Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Prøvetaking av cerebrospinalvæske og blod fra lateral halevene hos rotter under EEG-opptak

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

Protokollen viser gjentatte cerebrospinalvæsker og blodansamlinger fra epileptikere utført parallelt med kontinuerlig monitorering av video-elektroencefalogram (EEG). Disse er medvirkende til å utforske mulige koblinger mellom endringer i forskjellige kroppsvæskemolekyler og anfallsaktivitet.

Abstract

Fordi sammensetningen av kroppsvæsker gjenspeiler mange fysiologiske og patologiske dynamikker, blir biologiske væskeprøver ofte oppnådd i mange eksperimentelle sammenhenger for å måle molekyler av interesse, for eksempel hormoner, vekstfaktorer, proteiner eller små ikke-kodende RNA. Et spesifikt eksempel er prøvetaking av biologiske væsker i forskningen av biomarkører for epilepsi. I disse studiene er det ønskelig å sammenligne nivåene av molekyler i cerebrospinalvæsken (CSF) og i plasma, ved å trekke CSF og plasma parallelt og vurdere tidsavstanden til prøvetakingen fra og til anfall. Den kombinerte CSF- og plasmaprøvetakingen, kombinert med video-EEG-overvåking hos epileptiske dyr, er en lovende tilnærming for validering av antatte diagnostiske og prognostiske biomarkører. Her beskrives en prosedyre med kombinert CSF-seponering fra cisterna magna og blodprøvetaking fra laterale haleven hos epileptiske rotter som kontinuerlig overvåkes av video-EEG. Denne prosedyren gir betydelige fordeler i forhold til andre vanlige teknikker. Det tillater rask prøvetaking med minimal smerte eller invasivitet, og redusert anestesitid. I tillegg kan den brukes til å oppnå CSF- og plasmaprøver i både bundet og telemetri EEG-registrerte rotter, og den kan brukes gjentatte ganger over flere dager med eksperiment. Ved å minimere belastningen på grunn av prøvetaking ved å forkorte isoflurananestesi, forventes tiltak å reflektere mer nøyaktig de sanne nivåene av undersøkte molekyler i biofluider. Avhengig av tilgjengeligheten av en passende analytisk analyse, kan denne teknikken brukes til å måle nivåene av flere, forskjellige molekyler mens du utfører EEG-opptak samtidig.

Introduction

Cerebrospinalvæske (CSF) og blodprøvetaking er viktig for å identifisere og validere biomarkører for epilepsi, både i preklinisk og klinisk forskning 1,2. I dag fokuserer diagnosen epilepsi og det meste av forskningen på epilepsibiomarkører på EEG og neuroimaging 3,4,5. Disse tilnærmingene presenterer imidlertid flere begrensninger. Bortsett fra rutinemessige hodebunnsmålinger, krever EEG i mange tilfeller invasive teknikker som dybdeelektroder6. Hjerneavbildningsmetoder har dårlig tidsmessig og romlig oppløsning og er relativt dyre og tidkrevende 7,8. Av denne grunn vil identifisering av ikke-invasive, lave kostnader og biofluidbaserte biomarkører gi et svært attraktivt alternativ. I tillegg kan disse biofluidbiomarkørene kombineres med tilgjengelige diagnostiske tilnærminger for å skjerpe deres prediktivitet.

Pasienter diagnostisert med epilepsi blir rutinemessig sendt til EEG 9,10 og blodprøvetaking 11,12,13,14, og mange også til CSF-abstinens for å utelukke livstruende årsaker (dvs. akutte infeksjoner, autoimmun encefalitt)15. Disse blod- og CSF-prøvene kan brukes i klinisk forskning med sikte på å identifisere biomarkører for epilepsi. For eksempel har Hogg og medarbeidere funnet at en økning i tre plasma tRNA-fragmenter går foran anfallsforekomst i human epilepsi14. Tilsvarende kan interleukin-1beta (IL-1β) nivåer i humant CSF og serum, uttrykt som forholdet mellom IL-1β-nivåer i CSF over serum, forutsi posttraumatisk epilepsiutvikling etter traumatisk hjerneskade16. Disse studiene fremhever viktigheten av biofluidprøvetaking for epilepsibiomarkørforskning, men de står overfor flere begrensninger som er iboende for kliniske studier, for eksempel den medstiftende faktoren for antiepileptika (AED) i blod, den hyppige mangelen på etiologiinformasjon, utilstrekkelige kontroller, beskjedent antall pasienter og andre17,18.

Preklinisk forskning gir andre muligheter for å undersøke molekyler i biofluider som potensielle biomarkører for epilepsi. Det er faktisk mulig å trekke plasma og/eller CSF fra dyr mens du utfører EEG-registreringer. Videre kan prøvetaking utføres gjentatte ganger over flere dager av forsøket, og en rekke alder, kjønn og epileptiske fornærmelsesmatchede kontroller kan brukes til å forbedre studiens robusthet. Her beskrives en fleksibel teknikk for å oppnå CSF fra cisterna magna med parallell seponering av plasma fra halevenen hos EEG-monitorerte rotter i detalj. Den presenterte teknikken har flere fordeler i forhold til alternative metoder. Ved å bruke en sommerfuglnåltilnærming, er det mulig å samle CSF flere ganger uten at det går ut over funksjonen til EEG-elektroder eller lignende hodeimplantater. Dette representerer en forbedring av intratekale kateterabstinensprosedyrer, som er forbundet med en relativt høy infeksjonsrisiko. I tillegg er den rapporterte fritt fallfall-tilnærmingen som brukes til blodoppsamling, overlegen andre tilnærminger til tilbaketrekking av blod i halevene på grunn av den sterkt reduserte risikoen for hemolyse, på grunn av at blod ikke passerer gjennom slangen og ingen vakuumtrykk påføres. Hvis det utføres under strenge bakteriefrie forhold, er det spesielt lav risiko for infeksjon for dyr. I tillegg, ved å starte bloduttakene i enden av dyrets haler, kan prøvetaking gjentas flere ganger. Slike teknikker er enkle å mestre og kan brukes i mange prekliniske studier av sykdommer i sentralnervesystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer er godkjent av University of Ferrara Institutional Animal Care and Use Committee og av det italienske helsedepartementet (autorisasjon: D.M. 603/2022-PR) i samsvar med retningslinjene som er beskrevet i De europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24. november 1986 (86/609/EØF) om beskyttelse av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål. Denne protokollen er spesielt justert for ytterligere kvantitative polymerasekjedereaksjonsanalyser (qPCR) av små ikke-kodende ribonukleinsyre (sncRNA) i CSF hos rotter og plasma oppnådd under EEG-kontroll hos epileptiske dyr. Etter eget valg, vennligst se den relaterte JoVE-videoen for en bedre forståelse og forbedringer av operasjonen 19,20,21.

