Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

דגימת נוזל מוחי ודם מווריד זנב לטרלי בחולדות במהלך רישומי EEG

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

הפרוטוקול מראה איסוף חוזר של נוזל המוח השדרה ודם מחולדות אפילפטיות, המבוצע במקביל לניטור וידאו-אלקטרואנצפלוגרם רציף (EEG). אלה חיוניים לחקר קשרים אפשריים בין שינויים במולקולות שונות של נוזל הגוף לבין פעילות התקפים.

Abstract

מכיוון שהרכב נוזלי הגוף משקף דינמיקות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות, דגימות נוזל ביולוגיות מתקבלות בדרך כלל בהקשרים ניסיוניים רבים כדי למדוד מולקולות מעניינות, כגון הורמונים, גורמי גדילה, חלבונים או רנ"א קטנים שאינם מקודדים. דוגמה ספציפית היא דגימה של נוזלים ביולוגיים במחקר של סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. במחקרים אלה, רצוי להשוות את רמות המולקולות בנוזל השדרה (CSF) ובפלזמה, על ידי משיכת CSF ופלזמה במקביל והתחשבות במרחק הזמן של הדגימה מהתקפים ואליהם. הדגימה המשולבת של CSF ופלזמה, יחד עם ניטור וידאו-EEG בבעלי חיים אפילפטיים, היא גישה מבטיחה לאימות של סמנים ביולוגיים אבחוניים ופרוגנוסטיים משוערים. כאן מתואר הליך של נסיגה משולבת של CSF מ- cisterna magna ודגימת דם מווריד הזנב הצידי בחולדות אפילפטיות המנוטרות באופן רציף באמצעות וידאו EEG. הליך זה מציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. הוא מאפשר דגימה מהירה עם מינימום כאב או פולשניות, וקיצור זמן ההרדמה. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי להשיג דגימות CSF ופלזמה הן בחולדות קשוחות והן בחולדות שנרשמו באמצעות טלמטריה, וניתן להשתמש בו שוב ושוב במשך מספר ימי ניסוי. על ידי מזעור הלחץ כתוצאה מהדגימה על ידי קיצור הרדמה איזופלורנית, המדדים צפויים לשקף בצורה מדויקת יותר את הרמות האמיתיות של מולקולות נחקרות בנוזלים ביולוגיים. בהתאם לזמינות של בדיקה אנליטית מתאימה, טכניקה זו עשויה לשמש למדידת רמות של מולקולות מרובות ושונות תוך ביצוע רישום EEG בו זמנית.

Introduction

נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודגימת דם חשובים לזיהוי ואימות סמנים ביולוגיים של אפילפסיה, הן במחקר פרה-קליני והן במחקר קליני 1,2. כיום, האבחנה של אפילפסיה ורוב המחקר על סמנים ביולוגיים של אפילפסיה מתמקדים ב- EEG והדמיה מוחית 3,4,5. גישות אלה, עם זאת, מציבות מספר מגבלות. מלבד מדידות שגרתיות בקרקפת, במקרים רבים, EEG דורש טכניקות פולשניות כמו אלקטרודות עומק6. שיטות הדמיה מוחית הן בעלות רזולוציה טמפורלית ומרחבית ירודה והן יקרות יחסית וגוזלות זמן 7,8. מסיבה זו, זיהוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים, בעלות נמוכה ומבוססי נוזל ביולוגי יספק חלופה אטרקטיבית מאוד. בנוסף, סמנים ביולוגיים אלה של נוזל ביולוגי יכולים להיות משולבים עם גישות אבחון זמינות כדי לחדד את יכולת החיזוי שלהם.

חולים המאובחנים עם אפילפסיה נשלחים באופן שגרתי לדגימת EEG 9,10 ולדגימת דם 11,12,13,14, ורבים גם לנסיגה CSF כדי לשלול סיבות מסכנות חיים (כלומר, זיהומים חריפים, דלקת מוח אוטואימונית)15. דגימות דם ו- CSF אלה יכולות לשמש במחקר קליני שמטרתו לזהות סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. לדוגמה, הוג ועמיתיו מצאו כי עלייה בשלושה מקטעי tRNA פלזמה קודמת להתרחשות התקף באפילפסיה אנושית14. באופן דומה, רמות אינטרלוקין-1beta (IL-1β) ב- CSF ובנסיוב אנושי, המבוטאות ביחס בין רמות IL-1β ב- CSF על פני סרום, יכולות לנבא התפתחות אפילפסיה פוסט-טראומטית לאחר פגיעה מוחית טראומטית16. מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של דגימת נוזלים ביולוגיים למחקר סמנים ביולוגיים לאפילפסיה, אך הם מתמודדים עם מגבלות מרובות המהותיות לניסויים קליניים, למשל, הגורם המייסד של תרופות אנטי אפילפטיות (AEDs) בדם, היעדר תכוף של מידע אטיולוגי, בקרות לא מספקות, מספר צנוע של חולים, ואחרים17,18.

מחקר פרה-קליני מציע הזדמנויות אחרות לחקר מולקולות בנוזלים ביולוגיים כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאפילפסיה. למעשה, ניתן למשוך פלזמה ו / או CSF מבעלי חיים בעת ביצוע הקלטות EEG. יתר על כן, ניתן לבצע דגימה שוב ושוב לאורך מספר ימים של הניסוי, וניתן להשתמש במספר בקרות תואמות גיל, מין ועלבון אפילפטי כדי לשפר את עמידות המחקר. כאן, טכניקה גמישה כדי לקבל CSF מ cisterna magna עם נסיגה מקבילה של פלזמה מן הווריד הזנב חולדות EEG מנוטר מתואר בפירוט. לטכניקה המוצגת מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. על ידי שימוש בגישת מחט פרפר, ניתן לאסוף CSF מספר פעמים מבלי לפגוע בתפקוד של אלקטרודות EEG או שתלי ראש דומים. זה מייצג שכלול של הליכי גמילה קטטר intrathecal, אשר קשורים עם סיכון גבוה יחסית של זיהום. בנוסף, גישת הנפילה החופשית המדווחת המשמשת לאיסוף דם עדיפה על גישות אחרות של נסיגת דם מווריד הזנב בגלל הסיכון המופחת ביותר להמוליזה, בשל העובדה שהדם אינו עובר דרך צינורות ולא מופעל לחץ ואקום. אם מבוצע בתנאים קפדניים ללא חיידקים, קיים סיכון נמוך במיוחד להדבקה עבור בעלי חיים. בנוסף, על ידי התחלת משיכת הדם ממש בקצה זנבות החיות, ניתן לחזור על הדגימה מספר פעמים. טכניקות כאלה קל לשלוט והוא יכול להיות מיושם במחקרים פרה-קליניים רבים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פרארה ועל ידי משרד הבריאות האיטלקי (אישור: D.M. 603/2022-PR) בהתאם להנחיות המפורטות בדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוחים כמותיים נוספים של תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של חומצה ריבונוקלאית קטנה שאינה מקודדת (sncRNAs) בחולדה, CSF ופלזמה שהתקבלו תחת בקרת EEG בבעלי חיים אפילפטיים. לבחירתו, אנא עיין בסרטון JoVE הקשור להבנה טובה יותר ושיפורים של הניתוח 19,20,21.

1. הכנת בעלי חיים להשתלה כירורגית של אלקטרודות או טלמטרים

הערה: טכניקת הניתוח הסטריאוטקסי משתנה בהתאם למערכת EEG בה נעשה שימוש. סעיף השיטה הבא מספק תיאור של השלבים המשותפים לשני סוגי הניתוחים.

  1. השתמשו בחולדות Sprague-Dawley (SD) (זכרים, בני 7-8 שבועות, במשקל 250-290 גרם) המתוחזקות בהתאם לחוקים המקומיים לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אכסנו את בעלי החיים בתנאים סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומי שתייה.
  2. המשך בטיפול בחולדות במשך מספר ימים לפני הניתוח והליכי פרוטוקול הניסוי.
  3. השתמש במנגנון סטריאוטקסי להשתלת אלקטרודות או טלמטרים. בצע את הסטנדרטים העכשוויים עבור ניתוחים אספטיים. השתמש אלקטרודות סטריליות ועובדים טוב משדרים.
  4. לגלח את ראשו של בעל החיים עם סכין הגילוח החשמלי. יש להשרות הרדמה בבעל החיים עם תערובת של קטמין (45 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (7.5 מ"ג/ק"ג) הניתנת תוך צפקית (I.P.), ולאחר מכן להוסיף את חומר ההרדמה איזופלורן (1.4% באוויר; 1.2 מ"ל/דקה) המועברת דרך מסכת פנים ולקבע את ראשו של בעל החיים לתוך המנגנון הסטריאוטקסי.
  5. יש להבטיח עומק הרדמה נאות על ידי בדיקת רפלקס הנסיגה מדוושה לאחר כרית כף הרגל, לצבוט את כפות רגליהם האחוריות של שני בעלי החיים ולשמור על הרדמה איזופלורנית עד סוף הניתוח. בדוק באופן קבוע את עומק ההרדמה במשך כל ההליך.
  6. יש למרוח כמות מספקת של משחת עיניים על עיני שני בעלי החיים כדי למנוע נזק לקרנית עקב אובדן רפלקס המצמוץ שנגרם על ידי הרדמה.
  7. נקו היטב את הקרקפת של בעל החיים עם חומר חיטוי נוזלי ובצעו חתך אורכי באורך 2 ס"מ באמצעות אזמל מעוקר. פתחו את הקרקפת ומרחו קליפסים כירורגיים על דשי העור כדי להשאיר אותה פתוחה.
  8. בעדינות, נתק את periosteum כדי לחשוף את bregma ואת האזור של הגולגולת שדרכו אלקטרודת הקלטה יוכנס.

2. השתלה כירורגית של אלקטרודות קשורות

הערה: לפני קביעת הליך גמילה CSF ניקוב של פרוטוקול זה (ראה שלב 9 לפרטים), בוצעו משיכות CSF חוזרות ונשנות באמצעות צינורית מנחה בכמה חולדות לא מורדמות שנעו בחופשיות. בעלי חיים משומרים שהושתלו בהם אלקטרודות קשורות שימשו להערכת ההשפעה של שתלים דו-ראשיים על רישום EEG ארוך טווח בשילוב עם דגימת CSF מרובים. בניסויים ספציפיים אלה, חולדות הושתלו עם צינורית מנחה דמה שהונחה בתוך מגננת cisterna, שקצהו הוכנס 7 מ"מ לתוכה באופן סטריאוטקטי, על פי פרוטוקולים22 שפורסמו בעבר. גישות ניתוח השתלה כפולה היו דומות לאלה שאומצו על ידי חלק מהעובדים בעבר עבור צינוריות מדריך מיקרודיאליזה והשתלת אלקטרודות קשורות23,24.

  1. השתמש בזרוע אחת של המסגרת הסטריאוטקסית, הרכיב עליה את מחזיק האלקטרודה והנח את האלקטרודה זקופה לתוך המחזיק. הזיזו את קצה האלקטרודה בדיוק מעל הברגמה. רשום את הקואורדינטות הקדמיות והבינוניות של ברגמה ותרגם אותן לקואורדינטות הרצויות.
  2. מנמיכים את האלקטרודה עד שקצהו כמעט נוגע בגולגולת. סמן את נקודת הקידוח וקדח את הגולגולת במקום המסומן. היזהרו שלא לפגוע במוח ובקרומי המוח.
  3. עשו ארבעה חורים או יותר לעיגון ברגים והבריגו אותם לתוך הגולגולת. שימו לב לגודל האלקטרודה בעת ביצוע החורים לעיגון ברגים. גודל האלקטרודה לא אמור להפריע לברגי העיגון הממוקמים במקום.
  4. הורידו לאט לאט את הזרוע הסטריאוטקטית הנושאת את האלקטרודה על הציר הגב-ונטרלי, היכנסו לרקמת המוח ועצרו במיקום הרצוי. תקן את חוט הארקת האלקטרודה סביב אחד הברגים המוברגים לתוך הגולגולת.
  5. הניחו את המלט המתאקרילי על האלקטרודה והברגים המכסים כמחצית מגובה כן האלקטרודות. השאירו את החלק העליון של האלקטרודה, המתאים לקצה חוט הקשירה, חשוף.
  6. שחררו את האלקטרודה מהמחזיק והרימו את הזרוע הסטריאוטקטית. שחררו את בעל החיים מהמנגנון הסטריאוטקסי ותנו לו טיפול לאחר הניתוח.
  7. הניחו את בעל החיים בכלוב התאוששות נפרד והתבוננו בו כל 10 דקות עד שהוא ער ואמבולטורי. החזירו את בעל החיים לכלוב הדיור הסטנדרטי שלו ולחברה אחרת שאינה מורדמת רק לאחר שהחלים לחלוטין.

3. השתלה כירורגית של הטלמטרים

הערה: השתמש בטלמטרים סטריליים בלבד. אם נעשה שימוש חוזר בטלמטרים, נקו ועיקרו אותם לפני הניתוח בהתאם להוראות היצרן שלהם. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בטלמטרים של Data Science International (DSI) להקלטת EEG.

  1. הפעל את משדר הטלמטריה באמצעות מגנט ובדוק את האות באמצעות רדיו תדר AM. בדוק אם יש איתות חזק וברור לפני הניתוח. במידת הצורך, השליכו את הטלמונים הלא תקינים.
  2. הכינו את מוליכי הטלמטר על ידי קצירם לאורכים אופטימליים עבור חולדות בוגרות. מקלפים בחזרה את ציפוי הסיליקון על שני מוליכים (שליליים וחיוביים), וחושפים כ-5 מ"מ של עופרת הפלדה הסלילית. צור ידית לולאה באורך של כ-2 מ"מ וברוחב של 1 מ"מ בקצה המובילים.
  3. יש לגלח את צלע בעל החיים מתחת ומאחורי כתף שמאל. יש לחטא את אזור הניתוח בחומר חיטוי המבוסס על מי חמצן מיוצבים ופעילות אמוניום רבעונית. תן לחיטוי לפעול במשך 15 דקות.
  4. בצע חתך רוחבי של כ -2 ס"מ ממש מאחורי כתף החיה ועשה כיס תת עורי של כ 5 ס"מ3 מקום למיקום המשדר. מקם את המשדר במקביל לציר הארוך של הגוף, כאשר הלידים מופנים לכיוון הרוסטרלי.
  5. מקבעים את המשדר לדופן הפנימית של הכיס התת עורי בתפר כותנה 3-0. בעזרת מספריים קהות, יוצרים את התעלה התת עורית (כ-2.5 ס"מ אורך) דרך האגף והצוואר של החיה, ובכך מחברים את כיס המשדר עם חתך קו האמצע שנעשה בקרקפת של החיה בשלב 1.6.
  6. קח את שני מוליכי הטלמטר עם מלקחיים ומשוך אותם למעלה דרך המנהרה, כך שהם בולטים ממוצא החתך בקרקפת. החזיקו את העופרת מחוץ לחתך הקרקפת בעזרת קליפסים לפצע.
  7. השתמש במסגרת הסטריאוטקסית כדי לציין את הקואורדינטות הרצויות עבור עופרת חיובית (אדומה) וקדח את החור לתוך הגולגולת עבור קצה העופרת החיובי (בדומה לשלב 2.1). עשו עוד חור אחד לעיגון הבורג כלפי מעלה לרוסטרום והבריגו אותו לתוך הגולגולת.
  8. הכניסו את קצה העופרת החיובית מתחת לכיפה ולדורה והניחו אותו על משטח המוח. חבר את קצה הלולאה של עופרת שלילית (לבנה) על הבורג. שים כמות קטנה של מלט מתאקרילי סביב מוצא העופרת החיובי ואת העופרת השלילית כדי לשתק אותם על הגולגולת.
  9. תקן את המובילים לקיר הפנימי של עור הגולגולת עם תפר כותנה 3-0. יש לוודא שהמוליכים הקבועים ותפר התיקון לא יפריעו לאתר נסיגת CSF (כלומר, משטח דיכאוני עם הופעת מעוין בין הבליטה העורפית לעמוד השדרה של האטלס).
  10. סגור את החתך בקרקפת ואת החתך האגפי באמצעות תפר כותנה 3-0. החל חומרי חיטוי על הפצעים. רק לאחר שאלה התייבשו, יש למרוח קרם אנטיביוטי על הפצעים שנתפרו.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. יש לעקוב אחר בעלי החיים במשך כשעה לאחר הניתוח עד שהם זקופים ונעים בכלוב. שמור אותם על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. מתן בעלי חיים עם אנטיביוטיקה מערכתית למניעת זיהום ומשכך כאבים מערכתי למניעת כאב לאחר הניתוח במשך 2-3 ימים.
  2. אפשרו לחולדות להתאושש לפחות 7 ימים לאחר הליכים כירורגיים. יש לעקוב אחר בעלי החיים לפחות פעם ביום במשך 3 ימים לאיתור סימני כאב או מצוקה.

5. סטטוס אינדוקציה אפילפטיקוס בחולדות

הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט של השראת סטטוס אפילפטיקוס (SE) הדרושה כדי לשחזר את אפילפסיה של האונה הרקתית המזיאלית (mTLE) בחולדות, עיין ב- Guarino et al.25.

  1. לאחר שבוע של התאוששות לאחר הניתוח, הקצו את החיות באופן אקראי לקבוצות: (i) חיות בקרה המקבלות רכב ו-(ii) חיות אפילפטיות, אשר יקבלו pilocarpine. השתמש במספר גבוה יותר באופן יחסי של בעלי חיים עבור הקבוצה האפילפטית, שכן לא כל החולדות המנוהלות על ידי פילוקרפין ישרדו או יפתחו SE.
  2. יום לפני השראת SE, תן לבעלי חיים מנה אחת של 127 מ"ג / ק"ג ליתיום כלוריד מומס ב 0.9% מלוחים (3M) כנפח של 1 מ"ל / ק"ג על ידי gavage קיבה. מתן הליתיום של החיה, אשר מגביר את יעילות פילוקרפין26, כ -14 שעות לפני השראת SE על מנת להקטין את השונות בזמן להופעת SE.
  3. כ-14 שעות לאחר מתן ליתיום, תנו לחולדות זריקה אחת של מתיל סקופולאמין (1 מ"ג/ק"ג, תת עורית).
  4. בדיוק 30 דקות לאחר מתן מתיל סקופולמין, תן לחולדות זריקה אחת של פילוקרפין (50 מ"ג / ק"ג, כלומר p.p.) כדי לגרום ל- SE. תן מתיל סקופולמין ורכב (0.9% תמיסת NaCl) להדברת חולדות.
    1. הזרקת פילוקרפין גורמת להתנהגות אופיינית בבעלי חיים: התקפים חלקיים מוקדמים (תנועות של ויבריסה והנהוני ראש תוך 5 דקות לאחר מתן פילוקרפין) המתפתחים לעוויתות כלליות חוזרות ונשנות (SE) תוך 25-30 דקות. עבור חולדות שאינן מפתחות SE תוך 30 דקות, יש לתת מנה נוספת של פילוקרפין (25 מ"ג/ק"ג, כלומר ), ואם הן עדיין לא מפתחות SE, להוציא אותן מהמחקר (SE non-responders).
  5. התבוננו ודרגו את התנהגות ההתקפים בחולדות כל 5 דקות החל מיד לאחר הזרקת הפילוקרפין (pilocarpine). השתמש בסולם ראסין לניקוד27.
  6. להפסיק את SE 2h לאחר הופעת I.P. מתן קוקטייל של תרופות: diazepam (10 מ"ג / ק"ג), phenobarbital (25 מ"ג / ק"ג), ו scopolamine (1 מ"ג / ק"ג).
  7. תנו לחולדות את הקוקטייל הזה שוב אחרי 4 שעות. לבסוף, לאחר 4 שעות נוספות, תנו לחולדות את תערובת התרופות האחרונה (דיאזפם 10 מ"ג/ק"ג בתוספת סקופולאמין 1 מ"ג/ק"ג) על מנת להפסיק לחלוטין את פעילות ההתקף.
  8. הזריקו לבעלי החיים מי מלח (1 מ"ל של 0.9% תמיסת NaCl, pH מותאם ל-7.0) והאכילו אותם בתמיסת 10% סוכרוז במשך 2-3 ימים לאחר SE כדי להעדיף התאוששות מהירידה במשקל הגוף שבאה בעקבות SE.
  9. הקצאת בעלי חיים ששרדו לאחר SE באופן אקראי לקבוצות ניסוי שונות בהתאם לדרישות פרוטוקול הניסוי הספציפי. השתמש בקריטריוני ההכללה/אי-הכללה הבאים לניסויים נוספים בחולדות אפילפטיות: התפתחות SE עוויתית תוך שעה לאחר מתן פילוקרפין, עלייה במשקל בשבוע הראשון לאחר SE, ומיקום נכון של האלקטרודה באזור המוח המעניין עבור רישומי EEG25.

6. וידאו קשור EEG בחולדות אפילפטיות וניתוח פעילות התקפים

הערה: סעיף זה מתאר את ההליך הניסיוני לרישום אותות EEG בחולדות חד-ביתיות הנעות בחופשיות בתנאים סטנדרטיים. הכלוב לא צריך להכיל חפצים שבהם החיה או כבל ההקלטה יכולים להיתקע. בהתאם לשאלה המדעית שיש להתייחס אליה, ניתן לנתח מספר פרמטרים. במקרה של מחקר אפילפסיה, עקבות EEG נבדקים כדי לזהות התקפים חשמליים ומוטוריים. הפרמטרים הנפוצים ביותר המשמשים לזיהוי התקף הם המשרעת, התדירות ומשך הפעילות החשמלית הפרוקסימלית.

  1. הניחו את בעל החיים בכלוב נקי בחדר ההקלטות כדי לאפשר התרגלות ולהפחית את הלחץ שנגרם על ידי הסביבה החדשה. הכניסו את כלוב החיה לכלוב פאראדיי כדי למנוע זיהום של אות ה-EGG בשדה האלקטרומגנטי הסביבתי.
  2. חבר קצה אחד של כבל ההקלטה להתקן ההקלטה. השתמש במד מתח כדי למדוד את הפוטנציאל החשמלי ולהבדיל בין אלקטרודות הארקה לאלקטרודות ייחוס.
  3. חבר את הקצה השני של כבל ההקלטה לאלקטרודה הקבועה על ראשה של החולדה. למטרה זו, החזיקו את כיסוי המלט על ראשה של החיה בעת הכנסת תקע הכבל למחבר האלקטרודה והימנעו מהפעלת לחץ על ראש החולדה.
  4. איזון כנגד משקל כבל ההקלטה כדי לאפשר תנועה חופשית של בעל החיים תוך מניעת הסיכון של סיבוב הכבל. לשם כך, השתמש בזרוע איזון נגדית או בקומוטטורים. גם אם כבל ההקלטה מאוזן, הכניסו את המזון לכלוב במקום במחזיק האכלה, שבו החיות צריכות להתרומם כדי להגיע למזון.
  5. לפני תחילת הרישום, בדוק את כל ההגדרות המשמשות לרכישה ולעיבוד הנתונים מה- EEG.
    הערה: פרוטוקול זה אינו מספק מבוא למנגנון הנדרש לביצוע הקלטת EEG, עם זאת, יש ליישם קצבי סינון ודגימה נאותים כדי למנוע ממצאים ורעש באותות EEG.
    1. עבור ניסוי שגרתי, הגדר את קצב הדגימה על 500 הרץ, ואת רווח ההגברה על 5000x. סנן את האות באמצעות מסנן 0.005 הרץ בנוסף למסנן חריץ כדי לבטל את הפעילות החשמלית שמסביב בתחום התדרים 50 הרץ (ספציפי למדינות אירופה).
  6. התחל הן הקלטות וידאו והן הקלטות EEG וודא שהעקבות תואמות לאות EEG צפוי על ידי בדיקת ההספק בפסי תדרים ספציפיים לאורך זמן. רשום תקופת בסיס לפני תחילת ההתערבויות בבעלי החיים.
  7. בדוק בעלי חיים ועקבות EEG מעת לעת. אין זה נדיר שכבל הקלטה מתנתק ממחבר האלקטרודה בראש החולדה. אם זה קורה, חברו שוב את האלקטרודה בראש החולדה לכבל הקלטה ובדקו אם יש אות EEG ברור.
  8. נתח את אות ה- EEG באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. אם אתה מנתח באופן ידני, סנן באמצעות הקלטת EEG כדי לזהות פעילויות דמויות התקף. אם מתכוונים להשתמש בתוכנה, הגדר פרמטרים מרכזיים של אירוע התקף, כמו משרעת, תדירות ומשך הפעילות החשמלית.
    הערה: התקף יחיד עשוי להיות מאופיין בפעילות חשמלית עם משרעת גבוהה פי 3 מקו הבסיס, תדר שווה או גבוה מ- 5 הרץ, ומשך של לפחות 5 s22.
  9. ללא קשר לשיטה בה נעשה שימוש, אשר את ההתקפים העוויתיים הפוטנציאליים על ידי בדיקת הקלטת הווידאו המסונכרנת שנאספה בו זמנית עם EEG.

7. טלמטריה וידאו-EEG בחולדות אפילפטיות וניתוח פעילות התקפים

הערה: סעיף זה מתאר את ההליך הניסיוני להקלטת אותות EEG רדיוטלמטריה בחולדות חד-ביתיות הנעות בחופשיות בתנאים סטנדרטיים. הפרוטוקול מבוסס על מערכת טלמטריה זמינה מסחרית. עם זאת, מספר מערכות טלמטריה שונות מעט במפרט הפונקציונלי והטכני שלהן. יש לבחור את המערכת בהתאם לדרישות המעבדה ויעדי המחקר.

  1. מקם את הכלוב הביתי של בעלי החיים מעל מקלט האותות. חבר את מקלט האות למערכת איסוף הנתונים וזאת למחשב עם תוכנת הרכישה.
  2. הפעל את שתל הטלמטריה בתדרי רדיו על ידי הצבת מגנט בקרבת הטלמטר המוכנס לאגף החולדה. בדוק את האות באמצעות מכשיר רדיו. השתמש במכשיר רדיו אוניברסלי כדי לבדוק את הטלמונים ולשמוע צפצוף ברור המציין שהטלמטר מופעל, בעוד שצליל רוחש מציין טלמטר לא פעיל.
    הערה: יש לקחת בחשבון את אורך החיים של סוללת משדר גלי הרדיו לפני הגדרת משך ההקלטות.
  3. הגדר את תוכנת הרכישה וסנכרן את מערכת האות והווידאו של טלמטריה כדי להשיג בו זמנית נתוני EEG ווידאו. הקצה מקלט אות אחד לכל משדר מושתל והגדר את ערכי הכיול של המשדר. הגדר את קצב הדגימה על 1000 הרץ, זיהוי רעש בין -500 mV ל- +500 mV, ואת מרווח השילוב על 100 ms. אין להשתמש במסננים בעלי מעבר נמוך וגבוה.
  4. הפעל את הקלטות הטלמטריה והווידאו. בצע הקלטה בסיסית לטווח ארוך לפני רכישת הפעילות דמוית האפילפטי. נתח את אות ה- EEG כמתואר בשלבים 6.8 ו- 6.9.

8. הליך איסוף הדם מווריד הזנב

הערה. מערכת איסוף הדם ואקום מורכבת ממחט פרפר (23 גרם x 3/4 x 12 (0.8 מ"מ x 19 מ"מ x 305 מ"מ). טכניקת איסוף הדם יכולה להתבצע בקלות על ידי מפעיל אחד וההליך אורך כ -5 דקות.

  1. מצפים את מחט הפרפר ואת הצינור שלה ב-1% K2EDTA במים מזוקקים זמן קצר לפני הנסיגה, כלומר, מושכים פנימה ומוציאים את תמיסת K2EDTA מהמערכת באמצעות מזרק 1 מ"ל. חתכו את הצינורית ממש מאחורי המחט כדי לאסוף דם טיפה אחר טיפה, ללא שאיפה (איור 1A).
  2. הכניסו את החולדה לתא אינדוקציה והרדימו אותה עם איזופלורן (1.4% באוויר; 1.2 מ"ל/דקה). עברו למסגרת הסטריאוטקסית ושמרו על הרדמה באמצעות מסכת פנים. שים את כרית החימום מתחת לחיה, שמירה על חלק הזנב שלה במגע ישיר עם כרית.
  3. הזיזו בעדינות את גבו של בעל החיים הצידה כך שווריד הזנב הצידי יישמר בחלק העליון.
  4. טבלו את הזנב במים חמים (42°C) למשך 2 דקות כדי להרחיב את הווריד הרוחבי. נגבו את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי יותר. הניחו אור חם על הזנב באמצעות נורת ליבון רגילה.
  5. הכנס את מחט הפרפר 21G לווריד הזנב הצידי בעומק של 5 מ"מ ובזווית של 20°. אספו דם בשפופרת איסוף ואקום של 500 מיקרוליטר שמכילה 5 מ"ג K2EDTA כנוגד קרישה (איור 1B,C).
  6. הסר את המחט ועצור את זרימת הדם על ידי הפעלת לחץ על אתר הניקוב. החזירו את החולדה לכלוב הביתי שלה.
  7. הפוך בעדינות את הצינור 10x כדי לערבב נוגדי קרישה בדם. צרו חורים בעומק של כ-1.5 ס"מ לתוך הקרח כדי להכיל את צינורות האיסוף. בעדינות ואנכית לשים את הדגימה על קרח.
  8. צנטריפוגה דגימת הדם בצנטריפוגה מקוררת (4 ° C) ב 1300 x גרם במשך 10 דקות כדי להפריד פלזמה. בצע הליך זה תוך שעה לכל היותר.
  9. קח בערך 200 μL של פלזמה, הימנעות שכבת תאי הדם האדומים והלבנים. שים את הפלזמה נסוג לתוך microtube סטרילי 0.2 מ"ל. במידת הצורך, יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שעה לאחר הצנטריפוגה.
  10. שים בצד 5 μL של המדגם לבקרת איכות. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
    הערה: אין להשתמש בשואב אבק גם אם הומלץ על ידי חוקריםמסוימים 28 או לחלוב את הזנב במהלך ההליכים המתוארים בשלב 8.5 כדי להשיג דם נוסף, מכיוון שהוא מקטין את איכות הדגימה עבור ניתוחי הכימות הבאים של sncRNA (עיין בתוצאות המייצגות לקבלת פרטים). יש לזכור כי בחולדה, כמות הדם המקסימלית שניתן למשוך בפעם אחת היא <10% מנפח הדם הכולל שלה (כלומר, כ 1.6-1.9 מ"ל בחולדה 250-300 גרם) ו -<15% מנפח הדם הכולל (כ -2.64 מ"ל) בחודשאחד 29. בפרוטוקול זה, איסוף דם מקסימלי של 500 μL בהזדמנות אחת עד חמש פעמים בחיה אחת משמש30,31.

9. נוהל איסוף CSF

הערה. הטכניקה יכולה להתבצע בקלות על ידי מפעיל יחיד, וההליך דורש בערך 2-4 דקות. החומרים המשמשים לאיסוף CSF הם מחטי פרפר ואקום חד-פעמיות בעלות נמוכה וצינורות מיצוי. בפרוטוקול הזה משתמשים במערכת עירוי בעלת כנף פרפר שמחוברת למזרק סטרילי כדי ליצור את הוואקום (איור 2A).

  1. הכינו את מחט הפרפר 23G, חתכו את הגנת שרוול הפלסטיק שלה כך שקצה המחט החשופה ייחשף ב-7 מ"מ כדי למנוע ממנה לחדור לעומק של יותר מ-7 מ"מ לתוך מגנה הציסטרנה במהלך הנסיגה (איור 2B).
  2. חבר את מחט הפרפר המצוידת בצינורות פולימריים למזרק 1 מ"ל.
  3. הכניסו את החולדה לתא אינדוקציה והרדימו אותה עם איזופלורן (1.4% באוויר; 1.2 מ"ל/דקה). החליפו את זרימת האיזופלורן למסגרת הסטריאוטקסית ושמרו על הרדמה המועברת דרך מסכת פנים. הסירו את הפרווה שעל ראשה וצווארה האחוריים של החולדה בעזרת סכין גילוח.
  4. תקן את ראש החולדה עם מוטות אוזניים. הורידו את ראש החיה מטה בערך ב-45° אנכית, ונעו במורד מוט האף של המסגרת הסטריאוטקסית (איור 2C). בדוק את ראשו האחורי של בעל החיים ומצא משטח מעט מדוכא עם היבט של מעוין, בין הבליטה העורפית לעמוד השדרה של האטלס.
  5. שפשפו את המשטח הזה עם 70% אתנול על מנת להפוך אותו גלוי יותר ולחטא אותו.
  6. הכניסו את מחט הפרפר במאונך למרכז המשטח המדוכא בצורת מעוין לתוך ה-cisterna magna לאיסוף CSF עד שהתנועה תיחסם על-ידי חיתוך להגנה על שרוול פלסטיק בגודל של המחט (איור 2D). משוך לאחור בעדינות את בוכנה מזרק 1 מ"ל על מנת לאפשר CSF לזרום לאט דרך המחט.
  7. אספו כ-100 מיקרוליטר של CSF לתוך צינורות פולימריים (איור 2D). הימנע מכניסה לדם או כל זיהום נראה לעין אחר. צבטו את צינור הפולימר קרוב מאוד למחט הפרפר וחתכו את הצינור בשלב זה.
  8. ציירו את הדגימה השקופה (הלא מזוהמת) לתוך המזרק. יש להשליך את הדגימה המזוהמת, אם זיהום נראה לעין נכנס לצינורות האיסוף.
  9. יש לגרש את הדגימה לתוך המיקרו-צינורית הסטרילית של 0.2 מ"ל ולאחסן על קרח עד שעה אחת.
  10. לחטא את האתר של נסיגה CSF על הראש של החיה. הוציאו את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזירו אותה לכלוב שלה.
  11. שים בצד 2 μL של הדגימה לבקרת איכות. אחסן את שאר הדגימה ב -80 ° C לניתוח נוסף.
    הערה: בחולדות, אם משיכות CSF מרובות מבוצעות שוב ושוב, הנפח המומלץ למשיכה בכל אוסף הוא 100 μL32. בפרוטוקול זה, מקסימום של 100 μL של CSF בהזדמנות אחת עם נסיגה מקסימלית פי 5 ב -15 ימים בחיה אחת נעשתה.

10. ניתוח ספקטרופוטומטריה של איכות הדגימה

הערה: לאחר איסוף נכון של דגימות CSF ופלזמה, הדגימות מוכנות לניתוח ספקטרופוטומטר ואינן דורשות טיפול ספציפי. למדוד את ספיגת המוגלובין על ידי ספקטרופוטומטריה UV ב 414 ננומטר כדי להעריך את הסיכון המוליזה בדגימות. יש להשתמש בערך ספיגה חתך של 0.25 בדגימות חולדות. הבחירה במגבלה זו עשויה להיות תלויה בניתוח qPCR שלאחר מכן ובדרישות הספציפיות שלו לכימות sncRNA.

  1. הפעל את ספקטרופוטומטר UV. בחר את השיטה למדידת בליעה באורך גל יחיד של 414 ננומטר עבור PLASMA או CSF. לחץ על הבא.
  2. שטפו את הקובטה בקוטר 1 מ"מ במים מטוהרים. שים 5 μL של אתנול 70% על נקודת המדידה cuvette. יבש עם מגבת נייר ולשפשף עם נייר טישו ללא מוך. בדוק אם הוא שקוף לחלוטין.
  3. שים 1.5 μL של מים מטוהרים לתוך קובטה 1 מ"מ ולסגור אותו. הכנס את הקובט לתא המדידה של הספקטרופוטומטר ומדוד את ספיגת הדגימה הריקה על ידי לחיצה על כפתור ריק . בדוק שערך הספיגה ב- 414 ננומטר הוא 0.000.
  4. יבשו את הקובטה במגבת נייר ונקו אותה בנייר טישו ללא מוך. בדוק אם הוא שקוף לחלוטין.
  5. שים 1.5 μL של הדגימה לתוך קובטה 1 מ"מ ולסגור אותו. הכנס את הקובט לתא המדידה של הספקטרופוטומטר. מדוד את הדגימה, לחיצה על כפתור הדגימה . בדוק את ספיגת הדגימה ב 414 ננומטר ולהוסיף לה ביאורים.
  6. המשך לכמת את ספיגת ההמוגלובין בכל הדגימות הזמינות. מדוד את הדגימה הריקה לפני כל דגימת פלזמה או CSF, על-ידי לחיצה חלופית על הלחצנים ריק ודוגמה.
  7. שמור את הדגימות עם A414 ננומטר < 0.25 ב -80 ° C ומחק את הדגימות אם A414 ננומטר > 0.25.
  8. יש לשטוף את הקובטה בקוטר 1 מ"מ במים מטוהרים ואתנול 70%, ברצף. יבשו את הקוביה.
  9. סגרו את הקובטה הריקה לתוך תא המדידה כדי למנוע את האבק שלה. כבה את הספקטרופוטומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות של CSF שונים והליכי גמילה מדם שבוצעו ב -9 ביקורת ו -18 חולדות אפילפטיות, כולן מושתלות עם אלקטרודות חודש לאחר SE, מדווחת במונחים של שיעור הצלחה. לאחר ההשתלה, כל החולדות נוטרו באמצעות וידאו EEG במשך חודש אחד, שבמהלכו CSF בתוספת הדם הוצא 5x כל 3 ימים במהלך השבועיים האחרונים של הניסוי (כלומר, בימים 52, 55, 58, 61 ו-64 לאחר SE; dpSE). נתונים מנסיגות מרובות בבעלי חיים שונים שימשו להשוואת שיעור ההצלחה של איסוף CSF בחולדות בעלות ראש כפול שניחן בשתלים (מקופסאות שימורים למשיכת CSF) עם שיעור ההצלחה של איסוף CSF (שבוצע על ידי ניקוב cisterna magna) רק באלקטרודות קשורות או טלמטריה שהושתלו בבעלי חיים (טבלה 1). בבעלי חיים שונים הוערכה ההשפעה של איסוף דם ואקום או חליבת זנב על איכות דגימות הפלזמה (טבלה 2). למטרה זו, ניתוח ספקטרופוטומטריה UV ב 414 ננומטר שימש לזיהוי המוגלובין חופשי. לצורך ניתוחים סטטיסטיים נעשה שימוש בתוכנה מסחרית, ונעשה שימוש ב- Kruskal-Wallis או ANOVA חד כיוונית עם מבחני השוואה מרובים של Tukey לאחר הוק (p<0.05 הנחשב מובהק סטטיסטית). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM.

שיעור הצלחה של דגימות CSF מרובות בחולדות מנוקבות ומנוקבות
CSF נדגם 5x בתוך שבועיים ב-3 קבוצות של חולדות: (i) חולדות מושתלות אלקטרודות משומרות וקשורות (קבוצת CT של בעלי חיים); באלה, נסיגת CSF בוצעה באמצעות צינורית מדריך דמה ומפרק צינורות PTFE למזרק 1 מ"ל כאשר הם לא היו מורדמים ונעים בחופשיות תחת וידאו-EEG; (ii) חולדות מושתלות מנוקבות (שלב 9) ואלקטרודות קשורות (קבוצת PT); (iii) חולדות מושתלות באלקטרודות מנוקבות וטלמטריה (קבוצת PTe). בסך הכל נעשה שימוש ב-9 בעלי חיים בכל קבוצה (6 אפילפטיים ו-3 חולדות ביקורת). מספר האוספים המוצלחים מעל 5 פעמים הוערך. שיעור ההצלחה היה דומה בחולדות מנוקבות: 86.7% ±-5.8% בחולדות קשורות ו-88.9% ±-4.8% בחיות מושתלות באלקטרודות טלמטריה. במקום זאת, בחולדות המשומרות השיעור הופחת גם אם לא שונה משמעותית (71.1% ± 8.9%, לוח 1). תוצאות כאלה מצביעות על כך שהצינורית על ראשי בעלי חיים עלולה להפריע לדגימות CSF חוזרות ונשנות ולפגוע במחקרי אורך. טכניקת הניקוב מתאימה יותר למשיכות CSF מרובות באלקטרודות שהושתלו בבעלי חיים.

השפעת ואקום וחליבת זנב על שיטת איסוף הפלזמה
הדם נאסף פי 5 מ-9 חולדות (6 חולדות אפילפטיות ו-3 חולדות ביקורת) בימים 52, 55, 58, 61 ו-64 לאחר SE ואיכות הפלזמה הוערכה עבור המוליזה באופן חזותי ועל ידי ספקטרופוטומטריה UV ב-414 ננומטר. כדי לקבל את הדגימה הראשונה בכל חולדה, נעשה שימוש במשיכת ואקום באמצעות מחט פרפר 21G המחוברת למזרק 1 מ"ל. בדגימה השנייה, נסיגת הטיפות ומערכת מחטי הפרפר 21G הופעלו בעת חליבת הזנב בו זמנית. כדי לקבל את הדגימה 3-5, נעשה שימוש בהליך נסיגת הטיפה מבלי לחלוב את הזנב (המתואר בשלב 9).

בעת שימוש בוואקום, הפלזמה הייתה בצבע ורוד תחת הבדיקה החזותית, וערך הספיגה הממוצע של 9 דגימות של חולדות היה 0.647 ± 0.067 (טבלה 2, איור 3). תוצאות דומות התקבלו אם משתמשים בחליבת הזנב במהלך ההליך: פלזמה בצבע ורוד עם ספיגה ממוצעת של 0.620 ± 0.043 (טבלה 2, איור 3). לעומת זאת, עם נסיגת הנפילה המופעלת על ידי כוח הכבידה ומערכת מחטי הפרפר 21G, ערכי ספיגת הפלזמה הממוצעים הופחתו באופן משמעותי (0.226 ± 0.017 ב- 58 dpSE; 0.223 ± -0.09 ב- 61 dpSE; 0.226 ± 0.018 ב- 64 dpSE; טבלה 2, איור 3) ביחס לשיטת חליבה ואקום או זנב. יתר על כן, דגימות פלזמה טיפה היו בעיקר שקופות. ערכי ספיגה גבוהים יותר (52 ו- 55 dpSE) מתואמים עם הצבע הוורוד של הדגימות (הנתונים אינם מוצגים). תוצאות אלה עשויות להצביע על כך שהשיטה האחרונה היא הטובה ביותר לקבל דגימות באיכות גבוהה מאוד לניתוחים.

Figure 1
איור 1: שלבים עיקריים בתהליך העבודה של דגימת פלזמה. (A) חומרים הדרושים למשיכת דם וחולדה במסגרת הסטריאוטקסית, מוכנים לאיסוף; (ב, ג) הגדלות של הזנב עם מחט פרפר 21G מוחדרת לווריד הזנב הצידי וטיפת הדם נופלת על דפנות צינור האיסוף עם נוגד קרישה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שלבים עיקריים בתהליך העבודה של דגימת נוזל מוחי שדרתי (CSF). (A) חומרים הדרושים לנסיגה של CSF וחולדה במסגרת הסטריאוטקסית, זמן קצר לפני האיסוף; (ב) הכנת מחט פרפר 23G על ידי חיתוך הגנת שרוול הפלסטיק שלה כך שקצה המחט החשופה ייחשף במשך 7 מ"מ כדי להבטיח חדירה נכונה לתוך מגננת הסיסטרנה; (C) ראש החולדה נוטה כלפי מטה ב-45° במהלך הגמילה. (D) הגדלה באתר הרומבואיד באמצעות מחט פרפר המוחדרת למגננת הסיסטרנה. שימו לב ל-CSF שעולה בצינור, מסומן בקצה הסמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכת איכות של דגימות פלזמה. מידת ההמוליזה נמדדה ב 414 ננומטר עבור המוגלובין חופשי על ידי ספקטרוסקופיית UV בדגימות פלזמה של 9 בעלי חיים ב 5 נקודות זמן (52, 55, 58, 61, ו 64 ימים לאחר מצב אפילפטיקוס, dpSE) בשיטות שונות: יום 52 - טכניקת ואקום; יום 55 - חליבת הזנב; ימים 58-64 נעשה שימוש בטכניקות הצניחה. הירידה בהמוגלובין החופשי בפלזמה שהושגה בטכניקת טיפה בהשוואה לשיטות ואקום וחליבת זנב הייתה משמעותית (*p <0.05 על פי ANOVA חד כיווני ומבחן ההשוואה המרובה של Tukey לאחר הוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שיעורי ההצלחה של משיכות CSF. השוואה של שיעורי ההצלחה של נסיגה חוזרת של CSF בשלוש קבוצות ניסוי של בעלי חיים המתבטאת באחוז של משיכות מוצלחות במשך 5 ימים. הערך 1 הוקצה לנסיגה מוצלחת של > 100 μL של CSF ברור; ערך האפס הוקצה למשיכות < 100 μL ו/או של CSF לא ברור. קיצורים: N/A - היעדר איסוף עקב אובדן צינורית במהלך הליך הדגימה (CT בעלי חיים בלבד); CT - משומר קשור; PT - נקב קשור; PTe - אלקטרודות טלמטריה מנוקבות מושתלות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הערכת המוליזה בדגימות פלזמה. תוצאות מדידות המוליזה ב-5 נקודות זמן בשלוש שיטות שונות של דגימת דם: יום 52 - טכניקת ואקום; יום 55 - חליבת הזנב; ימים 58-64 טכניקות הנפילה. ערכים >0.3 של ספיגה מתואמים עם צבע ורוד של דגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

העבודה הנוכחית מדגימה טכניקה קלה לשליטה של CSF ואיסוף דם בחולדות, אשר עשויה להיות שימושית לא רק למחקרים במודלים של אפילפסיה אלא גם של מצבים נוירולוגיים אחרים או מחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון או טרשת נפוצה. במחקר אפילפסיה, שני הליכי הדגימה יחד עם וידאו-EEG הם אידיאליים כאשר מחפשים מתאם בין רמות של מולקולות מסיסות שונות לבין פעילות ההתקפים. מסיבה ספציפית זו, נעשה שימוש בהקלטת וידאו-EEG רציפה: i) על מנת לאבחן נכון אפילפסיה או ii) כדי לעקוב אחר השלבים השונים של התקדמות המחלה, ו / או iii) כדי להתאים דגימה עם התרחשות של התקפים ספונטניים. טכניקות דגימה כאלה יכולות להתבצע בחולדות מורדמות, ובכך לגרום ללחץ מינימלי.

שלבים קריטיים, פתרון בעיות, מגבלות שיטה
לפרוטוקול יש כמה שלבים טכניים קריטיים. ראשית, זה יכול להיות קשה למצוא את המקום הנכון עבור אוסף CSF בניסיון הראשון. אם המפעיל מחמיץ את cisterna magna בניסיון הראשון, כל ניסוי הבא יהיה מזוהם דם, כמו החיה ידמם מפצע המחט. מנקודת מבט זו, ההצלחה באוסף תלויה במידה רבה במיומנותו של המפעיל. שנית, כמה צעדים של נסיגה בדם צריך תשומת לב מיוחדת. בפרט, קיים סיכון גבוה להמוליזה אם המפעיל משפשף את הזנב במרץ רב מדי עם אתנול, אם טמפרטורת המים המשמשים להרחבת כלי הדם של וריד הזנב גבוהה מ -42 מעלות צלזיוס, או אם הדם בצינור האיסוף מעורבב עם נוגדי קרישה אנרגטיים מדי. ייחוד נוסף של איסוף הדם בבעלי חיים אפילפטיים כרוניים הוא השפעת הברדיקרדיה שלהם על הקצב שבו הדם נושר מווריד הזנב33. אם זה איטי מדי, הדם עלול לקרוש על קירות צינור האיסוף. כדי למנוע בעיה זו, אפשרות אחת היא לפצל את הדגימה לשני צינורות איסוף, ובכך להקטין את נפח הדם/צינור. לבסוף, יש מלכודת אחת שהיא מהותית למחקרי אפילפסיה. הלחץ המתעורר על ידי מניפולציה של בעלי חיים לפני הדגימה עלול לגרום להתקפים, אשר בתורו עלול להפריע לרמות המולקולות תחת החקירה34. במידת האפשר, הכניסו את תא השראת ההרדמה לכלוב הביתי ואפשרו לבעל החיים להיכנס אליו באופן ספונטני. כשינוי של הפרוטוקול המוצע, ניתן להשתמש בריסן לביצוע נסיגת דם ללא הרדמה איזופלורנית. עם זאת, ניתן לעשות זאת בטלמטריה, אך לא בבעלי חיים קשורים, מכיוון שחולדות קשורות עלולות לאבד את שתלי הראש שלהן במהלך הליך זה.

לאחר מפעיל מאומן היטב ומאמץ מקסימלי כדי למנוע מתח, המגבלה היחידה של הפרוטוקול הנוכחי היא נפח מקסימלי שניתן למשוך מבלי לסכן את בריאות החיה. על פי התקנים הנוכחיים, מומלץ לאסוף מקסימום של 100 μL של CSF במשך 4x במשך 15 ימים בחיה אחת32. באופן דומה, מומלץ לאסוף פחות מ -10% מנפח גוף הדם הכולל בדגימה אחת ופחות מ -15% מנפח גוף הדם הכולל תוך 28 ימים30,31.

השוואה של השיטה עם טכניקות אחרות
לגישות CSF ודגימת פלזמה המוצעות בזמן יש מספר יתרונות ביחס לשיטות חלופיות קיימות. ראשית, נקב cisterna magna המשמש לדגימת CSF בחולדות אפילפטיות, הוא בעל סיכון נמוך יותר לאובדן שתל ראש בהשוואה למערכת משומרת אם הוא מחובר ל-EEG קשור. בניגוד להליכי ניקוב, הצינורית המחוברת לאלקטרודה על ידי צמנט דנטלי (מגושמת וכבדה לראשי בעלי חיים), בעוד שהיא מתבקשת על ידי חיבורים/ניתוקים חוזרים ונשנים למשיכות CSF, נוטה הרבה יותר ללכת לאיבוד במהלך מספר ימים של דגימה. ואכן, תוצאות שיעור ההצלחה מראות כיצד חלק מבעלי החיים המשומרים (N/A) אינם מגיעים לנקודות הזמן המתקדמות של הדגימה, ולכן הדגימות שלהם אובדות (טבלה 1). בנוסף, נראה כי שיטת הניקוב עדיפה על גישת הקנולציה במונחים של סטריליות טובה יותר ותגובת קרום המוח מופחתת עם עלייה מוגבלת של תכולת התאים והאלבומין ב- CSF, כפי שתועד בעבר על ידי 22,35,36 אחרים. מידת לויקוציטים CSF וזיהום אלבומין עשויה להיות חשובה לתוקף השיטות המשמשות לכימות סמנים ביולוגיים של אפילפסיה35. שנית, שיטת הנפילה החופשית של דגימת פלסמה בדם המשמשת לפעולות חוזרות ונשנות עדיפה על כל שיטת גמילה אחרת מכיוון שהיא אינה סופנית (אי התאוששות), בניגוד לעריפת ראש, ניקוב לב, כלי דם בטני/חזה או נסיגה רטרו-אורביטלית ומאפשרת דגימת דם מרובה. זה פשוט יותר מאשר טכניקות רבות גמילה ואקום דם ורידים זנב, כפי שהוא אינו דורש צינורות28,37 ומייצר דגימות פלזמה ללא המוליזה באיכות גבוהה עבור ניתוחי sncRNA נוספים התמקדו בזיהוי סמנים ביולוגיים משוערים של אפילפטוגנזה38. היעדר המוגלובין חופשי בדגימות, בעת שימוש בטכניקת דגימת הטיפות או הימנעות מחליבת זנב, אושר על ידי תוצאות ספיגה נמוכה של דגימות הפלזמה (טבלה 2) בהתאם לנהלים שפורסמו בעבר המתאימים להערכת תכולת פלזמה sncRNA39,40.

יישומים וכיוונים עתידיים
ניתן ליישם את השיטות המתוארות לעיל כדי למדוד מולקולות מסיסות בעלות עניין בכל מודל של מחלות נוירולוגיות. דוגמה ספציפית היא דגימה של נוזלים ביולוגיים לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים/פוטנציאליים לאפילפסיה. קיים צורך רפואי דחוף שלא נענה לגלות סמנים ביולוגיים אלה עבור אנשים עם אפילפסיה, במיוחד סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ורגישים / סיכון, מכיוון שהם עדיין לא קיימים.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי אפשרי בחולדות, כולל חולדות אפילפטיות, וקל להפעלה עבור אנשים מאולפים. יתר על כן, הוא מאפשר דגימות באיכות גבוהה מרובות במחקרי אורך בהתאם לעיקרון של 3Rs (כלומר, החלפה, הפחתה ועידון)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק מתוכנית העבודה Horizon 2020 של האיחוד האירופי (התקשר H2020-FETOPEN-2018-2020) במסגרת הסכם מענק 964712 (PRIME; ל- M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

נוזל מוחי שדרתי דגימת דם וריד זנב לטרלי חולדות רישומי EEG סמנים ביולוגיים מחקר אפילפסיה נסיגה CSF Cisterna Magna ניטור וידאו-EEG סמנים ביולוגיים אבחנתיים סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים דגימה ללא כאבים פולשניות מינימלית זמן הרדמה מופחת
דגימת נוזל מוחי ודם מווריד זנב לטרלי בחולדות במהלך רישומי EEG
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter