıkarmak için tekrar PBS ile durulayın.
- Kolonileri sayın ve görüntüleyin.
NOT: >50 hücreli kolonileri sayın. Koloni oluşturma verimliliği, koloni oluşturan birim sayıları olarak hesaplanır.
- İmmünofloresan testi
- MSC'leri 35 mm'lik tabaklara tohumlayın ve% 80-90 birleşene kadar büyümelerine izin verin.
- Ortamı çıkarın ve bulaşıkları PBS ile bir kez durulayın.
- Hücreleri, oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe ederek 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
- Sabitlemeden sonra, kuyuları PBST ile külbütör üzerinde 3 x 5 dakika yıkayın.
- Hücreleri geçirgen hale getirmek için PBST'de% 0.3 Triton X-100 (PBS'de% 0.05 Tween 20 çözeltisi) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika külbütör üzerinde tutun.
- Kuyuları PBST ile külbütör üzerinde 3 x 5 dakika yıkayın.
- Bloke etmek için% 3 sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat külbütörde tutun.
- Kuyuları PBST ile külbütör üzerinde 3 x 5 dakika yıkayın.
- 800 μL 1:500 seyreltme fare anti-vimentin ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat külbütör üzerinde tutun ve gece boyunca inkübasyon için plakayı 4 °C'ye aktarın.
- Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın ve kuyucukları külbütör üzerinde 3 x 5 dakika boyunca PBST ile yıkayın.
- 800 μL 1:1,000 seyreltme keçi anti-fare IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 555 ekleyin ve külbütör üzerinde oda sıcaklığında 3 saat tutun.
- Kuyuları PBST ile külbütör üzerinde 3 x 5 dakika yıkayın.
- 1.000 μL PBS'ye Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL ekleyin ve külbütör üzerinde 60 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Kuyuları PBST ile külbütör üzerinde 3 x 5 dakika yıkayın.
- 700 μL DAPI mountant ekleyin ve hücreleri mikroskop altında gözlemleyin.
- Soya özgü farklılaşma
- 2D kültürü takip eden farklılaşma
- İki adet 48 oyuklu plaka alın ve bunları sırasıyla osteojenik ve adipojenik soylar olarak etiketleyin.
- Her plakanın dört oyuğuna 15.000 hücre/kuyu tohumlayın ve bunları %10 MSC kültür ortamında kültürleyin.
- Hücrelerin tek tabakası %90 birleşmeye ulaştığında, ilk iki kuyucuğu 'Kontrol' olarak etiketleyin ve mevcut ortamı serumdan yoksun ortamla (%2 ortam) değiştirin. 'Test' olarak etiketlenen son iki kuyucuğa, adipojenik veya osteojenik olmak üzere iki soydan birinin farklılaşma ortamını ekleyin. Bunu Gün 0 olarak işaretleyin.
- Soyulmayı önlemek için ortamı her üç günde bir nazikçe değiştirin ve kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun.
- Bu koşulları yirmi birinci güne kadar koruyun; Daha sonra boyama deneyi için işlem yapın.
- 3D kültürü takip eden farklılaşma
- 3D pelet kültürü kullanarak kondrojenik farklılaşma yapmak için iki adet 15 mL'lik tüp alın.
- Her tüpe 1 × 10 6 hücre aktarın ve bir pelet oluşturmak için 300 × g'da 6 dakika santrifüjleyin. Bir tüpü 'Kontrol' olarak etiketleyin ve buna %10 MSC kültür ortamı ekleyin; diğer tüpü 'Test' olarak etiketleyin ve kondrojenik farklılaşma ortamı ekleyin. Tüpleri, kapakları gevşek bir şekilde vidalanmış olarak inkübatöre dikkatlice yerleştirin. Bunu Gün 0 olarak işaretleyin.
- Medyayı her üç günde bir dikkatlice değiştirin, medya değişiklikleri sırasında peleti yerinden çıkarmamak/parçalamamak için.
- Bu koşulları yirmi birinci güne kadar koruyun ve daha sonra hücreleri daha ileri deneyler için işleyin.
- 2D kültürü takip eden farklılaşma
- Soya özgü sitokimyasal boyama
- 2D kültürler için, boyama için farklılaşmış (test) ve farklılaşmamış MSC'leri (kontrol) plakalarını (adım 3.4.1.5'ten itibaren) kullanın ve önce ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA kullanarak sabitleyin, süpernatanı çıkarın ve PBS ile bir kez yıkayın. Her soy için aşağıdaki gibi boyama yapın.
- Adiposit soyu için, kitten geçirgenlik solüsyonu ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 1 mL Yağ kırmızısı O çalışma solüsyonu hazırlayın ve ekleyin ve 10 dakika bekletin. Lekeyi çıkarın ve damıtılmış suyla beş yıkama yapın.
- Osteosit soyu için, her bir oyuğa% 5 taze hazırlanmış gümüş nitrat (damıtılmış suda) ekleyin ve plakayı 1 saat UV altında tutun. Çözeltiyi çıkarın ve reaksiyona girmemiş gümüşü çıkarmak için% 2.5 sodyum tiyosülfat ekleyin; 5 dakika bekletin. Lekeyi çıkarın, damıtılmış suyla iki kez yıkayın ve lekeli hücreleri mikroskop altında gözlemleyin.
- 3D kültürler için, adım 3.4.2.3'teki farklılaşma periyodunun bitiminden sonra peleti toplayın ve farklılaşmış dokunun pelet formundaki kriyoseksiyonlarını elde edin. Boyamaya geçmeden önce slaytların kurumasını ve oda sıcaklığında olmasını bekleyin.
- Kondrosit soyu için, yeterli hacimde yıkama solüsyonu eklemek için boyama kitinin talimatlarını izleyin, çıkarın, sabitleme solüsyonunu ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Damıtılmış suyla yıkayın, boyama solüsyonunu ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. 0.1 N hidroklorik asit ile üç kez yıkayın; Asitliği nötralize etmek için damıtılmış su ekleyin. Lekeli hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin.
- 2D kültürler için, boyama için farklılaşmış (test) ve farklılaşmamış MSC'leri (kontrol) plakalarını (adım 3.4.1.5'ten itibaren) kullanın ve önce ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA kullanarak sabitleyin, süpernatanı çıkarın ve PBS ile bir kez yıkayın. Her soy için aşağıdaki gibi boyama yapın.
(1)4. İmmünofenotipleme için hücre yüzeyi boyama
NOT: 4.2-4.5 adımlarında optimum sayıda hücre elde etmek için önerilen hücre kültürü plakaları 100 mm'lik tabaklar veya T75 şişelerdir.
- Akış sitometrik deneyleri için hücre hazırlığı
- Hücreleri birleşik bir tabaktan/şişeden deneyin ve toplayın ve hücre peletini elde etmek için 300 × g'da 6 dakika santrifüjleyin.
- Peletleri 1 mL besiyerinde yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlama yöntemini takiben bir hemositometre kullanarak canlı hücre sayısını belirleyin.
- Saydıktan sonra hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjleyin ve 1 mL boyama tamponu ile pelete iki yıkama daha yapın.
- Süpernatanı atın ve son olarak protokole bağlı olarak peleti uygun bir boyama tamponu hacminde yeniden süspanse edin (bkz. adım 4.2 ila 4.5).
- Kompanzasyon kontrollerinin hazırlanması
- Yedi FACS tüpü alın ve bunları Boyanmamış, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 ve APC olarak etiketleyin.
- Boyanmamış ve DAPI tüpleri için tüp başına 50 μL başına 0,5 ×10 6 hücre hücre yoğunluğunu koruyarak boyama tamponundaki son peleti yeniden süspanse edin (bkz. adım 4.1).
- Tek lekeli tüpleri Tablo 4'te açıklandığı gibi kompanzasyon için hazırlayın.
- Hazırlandıktan sonra her tüpü nazikçe girdap haline getirin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyerek iki yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 g'da kısa bir vorteksleme ve santrifüjleme yapın.
- Süpernatanı atın, peleti 500 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve elde edilene kadar bir kenara koyun.
- DAPI tüpü için, 60 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ve ardından 15 dakika buz üzerinde inkübe ederek ısı şoku işlemi uygulayın. Süspansiyona 5 μL DAPI ekleyin ve çalışma elde edilene kadar karanlıkta tutun.
- Floresan eksi bir (FMO) kontrollerinin hazırlanması
- Her tüp için 50 μL başına 0,5 ×10 6 hücre hücre yoğunluğunu koruyarak son peleti boyama tamponunda (bkz. adım 4.1) yeniden süspanse edin.
- Beş FACS tüpü alın ve bunları CD44-V450 izotipi, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5 izotipi ve CD105-APC izotipi olarak etiketleyin.
- Hücre ve antikor süspansiyonunu Tablo 5'e göre hazırlayın.
- Tüpleri nazikçe vorteksleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL boyama tamponu ile iki yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 g'da kısa bir vorteksleme ve santrifüjleme yapın.
- Süpernatanı atın, peleti 500 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve elde edilene kadar bir kenara koyun.
- Analiz için numunelerin hazırlanması
- Her tüp için 50 μL başına 0,5 ×10 6 hücre hücre yoğunluğunu koruyarak boyama tamponundaki son peleti yeniden süspanse edin (bkz. adım 4.1).
- İki FACS tüpü alın ve bunları Karışık tüpler 1 ve 2 olarak etiketleyin.
- Hücre ve antikor süspansiyonunu Tablo 6'ya göre hazırlayın.
- Tüpleri nazikçe vorteksleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL boyama tamponu ile iki yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 g'da kısa bir vorteksleme ve santrifüjleme yapın.
- Süpernatanı atın, peleti 500 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve elde edilene kadar bir kenara koyun.
- Tek hücreli ayıklama için numunelerin hazırlanması
- İki FACS tüpü alın, 1 mL FBS ekleyin ve her tüpün içinde eşit bir FBS tabakası oluşana kadar tüpü yuvarlayın. Numuneyi boyama için işlerken bunu 1-2 saat inkübe edin. Bu tüpleri Karışık tüpler 1 ve 2 olarak etiketleyin.