1. Forberedelse av dyr for kirurgisk implantasjon av elektroder eller telemetre

MERK: Den stereotaksiske kirurgiske teknikken varierer i henhold til EEG-systemet som brukes. Følgende metodedel inneholder en beskrivelse av trinnene som er felles for de to operasjonstypene.

  1. Bruk Sprague-Dawley (SD)-rotter (hannrotter, 7-8 uker gamle, veier 250-290 g) som vedlikeholdes i samsvar med lokale lover for pleie og bruk av forsøksdyr. Hus dyrene under vanlige forhold med fri tilgang til mat og drikkevann.
  2. Fortsett med å håndtere rotter i noen dager før operasjonen og de eksperimentelle protokollprosedyrene.
  3. Bruk et stereotaktisk apparat for elektroder eller telemetre implantasjon. Følg gjeldende standarder for aseptiske operasjoner. Bruk sterile og godt fungerende elektroder og sendere.
  4. Barber dyrets hode med den elektriske barberhøvelen. Indusere anestesi i dyret med blandingen av ketamin (45 mg / kg) og xylazin (7,5 mg / kg) administrert intraperitoneal (i.p.), legg deretter til isoflurananestesi (1,4% i luft, 1,2 ml / min) levert gjennom en ansiktsmaske og fest dyrets hode inn i det stereotaktiske apparatet.
  5. Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å teste pedal tilbaketrekningsrefleks etter fotpute klemme på begge dyrs bakføtter og opprettholde isofluran anestesi til slutten av operasjonen. Kontroller regelmessig bedøvelsesdybden for hele prosedyrens varighet.
  6. Påfør en tilstrekkelig mengde øyesalve på begge dyrs øyne for å forhindre hornhinneskader på grunn av tap av blinkrefleks forårsaket av anestesi.
  7. Rengjør dyrets hodebunn grundig med flytende desinfeksjonsmiddel og lag et langsgående 2 cm langt kutt med en sterilisert skalpell. Åpne hodebunnen og bruk kirurgiske klemmer på hudklaffene for å holde den åpen.
  8. Løsne periosteum forsiktig for å eksponere bregmaen og området av skallen gjennom hvilken opptakselektroden skal settes inn.

2. Kirurgisk implantasjon av bundet elektroder

MERK: Før etablering av punkteringsprosedyren for CSF i denne protokollen (se trinn 9 for detaljer), ble det utført gjentatte CSF-uttak via guidekanyle i noen få fritt bevegelige ikke-bedøvede rotter. Cannulated dyr implantert med tethered elektroder ble brukt for å evaluere effekten av dobbelthodeimplantater på langsiktig EEG-opptak kombinert med flere CSF-prøvetaking. I disse spesifikke forsøkene ble rotter implantert med en dummy guidekanyle plassert i cisterna magna, hvis spiss ble satt inn 7 mm i den stereotaktisk, i henhold til tidligere publiserte protokoller22. Dobbeltimplantatkirurgiske tilnærminger var lik de som ble vedtatt av noen arbeidere tidligere for mikrodialyseguidekanyler og bundet elektrodeimplantasjon23,24.

  1. Bruk en arm av den stereotaksiske rammen, monter elektrodeholderen på den og sett elektroden oppreist i holderen. Beveg elektrodespissen nøyaktig over bregma. Skriv ned de anteroposterior og mediolaterale koordinatene til bregma og oversett dem til de ønskede koordinatene.
  2. Senk elektroden til spissen nesten berører skallen. Merk borestedet og bor skallen på det markerte stedet. Vær forsiktig så du ikke skader hjernen og hjernehinnene.
  3. Lag fire eller flere hull for forankring av skruer og skru dem inn i skallen. Vær oppmerksom på størrelsen på elektroden når du lager hullene for forankring av skruer. Elektrodestørrelsen skal ikke forstyrre de plasserte forankringsskruene.
  4. Senk sakte den stereotaktiske armen som bærer elektroden på dorsoventral aksen, gå inn i hjernevevet, og stopp ved ønsket posisjon. Fest elektrodens jordledning rundt en av skruene som er skrudd inn i skallen.
  5. Sett metakrylsementen på elektroden og skruene som dekker omtrent halvparten av elektrodens sokkelhøyde. La den øvre halvdelen av elektroden, som passer til tethering-ledningens slutt, være bar.
  6. Slipp elektroden fra holderen og løft den stereotaktiske armen. Frigjør dyret fra det stereotaksiske apparatet og gi det postoperativ behandling.
  7. Plasser dyret i et separat gjenopprettingsbur og observer det hvert 10. minutt til det er våkent og ambulerende. Returner dyret til sitt standard boligbur og til et annet selskap som ikke er bedøvet dyr, først etter at det er fullstendig gjenopprettet.

3. Kirurgisk implantasjon av telemetrene

MERK: Bruk bare sterile telemetre. Hvis telemetre gjenbrukes, rengjør og steriliser dem før operasjonen i henhold til produsentens instruksjoner. I denne protokollen ble det brukt et datavitenskapelig internasjonalt (DSI) telemetre for EEG-registrering.

