Summary
Detta protokoll beskriver användningen av fluorescensaktiverad cellsortering av humana mesenkymala stamceller med hjälp av encellssorteringsmetoden. Specifikt kan användningen av encellssortering uppnå 99 % renhet av de immunfenotypade cellerna från en heterogen population i kombination med ett multiparametriskt flödescytometribaserat tillvägagångssätt.
Abstract
De mesenkymala stamcellerna (MSC) i en organism har en extraordinär förmåga att differentiera till flera linjer av vuxna celler i kroppen och är kända för sina immunmodulerande och antiinflammatoriska egenskaper. Användningen av dessa stamceller är en välsignelse för området regenerativ biologi, men samtidigt en förbannelse för regenerativ medicin och terapi på grund av de många cellulära tvetydigheter som är förknippade med dem. Dessa oklarheter kan bero på mångfalden i källan till dessa stamceller och på deras in vitro-tillväxtförhållanden , som båda återspeglar deras funktionella heterogenitet.
Detta motiverar metoder för att tillhandahålla rena, homogena populationer av MSC för terapeutiska tillämpningar. Framsteg inom flödescytometri har gjort det möjligt att detektera encelliga populationer med hjälp av ett multiparametriskt tillvägagångssätt. Detta protokoll beskriver ett sätt att identifiera och rena stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder (SHED) genom fluorescensassisterad encellssortering. Samtidig expression av ytmarkörer, nämligen CD90-fluoresceinisotiocyanat (FITC), CD73-peridinin-klorofyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC) och CD44-V450, identifierade de "ljusa", positiva uttryckarna av MSC med hjälp av multiparametrisk flödescytometri. En signifikant minskning observerades dock i procentandelar av fyrdubbla uttryckare av dessa positiva markörer från passage 7 och framåt till de senare passagerna.
De immunfenotypade subpopulationerna sorterades med hjälp av encellssortering där endast två positiva och en negativ markör utgjorde inklusionskriterierna. Denna metod säkerställde cellviabiliteten hos de sorterade populationerna och bibehöll cellproliferation efter sortering. Nedströmsapplikationen för sådan sortering kan användas för att utvärdera härstamningsspecifik differentiering för de inhägnade delpopulationerna. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på andra encellssystem för att förbättra isoleringsförhållandena och för att samla in information om flera cellytmarkörer.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) kan betraktas som en skalbar källa till celler som är lämpliga för cellbaserade terapier och kan betraktas som ett guldstandardsystem inom regenerativ medicin. Dessa celler kan isoleras från en mängd olika källor i kroppen med olika vävnadsursprung1. Beroende på deras källvävnad uppvisar varje typ av MSC ett tvetydigt in vitro-beteende 2. Detta är väl observerat i deras morfologiska och funktionella egenskaper3. Flera studier har visat intraklonal variation i dimensioner, inklusive vävnadsdifferentiering hos vuxna, genomiskt tillstånd och metabolisk och cellulär arkitektur för MSC 2,4.
Immunofenotypning av celler har varit en vanlig tillämpning av flödescytometri för identifiering av stamceller och detta användes av International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) 2006 för att föreskriva en lista med minimikriterier för att identifiera celler som MSC. Den uppgav att tillsammans med plastisk vidhäftning och förmågan att differentiera i tre linjer (osteogen, kondrogen och adipogen) in vitro, måste ≥95% av cellpopulationen uttrycka CD105, CD73, CD90, och dessa celler måste sakna uttrycket (≤2% positiva) av CD34, CD45, CD11b, CD14 och HLA-DR, mätt med flödescytometri5. Även om MSC definierades av en uppsättning biomarkörer enligt ISCT:s minimikriterier, kunde deras immunegenskaper inte jämföras med dessa biomarkörer och det fanns ett behov av mer utöver dessa kriterier för att göra jämförelser mellan studier och klonala variationer lättare att kvantifiera.
Trots de riktlinjer som fastställts av ISCT har omfattande forskning om MSC visat att heterogenitet existerar i denna population, vilket kan uppstå på grund av en mängd faktorer, främst på grund av den allestädes närvarande heterogeniteten som uppstår mellan MSC-donatorer6, vävnadskällor7, enskilda celler inom en klonal population8 och odlingsförhållanden2,9, 10. veckor Karakterisering och rening av dessa primära celler från en mängd olika vävnadskällor för att säkerställa kvalitet och cellöde är viktiga steg i deras produktion. Behovet av att förstå de uppvisade variationerna bland populationen kräver en effektiv metod för att dela upp den i delpopulationer som kan delas upp och samlas in separat11. Analyser på encellsnivå hjälper till att övervinna utmaningarna med cell-cellvariation, minska biologiskt brus som uppstår från en heterogen population och erbjuder möjligheten att undersöka och karakterisera sällsynta celler12.
Utifrån syfte och valda parametrar kan flera metoder användas för att sortera och berika de utvalda populationerna. Cellsorteringstekniker kan omfatta både bulksortering och encellssortering. Medan bulksortering kan berika målpopulationer genom magnetaktiverad cellsortering (MACS)13, fraktionering 14 och eluering15, kan encellssortering berika mer homogena populationer med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)11. En jämförande analys av var och en av dessa metoder med sina egna för- och nackdelar visas i tabell 1.
Tabell 1: Jämförande analyser av olika tekniker: MACS, Fractionation, Elutriation och FACS som belyser skillnaderna i deras princip och fördelarna och nackdelarna med att välja en viss teknik framför en annan. Förkortningar: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Sedan teknikens tillkomst har encellsflödescytometri spelat en viktig roll i uppräkning16, detektion och karakterisering av en specifik cellpopulation i ett heterogent prov17. Hewitt et al. lade 2006 grunden för automatiserade cellsorteringsmetoder för att förbättra isoleringen av homogena pooler av differentierade mänskliga embryonala stamceller (hESC)18. Encellssortering berikade populationen av GFP-transducerade hESCs och underlättade isoleringen av genetiskt modifierade kloner, vilket öppnade en ny dimension i klinisk forskning. För att förbättra sorteringseffektiviteten har man i allmänhet använt sig av två tillvägagångssätt; Antingen modifieras insamlingsmedierna för de sorterade populationerna för att upprätthålla livsdugligheten och spridningen av eftersorterade celler19 eller så modifieras cellsorteringsalgoritmen/cellsorteringsprogramvaran på lämpligt sätt12.
