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Neuroscience

ईईजी रिकॉर्डिंग के दौरान चूहों में पार्श्व पूंछ नस से मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त का नमूना

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

प्रोटोकॉल निरंतर वीडियो-इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राम (ईईजी) निगरानी के साथ समानांतर में प्रदर्शन किए गए मिर्गी चूहों से बार-बार मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त संग्रह दिखाता है। ये शरीर के विभिन्न द्रव अणुओं और जब्ती गतिविधि में परिवर्तन के बीच संभावित लिंक की खोज के लिए सहायक हैं।

Abstract

क्योंकि शरीर के तरल पदार्थ की संरचना कई शारीरिक और रोग गतिशीलता को दर्शाती है, जैविक तरल नमूने आमतौर पर ब्याज के अणुओं को मापने के लिए कई प्रयोगात्मक संदर्भों में प्राप्त किए जाते हैं, जैसे हार्मोन, विकास कारक, प्रोटीन या छोटे गैर-कोडिंग आरएनए। एक विशिष्ट उदाहरण मिर्गी के लिए बायोमार्कर के शोध में जैविक तरल पदार्थों का नमूना है। इन अध्ययनों में, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और प्लाज्मा में अणुओं के स्तर की तुलना करना वांछनीय है, समानांतर में सीएसएफ और प्लाज्मा को वापस लेना और नमूने से और दौरे की समय दूरी पर विचार करना। संयुक्त सीएसएफ और प्लाज्मा नमूनाकरण, मिर्गी के जानवरों में वीडियो-ईईजी निगरानी के साथ मिलकर, ख्यात नैदानिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के सत्यापन के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। यहां, सिस्टर्न मैग्ना से संयुक्त सीएसएफ वापसी की एक प्रक्रिया और मिर्गी के चूहों में पार्श्व पूंछ नस से रक्त का नमूना जो लगातार वीडियो-ईईजी निगरानी कर रहे हैं, का वर्णन किया गया है। यह प्रक्रिया आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली अन्य तकनीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है। यह कम से कम दर्द या आक्रामकता, और संज्ञाहरण के कम समय के साथ तेजी से नमूने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इसका उपयोग टीथर्ड और टेलीमेट्री ईईजी रिकॉर्ड किए गए चूहों दोनों में सीएसएफ और प्लाज्मा नमूने प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, और इसका उपयोग प्रयोग के कई दिनों में बार-बार किया जा सकता है। आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया को छोटा करके नमूने के कारण तनाव को कम करके, उपायों से बायोफ्लुइड में जांच किए गए अणुओं के सही स्तर को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने की उम्मीद है। एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक परख की उपलब्धता के आधार पर, इस तकनीक का उपयोग एक ही समय में ईईजी रिकॉर्डिंग करते समय कई, विभिन्न अणुओं के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और रक्त नमूना मिर्गी के बायोमार्कर की पहचान करने और मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, दोनों प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अनुसंधान 1,2 में। आजकल, मिर्गी का निदान और मिर्गी बायोमार्कर पर अधिकांश शोध ईईजी और न्यूरोइमेजिंग 3,4,5 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालाँकि, ये दृष्टिकोण कई सीमाएँ प्रस्तुत करते हैं। नियमित खोपड़ी माप के अलावा, कई मामलों में, ईईजी को गहराई इलेक्ट्रोड6 जैसी आक्रामक तकनीकों की आवश्यकता होती है। मस्तिष्क इमेजिंग विधियों में खराब अस्थायी और स्थानिक संकल्प होते हैं और अपेक्षाकृत महंगे और समय लेने वाले 7,8 होते हैं। इस कारण से, गैर-आक्रामक, कम लागत वाली और बायोफ्लुइड-आधारित बायोमार्कर की पहचान एक बहुत ही आकर्षक विकल्प प्रदान करेगी। इसके अलावा, इन बायोफ्लुइड बायोमार्कर को उनकी भविष्यवाणी को तेज करने के लिए उपलब्ध नैदानिक दृष्टिकोणों के साथ जोड़ा जा सकता है।

मिर्गी के साथ का निदान रोगियों नियमित रूप से ईईजी 9,10 और रक्त नमूना 11,12,13,14 के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, और कई भी सीएसएफ वापसी के लिए जीवन के लिए खतरा कारणों (यानी, तीव्र संक्रमण, autoimmune एन्सेफलाइटिस) 15 को बाहर करने के लिए. इन रक्त और सीएसएफ नमूनों का उपयोग नैदानिक अनुसंधान में किया जा सकता है जिसका उद्देश्य मिर्गी के लिए बायोमार्कर की पहचान करना है। उदाहरण के लिए, हॉग और सहकर्मियों ने पाया है कि तीन प्लाज्मा टीआरएनए टुकड़ों में वृद्धि मानव मिर्गी1 4 में जब्ती की घटना से पहले होती है। इसी तरह, मानव सीएसएफ और सीरम में इंटरल्यूकिन -1 बीटा (आईएल -1β) स्तर, सीरम पर सीएसएफ में आईएल-1β के अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया, दर्दनाक मस्तिष्ककी चोट 16 के बाद अभिघातजन्य मिर्गी के विकास की भविष्यवाणी कर सकते हैं. ये अध्ययन मिर्गी बायोमार्कर अनुसंधान के लिए बायोफ्लुइड नमूने के महत्व को उजागर करते हैं, लेकिन वे नैदानिक परीक्षणों के लिए आंतरिक कई सीमाओं का सामना करते हैं, उदाहरण के लिए, रक्त में एंटी-एपिलेप्टिक ड्रग्स (एईडी) का कोफाउंडिंग कारक, एटियलजि जानकारी की लगातार कमी, अपर्याप्त नियंत्रण, रोगियों की मामूली संख्या, और अन्य17,18।

पूर्व-नैदानिक अनुसंधान मिर्गी के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में बायोफ्लुइड में अणुओं की जांच के लिए अन्य अवसर प्रदान करता है। वास्तव में, ईईजी रिकॉर्डिंग करते समय जानवरों से प्लाज्मा और / या सीएसएफ को वापस लेना संभव है। इसके अलावा, प्रयोग के कई दिनों में नमूनाकरण बार-बार किया जा सकता है, और अध्ययन की मजबूती में सुधार के लिए कई उम्र, लिंग और मिर्गी के अपमान-मिलान वाले नियंत्रणों का उपयोग किया जा सकता है। यहां, ईईजी-निगरानी चूहों में पूंछ नस से प्लाज्मा की समानांतर वापसी के साथ सिस्टर्न मैग्ना से सीएसएफ प्राप्त करने के लिए एक लचीली तकनीक विस्तार से वर्णित है। प्रस्तुत तकनीक के वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं। एक तितली सुई दृष्टिकोण का उपयोग करके, ईईजी इलेक्ट्रोड या इसी तरह के सिर प्रत्यारोपण के कार्य से समझौता किए बिना कई बार सीएसएफ एकत्र करना संभव है। यह intrathecal कैथेटर वापसी प्रक्रियाओं के शोधन का प्रतिनिधित्व करता है, जो संक्रमण का एक अपेक्षाकृत उच्च जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं. इसके अलावा, रक्त संग्रह के लिए उपयोग किया जाने वाला रिपोर्ट किया गया फ्री फॉल ड्रॉपिंग दृष्टिकोण हेमोलिसिस के अत्यधिक कम जोखिम के कारण पूंछ नस रक्त वापसी के अन्य दृष्टिकोणों से बेहतर है, इस तथ्य के कारण कि रक्त टयूबिंग से नहीं गुजरता है और कोई वैक्यूम दबाव लागू नहीं होता है। यदि सख्त रोगाणु मुक्त परिस्थितियों में प्रदर्शन किया जाता है, तो जानवरों के लिए संक्रमण का विशेष रूप से कम जोखिम होता है। इसके अलावा, जानवरों की पूंछ के बहुत अंत में रक्त निकासी शुरू करके, नमूना कई बार दोहराया जा सकता है। ऐसी तकनीकों में महारत हासिल करना आसान है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों के कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फेरारा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (प्राधिकरण: डीएम 603/2022-पीआर) द्वारा 24 नवंबर 1986 (86/609/ईईसी) के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर अनुमोदित किया गया है। इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से चूहे सीएसएफ में छोटे गैर-कोडिंग राइबोन्यूक्लिक एसिड (एसएनसीआरएनए) के आगे मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण और मिर्गी के जानवरों में ईईजी नियंत्रण के तहत प्राप्त प्लाज्मा के लिए समायोजित किया गया है। इसके विकल्प पर, कृपया सर्जरी 19,20,21 की बेहतर समझ और सुधार के लिए संबंधित JoVE वीडियो देखें।

