Summary
Denne protokollen beskriver bruken av fluorescensaktivert cellesortering av humane mesenkymale stamceller ved bruk av enkeltcellesorteringsmetoden. Spesielt kan bruk av enkeltcellesortering oppnå 99% renhet av immunfenotypede celler fra en heterogen populasjon kombinert med en multiparametrisk flowcytometribasert tilnærming.
Abstract
De mesenkymale stamceller (MSC) i en organisme har en ekstraordinær evne til å differensiere til flere linjer av voksne celler i kroppen og er kjent for deres immunmodulerende og antiinflammatoriske egenskaper. Bruken av disse stamcellene er en velsignelse for feltet regenerativ biologi, men samtidig en bane til regenerativ medisin og terapi på grunn av de mange cellulære tvetydigheter som er forbundet med dem. Disse tvetydighetene kan oppstå fra mangfoldet i kilden til disse stamcellene og fra deres in vitro vekstbetingelser, som begge reflekterer deres funksjonelle heterogenitet.
Dette garanterer metoder for å gi rensede, homogene populasjoner av MSC for terapeutiske anvendelser. Fremskritt innen flowcytometri har gjort det mulig å oppdage enkeltcellepopulasjoner ved hjelp av en multiparametrisk tilnærming. Denne protokollen skisserer en måte å identifisere og rense stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner (SHEDs) gjennom fluorescensassistert enkeltcellesortering. Samtidig ekspresjon av overflatemarkører, nemlig CD90-fluoresceinisotiocyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC) og CD44-V450, identifiserte de "lyse", positive uttrykkerne av MSC ved bruk av multiparametrisk flowcytometri. Imidlertid ble det observert en signifikant nedgang i prosentandeler av firedoble ekspressorer av disse positive markørene fra passasje 7 og utover til de senere passasjene.
De immunfenotypede subpopulasjonene ble sortert i encellet sorteringsmodus der kun to positive og en negativ markør utgjorde inklusjonskriteriene. Denne metodikken sikret cellenes levedyktighet til de sorterte populasjonene og opprettholdt celleproliferasjon etter sortering. Nedstrømsapplikasjonen for slik sortering kan brukes til å evaluere avstamningsspesifikk differensiering for de inngjerdede delpopulasjonene. Denne tilnærmingen kan brukes på andre enkeltcellesystemer for å forbedre isolasjonsforholdene og for å anskaffe informasjon om flere celleoverflatemarkører.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC) kan betraktes som en skalerbar kilde til celler egnet for cellebaserte terapier og kan betraktes som et gullstandardsystem innen regenerativ medisin. Disse cellene kan isoleres fra en rekke kilder i kroppen med forskjellig vevsopprinnelse1. Avhengig av deres kildevev, viser hver type MSC en tvetydig in vitro-oppførsel 2. Dette er godt observert i deres morfologiske og funksjonelle egenskaper3. Flere studier har vist intraklonal variasjon i dimensjoner, inkludert vevsdifferensiering hos voksne, genomisk tilstand og metabolsk og cellulær arkitektur av MSCs 2,4.
Immunfenotyping av celler har vært en vanlig anvendelse av flowcytometri for identifisering av stamceller, og dette ble brukt av International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) i 2006 for å foreskrive en liste over minimale kriterier for å identifisere celler som MSC. Det uttalte at sammen med plastisk adherens og evnen til å differensiere i tre linjer (osteogen, kondrogen og adipogen) in vitro, må ≥95% av cellepopulasjonen uttrykke CD105, CD73, CD90, og disse cellene må mangle uttrykket (≤2% positivt) av CD34, CD45, CD11b, CD14 og HLA-DR, målt ved flowcytometri5. Selv om MSCene ble definert av et sett med biomarkører under ISCTs minimale kriterier, kunne deres immunegenskaper ikke benchmarkes med disse biomarkørene, og det var behov for mer utover disse kriteriene for å gjøre sammenligninger på tvers av studier og klonale variasjoner lettere å kvantifisere2.
Til tross for retningslinjene satt av ISCT, har omfattende forskning på MSC vist at heterogenitet eksisterer i denne populasjonen, noe som kan oppstå på grunn av en rekke faktorer, hovedsakelig på grunn av den allestedsnærværende naturen av heterogenitet som oppstår mellom MSC-donorer6, vevskilder7, individuelle celler i en klonal populasjon8 og kulturforhold2,9, 10. Karakterisering og rensing av disse primære cellene fra en rekke vevskilder for å sikre kvalitet og celleskjebne er viktige trinn i produksjonen. Behovet for å forstå de viste variasjonene blant populasjonen krever en effektiv metode for å løse den inn i delpopulasjoner som kan deles og samles separat11. Analyser på enkeltcellenivå bidrar til å overvinne utfordringene med cellecellevariasjon, redusere biologisk støy som oppstår fra en heterogen populasjon, og gir muligheten til å undersøke og karakterisere sjeldne celler12.
Basert på formålet og valgte parametere, kan flere metoder brukes til å sortere og berike de utvalgte populasjonene. Cellesorteringsteknikker kan omfatte både bulksortering og enkeltcellesorteringsmetoder. Mens massesortering kan berike målpopulasjoner gjennom magnetisk aktivert cellesortering (MACS)13, fraksjonering 14 og eluering 15, kan enkeltcellesortering berike mer homogene populasjoner ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS)11. En komparativ analyse av hver av disse metodene med egne fordeler og ulemper er fremhevet i tabell 1.
Tabell 1: Komparative analyser av ulike teknikker: MACS, fraksjonering, eluering og FACS som fremhever forskjellene i prinsippet og fordelene og ulempene ved å velge en bestemt teknikk fremfor en annen. Forkortelser: MACS = Magnetisk aktivert cellesortering; FACS = Fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Siden fremkomsten av teknikken har enkeltcelleflowcytometri spilt en viktig rolle i oppregning16, deteksjon og karakterisering av en spesifikk cellepopulasjon i en heterogen prøve17. Hewitt et al. la i 2006 grunnlaget for automatisert cellesorteringsmetodikk for å forbedre isoleringen av homogene bassenger av differensierte humane embryonale stamceller (hESCs)18. Enkeltcellesortering beriket populasjonen av GFP-transduserte hESC-er som letter isoleringen av genmodifiserte kloner, noe som åpnet en ny dimensjon i klinisk forskning. For å forbedre sorteringseffektiviteten er det generelt tatt to tilnærminger; Enten er innsamlingsmediene til de sorterte populasjonene modifisert for å opprettholde levedyktighet og spredning av ettersorterte celler19 eller cellesorteringsalgoritmen / programvaren er hensiktsmessig modifisert12.