  1. Slå på telemetrisenderen ved hjelp av en magnet og test signalet med en AM-frekvensradio. Sjekk for et sterkt og klart signal før operasjonen. Kast om nødvendig de dårlige arbeidstelemetrene.
  2. Forbered telemeterledningene ved å forkorte disse til optimale lengder for voksne rotter. Fjern silikonbelegget på to (negative og positive) ledninger, og utsett ca. 5 mm av spiralformet stålbly. Lag et sløyfehåndtak på ca 2 mm i lengde og 1 mm i bredde på spissen av ledningene.
  3. Barber dyrets flanke under og bak venstre skulder. Desinfiser operasjonsområdet med desinfeksjonsmiddel basert på stabiliserte peroksider og kvaternær ammoniumaktivitet. La desinfeksjonsmiddelet virke i 15 min.
  4. Lag ca 2 cm lateralt snitt like bak skulderen på dyret og lag en subkutan lomme på ca 5 cm3 plass til senderplasseringen. Plasser senderen parallelt med kroppens lange akse, med ledningene rettet mot rostralretningen.
  5. Fest senderen til innerveggen i underhudslommen med en 3-0 bomullsutur. Bruk butt saks til å lage den subkutane tunnelen (ca. 2,5 cm lang) gjennom flanken og nakken på dyret, og koble dermed senderlommen med midtlinjesnittet som ble gjort i dyrets hodebunn i trinn 1.6.
  6. Ta begge telemetre fører med tang og trekk dem opp gjennom tunnelen, slik at de stikker ut fra hodebunnen snitt utløpet. Hold ledningene ut av hodebunnssnittet med sårklemmer.
  7. Bruk den stereotaktiske rammen til å individuere de ønskede koordinatene for positiv (rød) bly og bor hullet inn i skallen for den positive blyspissen (ligner på trinn 2.1.). Lag et hull til for å forankre skruen oppover til talerstolen og skru den inn i skallen.
  8. Sett spissen av positiv bly under skallen og dura og legg den ned på hjerneoverflaten. Hekt opp løkkespissen av negativ (hvit) bly på skruen. Sett en liten mengde metakrylsement rundt det positive blyuttaket og det negative blyet for å immobilisere dem på skallen.
  9. Fest ledningene til den indre veggen av skallen, huden med en 3-0 bomullsutur. Forsikre deg om at de faste ledningene og festesuturen ikke vil forstyrre stedet for CSF-uttak (dvs. en depressibel overflate med utseendet på en rhombus mellom occipital fremspring og ryggraden i atlaset).
  10. Lukk hodebunnen snitt og flanke snitt med en 3-0 bomull sutur. Påfør desinfeksjonsmidler på sårene. Først etter at disse har tørket, påfør en antibiotikakrem på de suturerte sårene.

4. Postoperativ behandling

  1. Overvåk dyrene i ca 1 time deretter operasjonen til oppreist og flytte rundt buret. Hold dem på en varmepute for å forhindre hypotermi. Administrer dyr med et systemisk antibiotika for å forhindre infeksjon og et systemisk smertestillende middel for å forhindre postkirurgisk smerte i 2-3 dager.
  2. Tillat rotter å komme seg i minst 7 dager etter kirurgiske prosedyrer. Overvåk dyrene minst en gang daglig i 3 dager for tegn på smerte eller nød.

5. Status epilepticus induksjon hos rotter

MERK: For en detaljert protokoll for status epilepticus (SE) induksjon nødvendig for å reprodusere mesial temporallappsepilepsi (mTLE) hos rotter, se Guarino et al.25.

  1. Etter en uke med postoperativ rekonvalesens, tilordne dyrene tilfeldig til grupper: (i) kontrolldyr som mottar kjøretøy og (ii) epileptiske dyr som vil motta pilokarpin. Bruk et proporsjonalt høyere antall dyr for den epileptiske gruppen, siden ikke alle pilokarpinadministrerte rotter vil overleve eller utvikle SE.
  2. Dagen før SE-induksjonen gis dyrene en enkeltdose på 127 mg/kg litiumklorid oppløst i 0,9 % saltvann (3M) som et volum på 1 ml/kg ved magegass. Administrer dyrets litium, som øker pilokarpineffekten26, ca. 14 timer før induksjon av SE for å redusere variasjonen i tid til SE-utbrudd.
  3. Ca. 14 timer etter administrering av litium, gi rottene en enkelt injeksjon med metylskopolamin (1 mg/kg, subkutant).
  4. Nøyaktig 30 minutter etter administrering av metylskopolamin, gi rottene en enkelt injeksjon med pilokarpin (50 mg/kg, i.p.) for å indusere SE. Gi metylskopolamin og vehikkel (0,9 % NaCl-oppløsning) for å kontrollere rotter.
    1. Pilocarpine injeksjon induserer typisk atferd hos dyr: tidlige partielle anfall (bevegelser av vibrasjoner og hodenikk innen 5 minutter etter pilokarpinadministrasjon) utvikler seg til tilbakevendende generaliserte kramper (SE) innen 25-30 minutter. For rotter som ikke utvikler SE innen 30 minutter, administrer en ekstra dose pilokarpin (25 mg/kg, i.p.), og hvis de fortsatt ikke utvikler SE, ekskluder de fra studien (SE ikke-respondere).
  5. Observer og skår anfallsatferden hos rotter hvert 5. minutt som begynner umiddelbart etter pilokarpininjeksjonen. Bruk Racine-skalaen for å score27.
  6. Avbryt SE 2t etter utbruddet ved i.p. administrering av en cocktail av legemidler: diazepam (10 mg / kg), fenobarbital (25 mg / kg) og skopolamin (1 mg / kg).
  7. Gi rottene denne cocktailen igjen etter 4 timer. Til slutt, etter ytterligere 4 timer, gi rottene i.p. den siste blandingen av legemidler (diazepam 10 mg/kg pluss skopolamin 1 mg/kg) for å stoppe anfallsaktiviteten fullstendig.
  8. Injiser i.p. dyrene med saltvann (1 ml 0,9% NaCl-løsning, pH justert til 7,0) og mate dem med en 10% sukroseløsning i 2-3 dager etter SE for å favorisere utvinning fra kroppsvektstapet som følger SE.
  9. Tilordne overlevende dyr etter SE tilfeldig til forskjellige eksperimentelle grupper i henhold til kravene i den spesifikke eksperimentelle protokollen. Bruk følgende inklusjons-/eksklusjonskriterier for videre eksperimenter med epileptiske rotter: utvikling av konvulsiv SE innen 1 time etter administrering av pilokarpin, vektøkning den første uken etter SE, og korrekt plassering av elektroden i hjerneområdet av interesse for EEG-registreringer25.