1. इलेक्ट्रोड या टेलीमीटर के सर्जिकल आरोपण के लिए जानवरों की तैयारी

नोट: स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी तकनीक उपयोग की जाने वाली ईईजी प्रणाली के अनुसार भिन्न होती है। निम्न विधि अनुभाग उन चरणों का विवरण प्रदान करता है जो दो प्रकार की सर्जरी के लिए समान हैं।

  1. प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए स्थानीय कानूनों के अनुसार बनाए गए स्प्रैग-डॉली (एसडी) चूहों (नर, 7-8 सप्ताह पुराने, वजन 250-290 ग्राम) का उपयोग करें। भोजन और पीने के पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ मानक परिस्थितियों में जानवरों को घर दें।
  2. सर्जरी और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं से पहले कुछ दिनों के लिए चूहों को संभालने के साथ आगे बढ़ें.
  3. इलेक्ट्रोड या टेलीमीटर आरोपण के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करें। सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए समकालीन मानकों का पालन करें। बाँझ और अच्छे काम करने वाले इलेक्ट्रोड और ट्रांसमीटरों का उपयोग करें।
  4. इलेक्ट्रिक रेजर के साथ जानवर के सिर को शेव करें। केटामाइन (45 मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (7.5 मिलीग्राम/किग्रा) प्रशासित इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) के मिश्रण के साथ पशु में संज्ञाहरण प्रेरित करें, फिर आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया (हवा में 1.4%; 1.2 एमएल/मिनट) एक फेस मास्क के माध्यम से वितरित करें और जानवर के सिर को स्टीरियोटैक्सिक तंत्र में ठीक करें।
  5. दोनों जानवरों के हिंद पैरों पर पैर पैड चुटकी के बाद पेडल वापसी पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें और सर्जरी के अंत तक isoflurane संज्ञाहरण बनाए रखें. प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए नियमित रूप से संवेदनाहारी गहराई की जांच करें।
  6. संज्ञाहरण के कारण ब्लिंक रिफ्लेक्स के नुकसान के कारण कॉर्नियल क्षति को रोकने के लिए दोनों जानवरों की आंखों पर पर्याप्त मात्रा में आंख मरहम लागू करें।
  7. अच्छी तरह से तरल कीटाणुनाशक के साथ पशु की खोपड़ी को साफ करें और एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग करके एक अनुदैर्ध्य 2 सेमी लंबा कट बनाएं। खोपड़ी खोलें और इसे खुला रखने के लिए त्वचा के फ्लैप पर सर्जिकल क्लिप लागू करें।
  8. धीरे से, पेरिओस्टेम अलग ब्रेग्मा और खोपड़ी के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए जिसके माध्यम से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डाला जाएगा.

2. टेथर्ड इलेक्ट्रोड का सर्जिकल आरोपण

नोट: इस प्रोटोकॉल के पंचर सीएसएफ वापसी प्रक्रिया की स्थापना से पहले (विवरण के लिए चरण 9 देखें), कुछ स्वतंत्र रूप से चलती गैर anesthetized चूहों में गाइड प्रवेशनी के माध्यम से दोहराया सीएसएफ निकासी प्रदर्शन किया गया. कई सीएसएफ नमूने के साथ युग्मित लंबी अवधि ईईजी रिकॉर्डिंग पर डबल-हेड प्रत्यारोपण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए टेथर्ड इलेक्ट्रोड के साथ प्रत्यारोपित कैनुलेटेड जानवरों का उपयोग किया गया था। इन विशिष्ट प्रयोगों में, चूहों को एक डमी गाइड प्रवेशनी के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, जिसे सिस्टर्न मैग्ना, जिसकी नोक को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल22 के अनुसार, स्टीरियोटैक्टिक रूप से 7 मिमी डाला गया था। डबल प्रत्यारोपण सर्जरी दृष्टिकोण माइक्रोडायलिसिस गाइड प्रवेशनी और टेथर्ड इलेक्ट्रोड आरोपण23,24 के लिए अतीत में कुछ श्रमिकों द्वारा अपनाई उन लोगों के समान थे.

  1. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के एक हाथ का उपयोग करें, उस पर इलेक्ट्रोड धारक को माउंट करें, और इलेक्ट्रोड को धारक में सीधा रखें। इलेक्ट्रोड टिप बिल्कुल ब्रेग्मा के ऊपर ले जाएँ. ब्रेग्मा के एंटीरोपोस्टीरियर और औसत दर्जे के निर्देशांक लिखें और उन्हें वांछित निर्देशांक में अनुवाद करें।
  2. इलेक्ट्रोड को तब तक कम करें जब तक कि इसकी नोक लगभग खोपड़ी को न छू ले। ड्रिलिंग स्पॉट को चिह्नित करें और चिह्नित स्थान पर खोपड़ी ड्रिल करें। सावधान रहें कि मस्तिष्क और मेनिन्जेस को नुकसान न पहुंचे।
  3. एंकरिंग शिकंजा के लिए चार या अधिक छेद करें और उन्हें खोपड़ी में पेंच करें। एंकरिंग स्क्रू के लिए छेद बनाते समय इलेक्ट्रोड के आकार पर ध्यान दें। इलेक्ट्रोड का आकार तैनात एंकरिंग शिकंजा के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए।
  4. धीरे-धीरे dorsoventral अक्ष पर इलेक्ट्रोड ले स्टीरियोटैक्टिक हाथ कम, मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश, और वांछित स्थिति पर बंद करो. खोपड़ी में खराब शिकंजा में से एक के आसपास इलेक्ट्रोड जमीन तार फिक्स.
  5. इलेक्ट्रोड और इलेक्ट्रोड पेडस्टल ऊंचाई के बारे में आधा कवर शिकंजा पर मेथैसेलेटिक सीमेंट रखो. इलेक्ट्रोड के ऊपरी आधे हिस्से को छोड़ दें, जो टेथरिंग तार के अंत, नंगे फिट बैठता है।
  6. धारक से इलेक्ट्रोड जारी करें और स्टीरियोटैक्टिक हाथ उठाएं। स्टीरियोटैक्सिक तंत्र से पशु को रिहा करें और इसे पश्चात की देखभाल दें।
  7. एक अलग वसूली पिंजरे में पशु प्लेस और जाग और चल जब तक हर 10 मिनट का निरीक्षण. पूरी तरह से ठीक होने के बाद ही जानवर को उसके मानक आवास पिंजरे में और दूसरे को एनेस्थेटाइज्ड जानवरों की कंपनी में लौटाएं।

3. टेलीमीटर का सर्जिकल आरोपण

नोट: केवल बाँझ टेलीमीटर का उपयोग करें। यदि टेलीमीटर का पुन: उपयोग किया जाता है, तो उनके निर्माता के निर्देशों के अनुसार सर्जरी से पहले उन्हें साफ और निष्फल करें। इस प्रोटोकॉल में, ईईजी रिकॉर्डिंग के लिए एक डेटा साइंस इंटरनेशनल (डीएसआई) टेलीमीटर का उपयोग किया गया था।