- Her tüp için 50 μL başına 2-3 × 106 hücre hücre yoğunluğunu koruyarak boyama tamponundaki son peleti yeniden süspanse edin (bkz. adım 4.1).
- Hücre ve antikor süspansiyonunu Tablo 7'ye göre Karışık tüpler 1 ve 2'de hazırlayın.
- Tüpleri nazikçe vorteksleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL boyama tamponu ile iki yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 g'da kısa bir vorteksleme ve santrifüjleme yapın.
- Süpernatanı atın, peleti 500 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bir kenara koyun. Sıralamadan 15 dakika önce 5 μL DAPI ekleyin.
NOT: Sıralama deneyleri için tüp başına daha yüksek hücre yoğunluğunun önerildiğini unutmayın.
| Tüp tipi | Pozitif Comp Boncuklar* | Negatif Comp Boncuklar* | Hücre | Antikor eklendi | |
| FITC tüpü | 1 damla | 1 damla | – | Anti-insan CD90-FITC (2 μL) | |
| V450 tüp | 1 damla | 1 damla | – | Anti-insan CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5.5 tüp | 1 damla | 1 damla | – | Anti-insan CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL) | |
| PE tüp | 1 damla | 1 damla | – | Anti-insan CD45-PE (2 μL) | |
| APC tüpü | 1 damla | 1 damla | – | Anti-insan CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI tüpü | – | – | 50 μL | – | |
| Lekesiz tüp | – | – | 50 μL | – | |
| *1 damla= 60 μL boncuk süspansiyonu | |||||
Tablo 4: Kompanzasyon kontrol örnekleri. Kısaltmalar: Comp = telafi; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini.
| TÜP TİPİ | POZİTİF BELİRLEYİCİYE KARŞI ANTIKOR (2 μL) | NEGATİF İŞARETÇİYE KARŞI ANTIKOR (2 μL) | İZOTIP ANTİKOR EKLENDİ (2 μL) | TOPLAM ANTIKOR HACMI | HÜCRE SÜSPANSIYON HACMI EKLENDI | BOYAMA TAMPONU HACMI EKLENDI | ||
| CD90-FITC FMO tüpü | - Anti-insan CD44-V450 | Anti-insan CD45-PE | FITC IgG1 izotipi | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-insan CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO tüpü | - Anti-insan CD44-V450 | Anti-insan CD45-PE | PerCP Cy 5.5 IgG1 izotipi | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-insan CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO tüpü | - Anti-insan CD90-FITC | Anti-insan CD45-PE | V450 IgG1 izotipi | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO tüpü | - Anti-insan CD44-V450 | Anti-insan CD45-PE | APC IgG1 izotipi | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-insan CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| CD45-PE FMO tüpü | - Anti-insan CD44-V450 | - | PE IgG1 izotipi | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-insan CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||||
Tablo 5: FMO kontrol örnekleri. Kısaltmalar: FMO = floresan eksi bir; FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini.
| TÜP TİPİ | POZİTİF BELİRLEYİCİYE KARŞI ANTIKOR (2 μL) | NEGATİF İŞARETÇİYE KARŞI ANTIKOR (2 μL) | TOPLAM ANTIKOR HACMI | HÜCRE SÜSPANSIYON HACMI EKLENDI | BOYAMA TAMPONU HACMI EKLENDI | |
| Karışık tüp 1 | - Anti-insan CD44-V450 | Anti-insan CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-insan CD90-FITC | ||||||
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||
| Karışık tüp 2 | - Anti-insan CD44-V450 | Anti-insan CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-insan CD90-FITC | ||||||
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-insan CD105-APC | ||||||
Tablo 6: SHED'lerin çok renkli immünofenotiplemesi için numune tüpleri. Kısaltmalar: SHEDs = pul pul dökülmüş insan süt dişlerinden elde edilen kök hücreler; PE = fikoeritrin.
| TÜP TİPİ | POZİTİF MARKER'A KARŞI ANTİKOR (3 μL) | NEGATİF BELİRLEYİCİYE KARŞI ANTIKOR (3 μL) | TOPLAM ANTIKOR HACMI | HÜCRE SÜSPANSIYON HACMI EKLENDI | LEKE TAMPONU HACMI EKLENDI | |
| Karışık tüp 1 | - Anti-insan CD90-FITC | Anti-insan CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Karışık tüp 2 | - Anti-insan CD90-FITC | Anti-insan CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-insan CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tablo 7: Tek hücreli ayırma reaksiyon tüpleri. Kısaltmalar: FITC = floresein izotiyosiyanat; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini.
5. Tek hücreli sıralama
- Hücre sıralayıcının hazırlanması
- Sıralayıcıya 100 μm'lik bir nozul takın.
NOT: Uygun nozul, sıralanacak partikülün çapının en az beş katıdır. Ayırma için kullanılacak kılıf sıvısına, numune tipine ve deneyin hassasiyetine göre karar verilmesi gerekir; Bu deney için tescilli kılıf sıvısı kullanılmıştır. - Günlük cihaz kalite kontrolünü (QC) gerçekleştirin ve deney için sıralayıcıyı kurun. Cihaz kurulumuyla ilgili ayrıntılı bir kılavuz için cihaz kılavuzuna bakın.
