Summary
プロトコルは連続的なビデオ脳波(EEG)のモニタリングと並行して行なわれるてんかんラットからの繰り返された脳脊髄液および血のコレクションを示す。これらは、さまざまな体液分子の変化と発作活動との関連性を探るのに役立ちます。
Abstract
体液の組成は多くの生理学的および病理学的動態を反映しているため、ホルモン、成長因子、タンパク質、低分子ノンコーディングRNAなどの目的の分子を測定するために、多くの実験状況で生体液体サンプルが一般的に採取されます。具体例としては、てんかんのバイオマーカー研究における生体液のサンプリングがあります。これらの研究では、脳脊髄液(CSF)と血漿中の分子のレベルを比較することが望ましいです。てんかん動物におけるビデオ脳波モニタリングと組み合わせたCSFと血漿サンプリングの組み合わせは、推定診断および予後バイオマーカーの検証のための有望なアプローチです。ここでは、てんかんラットの大槽からのCSF離脱と側尾静脈からの採血を組み合わせた手順を、ビデオ脳波を継続的にモニターする手順について説明します。この手順には、一般的に使用される他の手法に比べて大きな利点があります。痛みや侵襲性を最小限に抑え、麻酔時間を短縮した迅速なサンプリングを可能にします。さらに、テザーおよびテレメトリーEEG記録ラットの両方でCSFおよび血漿サンプルを取得するために使用でき、数日間の実験で繰り返し使用できます。イソフルラン麻酔を短くすることでサンプリングによるストレスを最小限に抑えることで、生体液中の調査分子の真のレベルをより正確に反映する測定が期待されます。適切な分析アッセイの利用可能性に応じて、この技術を使用して、同時に脳波記録を実行しながら、複数の異なる分子のレベルを測定することができます。
Introduction
脳脊髄液(CSF)と採血は、前臨床研究と臨床研究の両方で、てんかんのバイオマーカーを特定および検証するために重要です1,2。現在、てんかんの診断とてんかんバイオマーカーに関する研究のほとんどは、脳波と神経画像に焦点を当てています3,4,5。ただし、これらのアプローチにはいくつかの制限があります。日常的な頭皮測定とは別に、多くの場合、EEGには深層電極6のような侵襲的な技術が必要です。脳イメージング法は、時間分解能と空間分解能が低く、比較的高価で時間がかかります7,8。このため、非侵襲的で低コストの生体液ベースのバイオマーカーの同定は、非常に魅力的な代替手段となります。さらに、これらの生体液バイオマーカーは、利用可能な診断アプローチと組み合わせることで、予測可能性を高めることができます。
てんかんと診断された患者は、日常的に脳波9,10と採血11,12,13,14に提出され、多くは生命を脅かす原因(すなわち、急性感染症、自己免疫性脳炎)を除外するためにCSF離脱に提出されます15。これらの血液およびCSFサンプルは、てんかんのバイオマーカーを特定することを目的とした臨床研究に使用できます。例えば、Hoggらは、ヒトのてんかんにおいて、3つの血漿tRNA断片の増加が発作の発生に先行することを発見した1、4。同様に、ヒトCSFおよび血清中のインターロイキン-1β(IL-1β)レベルは、血清に対するCSF中のIL-1βレベルの比率として表され、外傷性脳損傷後の心的外傷後てんかんの発症を予測することができる16。これらの研究は、てんかんバイオマーカー研究における体液サンプリングの重要性を強調しているが、血液中の抗てんかん薬(AED)の共創因子、病因情報の頻繁な欠如、不十分なコントロール、患者数の少なさなど、臨床試験に内在する複数の制限に直面している17,18。
前臨床研究は、てんかんの潜在的なバイオマーカーとして生体液中の分子を調査する他の機会を提供します。実際、脳波記録を行いながら、動物から血漿やCSFを採取することが可能です。さらに、サンプリングは実験の複数日にわたって繰り返し実行でき、年齢、性別、およびてんかんの侮辱に一致する多数のコントロールを使用して、研究の頑健性を向上させることができます。ここでは、EEGモニターラットの尾静脈からの血漿の並行回収を伴うシステルナマグナからCSFを得るための柔軟な技術が詳細に説明されています。提示された手法には、他の方法に比べていくつかの利点があります。バタフライニードルアプローチを用いることで、脳波電極や類似の頭部インプラントの機能を損なうことなく、CSFを複数回採取することが可能です。これは、感染のリスクが比較的高い髄腔内カテーテル抜去手順の改良を表しています。さらに、採血に使用される報告された自由落下アプローチは、血液がチューブを通過せず、真空圧が適用されないため、溶血のリスクが大幅に減少するため、尾静脈採血の他のアプローチよりも優れています。厳格な無菌条件下で行えば、動物の感染リスクは特に低くなります。また、動物の尻尾の一番端から採血を開始することで、サンプリングを数回繰り返すことができます。このような技術は習得が容易であり、中枢神経系障害の多くの前臨床試験に適用できます。