Med utviklingen av teknologi har kommersielle strømningscytometre og cellesorterere vært i stand til å bidra til å løse utfordringer som ble møtt mens aseptisk sortering av skjøre og sjeldne cellepopulasjoner, spesielt stamceller av forskjellig opprinnelse. En av de største utfordringene for stamcellebiologer har vært klonal isolering av humane pluripotente stamceller etter transfeksjonsprotokoller som kreves i genredigeringsstudier19. Dette ble adressert ved å sortere enkeltceller i 96-brønnsplater som ble belagt med musembryonale fibroblaster (MEF) sammen med kosttilskudd og kommersielle småmolekylære ROCK-hemmere. Imidlertid kan celleisolasjonsstrategier i stor grad raffineres ved bruk av indekssortering, en funksjon i sorteringsalgoritmen som identifiserer immunfenotypen til individuelle celler sortert12. Denne raffinerte modaliteten i enkeltcellesortering bidro ikke bare til å øke sorteringseffektiviteten for stamceller, spesielt med hensyn til sjeldne hematopoietiske stamcellepopulasjoner, men koblet også effektivt enkeltcellekloner til deres nedstrøms funksjonelle analyser20.
Denne artikkelen fokuserer på enkeltcellesortering av immunfenotypede stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner (SHEDs) for anrikning av underpopulasjoner for å studere deres funksjonelle differensieringskapasitet. Ved hjelp av en kombinasjon av to MSC-positive markører, CD90 og CD73, og en negativ hematopoietisk markør CD45, ble MSC immunfenotypet og dim og null ekspressorer ble identifisert. Basert på deres immunfenotype ble subpopulasjonene identifisert som rene MSC, enkle positive og dobbelt negative populasjoner. De ble sortert ved hjelp av encellesorteringsmodus for å oppnå rene og berikede subpopulasjoner for videre funksjonelle studier for å identifisere om differensialuttrykket av markører var en artefakt av in vitro-kulturforhold eller om det også har noen effekt på de funksjonelle egenskapene. Celler som ikke var homogene uttrykkere av de "positive MSC-markørene" ble sortert for å studere deres funksjonelle egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkjenning og samtykke til å delta: Humane eksfolierte løvfellende tannpulpprøver ble mottatt etter å ha innhentet informert samtykke og full etisk godkjenning av Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, i samsvar med standardene fastsatt av Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Deretter ble isolasjon, kultur, vedlikehold og bruk av SHEDs godkjent av og i samsvar med retningslinjene anbefalt av Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) ved Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. Fremstilling av reagenser og buffere
- For vedlikehold av kultur
- Klargjør MSC-cellekulturmedier (10 %) ved bruk av basalmedium for udifferensierte hESC, 10 % føtal bovint serum (FBS), 1 % L-glutamin og 1 % penicillin-streptomycin (Pen-streptokokker) (tabell 2).
- Klargjør MSC-cellekulturmedier (20 %) ved bruk av basalmedium for udifferensierte hESC-er, 20 % FBS, 1 % L-glutamin og 1 % pen-streptokokker (tabell 2).
- Forbered nøytraliserende medier ved hjelp av basalmedium for udifferensierte hESCs, 1% L-glutamin og 1% antibiotika-antimykotiske (Anti-Anti) (tabell 2).
- For flowcytometrisk analyse og sortering
- Forbered fargebuffer ved å bruke 2% FBS i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Lag en stamløsning av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 μg/ml) ved å tilsette 1 μL i 1 ml PBS
- For avstamningsspesifikk differensiering av MSC-er
- Klargjøre differensieringsmedier for osteogen, kondrogen og adipogen differensiering i henhold til sammensetningen beskrevet i tabell 3. Oppbevar de tilberedte alikotene ved 4 °C så lenge forsøket varer.
- Forbered serum-sultne medier (2% media) ved hjelp av basalmedium for udifferensierte hESCs, 2% FBS, 1% L-glutamin og 1% Pen-streptokokker (tabell 2).
| TYPE MEDIER | FORMÅL MED MEDIA | SAMMENSETNING FOR 50 ml | ||||||||
| FBS | Penn-streptokokker | L-glutamin | BASALMEDIUM FOR UDIFFERENSIERTE hESC | |||||||
| 10% medier | MSC kultur og vedlikehold | 5 ml | 500 μL | 500 μL | 44 ml | |||||
| 20% medier | CFU-F-analyse | 10 ml | 500 μL | 500 μL | 39 ml | |||||
| Serum sultet (2%) media | Media for kontrollbrønner i differensieringsprotokoll | 1 ml | 500 μL | 500 μL | 48 ml | |||||
| Nøytraliserende medier | Media for nøytralisering av cellesuspensjonen etter trypsinisering | - | 500 μL | 500 μL | 49 ml | |||||
Tabell 2: Cellekulturmedier for dyrkningsvedlikehold og analyser. Forkortelser: MSC = mesenkymal stamcelle; CFU-F = kolonidannende enhet-fibroblast.
| KOMPONENTER | OSTEOGENE MEDIER | HONDROGENE MEDIER | TAKOGENE MEDIER |
| Basale medier | 90 ml | 90 ml | 90 ml |
| Induksjonsmedier | 10 ml | 10 ml | 10 ml |
| Totalt volum | 100 ml | 100 ml | 100 ml |
Tabell 3: Differensieringsmedier for trilineær differensiering av SHED.
2. Kultur og vedlikehold av SHEDs
- Vedlikehold celler i 10% MSC kulturmedier og utfør medieendringer hver 2. dag eller etter behov.
- Trypsiniser celler ved 95% konfluens ved bruk av 0,25% trypsin-EDTA.
- Nøytraliser celler etter trypsinisering ved hjelp av nøytraliserende medier.
- Sentrifuger røret ved 300 × g i 6 minutter ved romtemperatur for å oppnå en cellepellet.
- Dekanter supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 % MSC-dyrkningsmedier.
- Frøceller til nylagde cellekulturretter som inneholder 10% MSC-kulturmedier for videre eksperimenter eller subdyrking.
MERK: Optimal såtetthet for SHEDs er 0,2 × 10 6 celler i en 100 mm tallerken og 0,8 × 10 6 celler i en T-75 kolbe, for å oppnå henholdsvis 1,5 × 10 6 celler og 4 × 10 6 celler ved 90-100% konfluens.
3. Karakterisering av MSC-er
- Kortsiktig cellevekstanalyse
- Frø 4 × 104 celler/brønn i triplikat til 6-brønnsplater i 10% MSC dyrkningsmedier.
- Inkuber platene i 7 dager ved 37 °C, og utfør medieskift hver 2.
- Høst cellene på dag 2, 4 og 8 ved hjelp av 0,25% trypsinbehandling og vask med kulturmedier.
- Sentrifuger cellene ved 300 g i 6 minutter ved romtemperatur og resuspender pelleten i 1 ml media.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og bestemme deres levedyktighet ved trypanblå ekskluderingsmetode.
- Beregn spredningshastigheten ved hjelp av ligning (1):
(1)
- Kolonidannende enhetsfibroblast (CFU-F) analyse
- Frø 10 000 celler i en 100 mm tallerken og dyrk dem i 20 % MSC-kulturmedier.
- Inkuber platene i 14 dager ved 37 °C, og utfør medieskift hver 3.
- Etter 14 dager, skyll koloniene med PBS, fest dem med krystallfiolett fargestoff i metanol, og skyll igjen med PBS for å fjerne gjenværende flekk.
- Tell og bilde koloniene.
MERK: Tell kolonier med >50 celler. Kolonidannende effektivitet beregnes som kolonidannende enhetsnumre.
- Immunfluorescensanalyse
- Frø MSC-ene på 35 mm tallerkener og la dem vokse til 80-90% samløp.
- Fjern mediet og skyll oppvasken med PBS en gang.
- Fikser cellene med 1 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) ved enten å inkubere i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Etter fiksering vaskes brønnene med PBST i 3 x 5 min på vipperen.
- Tilsett 0,3% Triton X-100 i PBST (0,05% Tween 20 løsning i PBS) for permeabilisering av cellene. Hold den på vipperen i 15 min ved romtemperatur.
- Vask brønnene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsett 3% bovint serumalbumin (BSA) for blokkering og hold det på vipperen i 1 time ved romtemperatur.
- Vask brønnene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsett 800 μL av 1:500 fortynning av mus anti-vimentin, hold den på vipperen i 1 time ved romtemperatur, og overfør platen til 4 ° C for inkubasjon over natten.
- Neste dag, fjern det primære antistoffet og vask brønnene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsett 800 μL av 1:1,000 fortynning av geit anti-mus IgG (H + L) kryssadsorbert sekundært antistoff, Alexa Fluor 555, og hold det i 3 timer ved romtemperatur på vipperen.
- Vask brønnene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsett Alexa fluor 488 Phalloidin Prober 240 μL i 1,000 μL PBS og inkuber ved romtemperatur i 60 minutter på vippen.
- Vask brønnene med PBST i 3 x 5 min på vippen.
- Tilsett 700 μL DAPI-monteringsmiddel og observer cellene under et mikroskop.
- Avstamningsspesifikk differensiering
- Differensiering etter 2D-kultur
- Ta to 48-brønnsplater og merk dem som henholdsvis osteogene og adipogene linjer.
- Frø 15.000 celler/brønner i fire brønner på hver plate og dyrk dem i 10% MSC dyrkningsmedier.
- Når monolaget av celler har nådd 90% konfluens, merk de to første brønnene som "Kontroll" og erstatt de eksisterende mediene med serum-sultne medier (2% media). I de to siste brønnene merket som 'Test', legg til differensieringsmedier av en av de to linjene, adipogen eller osteogen. Merk dette som dag 0.
- Bytt forsiktig ut media hver tredje dag for å omgå peeling og vær forsiktig for å unngå forurensning.
- Oppretthold disse forholdene til den tjueførste dagen; Deretter prosess for fargeeksperimentet.
- Differensiering etter 3D-kultur
- Ta to 15 ml rør for å utføre kondrogen differensiering ved bruk av 3D pelletskultur.
- Overfør 1 × 10 6 celler til hvert rør og sentrifuge ved 300 × g i6 minutter for å danne en pellet. Merk ett rør som 'Control' og tilsett 10 % MSC-kulturmedier til det; Merk den andre tuben som 'Test' og tilsett kondrogene differensieringsmedier. Plasser rørene forsiktig i inkubatoren med hettene løst skrudd. Merk dette som dag 0.
- Bytt mediet forsiktig hver tredje dag for ikke å løsne/oppløse pelleten under medieskift.
- Opprettholde disse forholdene til den tjueførste dagen, og deretter behandle cellene for videre eksperimenter.
- Differensiering etter 2D-kultur
- Avstamningsspesifikk cytokjemisk farging
- For 2D-kulturer, bruk de differensierte (test) og udifferensierte MSC-platene (fra trinn 3.4.1.5.) for farging, og fjern først mediet og vask to ganger med PBS. Fest cellene med 4% PFA i 30 minutter ved romtemperatur, fjern supernatanten og vask en gang med PBS. Utfør farging for hver avstamning som følger.
- For adipocytter, tilsett permeabiliseringsløsning fra settet og inkuber platen i 5 minutter ved romtemperatur. Forbered og tilsett 1 ml oljerød O-arbeidsløsning og hold den i 10 minutter. Fjern flekken og gi fem vasker med destillert vann.