Med teknikens framsteg har kommersiella flödescytometrar och cellsorterare kunnat hjälpa till att ta itu med utmaningar som uppfylldes vid aseptisk sortering av ömtåliga och sällsynta cellpopulationer, särskilt stamceller av olika ursprung. En av de största utmaningarna för stamcellsbiologer har varit klonal isolering av humana pluripotenta stamceller enligt transfektionsprotokoll som krävs i genredigeringsstudier19. Detta åtgärdades genom att sortera enskilda celler i 96-brunnars plattor som belades med musembryonala fibroblaster (MEF) tillsammans med kosttillskott och kommersiella småmolekylära ROCK-hämmare. Cellisoleringsstrategier kan dock till stor del förfinas med hjälp av indexsortering, en funktion i sorteringsalgoritmen som identifierar immunfenotypen hos enskilda celler sorterade12. Denna förfinade modalitet i encellssortering bidrog inte bara till att förbättra sorteringseffektiviteten för stamceller, särskilt med avseende på sällsynta hematopoetiska stamcellspopulationer, utan länkade också effektivt encelliga kloner till deras nedströms funktionella analyser20.
Denna artikel fokuserar på encellssortering av immunfenotypade stamceller från humana exfolierade mjölktänder (SHED) för anrikning av subpopulationer för att studera deras funktionella differentieringskapacitet. Med hjälp av en kombination av två MSC-positiva markörer, CD90 och CD73, och en negativ hematopoetisk markör CD45, immunofenotypades MSC och dim- och nolluttryckarna identifierades. Baserat på deras immunfenotyp identifierades subpopulationerna som rena MSC, enkla positiva och dubbelnegativa populationer. De sorterades med hjälp av encellssorteringsläget för att erhålla rena och berikade subpopulationer för ytterligare funktionella studier för att identifiera om det differentiella uttrycket av markörer var en artefakt av in vitro-odlingsförhållanden eller om det också har någon effekt på de funktionella egenskaperna. Celler som inte var homogena uttryckare av de "positiva MSC-markörerna" sorterades för att studera deras funktionella egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt godkännande och samtycke till att delta: Humana exfolierade lövfällande tandmassaprover mottogs efter att ha erhållit informerat samtycke och fullständigt etiskt godkännande av Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, i enlighet med de standarder som fastställts av Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Därefter godkändes isolering, odling, underhåll och applicering av SHEDs av och i enlighet med de riktlinjer som rekommenderas av Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) vid Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Se materialtabellen för detaljer om alla material och reagenser som används i detta protokoll.
1. Beredning av reagenser och buffertar
- För kulturunderhåll
- Bered MSC-cellodlingssubstrat (10 %) med hjälp av basalmedium för odifferentierade hESC, 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % L-glutamin och 1 % penicillin-streptomycin (Pen-streptokocker) (tabell 2).
- Bered MSC-cellodlingsmedia (20 %) med basalmedium för odifferentierade hESC, 20 % FBS, 1 % L-glutamin och 1 % Pen-streptokocker (tabell 2).
- Bered neutraliserande medier med basalmedium för odifferentierade hESC, 1 % L-glutamin och 1 % antibiotisk-antimykotika (Anti-Anti) (tabell 2).
- För flödescytometrisk analys och sortering
- Förbered färgningsbuffert med 2 % FBS i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Bered en stamlösning av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 μg/ml) genom att tillsätta 1 μl i 1 ml PBS
- För härstamningsspecifik differentiering av MSC
- Förbered differentieringsmedier för osteogen, kondrogen och adipogen differentiering enligt sammansättningen som beskrivs i tabell 3. Förvara de beredda alikvoter vid 4 °C under hela försöket.
- Bered serumsvältande media (2 % media) med basalmedium för odifferentierade hESC, 2 % FBS, 1 % L-glutamin och 1 % Pen-strep (tabell 2).
| TYP AV MEDIA | SYFTET MED MEDIA | SAMMANSÄTTNING FÖR 50 ml | ||||||||
| FBS (på engelska) | Pen-Streptokocker | L-glutamin | BASALT MEDIUM FÖR ODIFFERENTIERADE hESC | |||||||
| 10 % media | MSC-kultur och underhåll | 5 ml | 500 μL | 500 μL | 44 ml | |||||
| 20 % media | CFU-F-analys | 10 ml | 500 μL | 500 μL | 39 ml | |||||
| Serumsvältande (2%) media | Media för kontrollbrunnar i differentieringsprotokoll | 1 ml | 500 μL | 500 μL | 48 ml | |||||
| Neutralisera media | Medium för neutralisering av cellsuspensionen efter trypsinisering | - | 500 μL | 500 μL | 49 ml | |||||
Tabell 2: Cellodlingsmedier för underhåll och analyser av odlingar. Förkortningar: MSC = mesenkymal stamcell; CFU-F = kolonibildande enhetsfibroblast.
| KOMPONENTER | OSTEOGENA MEDIER | KONDROGEN MEDIA | ADIPOGENA MEDIER |
| Basala medier | 90 ml | 90 ml | 90 ml |
| Induktionsmedia | 10 ml | 10 ml | 10 ml |
| Total volym | 100 ml | 100 ml | 100 ml |
Tabell 3: Differentieringsmedier för trilineagedifferentiering av SHED.
2. Odling och underhåll av SHEDs
- Behåll cellerna i 10 % MSC-odlingsmedia och utför mediebyten varannan dag eller vid behov.
- Trypsinisera celler vid 95 % sammanflöde med 0,25 % trypsin-EDTA.
- Neutralisera celler efter trypsinisering med hjälp av neutraliserande media.
- Centrifugera röret vid 300 × g i 6 minuter vid rumstemperatur för att få en cellpellet.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 % MSC-odlingssubstrat.
- Fröceller till nyberedda cellodlingsskålar innehållande 10 % MSC-odlingssubstrat för ytterligare experiment eller subkultur.