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Protocol
すべての実験手順は、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)の実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するガイドラインに従って、フェラーラ大学施設動物管理および使用委員会およびイタリア保健省(認可:D.M.603/2022-PR)によって承認されています。このプロトコルは、てんかん動物のEEG制御下で得られたラットCSFおよび血漿中の小さな非コーディングリボ核酸(sncRNA)のさらなる定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析のために特別に調整されます。オプションで、手術19、20、21の理解と改善のために、関連するJoVEビデオをご覧ください。
1.電極またはテレメーターの外科的移植のための動物の調製
注:脳定位固定装置の手術方法は、使用する脳波システムによって異なります。次の方法のセクションでは、2 種類の手術に共通する手順について説明します。
- 実験動物の世話と使用に関する現地の法律に従って維持されているSprague-Dawley(SD)ラット(オス、7〜8週齢、体重250〜290 g)を使用してください。動物を標準的な条件で飼育し、餌や飲料水を自由に利用できるようにします。
- 手術と実験プロトコルの手順の前に、数日間ラットの取り扱いを進めます。
- 電極やテレメーターの植込みには脳定位固定装置を使用してください。無菌手術の最新の基準に従ってください。滅菌済みで正常に機能する電極と送信機を使用してください。
- 電気カミソリで動物の頭を剃ります。ケタミン(45mg/kg)とキシラジン(7.5mg/kg)の混合物を腹腔内投与して麻酔を誘発し、イソフルラン麻酔(空気中1.4%、1.2mL/分)をフェイスマスクで投与し、動物の頭を脳定位固定装置に固定する。
- 両動物の後ろ足でフットパッドをつまんだ後のペダル離脱反射をテストして、適切な麻酔深度を確保し、手術が終了するまでイソフルラン麻酔を維持します。処置の全期間にわたって麻酔薬の深さを定期的にチェックしてください。
- 麻酔によるまばたき反射の喪失による角膜の損傷を防ぐために、両方の動物に十分な量の眼軟膏を塗布します。
- 動物の頭皮を液体消毒剤で徹底的に洗浄し、滅菌したメスを使用して縦方向に2cmの長さの切り傷を作ります。頭皮を開き、皮膚フラップに外科用クリップを装着して開いたままにします。
- 骨膜をそっと取り外して、ブレグマと記録電極が挿入される頭蓋骨の領域を露出させます。
2. テザー電極の外科的埋め込み
注:このプロトコルの穿刺CSF回収手順を確立する前に(詳細はステップ9を参照)、自由に動く数人の麻酔なしラットでガイドカニューレを介してCSF回収を繰り返しました。テザー電極を移植したカニューレ動物を使用して、複数のCSFサンプリングと組み合わせた長期脳波記録に対するダブルヘッドインプラントの影響を評価しました。これらの特定の実験では、以前に発表されたプロトコル22に従って、ラットに大槽にダミーのガイドカニューレが埋め込まれ、その先端が定位的に7mm挿入されました。二重インプラント手術のアプローチは、過去に一部の労働者がマイクロ透析ガイドカニューレとテザー電極移植に採用したものと同様でした23,24。
- 脳定位固定装置フレームの片方のアームを使用し、その上に電極ホルダーを取り付け、電極をホルダーに直立させます。電極の先端をブレグマの真上に移動します。ブレグマの前後座標と中外側座標を書き留め、それらを目的の座標に変換します。
- 電極の先端が頭蓋骨にほぼ触れるまで電極を下げます。穴あけ場所に印を付け、マークされた場所に頭蓋骨を穴あけします。脳や髄膜を傷つけないように注意してください。
- ネジを固定するための穴を4つ以上開け、頭蓋骨にねじ込みます。ネジを固定するための穴を開けるときは、電極のサイズに注意してください。電極のサイズは、配置された固定ネジに干渉してはなりません。
- 電極を担持した定位アームを背腹軸上にゆっくりと下げ、脳組織に入り、所望の位置で停止します。頭蓋骨にねじ込まれたネジの1つに電極アース線を固定します。
- メタクリルセメントを電極に置き、電極台座の高さの約半分を覆うネジを締めます。テザリングワイヤーの終端に合う電極の上半分は裸のままにします。
- 電極をホルダーから外し、定位アームを上げます。動物を脳定位固定装置から解放し、術後のケアを行います。
- 動物を別の回復ケージに入れ、目を覚まして歩行可能になるまで10分ごとに観察します。動物を標準的な飼育ケージに戻し、麻酔をかけていない別の動物会社に完全に回復してから戻します。
3.テレメーターの外科的移植
注意: 滅菌テレメーターのみを使用してください。テレメーターを再利用する場合は、メーカーの指示に従って、手術前にテレメーターを洗浄および滅菌してください。このプロトコルでは、脳波記録にデータサイエンスインターナショナル(DSI)テレメーターが使用されました。