- For osteocytavstamning, tilsett 5% nytilberedt sølvnitrat (i destillert vann) til hver brønn og hold platen under UV i 1 time. Fjern løsningen og tilsett 2,5% natriumtiosulfat for å fjerne uomsatt sølv; Hold den i 5 min. Fjern flekken, vask to ganger med destillert vann, og observer de fargede cellene under et mikroskop.
- For 3D-kulturer, samle pelleten etter slutten av differensieringsperioden fra trinn 3.4.2.3 og oppnå kryoseksjoner av det differensierte vevet i form av pelleten. La lysbildene lufttørke og ha romtemperatur før du fortsetter til flekkene.
- For kondrocyttavstamning, følg instruksjonene til fargesettet for å tilsette et tilstrekkelig volum vaskeoppløsning, fjern det, tilsett festeløsningen og inkuber i 30 minutter. Vask med destillert vann, tilsett fargeløsningen og inkuber i 30 minutter. Vask tre ganger med 0,1 N saltsyre; Tilsett destillert vann for å nøytralisere surheten. Observer de fargede cellene under et lysfeltmikroskop.
- For 2D-kulturer, bruk de differensierte (test) og udifferensierte MSC-platene (fra trinn 3.4.1.5.) for farging, og fjern først mediet og vask to ganger med PBS. Fest cellene med 4% PFA i 30 minutter ved romtemperatur, fjern supernatanten og vask en gang med PBS. Utfør farging for hver avstamning som følger.
(1)4. Celleoverflatefarging for immunfenotyping
MERK: Anbefalte cellekulturplater for å få et optimalt antall celler i trinn 4,2-4,5 er 100 mm retter eller T75-kolber.
- Cellepreparasjon for flowcytometriske eksperimenter
- Trypsinize og samle cellene fra en konfluent tallerken / kolbe og sentrifuge ved 300 × g i 6 min for å oppnå cellepelleten.
- Resuspender pelleten i 1 ml media og bestem levedyktig celletall ved hjelp av et hemocytometer etter trypanblå ekskluderingsmetoden.
- Sentrifuger cellesuspensjonen igjen etter telling og gi ytterligere to vasker til pelleten med 1 ml fargebuffer.
- Kast supernatanten og til slutt resuspender pelleten i et passende volum av fargebufferen, avhengig av protokollen (se trinn 4.2 til 4.5).
- Utarbeidelse av erstatningskontroll
- Ta syv FACS-rør og merk dem som Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 og APC.
- Resuspender den endelige pelleten i fargebufferen (se trinn 4.1), og hold en celletetthet på 0,5 × 106 celler per 50 μL per rør for Unstained- og DAPI-rørene.
- Klargjør de enkeltfargede tubene for kompensasjon som beskrevet i tabell 4.
- Virv forsiktig hvert rør etter tilberedning og inkuber i mørket i 30 minutter.
- Etter inkubering, gi to vasker ved å tilsette 1 ml fargebuffer til hvert rør, etterfulgt av kort vortexing og sentrifugering ved 200 g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten i 500 μL fargebuffer, og sett den til side til oppkjøpet.
- For DAPI-røret, utfør varmesjokkbehandling ved å inkubere det i et 60 °C vannbad i 5 minutter etterfulgt av 15 minutter på is. Tilsett 5 μL DAPI til fjæringen og hold den i mørket til den kjørte anskaffelsen.
- Fremstilling av fluorescens minus en (FMO) kontroller
- Resuspender den endelige pelleten i fargebuffer (se trinn 4.1), og hold en celletetthet på 0,5 × 106 celler per 50 μL for hvert rør.
- Ta fem FACS-rør, og merk dem som CD44-V450 isotype, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5 isotype og CD105-APC isotype.
- Klargjør celle- og antistoffsuspensjonen i henhold til tabell 5.
- Virv rørene forsiktig og rug dem i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Etter inkubering, gi to vasker med 1 ml fargebuffer til hvert rør etterfulgt av kort vortexing og sentrifugering ved 200 g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten i 500 μL fargebuffer, og sett den til side til anskaffelse.
- Utarbeidelse av prøver for analyse
- Resuspender den endelige pelleten i fargebufferen (se trinn 4.1), og hold en celletetthet på 0,5 × 106 celler per 50 μL for hvert rør.
- Ta to FACS-rør og merk dem som blandede rør 1 og 2.
- Klargjør celle- og antistoffsuspensjonen i henhold til tabell 6.
- Virv rørene forsiktig og rug dem i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Etter inkubering, gi to vasker med 1 ml fargebuffer til hvert rør etterfulgt av kort vortexing og sentrifugering ved 200 g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten i 500 μL fargebuffer, og sett til side til anskaffelse.
- Klargjøring av prøver for enkeltcellesortering
- Ta to FACS-rør, legg til 1 ml FBS, og rull røret rundt til et jevnt lag med FBS dannes på innsiden av hvert rør. Inkuber dette i 1-2 timer mens du behandler prøven for farging. Merk disse rørene som blandede rør 1 og 2.
- Resuspender den endelige pelleten i fargebufferen (se trinn 4.1), og hold en celletetthet på 2-3 × 106 celler per 50 μL for hvert rør.
- Klargjør celle- og antistoffsuspensjonen i blandede rør 1 og 2 i henhold til tabell 7.
- Virv rørene forsiktig og rug dem i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Etter inkubering, gi to vasker med 1 ml fargebuffer til hvert rør etterfulgt av kort vortexing og sentrifugering ved 200 g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten i 500 μL fargebuffer og sett til side. Tilsett 5 μL DAPI 15 minutter før sortering.
MERK: Merk at for sorteringseksperimenter anbefales høyere celletetthet per rør.
| Tube type | Positive Comp perler * | Negative Comp perler * | Celler | Antistoff tilsatt | |
| FITC-rør | 1 dråpe | 1 dråpe | – | Anti-human CD90-FITC (2 μL) | |
| V450-rør | 1 dråpe | 1 dråpe | – | Anti-human CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5,5 rør | 1 dråpe | 1 dråpe | – | Anti-human CD73-PerCP Cy 5,5 (2 μL) | |
| PE-rør | 1 dråpe | 1 dråpe | – | Anti-human CD45-PE (2 μL) | |
| APC-rør | 1 dråpe | 1 dråpe | – | Anti-human CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI-rør | – | – | 50 μL | – | |
| Ufarget rør | – | – | 50 μL | – | |
| *1 dråpe= 60 mikrol perlefjæring | |||||
Tabell 4: Kompensasjonskontrollprøver. Forkortelser: Comp = kompensasjon; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
| TUBE TYPE | ANTISTOFF MOT POSITIV MARKØR (2 μL) | ANTISTOFF MOT NEGATIV MARKØR (2 μL) | ISOTYPE ANTISTOFFER TILSATT (2 μL) | TOTALT VOLUM ANTISTOFFER | VOLUM AV CELLESUSPENSJON LAGT TIL | VOLUM AV FARGEBUFFER LAGT TIL | ||
| CD90-FITC FMO-rør | - Anti-menneskelig CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | FITC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 5.5 Anti-human CD73 PerCP Cy | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO-rør | - Anti-menneskelig CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | PerCP Cy 5.5 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menneskelig CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO rør | - Anti-menneskelig CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | V450 IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - 5.5 Anti-human CD73-PerCP Cy | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO-rør | - Anti-menneskelig CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | APC IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menneskelig CD90-FITC | ||||||||
| - 5.5 Anti-human CD73-PerCP Cy | ||||||||
| CD45-PE FMO-rør | - Anti-menneskelig CD44-V450 | - | PE IgG1 isotype | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-menneskelig CD90-FITC | ||||||||
| - 5.5 Anti-human CD73-PerCP Cy | ||||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||||
Tabell 5: FMO-kontrollprøver. Forkortelser: FMO = fluorescens minus en; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
| TUBE TYPE | ANTISTOFF MOT POSITIV MARKØR (2 μL) | ANTISTOFF MOT NEGATIV MARKØR (2 μL) | TOTALT VOLUM ANTISTOFFER | VOLUM AV CELLESUSPENSJON LAGT TIL | VOLUM AV FARGEBUFFER LAGT TIL | |
| Blandet rør 1 | - Anti-menneskelig CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-menneskelig CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||
| Blandet rør 2 | - Anti-menneskelig CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-menneskelig CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-human CD105-APC | ||||||
Tabell 6: Prøvetak for flerfarget immunfenotyping av SHED. Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner; PE = phycoerythrin.
| TUBE TYPE | ANTISTOFF MOT POSITIV MARKØR (3 μL) | ANTISTOFF MOT NEGATIV MARKØR (3 μL) | TOTALT VOLUM ANTISTOFFER | VOLUM AV CELLESUSPENSJON LAGT TIL | VOLUM AV FLEKKBUFFER LAGT TIL | |
| Blandet rør 1 | - Anti-menneskelig CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Blandet rør 2 | - Anti-menneskelig CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tabell 7: Enkeltcellesorteringsreaksjonsrør. Forkortelser: FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
5. Enkeltcelle sortering
- Forberedelse av cellesortering
- Monter en 100 μm dyse i sorteringen.
MERK: Den riktige dysen er minst fem ganger diameteren til partikkelen som skal sorteres. Hylstervæsken som skal brukes til sortering må avgjøres basert på prøvetypen og følsomheten til eksperimentet; For dette eksperimentet har proprietær kappevæske blitt brukt. - Utfør den daglige instrumentkvalitetskontrollen (QC) og sett opp sorteringen for eksperimentet. Se instrumenthåndboken for en detaljert veiledning om instrumentoppsett.
- Monter en 100 μm dyse i sorteringen.
- Definere kompensasjonsmatrisen
- Angi kompensasjonsmatrisen ved hjelp av kompensasjonsrør med én flekk fra trinn 4.2.
- I den proprietære programvaren velger du Eksperiment fra verktøylinjen og klikker på Kompensasjonsoppsett. Åpne Opprett kompensasjonskontroller.
- Sjekk markørene og bekreft. Et nytt eksemplar er lagt til med navnet "Compensation" der nye rør kalt markørkontrollene legges til automatisk av programvaren.
- Velg Unstained-røret og kjør det for å registrere 5 000 hendelser. Dra porten til populasjonen av celler, og bruk den på alle kompensasjonskontroller. Dette er for å stille inn spenninger og negativ port for hver fluorescerende parameter.
- På samme måte laster du kompensasjonsrørene med en flekk separat, og registrerer og lagrer dataene. Velg porten som avgrenser populasjonen av interesse, og bruk for alle kompensasjonskontroller. Dette er for å stille inn de positive portene for hver fluorescerende parameter.
- Velg Eksperiment fra verktøylinjen og klikk på Beregn kompensasjonsverdier | lenke og lagre.
MERK: Når auto-comp-matrisen er generert ved hjelp av programvaren, kan spenningsparametrene til fluorokromene ikke endres for noen av kanalene i blandede rør.
- Innsamling av data
- Registrer 10 000 celler i hvert rør fra trinn 4.3. og 4,4 for å samle inn data for analyse av immunfenotypen til cellene.
- Klargjøring av oppsamlingsanordningene
- Avhengig av formålet med de sorterte cellepopulasjonene, velg mellom 6-brønn, 24-brønn, 48-brønn eller 96-brønnplater.
- Belegg brønnene med 200-500 μL FBS og hold platene uforstyrret i 2 timer.
- Etter 2 timer, fjern gjenværende FBS og tilsett 200-500 μL 10% MSC kulturmedier.
- Cellesortering i enkeltcellesorteringsmodus
- Kjør blandet rør 1 (fra trinn 4.5), og registrer 10 000 hendelser for å angi portene på populasjonen av interesse som skal sorteres, ved hjelp av riktig gating-strategi.
- Legg i en oppsamlingsplate og angi målcellenumre mellom 2 500 og 5 000 celler / brønn og velg den encellede sorteringsrenhetsmasken.
- Samle de sorterte populasjonene i innsamlingsenheten og hold dem på is til slutten av sorteringseksperimentet.
- Når du er ferdig, overfør platene til 5% CO2 -inkubatoren for å opprettholde kulturene ved 37 ° C.
MERK: Etter anskaffelsen ble rådatafiler eksportert som .fcs-filformat (v.3.0. og utover). Sorteringsrapportene som ble generert etter hvert eksperiment, registrerte antall hendelser/celler sortert per tilordnet brønn og indikerte antall konflikter som ble avbrutt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHED-ene ble karakterisert med standard immunfluorescensanalyser som viste uttrykket av vimentin (rødt, type III intermediære filamenter), aktinfilamenter (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) og kjerner farget med DAPI (figur 1A). For å estimere deres proliferative og kolonidannende kapasiteter ble det utført standard kortsiktige cellevekstanalyser. En 14,3 ganger økning i spredningsrate fra dag 2 til dag 8 er vist i figur 1B. De klonogene egenskapene til SHEDene ble bestemt fra CFU-F-analysene vist i figur 1C-E. I henhold til ISCT-kriteriene var de multipotente MSC-ene i stand til å differensiere i de tre mesodermale avledede linjene. Cytokjemisk farging med olje rød O ble brukt til å påvise oljedråpene i de differensierte adipocytter (figur 1F); von Kossa-farging ble brukt til å farge kalkavleiringene som ble funnet i matrisen til de differensierte osteoblastene (figur 1G); og aggrekanerne i 3D-kulturen ble farget for Alcian Blue i de differensierte kondroblastene (figur 1H).
For å karakterisere immunfenotypen til SHEDene ble det satt multiparametriske flowcytometrianalyser. Forsøkene ble utført sammen med bruk av fire typer eksperimentelle kontroller, nemlig kompensasjonskontroller (tabell 4), FMO og isotypekontroller (tabell 5) og ufargede kontroller. Isotypene av alle MSC- og HSC-antistoffene som ble brukt ble tilsatt sammen med FMO-rørene for å diskriminere positive versus negative signaler og høyt versus svakt antigenuttrykk. Figur 2A viser fordelingen av FMO og isotypekontrollene som ble brukt per eksperiment. De representative tetthetsplottene viste ingen uttrykk for FITC-isotypen av CD90 FITC-antistoffer. På samme måte sammenlignet histogramoverleggene (figur 2B) uttrykksnivåene til de fargede prøvene sammen med deres kontroller i de respektive kanalene til FITC, PerCP Cy5.5 og PE. Positivt uttrykk for markørene CD90 og CD73 (røde histogrammer) og negativt uttrykk for CD45 er sammenlignbare med de ufargede kontrollene og FMO-kontrollene (henholdsvis blå og svarte histogrammer).
Væskestrømscytometribasert karakterisering av immunfenotypene har vist markørfordeling fra en av de tidlige passasjene (P6) SHEDs (figur 3A-H). Både ISCT-anbefalte markører og CD44 bestemte foreldrepopulasjonene som MSC-er. Den tetrapositive populasjonen demonstrert i tetthetsplottene viste ≥98 % ekspresjon av CD90+CD73+CD105+CD44+ og ≤2 % ekspresjon av CD45-markører. Mer enn fem uavhengige eksperimenter viste lignende resultater. SHED-ene (P12), som viste differensialuttrykk for de positive markørene, ble valgt for encellesortering av høy- og dimmekspressorer (figur 4A-H). Etter gatingstrategien (figur 4H) ble singleter→ Levende celler→ Ikke-HSC→ Dobbelt positive CD73+CD90+ og enkeltpositive CD73+CD90- populasjoner sortert ved hjelp av encellesorteringsmodus. De sorterte populasjonene ble samlet i 96-brønn/48-brønn/6-brønns plateoppsett med ulikt såingsantall per brønn (tilleggsfil 1). Tre påfølgende forsøk ble gjort i en enkelt fase av sorteringseksperimenter, og overlevelsesevnen til celler etter sortering (i de dobbeltpositive ekspressorene: CD90 + CD73 +) per eksperiment var 100%. Tre uavhengige faser av eksperimenter er gjennomført. Vi matchet antall celler som vokste per brønnpost sortering til antall celler sortert per brønn.
Figur 5A viser CD90 + CD73 + postsorterte celler samlet i 96-brønnplaten viste adherens og spredning som deres foreldrepopulasjon. De sorterte cellene har blitt observert å nå 70-80% konfluens på den sjette dagen etter sortering. De adherde og prolifererende ettersorterte cellene ble differensiert i nærvær av adipogene vekstfaktorer og deretter farget etter dag 15 med olje rød O ved hjelp av passende ettersorterte kontrollceller (udifferensierte) celler også (figur 5B,C).
Figur 1: Karakterisering av stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner. (A) Immunfluorescensfarging bekrefter at de isolerte MSCene uttrykker vimentin (røde, type III mellomliggende filamenter), aktinfilamenter (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) og DAPI (blå, kjerner). Fotomikrograf oppnådd ved original forstørrelse på 20x. Skala bar = 10 μm. (B) Kortsiktig cellevekstanalyse av SHEDs viser sin høye proliferative kapasitet, som observert ved den signifikante økningen i antall celler i kultur innen dag 2 og en 14,3 ganger økning i proliferasjonshastighet ved slutten av dag 8 (n = 3, p-verdi <0,01). Feilfelt for standardavvik er vist. (VG Nett) CFU-F-analyse og krystallfiolett farging bekrefter kolonidannende evne til SHEDs; (C) flere kolonier forventes å dannes etter 14 dager i kultur; (D) enkelt klonogen koloni som stammer fra en enkelt celle; (E) Krystallfiolettfarget enkeltkoloni av SHEDs viser den typiske fibroblastlignende morfologien til cellene. (VG Nett) MSC under egnede in vitro-forhold forventes å gjennomgå differensiering i adipogene, osteogene og kondrogene linjer innen dag 21. Cytokjemisk farging viser (F) Oil Red O (innfelt viser 40x bilde av adipocytt som viser oljedråper), (G) von Kossa og (H) Alcian Blue-farging for henholdsvis adipogene, osteogene og kondrogene linjer på dag 22. Fotomikrografer oppnås ved en original forstørrelse på 20x. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: MSC = mesenkymale stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; SHEDs = stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner; CFU-F = kolonidannende enhet-fibroblast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Negative kontroller brukt i multiparametrisk eksperiment . (A) Fluorescens Minus One-kontroller har blitt vist i tabellform, der FMO-kontroller er erstattet av deres spesifikke isotyper. De representative tetthetsplottene (venstre til høyre) viser den ufargede kontrollen (venstre), FMO av CD90 FITC (midten) med alle antistoffer tilsatt unntatt CD90 FITC sammen med tillegg av CD90 FITC isotype, og fullt farget prøve med alle antistoffer av panelet lagt til (høyre). (B) Histogramoverlegg representerer sammenligningen av tre typer prøver, svart representerer FMO, blått representerer ufarget og rødt representerer fullt fargede prøver i sine respektive kanaler. Forkortelser: FMO = fluorescens minus en; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PerCP = peridinin-klorofyll-protein; PE = phycoerythrin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Multiparametrisk immunfenotyping av SHEDs (P6). (A) SSC-A versus FSC-A: Basert på deres side- og fremoverspredningsegenskaper, er celler av interesse inngjerdet og skilt fra rusk; (B) FSC-H versus FSC-A og (C) SSC-H versus SSC-A: De to tomtene brukes til dublettdiskriminering, noe som gjør det mulig å velge singleter samtidig som aggregater som kan generere falske positive signaler, elimineres; (D) SSC-A versus CD45 PE: Eksklusjonsgating gjør det mulig å velge CD45-populasjonen fra singletene; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 versus CD90 FITC: Fra CD45- live-singleter er CD90+CD73+-celler gated; (F) CD44 V450 versus CD105 APC: CD90 + CD73 + populasjonen, er videre inngjerdet for å definere de tetra-positive CD90 + CD73 + CD44 + CD105 + celler; (G) SSC-A versus Time(s): Plottet skildrer den stabile anskaffelsen over tid (sekunder) og at ingen hendelser forårsaket trykksvingninger under oppkjøpet; (H) Gating hierarki. Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Encellesortering av immunfenotypede SHEDs (P12). (A-F) En trinnvis eksklusjonsbasert gating-strategi for å sortere rene MSCer i følgende sekvensielle rekkefølge: Celler til singlets_1, til singlets_2, til DAPI- levende celler, til CD45- ikke-hematopoietiske celler, og til slutt til CD90 + CD73 + celler. De inngjerdede populasjonene vist i (F) ble sortert ved hjelp av encellet sorteringsmodus. (G) SSC-A versus Time(s)-plottet beskriver uavbrutt sortering av prøvene. (H) Gating hierarki. (n=3, sorteringseffektivitet = 100 %). Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner; MSC = mesenkymale stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein; SSC-A = side scatter-peak område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Morfologisk og funksjonell karakterisering av ettersorterte SKUR. (A) Fasekontrastbilder av postsorterte populasjoner ble samlet i en 96-brønnsplate på dag 6 ved en opprinnelig forstørrelse på 10x, skalabar = 10 μm (innfelt viser et 20x bilde som viser de sorterte enkeltcellene som endrer morfologi til fibroblastlignende MSC). Cytokjemisk farging for adipogen differensiering ved bruk av olje rød O observert i (B) udifferensiert (kontroll) og (C) differensiert postsorteringspopulasjon ved en opprinnelig forstørrelse på 20x, skala bar = 10 μm (innfelt viser et 40x bilde som viser de observerte oljedråpene). Forkortelser: SHEDs = stamceller fra humane eksfolierte løvfellende tenner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Kompilerte sorteringsrapporter generert per eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Optisk konfigurasjon av BD FACSAria Fusion. Forkortelser: LP = lang pass; PMT = fotomultiplikator rør; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innen vevsteknikk og regenerativ medisin, blant de postnatale kildene, har orale vevsavledede MSCer tiltrukket dyp interesse på grunn av deres minimale etiske forpliktelser og bemerkelsesverdige multilineage differensieringspotensial21. Dental pulp stamceller (DPSCs) fra den berørte tredje molar og SHEDs har fått mest oppmerksomhet blant dental MSCs for deres terapeutiske potensial i nevrodegenerative og traumatiske sykdommer22. Protokollen beskrevet i dette manuskriptet bidrar til å karakterisere SHEDs ved hjelp av en multiparametrisk tilnærming og videre sortere populasjoner av interesse ved hjelp av enkeltcellesorteringsmetoden. Anvendelsen av denne protokollen er imidlertid ikke bare begrenset til orale MSC-er, men kan også brukes til immunfenotyping og sortering av MSC fra andre kildevev i menneskekroppen23.
Flere kritiske trinn i denne protokollen må diskuteres her for en vellykket implementering for det biologiske problemet som tas opp. Nøkkelen til hver sorteringsprotokoll er å sjekke to viktige komponenter: dens biologiske kontroller og eksperimentelle kontroller. Til å begynne med sikrer vedlikehold av ren kultur at prøven som brukes ikke blir kompromittert mens den sorteres. Cellens levedyktighet i forsorteringen av encellede suspensjoner skal sikre at mer enn 70 % levedyktige cellepopulasjoner startes med, etterfulgt av analyse og sortering av friske delpopulasjoner. Flekkbufferen som brukes i encelleopphenget skal inneholde 2% FBS og eksperimenter gjøres best ved romtemperatur. Valg av riktig sammenløp av disse primære cellene (80-85% sammenløp) unngår å kompromittere deres celle levedyktighet og reduserer sjansene for store aggregater. I tillegg er bruk av en levende / død markør (DAPI i denne protokollen) avgjørende for hvert sorteringseksperiment. I denne studien, da prøvene som ble brukt var MSC-er med en omtrentlig diameter på 20-35 μm, var den valgte dysestørrelsen 100 μm for å sortere dem ved et trykk på 20 psi på BD FACSAria Fusion. Dette tillot cellesortering uten å kompromittere cellens levedyktighet under prosessen ved lavere kappetrykk. For detaljerte sorteringsoppsettforhold anbefales det å referere til programvaren BD FACSDiva guide24.
En viktig forutsetning for flerfargede eksperimenter i flowcytometri er behovet for hensiktsmessige kontroller; Det er fire hovedtyper av kontroller som brukes her: autofluorescens, isotyper, FMO og kompensasjonskontroller. Den automatiske kompensasjonsmatrisen tillot nøyaktig kompensasjon, forhindret spektral blødning i detektorene, og brukte både kompensasjonsperler og celler til dette formålet. Den ufargede prøven satte terskelen for autofluorescens av MSC. De blandede rørene med alle fire antistoffene inkluderer isotypen og FMOene til hvert antistoff som brukes. DAPI-kompensasjonskontroll ble utført ved hjelp av MSC-er, som ble behandlet separat (med varmesjokk). Antistoffpanelet (som angitt i tabell 8) som brukes her, er spesielt utviklet for hMSC basert på kriteriene angitt av ISCT og instrumentkonfigurasjonen til BD FACSAria Fusion cellesorterer (se tilleggstabell S1). Dette er svært viktig under planleggingen av multiparametriske flowcytometrieksperimenter. Karakteriseringspanelet som brukes til immunfenotyping består av fire positive MSC-markører (CD90, CD105, CD73 og CD44) og en negativ markør (CD45). I kontrast inneholder panelet for sorteringseksperimentet to positive markører (CD90 og CD73), en negativ markør (CD45) og en levende / død markør (DAPI) for å sikre et høyt antall levende MSC-er.
| Antistoff/markør | Fluorokrom | hMSC overflateprofil | Laser bølgelengde (nm) | Eksitasjonstopp (nm) | Utslippstopp (nm) |
| CD44 | V450 | Skal uttrykke; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 | FITC | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 | PE | Skal IKKE uttrykke <2% | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Markør for død celle | 405 | 358 | 461 |
Tabell 8: Flerfarget panel designet for karakterisering og sortering av SHEDs etter flowcytometri. Forkortelser: FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
Valg av sorteringsrenhetsmaske
Tatt i betraktning uforutsigbarheten av cellulær heterogenitet i MSC, kan bulksortering ikke nødvendigvis oppnå renhetsnivået blant de sorterte populasjonene. Vi optimaliserte enkeltcellesorteringsprotokollen i denne studien for å identifisere encellede kloner og spore deres funksjonelle egenskaper etter sortering når det gjelder styrke. Encellesortering ble utført på en BD FACSAria Fusion, som hadde fleksibiliteten til følgende innstillinger: valg av 100 μm dyse, 20 psi kappetrykk, en strømningshastighet som er justerbar (opprettholdt ved 20 μL / min) og terskelhastighet ved 380 hendelser / s. Sjansene for å velge to målceller i stedet for en er minimale i denne metoden. Normalt velges algoritmens encellesorteringsmodus som kan løse sorteringen av rene populasjoner av målceller og vurdere hvor mange dråper som skal sorteres i den valgte innsamlingsanordningen. Presisjonsmodusen bør til slutt velges nøyaktig slik at den kan kombinere maskene som er tilgjengelige i sorteringsalgoritmene og skape en streng sorteringsbetingelse for å sortere de reneste populasjonene av interesse. Enkeltcellesorteringsmodus går ikke på akkord med en målcelle hvis den aggregeres til en ikke-målcelle under sortering, og det oppnår renhetsnivået vi ser frem til i denne tilnærmingen. Dette var modulen som ble valgt i denne protokollen, og de sorterte cellene ble samlet i 96-brønn, 48-brønn, 24-brønn og 6-brønns plateanordninger.
I denne studien sorterte vi subpopulasjoner basert på deres differensielle immunfenotype, nemlig CD90+CD73+CD45-. I både karakteriserings- og sorteringsprotokoller har vår gatingstrategi (som vist i figur 3 og figur 4) vært basert på eksklusjon fra CD45-populasjonen for å gi oss den ikke-hematopoietiske populasjonen (slik disse har blitt validert og karakterisert før med ISCT-foreskrevne markører), etter identifisering av singleter. Til slutt ble MSC-ene identifisert fra CD45-populasjonen ved hjelp av de positive ISCT-markørene. Det er her verdt å merke seg at det ikke er stor prosentforskjell i først de positive uttrykkene av ISCT-markører etterfulgt av de negative uttrykkerne av CD45. Men siden formålet med denne sorteringen har vært å identifisere celler som viser endret uttrykk av de kjente MSC-markørene, har vi avsluttet analysen med de positive uttrykksplottene.
I de representative tallene er 97% av CD45-cellene MSC, men under kvantifisering av antigenuttrykkene har vi sett at 75% av cellene er dobbeltpositive ekspressorer av de to markørene CD90 og CD73, mens det er flere populasjoner som er enkeltpositive ekspressorer av de samme markørene (vist i figur 3F) og få celler som ikke uttrykker markørene i det hele tatt.
Under karakteriseringen av disse cellene har vi identifisert subpopulasjonene som tetra-positive MSC, trippel-positive og dobbelt-negative populasjoner. Dette differensialuttrykket av MSC-markører utvides med økende passasjer, og dermed kommer behovet for å studere og korrelere denne forskjellen med deres funksjonelle egenskaper. Det endelige formålet med å sortere MSC i vår studie er å lage en komparativ analyse mellom de identifiserte delpopulasjonene og avgjøre om differensialuttrykkene til positive markører har funksjonelle implikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt angående publiseringen av dette papiret.
Acknowledgments
Vi takker Flow Cell Facility ved Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, India, for bruken av kjernefasiliteten for flowcytometri. Kryosnittingen av pelletskulturen av differensierte celler ble utført ved Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, India. Dette arbeidet ble støttet av UCs intramurale finansiering fra Manipal Academy of Higher Education (MAHE), India. AG er takknemlig for støtten fra Dr. T. M. A. Pai-stipendet fra MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