6. Bundet video-EEG hos epileptiske rotter og analyser av anfallsaktivitet

MERK: Denne delen beskriver den eksperimentelle prosedyren for å registrere EEG-signaler i enkelthus, fritt bevegelige rotter under standardforhold. Buret skal ikke inneholde gjenstander der dyret eller opptakskabelen kan sette seg fast. Avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som skal behandles, kan flere parametere analyseres. Ved epilepsiforskning screenes EEG-sporene for å gjenkjenne elektriske og motoriske anfall. De vanligste parametrene som brukes til å identifisere et anfall er amplitude, frekvens og varighet av paroksysmal elektrisk aktivitet.

  1. Plasser dyret i et rent bur i opptaksrommet for å tillate tilvenning og redusere stresset forårsaket av det nye miljøet. Plasser dyrets bur i et Faraday-bur for å unngå forurensning av EGG-signalet med det omgivende elektromagnetiske feltet.
  2. Koble den ene enden av opptakskabelen til opptaksenheten. Bruk et voltmeter for å måle det elektriske potensialet og skille mellom jord- og referanseelektroder.
  3. Koble den andre enden av opptakskabelen til elektroden som er festet på rottehodet. For dette formålet, hold sementdekselet på dyrets hode når du setter kabelpluggen inn i elektrodekontakten, og unngå å legge press på rottens hode.
  4. Motvekt vekten av opptakskabelen for å tillate fri bevegelse av dyret samtidig som risikoen for å vri kabelen forhindres. For å gjøre dette, bruk en motbalanseringsarm eller kommutatorer. Selv om opptakskabelen er motbalansert, legg maten inn i buret i stedet for i en fôringsholder, der dyrene må heve seg for å nå maten.
  5. Før du starter registreringen, må du kontrollere alle innstillingene som brukes til å skaffe og behandle dataene fra EEG.
    MERK: Denne protokollen gir ikke en introduksjon til apparatet som kreves for å utføre EEG-opptaket, men tilstrekkelig filtrering og samplingsfrekvenser bør brukes for å unngå artefakter og støy i EEG-signaler.
    1. For et rutinemessig eksperiment, sett samplingsfrekvensen til 500 Hz, og forsterkningsforsterkningen til 5000x. Filtrer signalet med et 0,005 Hz filter i tillegg til et hakkfilter for å forkaste den omkringliggende elektriske aktiviteten i 50 Hz-båndet (spesielt for europeiske land).
  6. Start både video- og EEG-opptak og sørg for at sporene samsvarer med et forventet EEG-signal ved å sjekke effekten i bestemte frekvensbånd over tid. Registrer en basisperiode før du starter intervensjonene hos dyrene.
  7. Sjekk dyr og EEG-spor med jevne mellomrom. Det er ikke sjelden at en opptakskabel løsner fra elektrodekontakten i rottehodet. Hvis dette skjer, kobler du elektroden i rottehodet til en opptakskabel igjen og ser etter et klart EEG-signal.
  8. Analyser EEG-signalet manuelt eller automatisk ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Hvis du analyserer manuelt, kan du screene gjennom EEG-opptak for å identifisere anfallslignende aktiviteter. Hvis programvare skal brukes, konfigurerer du nøkkelparametere for en anfallshendelse, som amplitude, frekvens og varighet av elektrisk aktivitet.
    MERK: Enkeltanfall kan karakteriseres av en elektrisk aktivitet med en amplitude 3x høyere enn baseline, frekvens lik eller høyere enn 5 Hz, og varighet på minst 5 s22.
  9. Uansett hvilken metode som brukes, bekreft de potensielle krampeanfallene ved å sjekke det synkroniserte videoopptaket samlet samtidig med EEG.

7. Telemetri video-EEG hos epileptiske rotter og analyse av anfallsaktivitet

MERK: Denne delen beskriver den eksperimentelle prosedyren for å registrere radiotelemetri EEG-signaler i enkelthus, fritt bevegelige rotter under standardforhold. Protokollen er basert på et kommersielt tilgjengelig telemetrisystem. Imidlertid er flere telemetrisystemer noe forskjellige i funksjonelle og tekniske spesifikasjoner. Systemet bør velges avhengig av laboratoriekrav og forskningsmål.

  1. Plasser dyrets hjemmebur over signalmottakeren. Koble signalmottakeren til datainnsamlingssystemet og dette til en datamaskin med innsamlingsprogramvaren.
  2. Slå på radiofrekvenstelemetriimplantatet ved å plassere en magnet i nærheten av telemeteret som er satt inn i rotteflanken. Test signalet ved hjelp av en radioenhet. Bruk en universell radioenhet til å teste telemetrene og høre et klart pip indikerer at telemeteret er aktivert, mens en sizzling lyd indikerer et inaktivert telemeter.
    MERK: Levetiden til radiofrekvenssenderbatteriet bør tas i betraktning før du definerer varigheten av opptakene.
  3. Sett opp innsamlingsprogramvaren og synkroniser telemetrisignal- og videosystemet for samtidig å innhente EEG- og videodata. Tilordne en signalmottaker til hver implanterte sender og angi kalibreringsverdiene til senderen. Sett samplingsfrekvensen til 1000 Hz, støydeteksjon mellom -500 mV og +500 mV, og integrasjonsintervallet på 100 ms. Ikke bruk lav- og høypassfiltre.
  4. Start telemetri og videoopptak. Utfør langsiktig baseline-registrering før du får den epileptisk-lignende aktiviteten. Analyser EEG-signalet som beskrevet i trinn 6.8 og 6.9.