- 磁石を使用してテレメトリ送信機の電源を入れ、AM周波数無線で信号をテストします。手術前に強くてクリアな信号を確認してください。必要に応じて、動作不良のテレメーターを廃棄します。
- テレメーターのリード線を成体ラットに最適な長さに短くして準備します。2本(マイナスとプラス)のリード線のシリコンコーティングを剥がし、らせん鋼のリード線を約5mm露出させます。リードの先端に長さ約2mm、幅約1mmのループ状のハンドルを作成します。
- 動物の脇腹を左肩の下と後ろで剃ります。安定化された過酸化物と第四級アンモニウム活性に基づく消毒剤で手術部位を消毒します。消毒剤を15分間作用させます。
- 動物の肩のすぐ後ろに約2cmの横方向切開を行い、送信機の配置用に約5cm3 のスペースの皮下ポケットを作ります。送信機を体の長軸と平行に置き、リード線を吻側方向に向けます。
- トランスミッターを皮下ポケットの内壁に3-0の綿縫合糸で固定します。先端が鈍いハサミを使用して、動物の脇腹と首を通る皮下トンネル(長さ約2.5 cm)を作成し、送信機ポケットをステップ1.6で動物の頭皮に行われた正中線切開に接続します。
- 両方のテレメーターリードを鉗子で取り、トンネルを通って引き上げて、頭皮の切開口から突き出るようにします。傷口クリップで頭皮の切開部からリード線を外す。
- 脳定位固定装置フレームを使用して、プラス(赤)のリードの目的の座標を個別化し、頭蓋骨に穴を開けてプラスのリードの先端にします(ステップ2.1と同様)。ネジを吻に上向きに固定するための穴をもう1つ開き、頭蓋骨にねじ込みます。
- 頭蓋骨と硬膜の下にプラス鉛の先端を挿入し、脳表面に置きます。マイナス(白)リード線のループ状の先端をネジに引っ掛けます。プラスのリードの出口とマイナスのリードの周りに少量のメタクリルセメントを置き、頭蓋骨に固定します。
- リード線を3-0の綿縫合糸で頭蓋骨の皮膚の内壁に固定します。固定リードと固定縫合糸がCSF離脱部位(すなわち、後頭隆起とアトラスの脊椎の間にひし形の外観を有する陥没性表面)に干渉しないことを確認してください。
- 頭皮の切開と脇腹の切開を3-0の綿縫合糸で閉じます。傷口に消毒剤を塗ります。これらが乾いた後にのみ、縫合された傷口に抗生物質クリームを塗ります。
4.術後のケア
- 手術後、直立してケージの周りを移動するまで、約1時間動物を監視します。低体温症を防ぐために、保温パッドの上に置いてください。動物に、感染を防ぐための全身性抗生物質と、術後の痛みを防ぐための全身性鎮痛薬を2〜3日間投与します。
- ラットが外科的処置後少なくとも7日間回復できるようにします。少なくとも1日1回、痛みや苦痛の兆候がないか3日間動物を観察します。
5. ラットにおけるてんかん重積状態の誘導
注:ラットの近心側頭葉てんかん(mTLE)を再現するために必要なてんかん重積状態(SE)誘導の詳細なプロトコルについては、Guarinoらを参照してください25。
- 術後回復の週後、動物をランダムにグループに割り当てます:(i)ビヒクルを投与する対照動物と(ii)ピロカルピンを投与するてんかん動物。てんかんグループには、ピロカルピン投与されたすべてのラットが生存またはSEを発症するわけではないため、比例して多くの動物を使用します。.
- SE導入の前日に、0.9%生理食塩水(3M)に溶解した127 mg / kgの塩化リチウムを1 mL / kgの容量として胃強制経口投与で動物に単回投与します。.SE発症までの時間の変動を減らすために、SE誘導の約14時間前にピロカルピンの有効性を高める動物のリチウムを投与します。.
- リチウム投与の約14時間後、ラットにメチルスコポラミン(1 mg / kg、皮下)を単回注射します。.
- メチルスコポラミン投与の30分後に、ラットにピロカルピン(50 mg / kg、i.p.)を単回注射してSEを誘導します。
- ピロカルピン注射は動物の典型的な行動を誘発します:初期の部分発作(ピロカルピン投与後5分以内の振動と頭のうなずきの動き)は、25〜30分以内に再発性全身性けいれん(SE)に発展します。.30分以内にSEを発症しないラットには、ピロカルピンの追加用量(25 mg / kg、i.p.)を投与し、それでもSEを発症しない場合は、研究から除外します(SEノンレスポンダー)。.
- ピロカルピン注射の直後から5分ごとにラットの発作行動を観察し、スコアリングします。.27 のスコアリングにはラシーン スケールを使用します。
- ジアゼパム(10 mg / kg)、フェノバルビタール(25 mg / kg)、およびスコポラミン(1 mg / kg)の薬物カクテルのi.p.投与により、発症後2時間SEを中断します。.
- 4時間後にこのカクテルをネズミにもう一度与えます。最後に、さらに4時間後、発作活動を完全に停止するために、ラットに最後の薬物混合物(ジアゼパム10 mg / kgとスコポラミン1 mg / kg)を与えます。.
- 動物に生理食塩水(0.9%NaCl溶液1mL、pHを7.0に調整)を注射し、SE後の2〜3日間10%ショ糖溶液を与えて、SE後の体重減少からの回復を促進します。
- SE後の生存動物を、特定の実験プロトコルの要件に従って、異なる実験グループにランダムに割り当てます。てんかんラットでのさらなる実験には、次の包含/除外基準を使用します:ピロカルピン投与後1時間以内の痙攣性SEの発症、SE後の最初の1週間の体重増加、およびEEG登録の関心のある脳領域における電極の正しい位置付け25。
6. てんかんラットのテザービデオ脳波と発作活動の解析
注:このセクションでは、標準条件下で自由に動くシングルハウスのラットの脳波信号を記録するための実験手順について説明します。ケージには、動物や録音ケーブルが引っかかる可能性のある物体を入れないでください。対処すべき科学的問題に応じて、いくつかのパラメータを分析できます。てんかん研究の場合、脳波の痕跡をスクリーニングして、電気発作と運動発作を認識します。発作を特定するために使用される最も一般的なパラメータは、発作性電気的活動の振幅、頻度、および持続時間です。
- 動物を録音室の清潔なケージに入れて、慣れさせ、新しい環境によって引き起こされるストレスを軽減します。動物のケージをファラデーケージに入れて、環境電磁界によるEGG信号の汚染を防ぎます。
- 録音ケーブルの一方の端を録音デバイスに接続します。電圧計を使用して電位を測定し、接地電極と参照電極を区別します。
- 記録ケーブルのもう一方の端をラットの頭に固定された電極に接続します。この目的のために、ケーブルプラグを電極コネクタに挿入するときは、動物の頭のセメントカバーを持ち、ネズミの頭に圧力をかけないようにします。
- 記録ケーブルの重量を相殺して、ケーブルをねじるリスクを防ぎながら、動物の自由な動きを可能にします。これを行うには、カウンターバランスアームまたは整流子を使用します。記録ケーブルが相殺されていても、動物が餌にたどり着くために立ち上がらなければならない給餌ホルダーではなく、ケージの中に入れてください。
- 登録を開始する前に、EEGからのデータの取得と処理に使用されるすべての設定を確認してください。
注:このプロトコルは、EEG記録を実行するために必要な装置の紹介を提供しませんが、EEG信号のアーチファクトやノイズを避けるために、適切なフィルタリングとサンプリングレートを適用する必要があります。- ルーチン実験では、サンプルレートを500Hz、増幅ゲインを5000倍に設定します。ノッチ フィルターに加えて 0.005 Hz フィルターを使用して信号をフィルター処理し、50 Hz 帯域 (ヨーロッパ諸国に固有) の周囲の電気的活動を破棄します。
- ビデオ記録と脳波記録の両方を開始し、特定の周波数帯域の電力を経時的にチェックして、トレースが予想される脳波信号と一致することを確認します。動物への介入を開始する前に、ベースライン期間を記録します。
- 動物と脳波の痕跡を定期的にチェックしてください。ラットヘッド内の電極コネクタから記録ケーブルが外れることも珍しくありません。このような場合は、ラットヘッドの電極を記録ケーブルに再度接続し、脳波信号がクリアになっているか確認してください。
- 脳波信号を手動または市販のソフトウェアを使用して自動的に分析します。手動で分析する場合は、脳波記録をスクリーニングして、発作のような活動を特定します。ソフトウェアを使用する場合は、電気的活動の振幅、頻度、持続時間など、発作イベントの主要なパラメータを設定します。
注:単回発作は、振幅がベースラインの3倍、周波数が5Hz以上、持続時間が少なくとも5秒22の電気的活動によって特徴付けられる場合があります。 - 使用する方法に関係なく、脳波と同時に収集された同期ビデオ録画をチェックして、けいれん発作の可能性を確認します。
7. てんかんラットにおけるテレメトリービデオ脳波と発作活動の解析
注:このセクションでは、標準的な条件下で、単室で自由に動くラットのラジオテレメトリーEEG信号を記録するための実験手順について説明します。このプロトコルは、市販のテレメトリシステムに基づいています。ただし、いくつかのテレメトリシステムは、機能仕様と技術仕様がわずかに異なります。システムは、ラボの要件と研究目標に応じて選択する必要があります。
- 動物のホームケージを信号受信機の上に置きます。信号受信機をデータ収集システムに接続し、これをデータ収集ソフトウェアを備えたコンピューターに接続します。
- ラットの脇腹に挿入されたテレメーターの近くに磁石を配置して、無線周波数テレメトリーインプラントをオンにします。無線デバイスを使用して信号をテストします。ユニバーサル無線デバイスを使用してテレメーターをテストし、明確なビープ音が聞こえるとテレメーターがアクティブになっていることを示し、焼けるような音はテレメーターが非アクティブになっていることを示します。
注意: 録音時間を定義する前に、無線周波数送信機のバッテリーの寿命を考慮する必要があります。 - 取得ソフトウェアをセットアップし、テレメトリ信号とビデオシステムを同期して、EEGデータとビデオデータを同時に取得します。埋め込まれた各送信機に1つの信号受信機を割り当て、送信機の校正値を設定します。サンプルレートを1000Hz、ノイズ検出を-500mV〜+500mV、積分間隔を100msに設定します。ローパスフィルターとハイパスフィルターは使用しないでください。
- テレメトリとビデオ録画を開始します。てんかん様活性を取得する前に、長期ベースライン記録を実行します。.ステップ6.8および6.9の説明に従ってEEG信号を分析します。
8.尾静脈からの採血の手順
手記。真空採血システムは、バタフライニードル(23 G x 3/4 x 12(0.8 mm x 19 mm x 305 mm))で構成されています。採血技術は、オペレーター1人で簡単に行うことができ、手順は約5分で完了します。
- 回収の直前に、バタフライニードルとそのチューブを蒸留水で1%K2EDTAでコーティングする、すなわち、1 mLシリンジを使用してK2EDTA溶液をシステムから引き込み、排出する。吸引せずに、一滴ずつ血液を採取するために、針のすぐ後ろのチューブを切断します(図1A)。
- ラットを誘導チャンバーに入れ、イソフルラン(空気中1.4%、1.2 mL/分)で麻酔します。脳定位固定装置に切り替え、フェイスマスク越しに麻酔を維持します。動物の下に加熱パッドを置き、尻尾の一部をパッドに直接接触させます。
- 外側尾静脈が上部に保たれるように、動物の背中を横にそっと動かします。
- 尾部を温水(42°C)に2分間浸して、側静脈を拡張します。尾を70%エタノールで拭いて、静脈をより目立たせます。通常の白熱電球を使用して尾に暖かい光を当てます。
- 21Gバタフライニードルを側尾静脈に深さ5mm、角度20°で挿入します。抗凝固剤として5 mgのK2EDTAを含む500 μLの真空採取チューブに血液を採取します(図1B、C)。
- 針を外し、穿刺部位に圧力をかけて血液の流れを止めます。ネズミをホームケージに戻します。
- チューブを10回静かに反転させて、血液中の抗凝固剤を混合します。氷に約1.5cmの深さの穴を開けて、収集チューブを収容します。サンプルを静かに垂直に氷の上に置きます。
- 血液サンプルを冷蔵遠心分離機(4°C)で1300 x g で10分間遠心分離し、血漿を分離します。この手順は最大1時間以内に実行してください。
- 赤血球層と白血球層を避けて、約200μLの血漿を摂取します。回収した血漿を0.2 mLの滅菌マイクロチューブに入れます。必要に応じて、遠心分離後、4°Cで最大1時間保存してください。
- 品質管理のために5μLのサンプルを取っておきます。分析するまでサンプルを-80°Cで保管してください。
注:一部の研究者28が推奨した場合でも真空を使用したり、ステップ8.5で説明されている手順中に尾を搾乳してより多くの血液を採取したりしないでください(詳細については、代表的な結果を参照してください)。ラットでは、一度に抜くことができる血液の最大量は、総血液量の<10%(すなわち、250〜300gのラットでは約1.6〜1.9mL)、1か月で総血液量の<15%(約2.64mL)であることに注意してください29。このプロトコルでは、単一の動物の5回までのための単一の機会の血の最大500 μLが使用される30,31。
9. CSF収集手順
手記。この技術は1人のオペレーターで簡単に行うことができ、手順には約2〜4分かかります。CSFの採取に使用される材料は、低コストの使い捨て真空バタフライニードルと抽出チューブです。このプロトコルでは、滅菌シリンジに接続された蝶の羽の点滴セットを使用して真空を作り出します(図2A)。
- 23Gバタフライニードルを準備し、プラスチック製のスリーブ保護を切断して、裸の針の端が7mm露出するようにして、引き出し中に大槽に7mm以上の深さまで浸透しないようにします(図2B)。
- ポリマーチューブを装着したバタフライニードルを1 mLシリンジに接続します。
- ラットを誘導チャンバーに入れ、イソフルラン(空気中1.4%、1.2 mL/分)で麻酔をかけます。イソフルランの流れを脳定位固定装置に切り替え、フェイスマスクを通して投与される麻酔を維持します。ネズミの後頭と首の毛をカミソリで取り除きます。
- ネズミの頭をイヤーバーで固定します。動物の頭を垂直に約45°下げ、脳定位固定装置フレームのノーズバーを下に移動します(図2C)。動物の後頭部を検査し、後頭隆起とアトラス脊椎の間にひし形の面を持つわずかにくぼんだ表面を見つけます。
- この表面を70%エタノールでこすって、見やすくして消毒します。
- 菱形のくぼんだ面の中央に蝶針を垂直に挿入し、針のプラスチックスリーブ保護のサイズに切断して動きがブロックされるまで、CSF収集を行います(図2D)。1 mLのシリンジピストンを静かに引き戻して、CSFがニードルをゆっくりと流れるようにします。
- 約 100 μL の CSF をポリマーチューブに集めます(図 2D)。血液やその他の目に見える汚染が入らないようにしてください。ポリマーチューブをバタフライニードルのすぐ近くでつまみ、この時点でチューブを切断します。
- 透明な(汚染されていない)サンプルをシリンジに引き込みます。目に見える汚染が収集チューブに入った場合は、汚染されたサンプルを廃棄してください。
- サンプルを滅菌済み 0.2 mL マイクロチューブに排出し、氷上で最大 1 時間保存します。
- 動物の頭のCSF離脱部位を消毒します。ラットを脳定位固定装置から外し、ケージに戻します。
- 品質管理のために2 μLのサンプルを取っておきます。サンプルの残りの部分は、さらに分析するために-80°Cで保管してください。
注:ラットでは、複数のCSF回収が繰り返し行われる場合、各コレクションで回収される推奨容量は100μLです32。このプロトコルでは、1 匹の動物で 1 回に最大 100 μL の CSF を使用し、15 日間で最大 5 倍の離脱を行いました。
10. サンプルの質の分光光度法の分析
注:CSFおよび血漿サンプルを適切に収集した後、サンプルは分光光度計分析の準備が整い、特別な取り扱いは必要ありません。414 nmの紫外分光光度法でヘモグロビン吸光度を測定し、サンプルの溶血リスクを評価します。ラットサンプルでは、カットオフ吸光度値 0.25 を使用します。この制限の選択は、その後のqPCR分析と、sncRNA定量のための特定の要件によって異なります。
- UV分光光度計のスイッチを入れます。単一波長414nmの吸光度測定法をプラズマまたはCSFで選択します。「 次へ」をクリックします。
- 1mmのキュベットを精製水ですすいでください。5 μLの70%エタノールをキュベット測定スポットに入れます。ペーパータオルで乾かし、糸くずの出ないティッシュペーパーでこすります。完全に透明であるかどうかを確認します。
- 1.5μLの精製水を1mmのキュベットに入れて閉じます。キュベットを分光光度計の測定室に挿入し、 ブランク ボタンをクリックしてブランクサンプルの吸光度を測定します。414nmでの吸光度値が0.000であることを確認してください。
- キュベットをペーパータオルで乾かし、糸くずの出ないティッシュペーパーで拭きます。完全に透明であるかどうかを確認します。
- 1.5 μLのサンプルを1mmキュベットに入れて閉じます。キュベットを分光光度計の測定室に挿入します。[ サンプル ]ボタンをクリックして、サンプルを測定します。414 nmでのサンプルの吸光度を確認し、注釈を付けます。
- 利用可能なすべてのサンプルのヘモグロビン吸光度の定量化を進めます。血漿またはCSFサンプルよりも先にブランクサンプルを測定し、 ブランク ボタンと サンプル ボタンを交互にクリックします。
- A414 nm < 0.25 のサンプルを -80 °C で保存し、A414 nm が 0.25 の場合はサンプル>廃棄します。
- 1mmのキュベットを精製水と70%エタノールで順番にすすぎます。キュベットを乾かします。
- 空のキュベットを測定チャンバーに閉じて、粉塵を防ぎます。分光光度計のスイッチを切ります。
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Representative Results
SE後1か月で電極を埋め込んだ9匹の対照ラットと18匹の慢性てんかんラットで実施されたさまざまなCSFおよび採血手順の結果が、成功率の観点から報告されています。移植後、すべてのラットを1か月間ビデオ脳波でモニターし、その間、実験の最後の2週間(すなわち、SE後52、55、58、61、および64日目)に3日ごとにCSFと血液を5回回収しました。異なる動物における複数の離脱からのデータを使用して、双頭インプラントを授造したラット(CSF離脱のためにカニューレ挿入)におけるCSF採取の成功率と、係留またはテレメトリー電極のみでCSF採取の成功率(システルナマグナ穿刺によって実施)を比較しました(表1)。異なる動物において、真空採血または尾搾乳が血漿サンプルの品質に与える影響を評価しました(表2)。この目的のために、遊離ヘモグロビンの検出に414nmの紫外分光光度法分析が使用されました。統計解析には、市販のソフトウェアを使用し、Kruskal-Wallisまたは事後テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を使用しました(p<0.05は統計的に有意であると見なされます)。データは平均±SEMとして表されます。
カニューレおよび穿刺ラットにおける複数のCSFサンプリングの成功率
CSFは、ラットの3つのグループで2週間以内に5回サンプリングされています:(i)カニューレおよびテザー電極移植ラット(動物のCTグループ);これらでは、CSFの回収は、ダミーガイドカニューレとPTFEチューブジョイントを介して1mLシリンジに実行されました。(ii)穿刺(ステップ9)および係留電極埋め込みラット(PT群)、(iii)穿刺および遠隔測定電極埋め込みラット(PTeグループ)。グループごとに合計9匹の動物(てんかんラット6匹と対照ラット3匹)を使用しました。5回以上の成功したコレクションの数を評価しました。成功率は穿刺ラットでも同様で、テグリング動物では86.7%±5.8%、遠隔測定電極移植動物では88.9%±4.8%であった。代わりに、カニューレを装着したラットでは、有意差がなくても、その割合は低下しました(71.1%±8.9%、 表1)。このような結果は、動物の頭部のカニューレがCSFサンプリングの繰り返しを妨げ、縦断的研究を損なう可能性があることを示している。穿刺技術は、電極を埋め込まれた動物における複数のCSF回収により適しています。
真空搾乳とテール搾乳が血漿採取方法に与える影響
SE後52、55、58、61、および64日目に9匹のラット(てんかんラット6匹と対照ラット3匹)から5回採血し、血漿の質を目視および414nmのUV分光光度法によって溶血について評価しました。各ラットで最初のサンプルを採取するために、1 mLシリンジに取り付けられた21Gバタフライニードルによる真空引き抜きを採用しました。2番目のサンプルでは、テールを同時に搾乳する際に、ドロップの引き出しと21Gバタフライニードルシステムを使用しました。3〜5番目のサンプルを得るために、尾部を搾乳しない滴下回収手順(ステップ9で説明)を使用しました。
真空を用いた場合、血漿は目視検査でピンク色に着色し、9ラット試料の平均吸光度値は0.647±0.067であった(表2、図3)。手順中に尾部搾乳を採用した場合も同様の結果が得られました:平均吸光度が0.620±0.043のピンク色の血漿(表2、図3)。対照的に、重力を利用した液滴回収と21Gバタフライニードルシステムでは、平均血漿吸光度値が有意に低下しました(58 dpSEで0.226 ± 0.017、61 dpSEで0.223 ± -0.09、64 dpSEで0.226±0.018;表2、図3)を真空搾乳法または尾搾乳法に関して。さらに、滴下血漿サンプルは主に透明でした。吸光度の値が高い(52 dpSE および 55 dpSE)と、サンプルのピンク色と相関していました(データは示していません)。これらの結果は、分析のために非常に高品質のサンプルを得るには、最後の方法が最適であることを示唆している可能性があります。
図1:プラズマサンプリングワークフローの主なステップ。 (A)採血と脳定位固定装置フレーム内のラットに必要な材料で、収集の準備ができています。(B、C)外側尾静脈に21Gのバタフライ針を挿入した尾の倍率と、抗凝固剤で採取管の壁を流れ落ちる血滴。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:脳脊髄液(CSF)サンプリングワークフローの主なステップ。 (A)採取直前の脳髄液回収および脳定位固定装置フレーム内のラットに必要な材料。(B)23Gバタフライニードルの準備は、裸針の端が7mm露出するようにプラスチックスリーブ保護を切断して、システルナマグナへの正しい浸透を確保します。(C)ラットの頭は、離脱中に45°下向きに傾いています。(D)菱形部位を拡大し、蝶針を大槽に挿入した。マーカーの先端で示されているチューブ内で上昇するCSFに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:血漿サンプルの品質評価。 5 つの時点 (52、55、58、61、および 64 日後のてんかん重積状態、dpSE) の 9 匹の血漿サンプル中の UV 分光法により、遊離ヘモグロビンの溶血度を 414 nm で測定します。55日目-尾の搾乳。58-64日目 ドロップ技術が採用されました。滴下法で得られた血漿中の遊離ヘモグロビンの減少は、真空搾乳法およびテール搾乳法と比較して有意でした(*p <0.05 一元配置分散分析および事後テューキーの多重比較検定による)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:CSF離脱の成功率 3つの実験動物群におけるCSF離脱の反復成功率の比較を、5日間にわたる離脱成功率として表した。値 1 は、> 100 μL の透明 CSF の回収に成功した場合に割り当てられました。ゼロ値は、100 μL<および/または不明瞭なCSFの離脱に割り当てられました。略語: N/A - サンプリング手順中のカニューレの喪失による収集の欠如(CT動物のみ)。CT - カニューレテザー;PT - 穿刺されたテザー。PTe - 穿刺されたテレメトリ電極が埋め込まれています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:血漿サンプル中の溶血の評価。 採血の3つの異なる方法を使用した5つの時点での溶血測定の結果:52日目-真空技術。55日目-尾の搾乳。58-64日目ドロップテクニック。吸光度の>0.3値は、サンプルのピンク色と相関していました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、ラットにおけるCSFと採血の習得が容易な手法を示しており、てんかんのモデルだけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症などの他の神経疾患や疾患の研究にも有用である可能性がある。てんかんの研究では、さまざまな可溶性分子のレベルと発作活動の間の相関関係を追求する場合、ビデオ脳波と組み合わせた両方のサンプリング手順が理想的です。この特定の理由から、連続的なビデオ脳波記録が採用されました:i)てんかんを正しく診断するため、またはii)疾患進行のさまざまな段階を監視するため、および/またはiii)サンプリングを自然発作の発生と相関させるため。このようなサンプリング技術は、麻酔をかけたラットで実施できるため、ストレスを最小限に抑えることができます。
重要な手順、トラブルシューティング、メソッドの制限
このプロトコルには、いくつかの重要な技術的ステップがあります。まず、最初の試行でCSF収集の正しい場所を見つけるのは難しい場合があります。オペレーターが最初の試みでシステルナマグナを逃した場合、動物は針の傷から出血するため、その後の試験は血液が汚染されます。この観点から、コレクションの成功はオペレーターのスキルに大きく依存します。第二に、採血のいくつかのステップには特別な注意が必要です。特に、術者が尾部をエタノールで激しくこすったり、尾静脈の血管拡張に使用した水の温度が42°Cを超えたり、採取管内の血液が抗凝固剤と激しく混ざりすぎたりすると、溶血のリスクが高くなります。慢性てんかん動物における採血のもう一つの特徴は、尾静脈から血液が脱落する速度に対する徐脈の影響である33。これが遅すぎると、血液が採取チューブの壁に凝固する可能性があります。この問題を回避するには、サンプリングを2つの採取チューブに分割し、血液/チューブの量を減らす方法の1つがあります。最後に、てんかん研究に内在する落とし穴が1つあります。サンプリング前の動物操作によって引き起こされるストレスは、発作を誘発する可能性があり、それが調査中の分子のレベルに干渉する可能性があります34。可能な限り、麻酔導入室をホームケージに入れ、動物が自発的に入室できるようにします。提案されたプロトコルの修正として、拘束具を使用して、イソフルラン麻酔なしで採血を行うことができます。ただし、これはテレメトリーでは実行できますが、テザーされたラットはこの手順中に頭部インプラントを失う可能性があるため、テグリングされた動物では実行できません。
よく訓練されたオペレーターがいて、ストレスを避けるために最大限の努力をしている現在のプロトコルの唯一の制限は、動物の健康を損なうことなく引き出すことができる最大量です。現在の基準によれば、1匹の動物で15日間にわたって最大100μLのCSFを4回採取することが推奨されている32。同様に、1回のサンプリングで総血液量の10%未満を収集し、28日間で総血液体量の15%未満を収集することが提案されています30,31。
他の手法との比較
提案された時間分解CSFおよび血漿サンプリングアプローチには、既存の代替方法に関していくつかの利点があります。第一に、てんかんラットのCSFのサンプリングに使用される槽マグナ穿刺は、つなぎ型脳波と組み合わせた場合、カニューレ挿入システムと比較して頭部インプラント損失のリスクが低くなります。穿刺手順とは対照的に、歯科用セメント(動物の頭にはかさばり、重い)で電極に取り付けられたカニューレは、CSFの引き出しに繰り返し取り付け/剥離することで勧誘されますが、数日間のサンプリングで失われる可能性がはるかに高くなります。実際、成功率の結果は、一部のカニューレ動物(N/A)が高度なサンプリング時点に到達せず、それぞれのサンプルが失われることを示しています(表1)。さらに、穿刺法は、以前に他の22,35,36によって文書化されているように、CSFの細胞およびアルブミン含有量の増加が制限され、より優れた無菌性と髄膜反応の減少という点で、カニューレ法よりも優れているようです。CSF白血球およびアルブミン汚染の程度は、てんかんバイオマーカーの定量化に用いられる方法の妥当性にとって重要である可能性がある35。第二に、反復測定に使用される血漿サンプリングの自由落下滴法は、斬首、心臓穿刺、腹部/胸部血管、眼窩後離脱とは異なり、終末期(非回復)ではなく、複数回の採血を可能にするため、他のどの離脱方法よりも優れています。これは、チューブを必要とせず28,37、てんかん発生の推定バイオマーカーの同定に焦点を当てたさらなるsncRNA分析のための高品質の溶血のない血漿サンプルを生成するため、多くの尾静脈血液真空回収技術よりも単純です38。サンプル中の遊離ヘモグロビンの欠如は、ドロップサンプリング技術を採用した場合、またはテール搾乳を回避した場合、sncRNA血漿含有量の評価に適した以前に公開された手順に沿った血漿サンプルの低吸光度結果(表2)によって確認されました39,40。
用途と今後の方向性
上述した方法は、神経疾患の任意のモデルにおいて目的の可溶性分子を測定するために適用され得る。具体例としては、てんかんバイオマーカーの潜在的/推定的同定のための生体液のサンプリングがあります。てんかん患者のためのこれらのバイオマーカー、特に予後および感受性/リスクバイオマーカーはまだ存在しないため、これらを発見する緊急のアンメットメディカルニーズがあります。
結論として、本プロトコルは、てんかんラットを含むラットで実行可能であり、訓練を受けた個人にとって作動が容易である。さらに、3R(すなわち、置換、削減、精緻化)の原則に準拠した縦断的研究における複数の高品質のサンプリングを可能にします41。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Work Programme(H2020-FETOPEN-2018-2020)からの助成金契約964712(PRIME;M. Simonato)に基づく助成金の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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