- Sıralayıcıya 100 μm'lik bir nozul takın.
- Ücret matrisinin ayarlanması
- Adım 4.2'deki tek lekeli kompanzasyon tüplerini kullanarak kompanzasyon matrisini ayarlayın.
- Özel mülk yazılımda, Araç Çubuğundan Deney'i seçin ve Ücretlendirme kurulumu'na tıklayın. Ücret denetimleri oluştur'u açın.
- İşaretçileri kontrol edin ve onaylayın. "Kompanzasyon" adlı yeni bir numune eklenir ve bu numunenin altına işaretleyici kontrolleri olarak adlandırılan yeni tüpler yazılım tarafından otomatik olarak eklenir.
- 5.000 olay kaydetmek için Boyanmamış tüpü seçin ve çalıştırın. Geçidi hücre popülasyonuna sürükleyin ve tüm telafi denetimlerine uygulayın. Bu, her floresan parametresi için voltajları ve negatif kapıyı ayarlamak içindir.
- Benzer şekilde, tek lekeli kompanzasyon tüplerini ayrı ayrı yükleyin ve verileri kaydedin ve kaydedin. İlgilenilen popülasyonu sınırlayan geçidi seçin ve tüm ücret kontrollerine uygulayın. Bu, her floresan parametresi için pozitif kapıları ayarlamak içindir.
- Araç Çubuğundan Deneme'yi seçin ve Ücret değerlerini hesapla | bağlantısına tıklayın ve kaydedin.
NOT: Yazılım kullanılarak otomatik kompozisyon matrisi oluşturulduktan sonra, Karışık tüplerdeki kanalların hiçbiri için florokromların voltaj parametreleri değiştirilemez.
- Veri toplama
- Adım 4.3'ten itibaren her tüpte 10.000 hücre kaydedin. ve 4.4 hücrelerin immünofenotipinin analizi için veri toplamak.
- Toplama cihazlarının hazırlanması
- Sıralanan hücre popülasyonlarının amacına bağlı olarak, 6 kuyulu, 24 oyuklu, 48 oyuklu veya 96 oyuklu plakalar arasından seçim yapın.
- Kuyucukları 200-500 μL FBS ile kaplayın ve plakaları 2 saat boyunca rahatsız etmeyin.
- 2 saat sonra, kalan FBS'yi çıkarın ve 200-500 μL% 10 MSC kültür ortamı ekleyin.
- Tek hücreli sıralama modunda hücre sıralama
- Karışık tüp 1'i çalıştırın (adım 4.5'ten itibaren) ve uygun geçit stratejisini kullanarak sıralanacak ilgilenilen popülasyonun kapılarını ayarlamak için 10.000 olay kaydedin.
- Bir toplama plakası yükleyin ve hedef hücre numaralarını 2.500 ila 5.000 hücre/kuyu arasında ayarlayın ve tek hücreli sıralama saflık maskesini seçin.
- Sıralanan popülasyonları toplama cihazında toplayın ve sıralama deneyinin sonuna kadar buz üzerinde tutun.
- Tamamlandığında, kültürleri 37 °C'de tutmak için plakaları %5CO2 inkübatörüne aktarın.
NOT: Edinme sonrası, ham veri dosyaları .fcs dosya biçiminde (v.3.0'dan itibaren) dışa aktarılmıştır. Her denemeden sonra oluşturulan sıralama raporları, atanan kuyu başına sıralanan olay/hücre sayısını kaydetti ve durdurulan çakışmaların sayısını gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHED'ler, vimentin (kırmızı, tip III ara filamentler), aktin filamentleri (Alexa fluor 488 Phalloidin Probları) ve DAPI ile boyanmış çekirdeklerin ekspresyonunu gösteren standart immünofloresan testleri ile karakterize edildi (Şekil 1A). Proliferatif ve koloni oluşturma kapasitelerini tahmin etmek için standart kısa süreli hücre büyüme testleri yapıldı. Şekil 1B'de 2. günden 8. güne kadar proliferasyon hızında 14,3 kat artış gösterilmiştir. SHED'lerin klonojenik özellikleri, Şekil 1C-E'de gösterilen CFU-F Testlerinden belirlenmiştir. ISCT kriterlerine göre, multipotent MSC'ler mezodermal kaynaklı üç soya farklılaşabildi. Diferansiye adipositlerdeki yağ damlacıklarını tespit etmek için Yağ Kırmızısı O ile sitokimyasal boyama kullanıldı (Şekil 1F); Farklılaşmış osteoblastların matrisinde bulunan kalsiyum birikintilerini boyamak için von Kossa boyaması kullanıldı (Şekil 1G); ve 3D kültürdeki aggreganlar, farklılaşmış kondroblastlarda Alcian Mavisi için boyandı (Şekil 1H).
SHED'lerin immünofenotipini karakterize etmek için multiparametrik akış sitometri testleri yapıldı. Deneyler, kompanzasyon kontrolleri (Tablo 4), FMO ve izotip kontrolleri (Tablo 5) ve boyanmamış kontroller olmak üzere dört tip deneysel kontrol kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan tüm MSC ve HSC antikorlarının izotipleri, pozitif ve negatif sinyalleri ve yüksek ve loş antijen ekspresyonunu ayırt etmek için FMO tüpleri ile birlikte eklenmiştir. Şekil 2A , deney başına kullanılan FMO ve izotip kontrollerinin dağılımını göstermektedir. Temsili yoğunluk grafikleri, CD90 FITC antikorlarının FITC izotipinin ekspresyonunu göstermedi. Benzer şekilde, histogram kaplamaları (Şekil 2B), boyanmış numunelerin ekspresyon seviyelerini, ilgili FITC, PerCP Cy5.5 ve PE kanallarındaki kontrolleriyle karşılaştırdı. CD90 ve CD73 belirteçlerinin pozitif ekspresyonu (kırmızı histogramlar) ve CD45'in negatif ekspresyonu, boyanmamış ve FMO kontrolleriyle (sırasıyla mavi ve siyah histogramlar) karşılaştırılabilir.
İmmünofenotiplerin akış sitometrisine dayalı karakterizasyonu, erken pasajlardan (P6) SHED'lerden birinden belirteç dağılımını göstermiştir (Şekil 3A-H). Hem ISCT tarafından önerilen belirteçler hem de CD44, ana popülasyonları MSC'ler olarak belirledi. Yoğunluk grafiklerinde gösterilen tetra-pozitif popülasyon, CD90 + CD73 + CD105 + CD44 +'ın% ≥98 ekspresyonunu ve% ≤2 CD45 markörlerinin ekspresyonunu gösterdi. Beşten fazla bağımsız deney benzer sonuçlar verdi. Pozitif belirteçlerin diferansiyel ekspresyonunu gösteren geç geçişli SHED'ler (P12), yüksek ve sönük ekspresörlerin tek hücreli sıralaması için seçildi (Şekil 4A-H). Geçit stratejisini takiben (Şekil 4H), singletler→ Canlı hücreler→ HSC olmayanlar→ Çift pozitif CD73 + CD90 + ve tek pozitif CD73 + CD90- popülasyonları tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralandı. Sıralanan popülasyonlar, kuyu başına farklı tohumlama sayılarına sahip 96 kuyulu/48 oyuklu/6 oyuklu plaka düzenlerinde toplanmıştır (Ek Dosya 1). Sıralama deneylerinin tek bir aşamasında art arda üç deneme yapıldı ve deney başına sıralama sonrası hücrelerin hayatta kalma oranı (çift pozitif ekspresyonlarda: CD90 + CD73 +) %100 idi. Deneylerin üç bağımsız aşaması gerçekleştirilmiştir. Kuyu sonrası sıralama başına büyüyen hücre sayısını, kuyu başına sıralanan hücre sayısıyla eşleştirdik.
Şekil 5A , 96 oyuklu plakada toplanan CD90+CD73+ sonradan sıralanmış hücrelerin, ana popülasyonları gibi yapışma ve proliferasyon gösterdiğini göstermektedir. Sıralanan hücrelerin, sıralamadan sonraki altıncı günde %70-80 birleşmeye ulaştığı gözlemlenmiştir. Yapışan ve çoğalan post-sort hücreler, adipojenik büyüme faktörlerinin varlığında farklılaştırıldı ve daha sonra uygun post-sortif kontrol (farklılaşmamış) hücreler kullanılarak 15. günden sonra Yağ Kırmızısı O ile boyandı (Şekil 5B, C).
Şekil 1: İnsan pul pul dökülmüş yaprak döken dişlerden alınan kök hücrelerin karakterizasyonu. (A) İmmünofloresan boyama, izole MSC'lerin vimentin (kırmızı, tip III ara filamentler), aktin filamentleri (Alexa fluor 488 Phalloidin Probları) ve DAPI (mavi, çekirdekler) eksprese ettiğini doğrular. 20x orijinal büyütmede elde edilen fotomikrograf. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) SHED'lerin kısa süreli hücre büyüme testi, 2. güne kadar kültürdeki hücre sayısındaki önemli artış ve 8. günün sonunda proliferasyon hızında 14.3 kat artış ile gözlemlendiği gibi, yüksek proliferatif kapasitelerini sergiler (n = 3, p-değeri<0.01). Standart sapma hata çubukları gösterilmiştir. (C-E) CFU-F testi ve Kristal viyole boyama, SHED'lerin koloni oluşturma yeteneğini doğrular; (C) kültürde 14 gün sonra birden fazla koloninin oluşması beklenir; (D) tek bir hücreden kaynaklanan tek klonojenik koloni; (E) Kristal viyole lekeli tek SHED kolonisi, hücrelerin tipik fibroblast benzeri morfolojisini gösterir. (F-H) Uygun in vitro koşullar altında MSC'lerin 21. güne kadar adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaşması beklenir. Sitokimyasal boyama, 22. günde sırasıyla adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylar için (F) Yağ Kırmızısı O (ekte yağ damlacıklarını gösteren adipositin 40x görüntüsünü gösterir), (G) von Kossa ve (H) Alcian Mavisi boyamasını gösterir. Fotomikrograflar, orijinal 20x büyütme oranında elde edilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; SHEDs = pul pul dökülmüş insan süt dişlerinden elde edilen kök hücreler; CFU-F = koloni oluşturan birim-fibroblast. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Multiparametrik deneyde kullanılan negatif kontroller . (A) Floresan Eksi Bir kontrolleri, FMO kontrollerinin kendi spesifik izotipleriyle değiştirildiği tablo biçiminde görüntülenmiştir. Temsili yoğunluk grafikleri (soldan sağa), CD90 FITC izotipinin eklenmesiyle birlikte CD90 FITC hariç tüm antikorların eklendiği CD90 FITC'nin (ortada) boyanmamış kontrolünü (solda) ve panelin tüm antikorları eklenmiş tamamen boyanmış numuneyi (sağda) gösterir. (B) Histogram kaplaması, üç tür numunenin karşılaştırılmasını temsil eder, siyah FMO'yu, mavi boyanmamışı temsil eder ve kırmızı, ilgili kanallarında tamamen boyanmış numuneleri temsil eder. Kısaltmalar: FMO = Floresan eksi bir; FITC = floresein izotiyosiyanat; PerCP = peridinin-klorofil proteini; PE = fikoeritrin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SHED'lerin multiparametrik immünofenotiplemesi (P6). (A) SSC-A'ya karşı FSC-A: Yan ve ileri saçılma özelliklerine bağlı olarak, ilgilenilen hücreler geçitlenir ve enkazdan ayrılır; (B) FSC-H'ye karşı FSC-A ve (C) SSC-H'ye karşı SSC-A: İki çizim, yanlış pozitif sinyaller üretebilecek agregaları ortadan kaldırırken tekillerin seçilmesini sağlayan ikili ayrımcılığı için kullanılır; (D) SSC-A'ya karşı CD45 PE: Dışlama geçidi, CD45 popülasyonunun singletlerden seçilmesine izin verir; (E) CD73 PerCP-Cy5.5'e karşı CD90 FITC: CD45-canlı singlet'lerden, CD90+CD73+ hücreleri geçitlidir; (F) CD44 V450 ve CD105 APC: CD90 + CD73 + popülasyonu, tetra-pozitif CD90 + CD73 + CD44 + CD105 + hücrelerini tanımlamak için daha fazla kapılıdır; (G) SSC-A'ya karşı Zaman(lar): Grafik, zaman (saniye) boyunca kararlı edinimi ve edinme sırasında hiçbir olayın basınç dalgalanmalarına neden olmadığını gösterir; (H) Geçit hiyerarşisi. Kısaltmalar: SHEDs = pul pul dökülmüş insan süt dişlerinden elde edilen kök hücreler; FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; FSC-H = ileri saçılma-tepe yüksekliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İmmünfenotipli SHED'lerin (P12) tek hücreli sıralaması. (A-F) Saf MSC'leri aşağıdaki sırayla sıralamak için adım adım dışlama tabanlı bir geçit stratejisi: Hücreler singlets_1'a, singlets_2'ye, DAPI- canlı hücrelere, CD45- Hematopoetik olmayan hücrelere ve son olarak CD90 + CD73 + hücrelerine. (F)'de gösterilen geçitli popülasyonlar, tek hücreli sıralama modu kullanılarak sıralanmıştır. (G) SSC-A ve Zaman(lar) grafiği, numunelerin kesintisiz sıralamasını tanımlar. (H) Geçit hiyerarşisi. (n=3, Sıralama verimliliği = %100). Kısaltmalar: SHEDs = pul pul dökülmüş insan süt dişlerinden elde edilen kök hücreler; MSC'ler = mezenkimal kök hücreler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tasnif sonrası SHED'lerin morfolojik ve fonksiyonel karakterizasyonu. (A) Tasnif sonrası popülasyonların faz kontrast görüntüleri, 6. günde 96 oyuklu bir plakada 10x orijinal büyütmede toplandı, Ölçek çubuğu = 10 μm (ekte, morfolojiyi fibroblast benzeri MSC'lere dönüştüren sıralanmış tek hücreleri gösteren 20x'lik bir görüntü gösterilmektedir). 20x orijinal büyütmede (B) farklılaşmamış (kontrol) ve (C) farklılaşmış sıralama sonrası popülasyonda gözlemlenen Yağ Kırmızısı O kullanılarak adipojenik farklılaşma için sitokimyasal boyama, Ölçek çubuğu = 10 μm (ekte gözlemlenen yağ damlacıklarını gösteren 40x bir görüntü gösterilmektedir). Kısaltmalar: SHEDs = insan pul pul dökülmüş süt dişlerinden elde edilen kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Deneme başına oluşturulan derlenmiş sıralama raporları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: BD FACSAria Fusion'ın Optik Konfigürasyonu. Kısaltmalar: LP = uzun geçiş; PMT = fotoçoğaltıcı tüp; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında, doğum sonrası kaynaklar arasında, oral doku kaynaklı MSC'ler, asgari etik yükümlülükleri ve dikkate değer çok soylu farklılaşma potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi çekmiştir21. Gömülü üçüncü azı dişinden ve SHED'lerden elde edilen diş pulpası kök hücreleri (DPSC'ler), nörodejeneratif ve travmatik hastalıklardaki terapötik potansiyelleri nedeniyle dental MSC'ler arasında en fazla ilgiyi görmüştür22. Bu yazıda açıklanan protokol, multiparametrik bir yaklaşım kullanarak SHED'leri karakterize etmeye ve tek hücreli sıralama yaklaşımını kullanarak ilgilenilen popülasyonları daha fazla sıralamaya yardımcı olur. Bununla birlikte, bu protokolün uygulanması sadece oral MSC'lerle sınırlı olmayıp, aynı zamanda insan vücudundaki diğer kaynak dokulardan immünofenotipleme ve MSC'lerin sınıflandırılması için de kullanılabilir23.
Ele alınan biyolojik problemin başarılı bir şekilde uygulanması için bu protokoldeki birkaç kritik adımın burada tartışılması gerekmektedir. Her sıralama protokolünün anahtarı iki önemli bileşeni kontrol etmektir: biyolojik kontroller ve deneysel kontroller. Başlangıç olarak, temiz kültür bakımı, kullanılan numunenin ayıklanırken tehlikeye girmemesini sağlar. Tek hücreli süspansiyon ön sıralamasındaki hücre canlılığı, %70'ten fazla canlı hücre popülasyonunun başlatılmasını ve ardından sağlıklı alt popülasyonların analiz edilmesini ve sınıflandırılmasını sağlayacaktır. Tek hücreli süspansiyonda kullanılan leke tamponu %2 FBS içermelidir ve deneyler en iyi oda sıcaklığında yapılır. Bu birincil hücrelerin doğru birleşmesinin seçilmesi (% 80-85 birleşme), hücre canlılığından ödün vermekten kaçınır ve büyük agregaların olasılığını azaltır. Ek olarak, her sıralama deneyi için canlı/ölü bir işaretleyicinin (bu protokolde DAPI) kullanılması esastır. Bu çalışmada, kullanılan numuneler yaklaşık 20-35 μm çapında MSC'ler olduğundan, BD FACSAria Fusion üzerinde 20 psi'lik bir basınçta sıralamak için seçilen nozul boyutu 100 μm idi. Bu, daha düşük kılıf basıncında işlem sırasında hücre canlılığından ödün vermeden hücre sıralamasına izin verdi. Ayrıntılı sıralama kurulum koşulları için, BD FACSDiva kılavuzu24 yazılımına bakmanız önerilir.
Akış sitometrisinde çok renkli deneyler için temel bir ön koşul, uygun kontrollere duyulan ihtiyaçtır; Burada kullanılan dört ana kontrol türü vardır: otofloresan, izotipler, FMO ve kompanzasyon kontrolleri. Otomatik kompanzasyon matrisi, dedektörlerde spektral kanamayı önleyerek doğru kompanzasyona izin verdi ve bu amaçla hem kompanzasyon boncuklarını hem de hücrelerini kullandı. Boyanmamış numune, MSC'lerin otofloresan eşiğini belirledi. Dört antikorun tümünü içeren karışık tüpler, kullanılan her antikorun izotipini ve FMO'larını içerir. DAPI kompanzasyon kontrolü, ayrı ayrı işlenen (ısı şoku ile) MSC'ler kullanılarak gerçekleştirildi. Burada kullanılan antikor paneli ( Tablo 8'de belirtildiği gibi), ISCT tarafından belirtilen kriterlere ve BD FACSAria Fusion hücre sıralayıcısının cihaz konfigürasyonuna dayalı olarak hMSC'ler için özel olarak tasarlanmıştır (Ek Tablo S1'e bakın). Bu, multiparametrik akış sitometrisi deneylerinin planlanması sırasında çok önemlidir. İmmünfenotipleme için kullanılan karakterizasyon paneli dört pozitif MSC belirteci (CD90, CD105, CD73 ve CD44) ve bir negatif belirteçten (CD45) oluşur. Buna karşılık, sıralama deneyi paneli, yüksek sayıda canlı MSC sağlamak için iki pozitif işaretleyici (CD90 ve CD73), bir negatif işaretleyici (CD45) ve bir canlı/ölü işaretleyici (DAPI) içerir.
| Antikor/Belirteç | Florokrom | hMSC Yüzey Profili | Lazer Dalga Boyu (nm) | Uyarma zirvesi (nm) | Emisyon tepe noktası (nm) |
| CD44 Serisi | V450 Serisi | İfade etmesi gereken; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 Serisi | FITC (FITC) | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 Serisi | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 Serisi | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 Serisi | PE | İfade ETMEMELİDİR; %<2 | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Ölü hücre işaretleyici | 405 | 358 | 461 |
Tablo 8: Akış sitometrisi ile SHED'lerin karakterizasyonu ve sınıflandırılması için tasarlanmış çok renkli panel. Kısaltmalar: FITC = floresein izotiyosiyanat; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin; PerCP = peridinin-klorofil proteini.
Sıralama saflık maskesi seçimi
MSC'lerde hücresel heterojenliğin öngörülemezliği göz önüne alındığında, toplu sıralama, sıralanan popülasyonlar arasında saflık düzeyine ulaşamayabilir. Bu çalışmada, tek hücreli klonları tanımlamak ve potens açısından sıralama sonrası fonksiyonel özelliklerini izlemek için tek hücreli sıralama protokolünü optimize ettik. Tek hücreli sıralama, aşağıdaki ayarların esnekliğine sahip bir BD FACSAria Fusion üzerinde gerçekleştirildi: 100 μm nozul seçimi, 20 psi kılıf basıncı, ayarlanabilir bir akış hızı (20 μL/dk'da tutulur) ve 380 olay/s'de eşik hızı. Bu yöntemde bir yerine iki hedef hücre seçme şansı minimumdur. Normalde, hedef hücrelerin saf popülasyonlarının sıralanmasını çözebilen ve tercih edilen toplama cihazına kaç damla sıralanacağını düşünebilen algoritmanın tek hücreli sıralama modu seçilir. Kesinlik modu, sıralama algoritmalarında bulunan maskeleri birleştirebilecek ve ilgilenilen en saf popülasyonları sıralamak için katı bir sıralama koşulu oluşturabilecek şekilde doğru bir şekilde seçilmelidir. Tek hücreli sıralama modu, sıralama sırasında hedef olmayan bir hücreye toplanırsa hedef hücreden ödün vermez ve bu, bu yaklaşımda dört gözle beklediğimiz saflık düzeyine ulaşır. Bu, bu protokolde seçilen modüldü ve sıralanan hücreler 96 kuyulu, 48 oyuklu, 24 kuyulu ve 6 oyuklu plaka cihazlarında toplandı.
Bu çalışmada alt popülasyonları diferansiyel immünofenotiplerine göre yani CD90+CD73+CD45- olarak sıraladık. Hem karakterizasyon hem de sıralama protokollerinde, geçit stratejimiz (Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterildiği gibi), bize hematopoietik olmayan popülasyonu vermek için CD45 popülasyonundan dışlama kapısına dayanmaktadır (bunlar daha önce ISCT tarafından reçete edilen belirteçlerle doğrulanmış ve karakterize edilmiştir), singletlerin tanımlanmasından sonra. Sonunda, MSC'ler pozitif ISCT belirteçleri kullanılarak CD45 popülasyonundan tanımlandı. Burada, önce ISCT belirteçlerinin pozitif ekspresörlerinin ardından CD45'in negatif ekspresörlerinin geçitlenmesinde yüzdelerde çok fazla fark olmadığını belirtmekte fayda var. Bununla birlikte, bu sıralamanın amacı, bilinen MSC belirteçlerinin değişmiş ekspresyonunu gösteren hücreleri tanımlamak olduğundan, analizimizi pozitif ekspresyon grafikleri ile sonuçlandırdık.
Temsili rakamlarda, CD45 hücrelerinin %97'si MSC'lerdir, ancak antijen ekspresyonlarının nicelleştirilmesi sırasında, hücrelerin %75'inin CD90 ve CD73 belirteçlerinin çift pozitif ekspresörleri olduğunu gördük, aynı belirteçlerin tek pozitif ekspresörleri olan birkaç popülasyon vardır ( Şekil 3F'de gösterilmiştir) ve belirteçleri hiç ifade etmeyen birkaç hücre vardır.
Bu hücrelerin karakterizasyonu sırasında, alt popülasyonları tetra-pozitif MSC'ler, üçlü pozitif ve çift negatif popülasyonlar olarak tanımladık. MSC belirteçlerinin bu diferansiyel ekspresyonu, artan geçişlerle genişler ve bu nedenle, bu farkı fonksiyonel özellikleriyle inceleme ve ilişkilendirme ihtiyacı ortaya çıkar. Çalışmamızda MSC'leri sınıflandırmanın nihai amacı, tanımlanan alt popülasyonlar arasında karşılaştırmalı bir analiz oluşturmak ve pozitif belirteçlerin diferansiyel ifadelerinin işlevsel etkileri olup olmadığını belirlemektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalenin yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Hindistan'ın Bengaluru kentindeki Jawaharlal Nehru İleri Bilimsel Araştırma Merkezi'ndeki Akış Hücresi Tesisi'ne akış sitometrisi çekirdek tesisinin kullanımı için teşekkür ederiz. Farklılaşmış hücrelerin pelet kültürünün kriyo-kesiti, Hindistan'ın Bengaluru kentindeki Neuberg Anand Referans Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Bu çalışma, UC'nin Hindistan'daki Manipal Yüksek Öğrenim Akademisi'nden (MAHE) okul içi finansmanı ile desteklenmiştir. AG, MAHE'den Dr. T. M. A. Pai Bursu'nun desteği için minnettardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