8. Prosedyre for blodoppsamling fra halvenen

NOTAT. Vakuumblodoppsamlingssystemet består av en sommerfuglnål (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). Blodinnsamlingsteknikken kan enkelt utføres av en operatør, og prosedyren tar ca. 5 minutter.

  1. Belegg sommerfuglnålen og dens slange med 1% K2EDTA i destillert vann kort tid før uttakene, dvs. trekk inn og utvis K2EDTA-løsningen fra systemet ved hjelp av 1 ml sprøyten. Skjær slangen rett bak nålen for å samle opp bloddråpe for dråpe, uten aspirasjon (figur 1A).
  2. Plasser rotta i et induksjonskammer og bedøv den med isofluran (1,4 % i luft, 1,2 ml/min). Bytt til den stereotaktiske rammen og oppretthold anestesi gjennom en ansiktsmaske. Sett varmeputen under dyret, hold en del av halen i direkte kontakt med puten.
  3. Beveg forsiktig dyrets rygg til siden slik at den laterale halevenen holdes øverst.
  4. Dypp halen i varmt vann (42 °C) i 2 minutter for å utvide sidevenen. Tørk halen med 70% etanol for å gjøre venen mer synlig. Sett varmt lys på halen ved hjelp av en vanlig glødelampe.
  5. Sett 21G sommerfuglnålen inn i den laterale halevenen med en dybde på 5 mm og en vinkel på 20°. Samle blod i et 500 μL vakuumoppsamlingsrør som inneholder 5 mgK2EDTA som antikoagulant (figur 1B,C).
  6. Fjern nålen og stopp blodstrømmen ved å legge press på stikkstedet. Sett rotta tilbake til hjemmeburet.
  7. Snu forsiktig røret 10x for å blande antikoagulant i blodet. Lag hull på ca 1,5 cm dybde i isen for å få plass til oppsamlingsrørene. Legg prøven forsiktig og vertikalt på is.
  8. Sentrifuger blodprøven i en nedkjølt sentrifuge (4 °C) ved 1300 x g i 10 minutter for å skille plasma. Utfør denne prosedyren innen maksimalt 1 time.
  9. Ta ca 200 μL plasma, unngå det røde og hvite blodlegemelaget. Sett det uttrukne plasmaet inn i det 0,2 ml sterile mikrorøret. Oppbevares ved behov ved 4 °C i opptil 1 time etter sentrifugering.
  10. Legg til side 5 μL av prøven for kvalitetskontroll. Oppbevar prøven ved -80 °C inntil analyse.
    MERK: Ikke bruk vakuumet selv om det anbefales av noen forskere28 eller melk halen under prosedyrene beskrevet i trinn 8.5 for å få mer blod, da det reduserer prøvekvaliteten for de neste sncRNA-kvantifiseringsanalysene (se representative resultater for detaljer). Husk at hos rotter er den maksimale mengden blod som kan trekkes ut på en gang <10% av det totale blodvolumet (dvs. ca. 1,6-1,9 ml i en 250-300 g rotte) og <15% av det totale blodvolumet (ca. 2,64 ml) i 1 måned29. I denne protokollen brukes maksimalt 500 μL blodsamling ved en enkelt anledning for opptil fem ganger i et enkelt dyr30,31.

9. Prosedyre for CSF-innsamling

NOTAT. Teknikken kan enkelt utføres av en enkelt operatør, og prosedyren krever rundt 2-4 min. Materialene som brukes til innsamling av CSF er billige, engangsvakuum sommerfuglnåler og ekstraksjonsrør. I denne protokollen brukes et sommerfuglvinget infusjonssett koblet til en steril sprøyte for å skape vakuumet (figur 2A).

  1. Klargjør 23 G sommerfuglnålen, klipp beskyttelsen av plasthylsen slik at enden av den nakne nålen eksponeres med 7 mm for å hindre at den trenger mer enn 7 mm dypt inn i cisterna magna under uttak (figur 2B).
  2. Koble sommerfuglnålen utstyrt med polymerslange til en 1 ml sprøyte.
  3. Plasser rotta i et induksjonskammer og bedøv den med isofluran (1,4 % i luften, 1,2 ml/min). Bytt isofluran flow til stereotaksisk ramme og opprettholde anestesi levert gjennom en ansiktsmaske. Fjern pelsen på rottens bakre hode og nakke med en barberhøvel.
  4. Fest rottehodet med ørestenger. Senk dyrets hode ned ca. 45° vertikalt, og beveg deg nedover nesestangen i den stereotaktiske rammen (figur 2C). Inspiser dyrets bakre hode og finn en litt deprimert overflate med aspektet av en rhombus, mellom occipital fremspring og atlasryggraden.
  5. Gni denne overflaten med 70% etanol for å gjøre den mer synlig og desinfiser den.
  6. Sett sommerfuglnålen vertikalt inn i midten av den rombeformede deprimerte overflaten i cisterna magna for CSF-oppsamling til bevegelsen er blokkert ved å kutte til størrelse plasthylsebeskyttelse av nålen (figur 2D). Trekk forsiktig tilbake 1 ml sprøytestempelet for å la CSF sakte strømme gjennom kanylen.
  7. Samle ca. 100 μL av CSF i polymerrør (figur 2D). Unngå å gå inn i blod eller annen synlig forurensning. Klem polymerslangen svært nær sommerfuglnålen og kutt slangen på dette punktet.
  8. Trekk den klare (ukontaminerte) prøven inn i sprøyten. Kast den forurensede prøven, hvis synlig forurensning kommer inn i oppsamlingsslangen.
  9. Fjern prøven i det sterile 0,2 ml mikrorøret og oppbevar på is i opptil 1 time.
  10. Desinfiser stedet for CSF-uttak på dyrets hode. Fjern rotta fra stereotaktisk ramme og sett den tilbake i buret.
  11. Legg til side 2 μL av prøven for kvalitetskontroll. Oppbevar resten av prøven ved -80 °C for videre analyse.
    MERK: Hvis flere CSF-opptrekk utføres gjentatte ganger hos rotter, er anbefalt volum som skal trekkes opp ved hver samling 100 μL32. I denne protokollen ble det gjort maksimalt 100 μL CSF ved en enkelt anledning med 5x maksimal tilbaketrekking på 15 dager i et enkelt dyr.