  1. चुंबक का उपयोग करके टेलीमेट्री ट्रांसमीटर चालू करें और AM फ़्रीक्वेंसी रेडियो के साथ सिग्नल का परीक्षण करें। सर्जरी से पहले एक मजबूत और स्पष्ट संकेत की जाँच करें। यदि आवश्यक हो, तो खराब काम करने वाले टेलीमीटर को त्याग दें।
  2. वयस्क चूहों के लिए इष्टतम लंबाई के लिए इन छोटा करके टेलीमीटर सुराग तैयार करें. दो (नकारात्मक और सकारात्मक) लीड पर सिलिकॉन कोटिंग को वापस छीलें, पेचदार स्टील लीड के लगभग 5 मिमी को उजागर करें। लीड की नोक पर लंबाई में लगभग 2 मिमी और चौड़ाई में 1 मिमी का एक लूप हैंडल बनाएं।
  3. बाएं कंधे के नीचे और पीछे जानवर के फ्लैंक को शेव करें। स्थिर पेरोक्साइड और चतुर्धातुक अमोनियम गतिविधि के आधार पर कीटाणुनाशक के साथ सर्जरी के क्षेत्र कीटाणुरहित करें। कीटाणुनाशक को 15 मिनट के लिए कार्य करने दें।
  4. बस जानवर के कंधे के पीछे के बारे में 2 सेमी पार्श्व चीरा बनाओ और ट्रांसमीटर प्लेसमेंट के लिए के बारे में 5 सेमी3 अंतरिक्ष के बारे में एक चमड़े के नीचे जेब बनाते हैं. ट्रांसमीटर को शरीर की लंबी धुरी के समानांतर रखें, जिसमें लीड रोस्ट्रल दिशा में निर्देशित हो।
  5. ट्रांसमीटर को 3-0 कपास सिवनी के साथ चमड़े के नीचे की जेब की भीतरी दीवार पर ठीक करें। कुंद समाप्त कैंची का प्रयोग, पार्श्व और जानवर की गर्दन के माध्यम से चमड़े के नीचे सुरंग (लंबाई में लगभग 2.5 सेमी) बनाने, इस प्रकार 1.6 कदम पर जानवर की खोपड़ी पर किए गए midline चीरा के साथ ट्रांसमीटर जेब को जोड़ने.
  6. संदंश के साथ दोनों टेलीमीटर ले लो और उन्हें सुरंग के माध्यम से ऊपर खींच, तो वे खोपड़ी चीरा आउटलेट से फैला रहे हैं. घाव क्लिप के साथ खोपड़ी चीरा से बाहर की ओर पकड़ो.
  7. सकारात्मक (लाल) नेतृत्व के लिए वांछित निर्देशांक को अलग करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम का उपयोग करें और सकारात्मक लीड टिप (चरण 2.1 के समान) के लिए खोपड़ी में छेद ड्रिल करें। स्क्रू को ऊपर की ओर रोस्ट्रम में लंगर डालने के लिए एक और छेद बनाएं और इसे खोपड़ी में पेंच करें।
  8. खोपड़ी और ड्यूरा के नीचे सकारात्मक नेतृत्व की नोक डालें और इसे मस्तिष्क की सतह पर नीचे रखें। पेंच पर नकारात्मक (सफेद) लीड की लूप वाली नोक को हुक करें। सकारात्मक नेतृत्व आउटलेट के आसपास methacrylic सीमेंट की एक छोटी राशि रखो और नकारात्मक नेतृत्व खोपड़ी पर उन्हें स्थिर करने के लिए.
  9. एक 3-0 कपास सीवन के साथ खोपड़ी त्वचा की भीतरी दीवार की ओर जाता है ठीक करें. सुनिश्चित करें कि निश्चित लीड और फिक्सिंग सिवनी सीएसएफ वापसी की साइट में हस्तक्षेप नहीं करेगी (यानी, ओसीसीपटल प्रोट्यूबरेंस और एटलस की रीढ़ के बीच एक रोम्बस की उपस्थिति के साथ एक अवसादग्रस्तता सतह)।
  10. एक 3-0 कपास सीवन का उपयोग खोपड़ी चीरा और पार्श्व चीरा बंद करें. घावों पर कीटाणुनाशक लगाएं। इनके सूखने के बाद ही, टांके वाले घावों पर एंटीबायोटिक क्रीम लगाएं।

4. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल

  1. के बारे में 1 घंटे के लिए जानवरों की निगरानी उसके बाद सर्जरी सीधा और पिंजरे के चारों ओर घूम रहा है. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए उन्हें वार्मिंग पैड पर रखें। संक्रमण को रोकने के लिए एक प्रणालीगत एंटीबायोटिक के साथ जानवरों को प्रशासित करें और 2-3 दिनों के लिए शल्य चिकित्सा के बाद के दर्द को रोकने के लिए एक प्रणालीगत एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
  2. चूहों को शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद कम से कम 7 दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दें। दर्द या संकट के संकेतों के लिए 3 दिनों के लिए दैनिक रूप से कम से कम एक बार जानवरों की निगरानी करें।

5. चूहों में स्टेटस एपिलेप्टिकस इंडक्शन

नोट: चूहों में मेसियल टेम्पोरल लोब मिर्गी (एमटीएलई) को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक स्टेटस एपिलेप्टिकस (एसई) प्रेरण के विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, ग्वारिनो एट अल.25का संदर्भ लें।

  1. शल्य चिकित्सा के बाद की वसूली के एक सप्ताह के बाद, जानवरों को समूहों को यादृच्छिक रूप से असाइन करें: (i) वाहन प्राप्त करने वाले जानवरों को नियंत्रित करें और (ii) मिर्गी के जानवर जो पिलोकार्पिन प्राप्त करेंगे। मिर्गी समूह के लिए आनुपातिक रूप से अधिक संख्या में जानवरों का उपयोग करें, क्योंकि सभी पाइलोकार्पिन-प्रशासित चूहे जीवित नहीं रहेंगे या एसई विकसित नहीं करेंगे।
  2. एसई प्रेरण से एक दिन पहले, जानवरों को गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा 1 एमएल / किग्रा की मात्रा के रूप में 0.9% खारा (3 एम) में भंग 127 मिलीग्राम / किग्रा लिथियम क्लोराइड की एक खुराक दें। पशु के लिथियम का प्रशासन करें, जो एसई शुरुआत के समय में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एसई के प्रेरण से लगभग 14 घंटे पहले पाइलोकार्पिन प्रभावकारिता26, लगभग 14 घंटे बढ़ाता है।
  3. लिथियम प्रशासन के लगभग 14 घंटे बाद, चूहों को मिथाइल स्कोपोलामाइन (1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का एक इंजेक्शन दें।
  4. मिथाइल स्कोपोलामाइन प्रशासन के ठीक 30 मिनट बाद, चूहों को एसई को प्रेरित करने के लिए पाइलोकार्पिन (50 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) का एक इंजेक्शन दें। चूहों को नियंत्रित करने के लिए मिथाइल स्कोपोलामाइन और वाहन (0.9% NaCl समाधान) दें।
    1. Pilocarpine इंजेक्शन जानवरों में विशिष्ट व्यवहार को प्रेरित करता है: प्रारंभिक आंशिक दौरे (पाइलोकार्पिन प्रशासन के बाद 5 मिनट के भीतर वाइब्रिस और सिर हिलाने के आंदोलन) 25-30 मिनट के भीतर आवर्तक सामान्यीकृत आक्षेप (एसई) में विकसित होते हैं। चूहों के लिए जो 30 मिनट के भीतर एसई विकसित नहीं करते हैं, पाइलोकार्पिन (25 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) की एक अतिरिक्त खुराक का प्रशासन करते हैं, और यदि वे अभी भी एसई विकसित नहीं करते हैं, तो उन्हें अध्ययन (एसई गैर-उत्तरदाताओं) से बाहर करें।
  5. पिलोकार्पिन इंजेक्शन के तुरंत बाद शुरू होने वाले हर 5 मिनट में चूहों में जब्ती व्यवहार का निरीक्षण करें और स्कोर करें। 27 स्कोर करने के लिए रैसीन पैमाने का प्रयोग करें।
  6. दवाओं के कॉकटेल की आईपी प्रशासन द्वारा शुरुआत के बाद एसई 2 एच को बाधित करें: डायजेपाम (10 मिलीग्राम / किग्रा), फेनोबार्बिटल (25 मिलीग्राम / किग्रा), और स्कोपोलामाइन (1 मिलीग्राम / किग्रा)।
  7. चूहों को 4 घंटे के बाद फिर से यह कॉकटेल दें। अंत में, एक और 4 घंटे के बाद, चूहों आईपी दवाओं का अंतिम मिश्रण (डायजेपाम 10 मिलीग्राम / किग्रा प्लस स्कोपोलामाइन 1 मिलीग्राम / किग्रा) को पूरी तरह से जब्ती गतिविधि को रोकने के लिए दें।
  8. खारा (0.9% NaCl समाधान के 1 एमएल, 7.0 करने के लिए समायोजित पीएच) के साथ पशुओं आईपी इंजेक्ट और एसई के बाद 2-3 दिनों के लिए एक 10% सुक्रोज समाधान के साथ उन्हें खिलाने के लिए शरीर वजन घटाने जो एसई इस प्रकार से वसूली के पक्ष में.
  9. विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकताओं के अनुसार विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के लिए बेतरतीब ढंग से एसई जीवित जानवरों को असाइन करें। मिर्गी चूहों में आगे प्रयोगों के लिए निम्नलिखित समावेश / बहिष्करण मानदंड का उपयोग करें: पाइलोकार्पिन प्रशासन के बाद 1 घंटे के भीतर ऐंठन एसई का विकास, एसई के बाद पहले सप्ताह में वजन बढ़ना, और ईईजी पंजीकरण25 के लिए ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में इलेक्ट्रोड की सही स्थिति।

6. मिर्गी के चूहों में टेथर्ड वीडियो-ईईजी और जब्ती गतिविधि का विश्लेषण

नोट: यह खंड मानक परिस्थितियों में एकल-हाउस, स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में ईईजी संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है। पिंजरे में ऐसी वस्तुएं नहीं होनी चाहिए जहां जानवर या रिकॉर्डिंग केबल फंस सकती है। संबोधित किए जाने वाले वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर, कई मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है। मिर्गी अनुसंधान के मामले में, विद्युत और मोटर दौरे को पहचानने के लिए ईईजी निशान की जांच की जाती है। एक जब्ती की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम पैरामीटर पैरॉक्सिस्मल विद्युत गतिविधि के आयाम, आवृत्ति और अवधि हैं।

  1. आदत की अनुमति देने और नए वातावरण से प्रेरित तनाव को कम करने के लिए रिकॉर्डिंग रूम में एक साफ पिंजरे में जानवर रखें। पर्यावरण विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र के साथ ईजीजी संकेत के संदूषण से बचने के लिए एक फैराडे पिंजरे में जानवर के पिंजरे रखें.
  2. रिकॉर्डिंग केबल के एक सिरे को रिकॉर्डिंग डिवाइस से कनेक्ट करें। विद्युत क्षमता को मापने और जमीन और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच अंतर करने के लिए वाल्टमीटर का उपयोग करें।
  3. रिकॉर्डिंग केबल के दूसरे छोर को चूहे के सिर पर तय किए गए इलेक्ट्रोड से कनेक्ट करें। इस उद्देश्य के लिए, इलेक्ट्रोड कनेक्टर में केबल प्लग डालने जब जानवर के सिर पर सीमेंट कवर पकड़ और चूहे के सिर पर किसी भी दबाव लागू करने से बचने.
  4. केबल को घुमाने के जोखिम को रोकने के दौरान जानवर की मुक्त आवाजाही की अनुमति देने के लिए रिकॉर्डिंग केबल के वजन को संतुलित करें। ऐसा करने के लिए, एक काउंटरबैलेंसिंग आर्म या कम्यूटेटर का उपयोग करें। यहां तक कि अगर रिकॉर्डिंग केबल असंतुलित है, तो भोजन को खिलाने वाले धारक के बजाय पिंजरे के अंदर रखें, जिसमें जानवरों को भोजन तक पहुंचने के लिए उठना होगा।
  5. पंजीकरण शुरू करने से पहले, ईईजी से डेटा प्राप्त करने और संसाधित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सेटिंग्स की जांच करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल ईईजी रिकॉर्डिंग करने के लिए आवश्यक उपकरण का परिचय प्रदान नहीं करता है, हालांकि, ईईजी संकेतों में कलाकृतियों और शोर से बचने के लिए पर्याप्त फ़िल्टरिंग और नमूना दरों को लागू किया जाना चाहिए।
    1. एक नियमित प्रयोग के लिए, 500 हर्ट्ज पर नमूना दर सेट, और 5000x पर प्रवर्धन लाभ. 0.005 हर्ट्ज बैंड (यूरोपीय देशों के लिए विशिष्ट) में आसपास की विद्युत गतिविधि को त्यागने के लिए एक पायदान फिल्टर के अलावा 50 हर्ट्ज फिल्टर का उपयोग करके सिग्नल को फ़िल्टर करें।
  6. वीडियो और ईईजी रिकॉर्डिंग दोनों शुरू करें और सुनिश्चित करें कि निशान समय भर में विशिष्ट आवृत्ति बैंड में शक्ति की जांच करके एक अपेक्षित ईईजी संकेत से मेल खाते हैं। जानवरों में हस्तक्षेप शुरू करने से पहले एक आधारभूत अवधि रिकॉर्ड करें।
  7. समय-समय पर जानवरों और ईईजी निशान की जाँच करें। यह दुर्लभ नहीं है कि एक रिकॉर्डिंग केबल चूहे के सिर में इलेक्ट्रोड कनेक्टर से अलग हो जाती है। यदि ऐसा होता है, तो चूहे के सिर में इलेक्ट्रोड को फिर से रिकॉर्डिंग केबल से कनेक्ट करें और एक स्पष्ट ईईजी सिग्नल की जांच करें।
  8. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से ईईजी सिग्नल का विश्लेषण करें। यदि मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जाता है, तो जब्ती जैसी गतिविधियों की पहचान करने के लिए ईईजी रिकॉर्डिंग के माध्यम से स्क्रीन करें। यदि सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा रहा है, तो जब्ती घटना के प्रमुख मापदंडों को कॉन्फ़िगर करें, जैसे आयाम, आवृत्ति और विद्युत गतिविधि की अवधि।
    नोट: एकल जब्ती को बेसलाइन से 3x अधिक आयाम, 5 हर्ट्ज के बराबर या उससे अधिक आवृत्ति और कम से कम 5 एस22 की अवधि के साथ एक विद्युत गतिविधि की विशेषता हो सकती है।
  9. उपयोग की जाने वाली विधि के बावजूद, ईईजी के साथ एक साथ एकत्र की गई सिंक्रनाइज़ वीडियो रिकॉर्डिंग की जांच करके संभावित ऐंठन बरामदगी की पुष्टि करें।

7. टेलीमेट्री वीडियो-मिर्गी चूहों में ईईजी और जब्ती गतिविधि का विश्लेषण

नोट: यह खंड मानक परिस्थितियों में एकल-हाउस, स्वतंत्र रूप से चलती चूहों में रेडियोटेलीमेट्री ईईजी संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टेलीमेट्री सिस्टम पर आधारित है। हालांकि, कई टेलीमेट्री सिस्टम अपने कार्यात्मक और तकनीकी विशिष्टताओं में थोड़ा भिन्न होते हैं। प्रणाली को प्रयोगशाला आवश्यकताओं और अनुसंधान लक्ष्यों के आधार पर चुना जाना चाहिए।

  1. सिग्नल रिसीवर के ऊपर पशु घर पिंजरे रखें. सिग्नल रिसीवर को डेटा अधिग्रहण प्रणाली से कनेक्ट करें और इसे अधिग्रहण सॉफ्टवेयर वाले कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
  2. चूहे के फ्लैंक में डाले गए टेलीमीटर के निकटता में एक चुंबक रखकर रेडियोफ्रीक्वेंसी टेलीमेट्री इम्प्लांट चालू करें। रेडियो डिवाइस का उपयोग करके सिग्नल का परीक्षण करें। टेलीमीटर का परीक्षण करने के लिए एक सार्वभौमिक रेडियो डिवाइस का उपयोग करें और एक स्पष्ट बीप सुनें जो इंगित करता है कि टेलीमीटर सक्रिय है, जबकि एक जलती हुई ध्वनि एक निष्क्रिय टेलीमीटर को इंगित करती है।
    नोट: रिकॉर्डिंग की अवधि को परिभाषित करने से पहले रेडियोफ्रीक्वेंसी ट्रांसमीटर बैटरी के जीवनकाल को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
  3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सेट करें और एक साथ ईईजी और वीडियो डेटा प्राप्त करने के लिए टेलीमेट्री सिग्नल और वीडियो सिस्टम को सिंक्रनाइज़ करें। प्रत्येक प्रत्यारोपित ट्रांसमीटर के लिए एक संकेत रिसीवर असाइन करें और ट्रांसमीटर के अंशांकन मूल्यों को सेट करें। नमूना दर को 1000 हर्ट्ज पर सेट करें, -500 एमवी और +500 एमवी के बीच शोर का पता लगाना, और 100 एमएस पर एकीकरण अंतराल। निम्न और उच्च पास फिल्टर का उपयोग न करें।
  4. टेलीमेट्री और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें। मिर्गी जैसी गतिविधि प्राप्त करने से पहले दीर्घकालिक आधारभूत रिकॉर्डिंग करें। चरण 6.8 और 6.9 में वर्णित के रूप में ईईजी संकेत का विश्लेषण.

8. पूंछ नस से रक्त संग्रह की प्रक्रिया

नोट। वैक्यूम रक्त संग्रह प्रणाली में एक तितली सुई (23 ग्राम x 3/4 x 12 (0.8 मिमी x 19 मिमी x 305 मिमी) होती है। रक्त संग्रह तकनीक आसानी से एक ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है और प्रक्रिया के बारे में 5 मिनट लगते हैं.

  1. निकासी से कुछ समय पहले आसुत जल में 1% K2EDTA के साथ तितली सुई और उसकी टयूबिंग को कोट करें, अर्थात, 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके सिस्टम से K2EDTA समाधान को आकर्षित करें और निष्कासित करें। बस सुई के पीछे टयूबिंग में कटौती करने के क्रम में बूंद से रक्त ड्रॉप इकट्ठा करने के लिए, आकांक्षा (चित्रा 1 ए) के बिना.
  2. चूहे को एक प्रेरण कक्ष में रखें और इसे आइसोफ्लुरेन (हवा में 1.4%; 1.2 एमएल/मिनट) के साथ एनेस्थेटाइज करें। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर स्विच करें और फेस मास्क के माध्यम से एनेस्थीसिया बनाए रखें। जानवर के नीचे हीटिंग पैड रखो, पैड के साथ सीधे संपर्क में अपनी पूंछ का एक हिस्सा रखते हुए.
  3. धीरे पक्ष के लिए जानवर की पीठ ले जाएँ इतना है कि पार्श्व पूंछ नस शीर्ष पर रखा जाता है.
  4. पार्श्व नस को फैलाने के लिए 2 मिनट के लिए गर्म पानी (42 डिग्री सेल्सियस) में पूंछ डुबोएं। नस को अधिक दृश्यमान बनाने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पूंछ पोंछ लें। एक नियमित तापदीप्त बल्ब का उपयोग करके पूंछ पर गर्म प्रकाश डालें।
  5. 21G तितली सुई को पार्श्व पूंछ की नस में 5 मिमी की गहराई और 20° के कोण के साथ डालें। एक 500 माइक्रोन वैक्यूम संग्रह ट्यूब में रक्त एकत्र करें जिसमें थक्कारोधी के रूप में 5 मिलीग्राम के2ईडीटीए होता है (चित्र 1 बी, सी)।
  6. सुई निकालें और पंचर साइट पर दबाव डालकर रक्त के प्रवाह को रोकें। चूहे को उसके घर के पिंजरे में लौटा दें।
  7. धीरे ट्यूब 10x पलटना रक्त में थक्कारोधी मिश्रण करने के लिए. संग्रह ट्यूबों को समायोजित करने के लिए बर्फ में लगभग 1.5 सेमी गहराई के छेद बनाएं। धीरे और खड़ी बर्फ पर नमूना डाल दिया.
  8. प्लाज्मा को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए 1300 x ग्राम पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस ) में रक्त के नमूने को अपकेंद्रित्र करें। इस प्रक्रिया को अधिकतम 1 घंटे के भीतर करें।
  9. प्लाज्मा के बारे में 200 माइक्रोन ले लो, लाल और सफेद रक्त कोशिका परत से परहेज. वापस ले लिया प्लाज्मा 0.2 एमएल बाँझ microtube में रखो. यदि आवश्यक हो, centrifugation के बाद अप करने के लिए 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  10. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 5 माइक्रोन को अलग रखें। विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें।
    नोट: वैक्यूम का उपयोग न करें भले ही कुछ शोधकर्ताओं द्वारा सिफारिश की28 या अधिक रक्त प्राप्त करने के लिए चरण 8.5 में वर्णित प्रक्रियाओं के दौरान पूंछ दूध, के रूप में यह अगले sncRNA परिमाणीकरण विश्लेषण के लिए नमूना गुणवत्ता कम हो जाती है (कृपया विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें). ध्यान रखें कि चूहे में, एक समय में वापस लिए जा सकने वाले रक्त की अधिकतम मात्रा इसकी कुल रक्त मात्रा का <10% (यानी, 250-300 ग्राम चूहे में लगभग 1.6-1.9 एमएल) और1 महीने में कुल रक्त मात्रा (लगभग 2.64 एमएल) का <15% है। इस प्रोटोकॉल में, एक ही जानवर में पांच बार तक एक ही अवसर पर रक्त संग्रह का अधिकतम 500 माइक्रोन30,31 का उपयोग किया जाता है।

9. सीएसएफ संग्रह प्रक्रिया

नोट। तकनीक आसानी से एक एकल ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है, और प्रक्रिया के लिए लगभग 2-4 मिनट की आवश्यकता होती है। सीएसएफ के संग्रह के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री कम लागत, एकल-उपयोग वैक्यूम तितली सुई और निष्कर्षण ट्यूब हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक बाँझ सिरिंज से जुड़े एक तितली पंखों वाला जलसेक सेट वैक्यूम (चित्रा 2ए) बनाने के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. 23 जी तितली सुई तैयार करें, इसकी प्लास्टिक आस्तीन संरक्षण में कटौती ताकि नंगे सुई के अंत को 7 मिमी से उजागर किया जा सके ताकि इसे वापसी के दौरान सिस्टर्न मैग्ना में 7 मिमी से अधिक गहराई से घुसने से रोका जा सके (चित्र 2बी)।
  2. बहुलक टयूबिंग से सुसज्जित तितली सुई को 1 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें।
  3. चूहे को एक प्रेरण कक्ष में रखें और इसे isoflurane (हवा में 1.4%; 1.2 एमएल/मिनट) के साथ संवेदनाहारी करें। isoflurane प्रवाह stereotaxic फ्रेम के लिए स्विच और एक चेहरा मुखौटा के माध्यम से दिया संज्ञाहरण बनाए रखने. एक रेजर के साथ चूहे के पिछले सिर और गर्दन पर फर निकालें।
  4. कान सलाखों के साथ चूहे के सिर को ठीक करें। जानवर के सिर को लगभग 45 डिग्री नीचे लंबवत रूप से कम करें, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम(चित्रा 2सी)की नाक पट्टी को नीचे ले जाएं। जानवर के पीछे के सिर का निरीक्षण करें और ओसीसीपटल प्रोट्यूबरेंस और एटलस रीढ़ के बीच, एक रोम्बस के पहलू के साथ थोड़ा उदास सतह ढूंढें।
  5. इस सतह को 70% इथेनॉल के साथ रगड़ें ताकि इसे और अधिक दृश्यमान बनाया जा सके और इसे कीटाणुरहित किया जा सके।
  6. तितली सुई को सीएसएफ संग्रह के लिए सिस्टर्न मैग्ना में रोम्बस के आकार की उदास सतह के केंद्र में लंबवत रूप से डालें जब तक कि आंदोलन सुई के आकार प्लास्टिक आस्तीन संरक्षण (चित्रा 2डी) को काटकर अवरुद्ध न हो जाए। धीरे वापस ड्रा 1 एमएल सिरिंज पिस्टन क्रम में सीएसएफ धीरे धीरे सुई के माध्यम से प्रवाह जाने के लिए.
  7. बहुलक टयूबिंग(चित्रा 2डी)में सीएसएफ के बारे में 100 माइक्रोन लीजिए. रक्त या किसी अन्य दृश्य संदूषण में प्रवेश करने से बचें। तितली सुई के बहुत करीब बहुलक टयूबिंग चुटकी और इस बिंदु पर टयूबिंग में कटौती.
  8. सिरिंज में स्पष्ट (असंदूषित) नमूना ड्रा. दूषित नमूने त्यागें, अगर दृश्य संदूषण एकत्रित टयूबिंग में प्रवेश करती है.
  9. नमूना को बाँझ 0.2 एमएल माइक्रोट्यूब में निष्कासित करें और 1 घंटे तक बर्फ पर स्टोर करें।
  10. जानवर के सिर पर सीएसएफ वापसी की साइट कीटाणुरहित. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से चूहे निकालें और इसे अपने पिंजरे में वापस डाल दिया.
  11. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 2 माइक्रोन अलग रखो। आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना के बाकी स्टोर करें.
    नोट: चूहों में, यदि कई सीएसएफ निकासी बार-बार की जाती है, तो प्रत्येक संग्रह में वापस लेने की सिफारिश की गई मात्रा 100 माइक्रोन32 है। इस प्रोटोकॉल में, एक ही जानवर में 15 दिनों में 5x अधिकतम निकासी के साथ एक ही अवसर पर सीएसएफ के अधिकतम 100 माइक्रोन किया गया था।

10. नमूने की गुणवत्ता का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री विश्लेषण

नोट: सीएसएफ और प्लाज्मा नमूनों के उचित संग्रह के बाद, नमूने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण के लिए तैयार हैं और किसी विशिष्ट हैंडलिंग की आवश्यकता नहीं है। नमूनों में हेमोलिसिस जोखिम का मूल्यांकन करने के लिए 414 एनएम पर यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा हीमोग्लोबिन अवशोषण को मापें। चूहे के नमूनों में 0.25 की कट-ऑफ अवशोषण मूल्य का उपयोग करें। इस सीमा का चुनाव बाद के qPCR विश्लेषण और sncRNAs परिमाणीकरण के लिए इसकी विशिष्ट आवश्यकताओं पर निर्भर हो सकता है।

  1. यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर स्विच करें। प्लाज्मा या सीएसएफ के लिए 414 एनएम की एकल तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण माप के लिए विधि का चयन करें। अगला पर क्लिक करें.
  2. शुद्ध पानी के साथ 1 मिमी क्युवेट कुल्ला। क्युवेट मापने के स्थान पर 70% इथेनॉल के 5 माइक्रोन रखो। एक कागज़ के तौलिये से सुखाएं और लिंट-फ्री टिशू पेपर से रगड़ें। जांचें कि क्या यह पूरी तरह से पारदर्शी है।
  3. 1 मिमी क्युवेट में शुद्ध पानी के 1.5 माइक्रोन डालें और इसे बंद करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के मापने कक्ष में क्युवेट डालें और रिक्त बटन पर क्लिक करके रिक्त नमूना अवशोषण को मापें। जांचें कि 414 एनएम पर अवशोषण मूल्य 0.000 है।
  4. क्युवेट को पेपर टॉवल से सुखाएं और लिंट-फ्री टिशू पेपर से साफ करें। जांचें कि क्या यह पूरी तरह से पारदर्शी है।
  5. नमूने के 1.5 माइक्रोन को 1 मिमी क्युवेट में डालें और इसे बंद करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के मापने कक्ष में क्युवेट डालें। नमूना बटन पर क्लिक करते हुए, नमूना को मापें। 414 एनएम पर नमूने के अवशोषण की जांच करें और इसे एनोटेट करें।
  6. सभी उपलब्ध नमूनों में हीमोग्लोबिन अवशोषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए आगे बढ़ें। रिक्त और नमूना बटन पर वैकल्पिक रूप से क्लिक करके, किसी भी प्लाज्मा या सीएसएफ नमूने के आगे रिक्त नमूना को मापने.
  7. -80 डिग्री सेल्सियस पर A414 एनएम < 0.25 के साथ नमूनों को संरक्षित करें और नमूनों को त्यागें यदि A414 एनएम 0.25 > हैं।
  8. शुद्ध पानी और 70% इथेनॉल के साथ 1 मिमी क्युवेट कुल्ला, क्रमिक रूप से. क्यूवेट को सुखा लें।
  9. इसकी धूल को रोकने के लिए मापने वाले कक्ष में खाली क्युवेट को बंद करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर बंद करें।

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Representative Results

9 नियंत्रण और 18 पुरानी मिर्गी चूहों में किए गए विभिन्न सीएसएफ और रक्त वापसी प्रक्रियाओं का परिणाम, सभी को 1 महीने के बाद एसई में इलेक्ट्रोड के साथ प्रत्यारोपित किया गया है, सफलता दर के संदर्भ में बताया गया है। आरोपण के बाद, सभी चूहों वीडियो ईईजी 1 महीने के लिए निगरानी की गई, जिसके दौरान सीएसएफ प्लस रक्त प्रयोग के दो पिछले हफ्तों के दौरान हर 3 दिनों में 5x वापस ले लिया गया था (यानी, दिन 52, 55, 58, 61, और 64 के बाद एसई; डीपीएसई)। विभिन्न जानवरों में कई निकासी से डेटा का उपयोग डबल-हेड इम्प्लांट-संपन्न चूहों (सीएसएफ निकासी के लिए कैनुलेटेड) में सीएसएफ संग्रह की सफलता दर (सिस्टर्न मैग्ना पंचर द्वारा किए गए) के साथ सीएसएफ संग्रह की सफलता दर की तुलना करने के लिए किया गया था, केवल टेथर्ड या टेलीमेट्री इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित जानवरों (तालिका 1)। विभिन्न जानवरों में, प्लाज्मा नमूनों की गुणवत्ता पर वैक्यूम रक्त संग्रह या पूंछ दूध देने के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था(तालिका 2)। इस प्रयोजन के लिए, 414 एनएम पर यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग मुक्त हीमोग्लोबिन का पता लगाने के लिए किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था, और क्रुस्कल-वालिस या पोस्ट-हॉक टुकी के कई तुलना परीक्षणों के साथ एक तरफा एनोवा का उपयोग किया गया था (पी <0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है)। डेटा को SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है।

कैनुलेटेड और पंचर चूहों में कई सीएसएफ नमूने की सफलता दर
सीएसएफ चूहों के 3 समूहों में 2 सप्ताह के भीतर 5x नमूना किया गया है: (मैं) cannulated और टेथर्ड इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित चूहों (जानवरों की सीटी समूह); इनमें, सीएसएफ वापसी डमी गाइड प्रवेशनी और पीटीएफई ट्यूबिंग संयुक्त के माध्यम से 1 एमएल सिरिंज के माध्यम से किया गया था जब वे गैर-संवेदनाहारी थे और वीडियो-ईईजी के तहत स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे थे; (ii) पंचर (चरण 9) और टेथर्ड इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित चूहे (पीटी समूह); (iii) पंचर और टेलीमेट्री इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित चूहे (पीटीई समूह)। प्रति समूह कुल 9 जानवरों (6 मिर्गी और 3 नियंत्रण चूहों) का उपयोग किया गया था। 5 गुना से अधिक सफल संग्रह की संख्या का मूल्यांकन किया गया था। पंचर चूहों में सफलता दर समान थी: 86.7% ± टेथर्ड में 5.8% और टेलीमेट्री इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित जानवरों में 88.9% ± 4.8%। इसके बजाय, cannulated चूहों में, दर भले ही काफी अलग नहीं (71.1% ± 8.9%, तालिका 1) कम हो गया था. इस तरह के परिणामों से संकेत मिलता है कि जानवरों के सिर पर प्रवेशनी बार-बार सीएसएफ नमूनाकरण में हस्तक्षेप कर सकती है और अनुदैर्ध्य अध्ययनों से समझौता कर सकती है। पंचर तकनीक प्रत्यारोपित जानवरों इलेक्ट्रोड में कई सीएसएफ निकासी के लिए अधिक उपयुक्त है।

प्लाज्मा संग्रह विधि पर वैक्यूम और पूंछ दूध देने का प्रभाव
रक्त 52, 55, 58, 61, और 64 पोस्ट-एसई दिनों में 9 चूहों (6 मिर्गी और 3 नियंत्रण चूहों) से 5x एकत्र किया गया था और प्लाज्मा गुणवत्ता का मूल्यांकन हेमोलिसिस नेत्रहीन और यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा 414 एनएम पर किया गया था। प्रत्येक चूहे में पहला नमूना प्राप्त करने के लिए, एक 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक 21G तितली सुई के माध्यम से वैक्यूम वापसी कार्यरत था. दूसरे नमूने के साथ, ड्रॉप निकासी और 21 जी तितली सुई प्रणाली को एक साथ पूंछ को दूध देते समय नियोजित किया गया था। तीसरा-पांचवां नमूना प्राप्त करने के लिए, पूंछ को दूध दिए बिना ड्रॉप वापसी प्रक्रिया (चरण 9 में वर्णित) का उपयोग किया गया था।

वैक्यूम को नियोजित करते समय, प्लाज्मा दृश्य निरीक्षण के तहत गुलाबी रंग का था, और 9 चूहों के नमूनों का औसत अवशोषण मूल्य 0.647 ± 0.067 (तालिका 2, चित्रा 3) था। इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे यदि प्रक्रिया के दौरान पूंछ दूध देने को नियोजित किया गया था: 0.620 ± 0.043 मतलब अवशोषण (तालिका 2, चित्रा 3) के साथ गुलाबी रंग का प्लाज्मा। इसके विपरीत, गुरुत्वाकर्षण-सक्षम ड्रॉप निकासी और 21G तितली सुई प्रणाली के साथ, औसत प्लाज्मा अवशोषण मान काफी कम हो गए थे (0.226 ± 0.017 58 dpSE पर; 0.223 ± -0.09 61 dpSE पर; 0.226 ± 0.018 64 dpSE पर; तालिका 2, चित्रा 3) वैक्यूम या पूंछ दूध देने की विधि के संबंध में। इसके अलावा, ड्रॉप प्लाज्मा नमूने मुख्य रूप से पारदर्शी थे। अवशोषण के उच्च मूल्य (52 और 55 डीपीएसई) नमूनों के गुलाबी रंग (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ सहसंबद्ध हैं। ये परिणाम सुझाव दे सकते हैं कि विश्लेषण के लिए बहुत उच्च गुणवत्ता के नमूने प्राप्त करने के लिए अंतिम विधि सबसे अच्छी है।

Figure 1
चित्रा 1: प्लाज्मा नमूना वर्कफ़्लो के प्रमुख चरण। (ए) स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रक्त वापसी और चूहे के लिए आवश्यक सामग्री, संग्रह के लिए तैयार; (बी, सी) पार्श्व पूंछ नस में डाली गई 21G तितली सुई के साथ पूंछ का आवर्धन और एक थक्कारोधी के साथ संग्रह ट्यूब की दीवारों से नीचे गिरने वाली रक्त की बूंद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) नमूना वर्कफ़्लो के प्रमुख कदम। (ए) संग्रह से कुछ समय पहले स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में सीएसएफ वापसी और चूहे के लिए आवश्यक सामग्री; (बी) 23 जी तितली सुई अपनी प्लास्टिक आस्तीन संरक्षण में कटौती करके तैयारी ताकि नंगे सुई के अंत को 7 मिमी के लिए उजागर किया जा सके ताकि सिस्टर्न मैग्ना में सही प्रवेश सुनिश्चित किया जा सके; (सी) चूहे सिर वापसी के दौरान 45 डिग्री से नीचे की ओर झुका हुआ है. (डी) सिस्टर्न मैग्ना में डाली गई तितली की सुई के साथ rhomboid साइट पर आवर्धन। टयूबिंग में उगता है कि सीएसएफ नोट, मार्कर की नोक द्वारा इंगित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्लाज्मा नमूनों की गुणवत्ता मूल्यांकन। विभिन्न तरीकों का उपयोग करके 5 समय-बिंदुओं (52, 55, 58, 61, और 64 दिनों के पोस्ट स्टेटस एपिलेप्टिकस, डीपीएसई) पर 9 जानवरों के प्लाज्मा नमूनों में यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मुक्त हीमोग्लोबिन के लिए 414 एनएम पर मापा गया हेमोलिसिस की डिग्री: दिन 52 - वैक्यूम तकनीक; दिन 55 - पूंछ दुहना; दिन 58-64 ड्रॉप तकनीकों को नियोजित किया गया था। वैक्यूम और पूंछ दूध देने के तरीकों की तुलना में ड्रॉप तकनीक द्वारा प्राप्त प्लाज्मा में मुक्त हीमोग्लोबिन में कमी महत्वपूर्ण थी (* एक तरफा एनोवा और पोस्ट-हॉक टुकी के कई तुलना परीक्षण के अनुसार पी < 0.05)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सीएसएफ निकासी की सफलता दर। जानवरों के तीन प्रयोगात्मक समूहों में दोहराया सीएसएफ वापसी की सफलता दर की तुलना में 5 दिनों में सफल निकासी का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया. मान 1 को स्पष्ट सीएसएफ के > 100 माइक्रोन की सफल वापसी के लिए सौंपा गया था; शून्य मूल्य 100 μL और / या अस्पष्ट CSF < निकासी को सौंपा गया था। संक्षिप्ताक्षर: एन / ए - नमूना प्रक्रिया (केवल सीटी जानवरों) के दौरान प्रवेशनी के नुकसान के कारण संग्रह की अनुपस्थिति; सीटी - कैनुलेटेड, टेदर; पीटी - पंचर, टेदर; PTe - पंचर टेलीमेट्री इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: प्लाज्मा नमूनों में हेमोलिसिस का मूल्यांकन। रक्त के नमूने के तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके 5 समय-बिंदुओं पर हेमोलिसिस माप के परिणाम: दिन 52 - वैक्यूम तकनीक; दिन 55 - पूंछ दुहना; दिन 58-64 ड्रॉप तकनीक। अवशोषण के मान >0.3 नमूनों के गुलाबी रंग के साथ सहसंबद्ध हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान कार्य चूहों में सीएसएफ और रक्त संग्रह की एक आसान-से-मास्टर तकनीक दिखाता है, जो न केवल मिर्गी के मॉडल में अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है, बल्कि अन्य न्यूरोलॉजिकल स्थितियों या अल्जाइमर, पार्किंसंस या मल्टीपल स्केलेरोसिस जैसी बीमारियों के लिए भी उपयोगी हो सकता है। मिर्गी अनुसंधान में, वीडियो-ईईजी के साथ मिलकर दोनों नमूना प्रक्रियाएं आदर्श होती हैं जब विभिन्न घुलनशील अणुओं और जब्ती गतिविधि के स्तर के बीच एक संबंध का पीछा किया जाता है। इस विशिष्ट कारण के लिए, एक निरंतर वीडियो-ईईजी रिकॉर्डिंग नियोजित की गई थी: i) मिर्गी का सही निदान करने के लिए या ii) रोग की प्रगति के विभिन्न चरणों की निगरानी करने के लिए, और / या iii) सहज दौरे की घटना के साथ नमूने को सहसंबंधित करने के लिए। इस तरह के नमूने तकनीक संवेदनाहारी चूहों में किया जा सकता है, इस प्रकार कम से कम तनाव के कारण.

महत्वपूर्ण कदम, समस्या निवारण, विधि सीमाएँ
प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण तकनीकी कदम हैं। सबसे पहले, पहले प्रयास में सीएसएफ संग्रह के लिए सही जगह ढूंढना मुश्किल हो सकता है। यदि ऑपरेटर पहले प्रयास में सिस्टर्न मैग्ना को याद करता है, तो बाद का कोई भी परीक्षण रक्त दूषित होगा, क्योंकि जानवर सुई के घाव से खून बहेगा। इस दृष्टिकोण से, संग्रह में सफलता ऑपरेटर के कौशल पर बहुत अधिक निर्भर है। दूसरे, रक्त वापसी के कुछ चरणों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, हेमोलिसिस का एक उच्च जोखिम होता है यदि ऑपरेटर इथेनॉल के साथ पूंछ को बहुत सख्ती से रगड़ता है, अगर पूंछ शिरा वासोडिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी का तापमान 42 डिग्री सेल्सियस से अधिक है, या यदि संग्रह ट्यूब में रक्त थक्कारोधी के साथ मिश्रित होता है बहुत ऊर्जावान रूप से। पुरानी मिर्गी के जानवरों में रक्त संग्रह की एक और ख़ासियत उनके ब्रैडीकार्डिया का प्रभाव उस दर पर है जिस पर रक्त पूंछ की नस33 से बाहर निकलता है। यदि यह बहुत धीमा है, तो रक्त संग्रह ट्यूब की दीवारों पर जमा हो सकता है। इस समस्या से बचने के लिए, एक विकल्प नमूना को दो संग्रह ट्यूबों में विभाजित करना है, जिससे रक्त/ट्यूब की मात्रा कम हो जाती है। अंत में, एक नुकसान है जो मिर्गी के अध्ययन के लिए आंतरिक है। नमूना लेने से पहले पशु हेरफेर द्वारा उकसाया तनाव बरामदगी, जो बारी में जांच34 के तहत अणुओं के स्तर के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं प्रेरित कर सकते हैं. जब भी यह संभव है, घर पिंजरे में संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष जगह है और जानवर अनायास यह दर्ज करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रस्तावित प्रोटोकॉल के संशोधन के रूप में, एक निरोधक isoflurane संज्ञाहरण के बिना रक्त वापसी प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह टेलीमेट्री में किया जा सकता है, लेकिन टेथर्ड जानवरों में नहीं, क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान टेथर्ड चूहे अपने सिर के प्रत्यारोपण खो सकते हैं।

एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित ऑपरेटर होने और तनाव से बचने के लिए अधिकतम प्रयास प्रस्तुत करना, वर्तमान प्रोटोकॉल की एकमात्र सीमा अधिकतम मात्रा है जिसे पशु के स्वास्थ्य से समझौता किए बिना वापस लिया जा सकता है। वर्तमान मानकों के अनुसार, यह एक ही जानवर32 में 15 दिनों से अधिक 4x के लिए सीएसएफ के अधिकतम 100 माइक्रोन इकट्ठा करने की सिफारिश की है. इसी तरह, यह एक ही नमूने पर कुल रक्त शरीर की मात्रा का 10% से कम और 28 दिनों में कुल रक्त शरीर की मात्रा का 15% से कम30,31 एकत्र करने का सुझाव दिया है।

अन्य तकनीकों के साथ विधि की तुलना
प्रस्तावित समय-हल सीएसएफ और प्लाज्मा नमूनाकरण दृष्टिकोण मौजूदा वैकल्पिक तरीकों के संबंध में कई फायदे हैं। सबसे पहले, मिर्गी के चूहों में सीएसएफ का नमूना लेने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक सिस्टर्न मैग्ना पंचर में एक कैनुलेटेड सिस्टम की तुलना में सिर प्रत्यारोपण हानि का कम जोखिम होता है यदि टीथर्ड ईईजी के साथ युग्मित होता है। पंचर प्रक्रियाओं के विपरीत, दंत सीमेंट (जानवरों के सिर के लिए भारी और भारी) द्वारा इलेक्ट्रोड से जुड़ी प्रवेशनी, जबकि सीएसएफ निकासी के लिए बार-बार संलग्नक / टुकड़ी द्वारा अनुरोध किया जाता है, नमूने के कई दिनों में खो जाने का खतरा अधिक होता है। दरअसल, सफलता दर के परिणाम दिखाते हैं कि कैसे कुछ कैनुलेटेड जानवर (एन/ए) उन्नत नमूना समय बिंदुओं पर नहीं पहुंचते हैं, इस प्रकार उनके संबंधित नमूने खो जाते हैं(तालिका 1)। इसके अतिरिक्त, पंचर विधि बेहतर बाँझपन और सीएसएफ में सेल और एल्ब्यूमिन सामग्री की सीमित वृद्धि के साथ मेनिंगियल प्रतिक्रिया को कम करने के मामले में कैनुलेटेड दृष्टिकोण से बेहतर प्रतीत होती है, जैसा कि पहले अन्य 22,35,36 द्वारा प्रलेखित किया गया है। सीएसएफ ल्यूकोसाइट्स और एल्ब्यूमिन संदूषण की डिग्री मिर्गी बायोमार्कर परिमाणीकरण35 के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की वैधता के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. दूसरा, बार-बार उपायों के लिए उपयोग किए जाने वाले रक्त प्लाज्मा नमूनाकरण की मुक्त गिरावट छोड़ने की विधि किसी भी अन्य निकासी विधि से बेहतर है क्योंकि यह टर्मिनल (गैर-वसूली) नहीं है, डिकैपिटेशन, कार्डियक पंचर, पेट / वक्ष रक्त वाहिका या रेट्रो-ऑर्बिटल निकासी के विपरीत और कई रक्त नमूने की अनुमति देता है। यह कई पूंछ नस रक्त वैक्यूम वापसी तकनीक की तुलना में सरल है, क्योंकि इसे28,37 टयूबिंग की आवश्यकता नहीं होती है और मिर्गी38 के ख्यात बायोमार्कर की पहचान करने पर केंद्रित आगे के sncRNA विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता के हेमोलिसिस मुक्त प्लाज्मा नमूने पैदा करता है। नमूनों में मुक्त हीमोग्लोबिन की अनुपस्थिति, जब ड्रॉप नमूना तकनीक को नियोजित या पूंछ दूध देने से परहेज, sncRNA प्लाज्मा सामग्री39,40 के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं के साथ लाइन में प्लाज्मा नमूने (तालिका 2) के कम अवशोषण परिणामों द्वारा पुष्टि की गई थी.

आवेदन और भविष्य की दिशाएं
न्यूरोलॉजिकल रोगों के किसी भी मॉडल में रुचि के घुलनशील अणुओं को मापने के लिए ऊपर वर्णित तरीकों को लागू किया जा सकता है। एक विशिष्ट उदाहरण संभावित/ख्यात मिर्गी बायोमार्कर की पहचान के लिए जैविक तरल पदार्थों का नमूना है। मिर्गी वाले लोगों के लिए इन बायोमार्कर की खोज करने के लिए एक तत्काल चिकित्सा आवश्यकता है, विशेष रूप से रोगनिरोधी और संवेदनशीलता / जोखिम बायोमार्कर, क्योंकि वे अभी तक मौजूद नहीं हैं।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में संभव है, मिर्गी चूहों सहित, और प्रशिक्षित व्यक्तियों के लिए सक्रिय करने के लिए आसान है. इसके अलावा, यह 3 आर (यानी, प्रतिस्थापन, कमी, और शोधन)41के सिद्धांत के अनुपालन में अनुदैर्ध्य अध्ययन में कई उच्च गुणवत्ता वाले नमूने की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को अनुदान समझौते 964712 (PRIME; M. Simonato) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 कार्य कार्यक्रम (H2020-FETOPEN-2018-2020 पर कॉल करें) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

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