OBS: Optimal sådddensitet för SHEDs är 0,2 × 10 6 celler i en 100 mm skål och 0,8 × 10 6 celler i en T-75-kolv, för att erhålla 1,5 × 10 6 celler respektive 4 × 10 6 celler vid 90-100 % sammanflöde.
3. Karakterisering av MSC
- Analys av kortvarig celltillväxt
- Frö 4 × 104 celler/brunn i tre exemplar till 6-hålsplattor i 10 % MSC-odlingsmedia.
- Inkubera plattorna i 7 dagar vid 37 °C och byt media varannan dag.
- Skörda cellerna dag 2, 4 och 8 med 0,25 % trypsinbehandling och tvätta med odlingssubstrat.
- Centrifugera cellerna vid 300 g i 6 minuter vid rumstemperatur och återsuspendera pelleten i 1 ml medium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och bestäm deras livsduglighet med trypanblå uteslutningsmetoden.
- Beräkna spridningshastigheten med hjälp av ekvation (1):
Nej (1)
- Kolonibildande enhetsfibroblast (CFU-F) analys
- Frö 10 000 celler i en 100 mm skål och odla dem i 20 % MSC-odlingsmedium.
- Inkubera plattorna i 14 dagar vid 37 °C och byt medier var 3:e dag.
- Efter 14 dagar, skölj kolonierna med PBS, fixera dem med kristallviolett färgämne i metanol och skölj igen med PBS för att ta bort den kvarvarande fläcken.
- Räkna och avbilda kolonierna.
OBS: Räkna kolonier med >50 celler. Kolonibildande effektivitet beräknas som antal kolonibildande enheter.
- Immunofluorescensanalys
- Frö MSC på 35 mm skålar och låt dem växa till 80-90% sammanflöde.
- Ta bort mediet och skölj disken med PBS en gång.
- Fixera cellerna med 1 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) genom att antingen inkubera i 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Efter fixering, tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 min på vippan.
- Tillsätt 0,3 % Triton X-100 i PBST (0,05 % Tween 20-lösning i PBS) för permeabilisering av cellerna. Låt den ligga på vippan i 15 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 min på vippan.
- Tillsätt 3 % bovint serumalbumin (BSA) för blockering och låt det ligga på vippan i 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 min på vippan.
- Tillsätt 800 μl 1:500 utspädning av antivimentin från möss, låt den ligga på vippan i 1 timme i rumstemperatur och överför plattan till 4 °C för inkubation över natten.
- Nästa dag, ta bort den primära antikroppen och tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 minuter på vippan.
- Tillsätt 800 μl 1:1 000 utspädning av get-anti-mus IgG (H+L) korsadsorberad sekundär antikropp, Alexa Fluor 555, och låt den förvaras i 3 timmar i rumstemperatur på vippan.
- Tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 min på vippan.
- Tillsätt Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL i 1 000 μL PBS och inkubera i rumstemperatur i 60 minuter på vippan.
- Tvätta brunnarna med PBST i 3 x 5 min på vippan.
- Tillsätt 700 μL DAPI-monteringsmedel och observera cellerna i mikroskop.
- Ursprungsspecifik differentiering
- Differentiering efter 2D-kultur
- Ta två 48-brunnars plattor och märk dem som osteogena respektive adipogena linjer.
- Sådd 15 000 celler/brunn i fyra brunnar på varje platta och odla dem i 10 % MSC-odlingsmedia.
- När monolagret av celler har nått 90 % sammanflöde, märk de två första brunnarna som "Kontroll" och ersätt det befintliga mediet med serumsvältande media (2 % media). I de två sista brunnarna märkta som "Test", tillsätt differentieringsmedier av någon av de två linjerna, adipogena eller osteogena. Markera detta som dag 0.
- Byt försiktigt ut media var tredje dag för att undvika flagning och var noga med att undvika kontaminering.
- Upprätthåll dessa förhållanden till den tjugoförsta dagen; Bearbeta sedan för färgningsexperimentet.
- Differentiering efter 3D-kultur
- Ta två 15 ml rör för att utföra kondrogen differentiering med hjälp av 3D-pelletskultur.
- Överför 1 × 10 6 celler till varje rör och centrifugera vid 300 × g i6 minuter för att bilda en pellet. Märk ett rör som "Control" och tillsätt 10 % MSC-odlingsmedia till det; märk det andra röret som "Test" och tillsätt kondrogena differentieringsmedier. Placera rören försiktigt i inkubatorn med locken löst fastskruvade. Markera detta som dag 0.
- Byt media var tredje dag noggrant, för att inte lossna/sönderdela pelleten under mediabyten.
- Behåll dessa förhållanden till den tjugoförsta dagen och bearbeta sedan cellerna för ytterligare experiment.
- Differentiering efter 2D-kultur
- Linjespecifik cytokemisk färgning
- För 2D-kulturer, använd de differentierade (test) och odifferentierade MSC-plattorna (kontroll) (från steg 3.4.1.5) för färgning, och ta först bort mediet och tvätta två gånger med PBS. Fixera cellerna med 4 % PFA i 30 minuter i rumstemperatur, ta bort supernaturanen och tvätta en gång med PBS. Utför färgning för varje härstamning enligt följande.
- För adipocythärstamning, tillsätt permeabiliseringslösning från satsen och inkubera plattan i 5 minuter vid rumstemperatur. Förbered och tillsätt 1 ml Oil red O arbetslösning och låt den stå i 10 minuter. Ta bort fläcken och tvätta fem gånger med destillerat vatten.
- För osteocythärstamning, tillsätt 5 % nyberett silvernitrat (i destillerat vatten) till varje brunn och håll plattan under UV i 1 timme. Ta bort lösningen och tillsätt 2,5% natriumtiosulfat för att avlägsna det oreagerade silvret; Låt stå i 5 min. Ta bort fläcken, tvätta två gånger med destillerat vatten och observera de färgade cellerna under ett mikroskop.
- För 3D-kulturer samlas pelleten upp efter utgången av differentieringsperioden från steg 3.4.2.3 och erhålls kryosektioner av den differentierade vävnaden i form av pelleten. Låt objektglasen lufttorka och ha rumstemperatur innan du fortsätter med färgningen.
- För kondrocythärstamning, följ anvisningarna i färgningssatsen för att tillsätta en tillräcklig volym tvättlösning, ta bort den, tillsätt fixeringslösningen och inkubera i 30 minuter. Tvätta med destillerat vatten, tillsätt färgningslösningen och inkubera i 30 minuter. Tvätta tre gånger med 0,1 N saltsyra; Tillsätt destillerat vatten för att neutralisera surheten. Observera de färgade cellerna under ett ljusfältsmikroskop.
- För 2D-kulturer, använd de differentierade (test) och odifferentierade MSC-plattorna (kontroll) (från steg 3.4.1.5) för färgning, och ta först bort mediet och tvätta två gånger med PBS. Fixera cellerna med 4 % PFA i 30 minuter i rumstemperatur, ta bort supernaturanen och tvätta en gång med PBS. Utför färgning för varje härstamning enligt följande.
Nej (1)4. Färgning av cellytan för immunofenotypning
OBS: Rekommenderade cellodlingsplattor för att få ett optimalt antal celler i steg 4.2-4.5 är 100 mm skålar eller T75-kolvar.
- Cellpreparation för flödescytometriska experiment
- Trypsinisera och samla upp cellerna från en skål/kolv och centrifugera vid 300 × g i 6 minuter för att erhålla cellpelleten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml medium och bestäm det livsdugliga cellantalet med hjälp av en hemocytometer enligt trypanblå uteslutningsmetoden.
- Centrifugera cellsuspensionen igen efter räkningen och tvätta pelleten ytterligare två gånger med 1 ml färgningsbuffert.
- Kassera supernatanten och återsuspendera slutligen pelleten i en lämplig volym av färgningsbufferten beroende på protokollet (se steg 4.2 till 4.5).
- Förberedelse av kompensationskontroller
- Ta sju FACS-rör och märk dem som Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 och APC.
- Återsuspendera den slutliga pelleten i färgningsbufferten (se steg 4.1) med en celldensitet på 0,5 × 106 celler per 50 μL per rör för ofärgade och DAPI-rör.
- Förbered de enfärgade rören för kompensation enligt beskrivningen i tabell 4.
- Virvla försiktigt varje rör efter beredning och inkubera i mörker i 30 minuter.
- Efter inkubationen, ge två tvättar genom att tillsätta 1 ml färgningsbuffert till varje rör, följt av kort vortexing och centrifugering vid 200 g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 μL färgningsbuffert och ställ den åt sidan tills den förvärvas.
- För DAPI-röret, utför värmechockbehandling genom att inkubera det i ett 60 °C vattenbad i 5 minuter följt av 15 minuter på is. Tillsätt 5 μl DAPI till suspensionen och håll den mörk tills körningen förvärvas.
- Beredning av fluorescenskontroller minus en (FMO)
- Återsuspendera den slutliga pelleten i färgningsbuffert (se steg 4.1) med en celldensitet på 0,5 × 106 celler per 50 μL för varje rör.
- Ta fem FACS-rör och märk dem som CD44-V450 isotyp, CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5 isotyp och CD105-APC isotyp.
- Bered cell- och antikroppssuspensionen enligt tabell 5.
- Virvla rören försiktigt och inkubera dem i 30 minuter i rumstemperatur i mörker.
- Efter inkubationen, ge två tvättar med 1 ml färgningsbuffert till varje rör följt av kort virvelning och centrifugering vid 200 g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 μL färgningsbuffert och ställ den åt sidan tills den förvärvas.
- Beredning av prover för analys
- Återsuspendera den slutliga pelleten i färgningsbufferten (se steg 4.1) med en celldensitet på 0,5 × 106 celler per 50 μL för varje rör.
- Ta två FACS-rör och märk dem som blandade rör 1 och 2.
- Bered cell- och antikroppssuspensionen enligt tabell 6.
- Virvla rören försiktigt och inkubera dem i 30 minuter i rumstemperatur i mörker.
- Efter inkubationen, ge två tvättar med 1 ml färgningsbuffert till varje rör följt av kort virvelning och centrifugering vid 200 g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 μL färgningsbuffert och ställ åt sidan tills den tas upp.
- Beredning av prover för encellssortering
- Ta två FACS-rör, tillsätt 1 ml FBS och rulla röret runt tills ett jämnt lager FBS bildas på insidan av varje rör. Inkubera detta i 1-2 timmar medan du bearbetar provet för färgning. Märk dessa rör som blandade rör 1 och 2.
- Återsuspendera den slutliga pelleten i färgningsbufferten (se steg 4.1) med en celldensitet på 2-3 × 106 celler per 50 μL för varje rör.
- Bered cell- och antikroppssuspensionen i blandade rör 1 och 2 enligt tabell 7.
- Virvla rören försiktigt och inkubera dem i 30 minuter i rumstemperatur i mörker.
- Efter inkubationen, ge två tvättar med 1 ml färgningsbuffert till varje rör följt av kort virvelning och centrifugering vid 200 g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 μL färgningsbuffert och ställ åt sidan. Tillsätt 5 μL DAPI 15 min före sortering.
OBS: Observera att för sorteringsexperiment rekommenderas högre celltäthet per rör.
| Typ av rör | Positiva Comp Pärlor* | Negativa Comp Pärlor* | Celler | Antikropp tillsatt | |
| Fitc-rör | 1 droppe | 1 droppe | – | CD90-FITC (2 μL) mot människa | |
| V450 rör | 1 droppe | 1 droppe | – | Anti-human CD44-V450 (2 μL) | |
| PerCP-Cy 5.5-rör | 1 droppe | 1 droppe | – | Antihumant CD73-PerCP Cy 5,5 (2 μL) | |
| PE-rör | 1 droppe | 1 droppe | – | Anti-human CD45-PE (2 μL) | |
| APC-rör | 1 droppe | 1 droppe | – | Anti-human CD105-APC (2 μL) | |
| DAPI-rör | – | – | 50 μL | – | |
| Ofärgat rör | – | – | 50 μL | – | |
| *1 droppe = 60 μL pärlsuspension | |||||
Tabell 4: Urval av kompensationskontroll. Förkortningar: Comp = kompensation; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
| TYP AV RÖR | ANTIKROPP MOT POSITIV MARKÖR (2 μL) | ANTIKROPP MOT NEGATIV MARKÖR (2 μL) | ISOTYPANTIKROPPAR TILLSATTA (2 μL) | TOTAL VOLYM AV ANTIKROPPAR | VOLYM CELLSUSPENSION TILLSATT | VOLYM AV FÄRGNINGSBUFFERT TILLSATT | ||
| CD90-FITC FMO-rör | - Anti-människa CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | FITC IgG1 isotyp | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD73 PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||||
| CD73-PerCP Cy5.5 FMO-rör | - Anti-människa CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | PerCP Cy 5.5 IgG1 isotyp | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||||
| CD44-V450 FMO-rör | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | V450 IgG1 isotyp | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||||
| CD105-APC FMO-rör | - Anti-människa CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | APC IgG1 isotyp | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| CD45-PE FMO-rör | - Anti-människa CD44-V450 | - | PE IgG1 isotyp | 10 μL | 50 μL | 40 μL | ||
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy 5.5 | ||||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||||
Tabell 5: Kontrollprover för FMO. Förkortningar: FMO = fluorescens minus ett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
| TYP AV RÖR | ANTIKROPP MOT POSITIV MARKÖR (2 μL) | ANTIKROPP MOT NEGATIV MARKÖR (2 μL) | TOTAL VOLYM AV ANTIKROPPAR | VOLYM CELLSUSPENSION TILLSATT | VOLYM AV FÄRGNINGSBUFFERT TILLSATT | |
| Blandat rör 1 | - Anti-människa CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||
| Blandat rör 2 | - Anti-människa CD44-V450 | Anti-human CD45-PE | 10 μL | 50 μL | 40 μL | |
| - Anti-human CD90-FITC | ||||||
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| - Anti-människa CD105-APC | ||||||
Tabell 6: Provrör för flerfärgad immunofenotypning av SHED. Förkortningar: SHEDs = stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder; PE = fykoerytrin.
| TYP AV RÖR | ANTIKROPP MOT POSITIV MARKÖR (3 μL) | ANTIKROPP MOT NEGATIV MARKÖR (3 μL) | TOTAL VOLYM AV ANTIKROPPAR | VOLYM CELLSUSPENSION TILLSATT | VOLYM AV FLÄCKBUFFERT TILLAGD | |
| Blandat rör 1 | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
| Blandat rör 2 | - Anti-human CD90-FITC | Anti-human CD45-PE | 9 μL | 50 μL | 41 μL | |
| - Anti-human CD73-PerCP Cy5.5 | ||||||
Tabell 7: Encellssorterande reaktionsrör. Förkortningar: FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
5. Sortering av enstaka celler
- Beredning av cellsorterare
- Installera ett 100 μm munstycke i sorteraren.
OBS: Lämpligt munstycke är minst fem gånger diametern på partikeln som ska sorteras. Vilken mantelvätska som ska användas för sortering måste bestämmas på grundval av provtypen och experimentets känslighet. För detta experiment har proprietär mantelvätska använts. - Utför den dagliga instrumentkvalitetskontrollen (QC) och ställ in sorteraren för experimentet. Se instrumentmanualen för en detaljerad guide till instrumentinställning.
- Installera ett 100 μm munstycke i sorteraren.
- Ställa in kompensationsmatrisen
- Ställ in kompensationsmatrisen med hjälp av enfärgskompensationsrör från steg 4.2.
- I den proprietära programvaran väljer du Experiment i verktygsfältet och klickar på Kompensationsinställningar. Öppna Skapa kompensationskontroller.
- Kontrollera markörerna och bekräfta. Ett nytt prov läggs till med namnet "Kompensation" under vilket nya rör som namnges markörkontrollerna läggs till automatiskt av programvaran.
- Välj det ofärgade röret och kör det för att spela in 5 000 händelser. Dra grinden till populationen av celler och tillämpa den på alla kompensationskontroller. Detta för att ställa in spänningar och negativ grind för varje fluorescerande parameter.
- På samma sätt kan du ladda kompensationsrören för enstaka fläckar separat och registrera och spara data. Välj den grind som avgränsar populationen av intresse och tillämpa på alla kompensationskontroller. Detta för att ställa in de positiva grindarna för varje fluorescerande parameter.
- Välj Experiment i verktygsfältet och klicka på Beräkna kompensationsvärden | och spara.
OBS: När den automatiska kompmatrisen har genererats med hjälp av programvaran kan spänningsparametrarna för fluorokromerna inte ändras för någon av kanalerna i de blandade rören.
- Datainsamling
- Anteckna 10 000 celler i varje rör från steg 4.3. och 4.4 för att samla in data för analys av cellernas immunfenotyp.
- Förberedelse av insamlingsanordningarna
- Beroende på syftet med de sorterade cellpopulationerna kan du välja mellan plattor med 6 brunnar, 24 brunnar, 48 brunnar eller 96 brunnar.
- Täck brunnarna med 200-500 μL FBS och håll plattorna ostörda i 2 timmar.
- Efter 2 timmar avlägsnar du resterna av FBS och tillsätter 200–500 μL 10 % MSC-odlingsmedium.
- Cellsortering i encellssorteringsläge
- Kör Mixed tube 1 (från steg 4.5) och registrera 10 000 händelser för att ställa in grindarna för den population av intresse som ska sorteras med hjälp av lämplig grindstrategi.
- Ladda en uppsamlingsplatta och ställ in målcellnummer mellan 2 500 och 5 000 celler/brunn och välj sorteringsrenhetsmasken för en cell.
- Samla in de sorterade populationerna i insamlingsanordningen och håll dem på is tills sorteringsförsöket är slut.
- När du är klar överför du plattorna till 5 % CO2 -inkubatorn för att hålla kulturerna vid 37 °C.
Efter förvärvet exporterades rådatafiler som .fcs-filformat (v.3.0. och senare). Sorteringsrapporterna som genererades efter varje experiment registrerade antalet händelser/celler sorterade per tilldelad brunn och angav antalet konflikter som avbröts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SHEDs karakteriserades med standardimmunofluorescensanalyser som visade uttrycket av vimentin (röda, typ III-intermediära filament), aktinfilament (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) och kärnor färgade med DAPI (Figur 1A). För att uppskatta deras proliferativa och kolonibildande kapacitet utfördes standardanalyser av kortvarig celltillväxt. En 14,3-faldig ökning av spridningshastigheten från dag 2 till dag 8 har visats i figur 1B. De klonogena egenskaperna hos SHED bestämdes från CFU-F-analyserna som visas i figur 1C-E. Enligt ISCT-kriterierna kunde de multipotenta MSC:erna differentiera sig till de tre mesodermala härledda linjerna. Cytokemisk färgning med Oil Red O användes för att detektera oljedropparna i de differentierade adipocyterna (Figur 1F); von Kossa-färgning användes för att färga kalciumavlagringarna som finns i matrisen för de differentierade osteoblasterna (Figur 1G); och aggrekanerna i 3D-kulturen färgades för Alcian Blue i de differentierade kondroblasterna (Figur 1H).
För att karakterisera immunfenotypen hos SHEDs sattes multiparametriska flödescytometrianalyser. Experimenten utfördes tillsammans med användning av fyra typer av experimentella kontroller, nämligen kompensationskontroller (tabell 4), FMO- och isotypkontroller (tabell 5) och ofärgade kontroller. Isotyperna av alla MSC- och HSC-antikroppar som användes tillsattes tillsammans med FMO-rören för att särskilja positiva kontra negativa signaler och högt kontra svagt antigenuttryck. Figur 2A visar fördelningen av de FMO- och isotypkontroller som används per experiment. De representativa densitetsdiagrammen visade inget uttryck av FITC-isotypen av CD90 FITC-antikroppar. På samma sätt jämförde histogramöverlagringarna (figur 2B) uttrycksnivåerna för de färgade proverna tillsammans med deras kontroller i respektive kanaler för FITC, PerCP Cy5.5 och PE. Det positiva uttrycket av markörerna CD90 och CD73 (röda histogram) och det negativa uttrycket av CD45 är jämförbart med det för deras ofärgade och FMO-kontroller (blå respektive svarta histogram).
Flödescytometribaserad karakterisering av immunfenotyperna har visat markörfördelningen från en av de tidiga passagerna (P6) SHEDs (Figur 3A-H). Både de ISCT-rekommenderade markörerna och CD44 bestämde moderpopulationerna som MSC. Den tetrapositiva populationen som visades i densitetsdiagrammen visade ≥98 % uttryck av CD90+CD73+CD105+CD44+ och ≤2 % uttryck av CD45-markörer. Mer än fem oberoende experiment visade liknande resultat. De sena passage-SHED:erna (P12), som visade differentiellt uttryck av de positiva markörerna, valdes för encellssortering av höga och svaga expressorer (Figur 4A-H). I enlighet med regleringsstrategin (Figur 4H) sorterades singlets→ levande celler→ icke-HSCs→ dubbelpositiva CD73+CD90+ och enkla positiva CD73+CD90- populationer med hjälp av encellssorteringsläget. De sorterade populationerna samlades in i plattlayouter med 96 brunnar/48 brunnar/6 brunnar med olika såddantal per brunn (tilläggsfil 1). Tre på varandra följande försök gjordes i en enda fas av sorteringsexperiment och överlevnadsförmågan för celler efter sortering (i de dubbelpositiva uttryckarna: CD90+CD73+) per experiment var 100 %. Tre oberoende faser av experiment har genomförts. Vi matchade antalet celler som växte per brunn efter sortering med antalet celler sorterade per brunn.
Figur 5A visar att CD90+CD73+ eftersorterade celler som samlats in i 96-hålsplattan visade vidhäftning och proliferation som deras moderpopulation. De sorterade cellerna har observerats nå 70-80% sammanflöde på den sjätte dagen efter sortering. De vidhäftande och prolifererande eftersorterade cellerna differentierades i närvaro av adipogena tillväxtfaktorer och färgades sedan efter dag 15 med Oil Red O med hjälp av lämpliga eftersorterade (odifferentierade) kontrollceller (Figur 5B,C).
Figur 1: Karakterisering av stamceller från humana exfolierade mjölktänder. (A) Immunofluorescensfärgning bekräftar att de isolerade MSC:erna uttrycker vimentin (röda, typ III-intermediära filament), aktinfilament (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) och DAPI (blå, kärnor). Fotomikrograf erhållen vid ursprunglig förstoring på 20x. Skalstapel = 10 μm. (B) Kortvarig celltillväxtanalys av SHEDs uppvisar sin höga proliferativa kapacitet, vilket observeras av den signifikanta ökningen av antalet celler i odling vid dag 2 och en 14,3-faldig ökning av proliferationshastigheten i slutet av dag 8 (n = 3, p-värde<0,01). Felstaplar för standardavvikelse har visats. (C-E) CFU-F-analys och kristallviolett färgning bekräftar den kolonibildande förmågan hos SHEDs; C) Flera kolonier förväntas bildas efter 14 dagars odling. D) En enda klonogen koloni som härrör från en enda cell. (E) Kristallviolettfärgad enda koloni av SHEDs uppvisar den typiska fibroblastliknande morfologin hos cellerna. (F-H) MSC under lämpliga in vitro-förhållanden förväntas genomgå differentiering till adipogena, osteogena och kondrogena linjer vid dag 21. Cytokemisk färgning visar (F) Oil Red O (infälld visar 40x bild av adipocyt som visar oljedroppar), (G) von Kossa och (H) Alcian Blue-färgning för adipogena, osteogena respektive kondrogena linjer vid dag 22. Mikrofotografier erhålls vid en ursprunglig förstoring på 20x. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: MSC = mesenkymala stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; SHEDs = stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder; CFU-F = kolonibildande enhetsfibroblast. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Negativa kontroller som används i multiparametriska experiment . (A) Fluorescens minus One-kontroller har visats i tabellform, där FMO-kontroller har ersatts av deras specifika isotyper. De representativa densitetsdiagrammen (från vänster till höger) visar den ofärgade kontrollen (vänster), FMO för CD90 FITC (mitten) med alla antikroppar tillsatta utom CD90 FITC tillsammans med tillägg av CD90 FITC-isotyp, och fullständigt färgat prov med alla antikroppar i panelen tillagda (höger). (B) Histogramöverlägg representerar jämförelsen av tre typer av prover, svart representerar FMO, blått representerar ofärgat och rött representerar helt färgade prover i deras respektive kanaler. Förkortningar: FMO = fluorescens minus ett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PerCP = peridinin-klorofyllprotein; PE = fykoerytrin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Multiparametrisk immunofenotypning av SHEDs (P6). (A) SSC-A kontra FSC-A: Baserat på deras sido- och framåtspridningsegenskaper är celler av intresse inhägnade och separerade från skräpet. (B) FSC-H kontra FSC-A och (C) SSC-H kontra SSC-A: De två diagrammen används för dubbeldiskriminering, vilket gör det möjligt att välja singlets samtidigt som aggregat som kan generera falska positiva signaler elimineras. (D) SSC-A kontra CD45 PE: Uteslutningsgrind gör det möjligt att välja CD45-populationen från singletterna; (E) CD73 PerCP-Cy5.5 kontra CD90 FITC: Från CD45-levande singlets är CD90+CD73+-celler gated; (F) CD44 V450 kontra CD105 APC: CD90+CD73+-populationen är ytterligare begränsad för att definiera de tetra-positiva CD90+CD73+CD44+CD105+-cellerna; (G) SSC-A kontra tid(er): Diagrammet visar den stabila insamlingen över tid (sekunder) och att inga händelser orsakade tryckfluktuationer under förvärvet; (H) Grind-hierarki. Förkortningar: SHEDs = stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyllprotein; SSC-A = sidospridningstoppsarea; FSC-A = främre spridningstoppsarea; FSC-H = spridningstoppens höjd framåt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Encellssortering av immunfenotypade SHEDs (P12). (A-F) En steg-för-steg-exklusionsbaserad regleringsstrategi för att sortera rena MSC:er i följande sekventiella ordning: Celler till singlets_1, till singlets_2, till DAPI-levande celler, till CD45-icke-hematopoetiska celler och slutligen till CD90+CD73+-celler. De inhägnade populationerna som visas i (F) sorterades med hjälp av encellssorteringsläge. G) Diagrammet SSC-A kontra tid(er) beskriver den oavbrutna sorteringen av proverna. (H) Grind-hierarki. (n=3, sorteringseffektivitet = 100 %). Förkortningar: SHEDs = stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder; MSC = mesenkymala stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyllprotein; SSC-A = sidospridningstoppsarea. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Morfologisk och funktionell karakterisering av eftersorterade SHEDs. (A) Faskontrastbilder av eftersorterade populationer samlades in i en 96-hålsplatta på dag 6 med en ursprunglig förstoring på 10x, skalstapel = 10 μm (infälld visar en 20x bild som visar de sorterade enskilda cellerna som ändrar morfologi till fibroblastliknande MSC). Cytokemisk färgning för adipogendifferentiering med Oil Red O observerad i (B) odifferentierad (kontroll) och (C) differentierad eftersorteringspopulation vid en ursprunglig förstoring på 20x, skalstapel = 10 μm (infälld visar en 40x bild som visar de observerade oljedropparna). Förkortningar: SHEDs = stamceller från mänskliga exfolierade mjölktänder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Sammanställda sorteringsrapporter som genererats per experiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S1: Optisk konfiguration av BD FACSAria Fusion. Förkortningar: LP = långpass; PMT = fotomultiplikatorrör; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inom området vävnadsteknik och regenerativ medicin, bland de postnatala källorna, har orala vävnadshärledda MSC väckt stort intresse på grund av deras minimala etiska skyldigheter och anmärkningsvärda potential för differentiering av flera linjer21. Stamceller från tandpulpa (DPSC) från den drabbade tredje molaren och SHEDs har fått mest uppmärksamhet bland dentala MSC för sin terapeutiska potential vid neurodegenerativa och traumatiska sjukdomar22. Protokollet som beskrivs i detta manuskript hjälper till att karakterisera SHEDs med hjälp av en multiparametrisk metod och ytterligare sortera populationer av intresse med hjälp av encellssorteringsmetoden. Tillämpningen av detta protokoll är dock inte bara begränsad till orala MSC utan kan också användas för immunofenotypning och sortering av MSC från andra källvävnader i människokroppen23.
Flera kritiska steg i detta protokoll måste diskuteras här för att det ska kunna genomföras på ett framgångsrikt sätt för det biologiska problem som behandlas. Nyckeln till varje sorteringsprotokoll är att kontrollera två viktiga komponenter: dess biologiska kontroller och de experimentella kontrollerna. Till att börja med säkerställer underhåll av ren kultur att provet som används inte äventyras när det sorteras. Cellviabiliteten i försorteringen av encelliga suspensioner ska säkerställa att mer än 70 % livsdugliga cellpopulationer startas, följt av analys och sortering av friska subpopulationer. Fläckbufferten som används i encellssuspensionen bör innehålla 2 % FBS och experiment görs bäst vid rumstemperatur. Genom att välja rätt sammanflöde av dessa primära celler (80-85 % sammanflöde) undviker man att äventyra deras cellviabilitet och minskar risken för stora aggregat. Dessutom är det viktigt att använda en levande/död markör (DAPI i det här protokollet) för varje sorteringsexperiment. I denna studie, eftersom proverna som användes var MSC med en ungefärlig diameter på 20-35 μm, valdes munstycksstorleken 100 μm för att sortera dem vid ett tryck på 20 psi på BD FACSAria Fusion. Detta möjliggjorde cellsortering utan att kompromissa med cellens livskraft under processen vid lägre manteltryck. För detaljerade sorteringsinställningar, rekommenderar vi att du hänvisar till programvaran BD FACSDiva guide24.
En viktig förutsättning för flerfärgsexperiment inom flödescytometri är behovet av lämpliga kontroller; Det finns fyra huvudtyper av kontroller som används här: autofluorescens, isotyper, FMO och kompensationskontroller. Den automatiska kompensationsmatrisen möjliggjorde noggrann kompensation, vilket förhindrade spektral genomblödning i detektorerna, och använde både kompensationspärlor och celler för detta ändamål. Det ofärgade provet satte tröskeln för autofluorescens av MSC. De blandade rören med alla fyra antikropparna innehåller isotyp och FMO för varje antikropp som används. DAPI-kompensationskontroll utfördes med hjälp av MSC, som bearbetades separat (med värmechock). Antikroppspanelen (som anges i tabell 8) som används här är särskilt utformad för hMSC baserat på de kriterier som anges av ISCT och instrumentkonfigurationen för BD FACSAria Fusion-cellsorteraren (se tilläggstabell S1). Detta är mycket viktigt under planeringen av multiparametriska flödescytometriexperiment. Karakteriseringspanelen som används för immunofenotypning består av fyra positiva MSC-markörer (CD90, CD105, CD73 och CD44) och en negativ markör (CD45). Däremot innehåller panelen för sorteringsexperimentet två positiva markörer (CD90 och CD73), en negativ markör (CD45) och en levande/död markör (DAPI) för att säkerställa ett högt antal levande MSC:er.
| Antikropp/markör | Fluorokrom | hMSC Ytprofil | Laservåglängd (nm) | Maximal excitation (nm) | Utsläppstopp (nm) |
| CD44 | V450 V450 | Bör uttrycka; >95% | 405 | 405 | 450 |
| CD90 | FITC (på engelska) | 488 | 495 | 519 | |
| CD73 | PerCP-Cy5.5 | 488 | 488 | 695 | |
| CD105 | APC | 640 | 650 | 660 | |
| CD45 | PE | Bör INTE uttrycka; <2 % | 561 | 566 | 574 |
| DAPI | - | Markör för döda celler | 405 | 358 | 461 |
Tabell 8: Flerfärgspanel utformad för karakterisering och sortering av SHEDs efter flödescytometri. Förkortningar: FITC = fluoresceinisotiocyanat; APC = allophycocyanin; PE = fykoerytrin; PerCP = peridinin-klorofyll-protein.
Val av sorteringsrenhetsmask
Med tanke på oförutsägbarheten hos cellulär heterogenitet i MSC, kan bulksortering inte nödvändigtvis uppnå renhetsnivån bland de sorterade populationerna. Vi optimerade encellssorteringsprotokollet i denna studie för att identifiera encellsklonerna och spåra deras funktionella egenskaper efter sortering när det gäller styrka. Encellssortering utfördes på en BD FACSAria Fusion, som hade flexibiliteten av följande inställningar: val av 100 μm munstycke, 20 psi manteltryck, en flödeshastighet som är justerbar (bibehålls vid 20 μL/min) och tröskelhastighet vid 380 händelser/s. Chanserna att välja två målceller istället för en är minimala i denna metod. Normalt väljs algoritmens encellssorteringsläge som kan lösa sorteringen av rena populationer av målceller och överväga hur många droppar som kommer att sorteras in i den valda insamlingsenheten. Precisionsläget bör i slutändan väljas korrekt så att det kan kombinera de masker som finns tillgängliga i sorteringsalgoritmerna och skapa ett strikt sorteringsvillkor för att sortera de renaste populationerna av intresse. Encellssorteringsläget kompromissar inte med en målcell om den aggregeras till en icke-målcell under sorteringen och som uppnår den renhetsnivå som vi ser fram emot i den här metoden. Detta var den modul som valdes i detta protokoll och de sorterade cellerna samlades in i 96-brunnars, 48-brunnars, 24-brunnars och 6-håls plattanordningar.
I den här studien sorterade vi subpopulationer baserat på deras differentiella immunfenotyp, nämligen CD90+CD73+CD45-. I både karakteriserings- och sorteringsprotokoll har vår gatingstrategi (som visas i figur 3 och figur 4) baserats på exkluderande gating från CD45-populationen för att ge oss den icke-hematopoetiska populationen (eftersom dessa har validerats och karakteriserats tidigare med ISCT-föreskrivna markörer), efter identifiering av singlets. Så småningom identifierades MSC från CD45-populationen med hjälp av de positiva ISCT-markörerna. Det är värt att notera här att det inte är någon större skillnad i procentsatser i den första mätningen av de positiva uttryckarna av ISCT-markörer följt av de negativa uttryckarna av CD45. Men eftersom syftet med denna sortering har varit att identifiera celler som uppvisar förändrat uttryck av de kända MSC-markörerna, har vi avslutat vår analys med de positiva expressionsdiagrammen.
I de representativa figurerna är 97 % av CD45-cellerna MSC, men vid kvantifiering av antigenuttrycken har vi sett att 75 % av cellerna är dubbelpositiva uttryckare av de två markörerna CD90 och CD73, medan det finns flera populationer som är enkelpositiva uttryckare av samma markörer (visas i figur 3F) och få celler som inte uttrycker markörerna alls.
Under karakteriseringen av dessa celler har vi identifierat subpopulationerna som tetra-positiva MSC, trippel-positiva och dubbelnegativa populationer. Detta differentiella uttryck av MSC-markörer expanderar med ökande passager och därmed kommer behovet av att studera och korrelera denna skillnad med deras funktionella egenskaper. Det yttersta syftet med att sortera MSC i vår studie är att skapa en jämförande analys mellan de identifierade subpopulationerna och avgöra om de differentiella uttrycken av positiva markörer har funktionella implikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Vi tackar Flow Cell Facility vid Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Indien, för användningen av kärnfaciliteten för flödescytometri. Kryosnittningen av pelletskulturen av differentierade celler utfördes vid Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Indien. Detta arbete stöddes av UC:s intramurala finansiering från Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Indien. AG är tacksam för stödet från Dr. T. M. A. Pai-stipendiet från MAHE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
References
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).