10. Spektrofotometrianalyse av prøvens kvalitet

MERK: Etter riktig innsamling av CSF- og plasmaprøver er prøvene klare for spektrofotometeranalyser og krever ingen spesifikk håndtering. Mål hemoglobinabsorbansen ved UV-spektrofotometri ved 414 nm for å evaluere hemolyserisikoen i prøver. Bruk en grenseabsorbansverdi på 0,25 i rotteprøver. Valget av denne grensen kan avhenge av påfølgende qPCR-analyse og dens spesifikke krav til sncRNAs kvantifisering.

  1. Slå på UV-spektrofotometeret. Velg metode for absorbansmåling ved en enkelt bølgelengde på 414 nm for PLASMA eller CSF. Klikk på Neste.
  2. Skyll 1 mm kyvetten med renset vann. Tilsett 5 μL 70 % etanol på kyvettemålepunktet. Tørk med et papirhåndkle og gni med lofritt silkepapir. Sjekk om den er helt gjennomsiktig.
  3. Sett 1,5 μL renset vann i 1 mm kyvetten og lukk den. Sett kyvetten inn i målekammeret til spektrofotometeret og mål den tomme prøveabsorbansen ved å klikke på Blank-knappen . Kontroller at absorbansverdien ved 414 nm er 0,000.
  4. Tørk kyvetten med et papirhåndkle og rengjør den med lofritt silkepapir. Sjekk om den er helt gjennomsiktig.
  5. Sett 1,5 μL av prøven i 1 mm kyvetten og lukk den. Sett kyvetten inn i målekammeret til spektrofotometeret. Mål prøven, klikk på Eksempel-knappen . Kontroller absorbansen av prøven ved 414 nm og kommenter den.
  6. Fortsett kvantifisering av hemoglobinabsorbans i alle tilgjengelige prøver. Mål den tomme prøven foran en plasma- eller CSF-prøve, ved å klikke alternativt på knappene Blank og Sample .
  7. Ta vare på prøvene med A414 nm < 0,25 ved -80 °C og kast prøvene hvis A414 nm > 0,25.
  8. Skyll 1 mm kyvetten med renset vann og 70% etanol, sekvensielt. Tørk kyvetten.
  9. Lukk den tomme kyvetten inn i målekammeret for å unngå støvtørking. Slå av spektrofotometeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utfallet av forskjellige CSF- og blodabstinensprosedyrer utført hos 9 kontroll- og 18 kroniske epileptiske rotter, alle implantert med elektroder 1 måned etter SE, er rapportert med hensyn til suksessrate. Etter implantasjon ble alle rotter video-EEG-overvåket i 1 måned, hvor CSF pluss blod ble trukket ut 5x hver 3. dag i løpet av de to siste ukene av forsøket (dvs. på dagene 52, 55, 58, 61 og 64 etter SE; dpSE). Data fra flere uttak hos forskjellige dyr ble brukt til å sammenligne suksessraten for CSF-innsamling hos rotter med dobbelthodeimplantat (kanylert for CSF-seponering) med suksessraten for CSF-innsamling (utført ved cisterna magna-punktering) hos implanterte dyr med bare bundet eller telemetrielektrode (tabell 1). Hos forskjellige dyr ble effekten av vakuumblodoppsamling eller halemelking på kvaliteten på plasmaprøver evaluert (tabell 2). Til dette formål ble UV-spektrofotometrianalyse ved 414 nm brukt til påvisning av fritt hemoglobin. For statistiske analyser ble kommersiell programvare brukt, og Kruskal-Wallis eller enveis ANOVA med post-hoc Tukeys flere sammenligningstester ble brukt (s<0.05 anses statistisk signifikant). Dataene er uttrykt som et gjennomsnitt ± SEM.

Suksessrate for flere CSF-prøvetaking hos kanylerte og punkterte rotter
CSF har blitt samplet 5x innen 2 uker i 3 grupper av rotter: (i) kanylerte og bundet elektrodeimplanterte rotter (CT-gruppe av dyr); hos disse ble CSF-uttaket utført via dummy guidekanyle og PTFE-slangeledd til 1 ml sprøyte når de ikke var bedøvet og fritt beveget seg under video-EEG; (ii) punkterte (trinn 9) og bundet elektrodeimplanterte rotter (PT-gruppe); (iii) punkterte og telemetrielektrodeimplanterte rotter (PTe-gruppe). Totalt 9 dyr per gruppe (6 epileptiske og 3 kontrollrotter) ble brukt. Antall vellykkede samlinger over 5 ganger ble evaluert. Suksessraten var lik hos punkterte rotter: 86,7 % ± 5,8 % hos bundet og 88,9 % ± 4,8 % hos implanterte dyr med telemetrielektrode. I stedet ble frekvensen redusert hos kanylerte rotter selv om den ikke var signifikant forskjellig (71,1 % ± 8,9 %, tabell 1). Slike resultater indikerer at kanylen på dyrenes hoder kan forstyrre gjentatt CSF-prøvetaking og kompromittere longitudinelle studier. Punkteringsteknikken er mer egnet for flere CSF-uttak i elektroder implanterte dyr.

Virkningen av vakuum- og halemelking på plasmaoppsamlingsmetoden
Blod ble samlet 5x fra 9 rotter (6 epileptiske og 3 kontrollrotter) på dagene 52, 55, 58, 61 og 64 etter SE, og plasmakvaliteten ble evaluert for hemolyse visuelt og ved UV-spektrofotometri ved 414 nm. For å oppnå den første prøven i hver rotte, ble vakuumuttaket via en 21G sommerfuglnål festet til en 1 ml sprøyte benyttet. Med den andre prøven ble dråpeuttaket og 21G sommerfuglnålsystemet brukt når halen melket samtidig. For å få 3.-5. prøve ble dråpeuttaksprosedyren uten melking av halen (beskrevet i trinn 9) brukt.

Ved bruk av vakuum var plasmaet rosafarget under visuell inspeksjon, og gjennomsnittlig absorbansverdi for 9 rotteprøver var 0,647 ± 0,067 (tabell 2, figur 3). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av halemelking under prosedyren: rosafarget plasma med 0,620 ± 0,043 gjennomsnittlig absorbans (tabell 2, figur 3). I kontrast, med gravitasjonsaktivert dråpeuttak og 21G sommerfuglnålsystem, ble de gjennomsnittlige plasmaabsorbansverdiene signifikant redusert (0,226 ± 0,017 ved 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 ved 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 ved 64 dpSE; Tabell 2, figur 3) med hensyn til vakuum- eller halemelkingsmetode. Videre var dråpeplasmaprøvene hovedsakelig gjennomsiktige. Høyere absorbansverdier (52 og 55 dpSE) korrelerte med den rosa fargen på prøvene (data ikke vist). Disse resultatene kan tyde på at den siste metoden er den beste for å få prøver av svært høy kvalitet til analyser.

Figure 1
Figur 1: Viktige trinn i arbeidsflyten for plasmaprøvetaking. (A) Materialer som er nødvendige for bloduttak og rotte i den stereotaktiske rammen, klar for innsamling; (B, C) Forstørrelser av halen med 21G sommerfuglnål satt inn i sidehalevenen og bloddråpen faller nedover veggene i oppsamlingsrøret med en antikoagulant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Viktige trinn i arbeidsflyten for prøvetaking av cerebrospinalvæske (CSF). (A) Materialer som er nødvendige for CSF-uttak og rotte i den stereotaktiske rammen, kort tid før innsamling; (B) 23G butterfly nål forberedelse ved å kutte plasthylsen beskyttelse slik at enden av den nakne nålen er utsatt for 7 mm for å sikre riktig inntrengning i cisterna magna; (C) Rottehodet skråner 45° nedover under uttak. (D) Forstørrelse på rhomboidstedet med en sommerfuglnål satt inn i cisterna magna. Legg merke til CSF som stiger i slangen, indikert med tuppen av markøren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsvurdering av plasmaprøver. Grad av hemolyse målt ved 414 nm for fritt hemoglobin ved UV-spektroskopi i plasmaprøver av 9 dyr ved 5 tidspunkter (52, 55, 58, 61 og 64 dager etter status epilepticus, dpSE) ved bruk av forskjellige metoder: dag 52 - vakuumteknikken; dag 55 - halen melking; Dag 58-64 ble droppteknikkene benyttet. Reduksjonen i fritt hemoglobin i plasma oppnådd ved dråpeteknikk sammenlignet med vakuum- og halemelkingsmetoder var signifikant (*p <0,05 i henhold til enveis ANOVA og post-hoc Tukeys multippel sammenligningstest). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Suksessrater for CSF-uttak. Sammenligning av suksessraten for gjentatt CSF-seponering i tre eksperimentelle grupper av dyr uttrykt som en prosentandel av vellykkede uttak over 5 dager. Verdien 1 ble tildelt vellykket tilbaketrekking av > 100 μL klar CSF; nullverdien ble tildelt uttak < 100 μL og/eller av uklar CSF. Forkortelser: N/A - fravær av oppsamling på grunn av tap av kanyle under prøvetakingsprosedyren (kun CT-dyr); CT - kanylert tethered; PT - punktert bundet; PTe - punkterte telemetrielektroder implantert. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Evaluering av hemolyse i plasmaprøver. Resultater av hemolysemålingene ved 5 tidspunkter ved bruk av tre forskjellige metoder for blodprøvetaking: dag 52 - vakuumteknikken; dag 55 - halen melking; Dag 58-64 SLIPPTEKNIKKENE. Verdier >0,3 av absorbans korrelert med rosa farge på prøver. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nåværende arbeidet illustrerer en lett-å-mestre teknikk for CSF og blodinnsamling hos rotter, noe som kan være nyttig ikke bare for studier i modeller av epilepsi, men også av andre nevrologiske tilstander eller sykdommer som Alzheimer, Parkinson eller multippel sklerose. I epilepsiforskning er begge prøvetakingsprosedyrene kombinert med video-EEG ideelle når det forfølges en sammenheng mellom nivåene av forskjellige løselige molekyler og anfallsaktivitet. Av denne spesifikke grunnen ble det benyttet et kontinuerlig video-EEG-opptak: i) for korrekt diagnostisering av epilepsi eller ii) for å overvåke de ulike fasene av sykdomsprogresjonen, og/eller iii) for å korrelere prøvetaking med forekomsten av spontane anfall. Slike prøvetakingsteknikker kan utføres i bedøvede rotter, og dermed forårsake minimal stress.

Kritiske trinn, feilsøking, metodebegrensninger
Protokollen har noen kritiske tekniske trinn. For det første kan det være vanskelig å finne riktig sted for CSF-samling ved første forsøk. Hvis operatøren bommer på cisterna magna ved første forsøk, vil enhver etterfølgende prøve være blodforurenset, da dyret vil blø fra nålesåret. Fra dette synspunktet er suksessen i samlingen sterkt avhengig av operatørens dyktighet. For det andre trenger noen trinn med bloduttak spesiell oppmerksomhet. Spesielt er det stor risiko for hemolyse hvis operatøren gnir halen for kraftig med etanol, hvis temperaturen på vannet som brukes til vasodilatasjon i halevenen er høyere enn 42 °C, eller hvis blodet i oppsamlingsrøret blandes med antikoagulant for energisk. En annen særegenhet ved blodinnsamling hos kroniske epileptiske dyr er påvirkning av deres bradykardi på hastigheten som blod faller ut av halevenen33. Hvis dette er for sakte, kan blodet koagulere på veggene i oppsamlingsrøret. For å unngå dette problemet er ett alternativ å dele prøvetakingen i to oppsamlingsrør, noe som reduserer volumet av blod / rør. Til slutt er det en fallgruve som er iboende i epilepsistudier. Stresset fremkalt av dyremanipulasjon før prøvetaking kan indusere anfall, noe som igjen kan forstyrre nivåene av molekyler under undersøkelsen34. Når det er mulig, plasser anestesiinduksjonskammeret i hjemmeburet og la dyret komme inn i det spontant. Som en modifikasjon av den foreslåtte protokollen kan en fastholder brukes til å utføre bloduttak uten isoflurananestesi. Dette kan imidlertid gjøres i telemetri, men ikke hos bundet dyr, fordi bundet rotter kan miste hodeimplantatene under denne prosedyren.

Å ha en godt trent operatør og utgjøre maksimal innsats for å unngå stress, er den eneste begrensningen i den nåværende protokollen det maksimale volumet som kan trekkes tilbake uten å kompromittere dyrets helse. I henhold til gjeldende standarder anbefales det å samle maksimalt 100 μL CSF i 4x over 15 dager i et enkelt dyr32. Tilsvarende foreslås det å samle mindre enn 10% av det totale blodkroppsvolumet på en enkelt prøvetaking og mindre enn 15% av det totale blodkroppsvolumet i 28 dager30,31.

Sammenligning av metoden med andre teknikker
Foreslåtte tidsoppløste CSF- og plasmaprøvetakingsmetoder har flere fordeler i forhold til eksisterende alternative metoder. For det første har en cisterna magna-punktering som brukes til å prøve CSF hos epileptiske rotter, en lavere risiko for tap av hodeimplantat sammenlignet med et kanylert system hvis det kobles til bundet EEG. I motsetning til punkteringsprosedyrer, er kanylen festet til elektroden med tannsement (klumpete og tung for dyrs hoder), mens den anmodes ved gjentatte vedlegg / løsrivelser til CSF-uttakene, mye mer utsatt for å gå tapt over flere dager med prøvetaking. Resultatene fra suksessraten viser faktisk hvordan noen kanylerte dyr (N/A) ikke kommer frem til de avanserte prøvetakingstidspunktene, og dermed går deres respektive prøver tapt (tabell 1). I tillegg synes punkteringsmetoden å være bedre enn kanylert tilnærming når det gjelder bedre sterilitet og redusert meningeal reaksjon med begrenset økning av celle- og albumininnhold i CSF, som tidligere er dokumentert av andre 22,35,36. Graden av CSF-leukocytter og albuminkontaminasjon kan være viktig for validiteten av metoder som brukes for kvantifisering av epilepsibiomarkører35. For det andre er fritt fall-dråpemetoden for blodplasmaprøvetaking som brukes til gjentatte målinger, bedre enn noen annen uttaksmetode, da den ikke er terminal (ikke-utvinning), i motsetning til halshugging, hjertepunktering, abdominal / thoracic blodkar eller retro-orbital tilbaketrekking og tillater flere blodprøver. Det er enklere enn mange haleblodvakuumuttaksteknikker, da det ikke krever rør28,37 og produserer hemolysefrie plasmaprøver av høy kvalitet for videre sncRNA-analyser fokusert på å identifisere antatte biomarkører for epileptogenese38. Fraværet av fritt hemoglobin i prøvene, ved bruk av dråpeprøvetakingsteknikk eller unngåelse av halemelking, ble bekreftet av lave absorbansresultater fra plasmaprøvene (tabell 2) i tråd med tidligere publiserte prosedyrer egnet for evaluering av plasmainnhold av sncRNA39,40.

Bruksområder og fremtidige retninger
De ovenfor beskrevne metodene kan brukes til å måle løselige molekyler av interesse i en hvilken som helst modell av nevrologiske sykdommer. Et spesifikt eksempel er prøvetaking av biologiske væsker for identifisering av potensielle/antatte epilepsibiomarkører. Det er et presserende udekket medisinsk behov for å oppdage disse biomarkørene for personer med epilepsi, spesielt prognostiske og følsomhets-/risikobiomarkører, da de ennå ikke eksisterer.

Avslutningsvis er den nåværende protokollen mulig hos rotter, inkludert epileptiske rotter, og er lett å aktivere for trente personer. Videre tillater det flere høykvalitets prøvetaking i longitudinelle studier i samsvar med prinsippet om 3Rs (dvs. erstatning, reduksjon og forbedring)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av et tilskudd fra EUs Horizon 2020 Work Programme (ring H2020-FETOPEN-2018-2020) under tilskuddsavtale 964712 (PRIME; til M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Cerebrospinalvæske blodprøvetaking lateral halevene rotter EEG-opptak biomarkører epilepsiforskning CSF-abstinenser cisterna magna video-EEG-monitorering diagnostiske biomarkører prognostiske biomarkører smertefri prøvetaking minimal invasivitet redusert anestesitid
Prøvetaking av cerebrospinalvæske og blod fra lateral halevene hos rotter under EEG-opptak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter