Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

EEG Kayıtları Sırasında Sıçanlarda Lateral Kuyruk Veninden Beyin Omurilik Sıvısı ve Kan Örneği Alınması

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

Protokol, sürekli video-elektroensefalogram (EEG) monitörizasyonuna paralel olarak gerçekleştirilen epileptik sıçanlardan tekrarlanan beyin omurilik sıvısı ve kan alımlarını gösterir. Bunlar, çeşitli vücut sıvısı moleküllerindeki değişiklikler ile nöbet aktivitesi arasındaki olası bağlantıları araştırmak için etkilidir.

Abstract

Vücut sıvılarının bileşimi birçok fizyolojik ve patolojik dinamiği yansıttığından, hormonlar, büyüme faktörleri, proteinler veya küçük kodlamayan RNA'lar gibi ilgilenilen molekülleri ölçmek için birçok deneysel bağlamda biyolojik sıvı örnekleri yaygın olarak elde edilir. Spesifik bir örnek, epilepsi için biyobelirteçlerin araştırılmasında biyolojik sıvıların örneklenmesidir. Bu çalışmalarda, beyin omurilik sıvısındaki (BOS) ve plazmadaki molekül düzeylerinin, BOS ve plazmayı paralel olarak geri çekerek ve örneklemenin nöbetlerden ve nöbetlere olan zaman mesafesini göz önünde bulundurarak karşılaştırılması arzu edilir. Epileptik hayvanlarda video-EEG monitörizasyonu ile birlikte kombine BOS ve plazma örneklemesi, varsayılan tanısal ve prognostik biyobelirteçlerin doğrulanması için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, sürekli video-EEG izlenen epileptik sıçanlarda cisterna magna'dan kombine BOS çekilmesi ve lateral kuyruk veninden kan örneklemesi prosedürü anlatılmaktadır. Bu prosedür, yaygın olarak kullanılan diğer tekniklere göre önemli avantajlar sunar. Minimum ağrı veya invazivlik ve daha kısa anestezi süresi ile hızlı örneklemeye izin verir. Ek olarak, hem bağlı hem de telemetri EEG kayıtlı sıçanlarda BOS ve plazma örnekleri elde etmek için kullanılabilir ve birkaç günlük deney boyunca tekrar tekrar kullanılabilir. İzofluran anestezisini kısaltarak örneklemeden kaynaklanan stresi en aza indirerek, önlemlerin biyosıvılarda araştırılan moleküllerin gerçek seviyelerini daha doğru bir şekilde yansıtması beklenir. Uygun bir analitik testin mevcudiyetine bağlı olarak, bu teknik, aynı anda EEG kaydı yaparken birden fazla, farklı molekülün seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Introduction

Beyin omurilik sıvısı (BOS) ve kan örneklemesi, hem klinik öncesi hem de klinik araştırmalarda epilepsinin biyobelirteçlerini tanımlamak ve doğrulamak için önemlidir 1,2. Günümüzde epilepsi tanısı ve epilepsi biyobelirteçleri ile ilgili araştırmaların çoğu EEG ve nörogörüntüleme üzerine odaklanmaktadır 3,4,5. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar çeşitli sınırlamalar sunar. Rutin kafa derisi ölçümlerinin yanı sıra, çoğu durumda EEG, derinlik elektrotları gibi invaziv teknikler gerektirir6. Beyin görüntüleme yöntemleri zayıf zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahiptir ve nispeten pahalı ve zaman alıcıdır 7,8. Bu nedenle, non-invaziv, düşük maliyetli ve biyoakışkan bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması çok çekici bir alternatif sağlayacaktır. Ek olarak, bu biyoakışkan biyobelirteçleri, öngörücülüklerini keskinleştirmek için mevcut tanısal yaklaşımlarla birleştirilebilir.

Epilepsi teşhisi konan hastalar rutin olarak EEG 9,10 ve kan örneklemesi 11,12,13,14'e ve birçoğu da hayatı tehdit eden nedenleri (yani akut enfeksiyonlar, otoimmün ensefalit) dışlamak için BOS yoksunluğuna gönderilir15. Bu kan ve BOS örnekleri, epilepsi için biyobelirteçleri tanımlamayı amaçlayan klinik araştırmalarda kullanılabilir. Örneğin, Hogg ve çalışma arkadaşları, insan epilepsisinde nöbet oluşumundan önce üç plazma tRNA fragmanındaki bir artışın olduğunu bulmuşlardır14. Benzer şekilde, insan BOS ve serumundaki interlökin-1beta (IL-1β) seviyeleri, BOS'taki IL-1β seviyelerinin seruma oranı olarak ifade edilir, travmatik beyin hasarı sonrası travma sonrası epilepsi gelişimini öngörebilir16. Bu çalışmalar, epilepsi biyobelirteçleri araştırmaları için biyoakışkan örneklemesinin önemini vurgulamaktadır, ancak klinik çalışmalara özgü birçok sınırlama ile karşı karşıyadırlar, örneğin, kandaki anti-epileptik ilaçların (AED'ler) kurucu faktörü, sık etiyoloji bilgisi eksikliği, yetersiz kontroller, mütevazı sayıda hasta ve diğerleri17,18.

Klinik öncesi araştırmalar, epilepsi için potansiyel biyobelirteçler olarak biyosıvılardaki molekülleri araştırmak için başka fırsatlar sunar. Aslında, EEG kayıtları yapılırken hayvanlardan plazma ve/veya BOS çekilmesi mümkündür. Ayrıca, örnekleme, deneyin birkaç günü boyunca tekrar tekrar gerçekleştirilebilir ve çalışmanın sağlamlığını artırmak için bir dizi yaş, cinsiyet ve epileptik hakaret uyumlu kontroller kullanılabilir. Burada, EEG ile izlenen sıçanlarda kuyruk veninden plazmanın paralel olarak çekilmesi ile cisterna magna'dan BOS elde etmek için esnek bir teknik ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sunulan tekniğin alternatif yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. Kelebek iğne yaklaşımı kullanılarak, EEG elektrotlarının veya benzer kafa implantlarının işlevinden ödün vermeden BOS birkaç kez toplamak mümkündür. Bu, nispeten yüksek bir enfeksiyon riski ile ilişkili olan intratekal kateter geri çekme prosedürlerinin iyileştirilmesini temsil eder. Ek olarak, kan alma için kullanılan bildirilen serbest düşüş düşürme yaklaşımı, kanın tüpten geçmemesi ve vakum basıncı uygulanmaması nedeniyle hemoliz riskinin oldukça azalması nedeniyle diğer kuyruk veni kan alma yaklaşımlarından daha üstündür. Sıkı mikropsuz koşullar altında gerçekleştirilirse, hayvanlar için özellikle düşük bir enfeksiyon riski vardır. Ek olarak, hayvanların kuyruklarının en sonunda kan çekilmeleri başlatılarak, örnekleme birkaç kez tekrarlanabilir. Bu tür tekniklerin ustalaşması kolaydır ve merkezi sinir sistemi bozukluklarının birçok klinik öncesi çalışmasında uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler, deneysel ve diğer bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 24 Kasım 1986 tarihli Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'nde (86/609/EEC) belirtilen yönergelere uygun olarak Ferrara Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve İtalya Sağlık Bakanlığı (yetkilendirme: DM 603/2022-PR) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, sıçan BOS'undaki küçük kodlamayan ribonükleik asidin (sncRNA'lar) ve epileptik hayvanlarda EEG kontrolü altında elde edilen plazmanın daha fazla kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizleri için özel olarak ayarlanmıştır. İsteğe bağlı olarak, ameliyatın daha iyi anlaşılması ve iyileştirilmesi için lütfen ilgili JoVE videosuna bakın 19,20,21.

1. Elektrotların veya telemetrelerin cerrahi implantasyonu için hayvanların hazırlanması

NOT: Stereotaksik cerrahi tekniği kullanılan EEG sistemine göre değişmektedir. Aşağıdaki yöntem bölümü, iki tür ameliyat için ortak olan adımların bir açıklamasını sağlar.

  1. Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için yerel yasalara uygun olarak muhafaza edilen Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (erkekler, 7-8 haftalık, 250-290 g ağırlığında) kullanın. Hayvanları, yiyecek ve içme suyuna ücretsiz erişimle standart koşullar altında barındırın.
  2. Ameliyattan ve deneysel protokol prosedürlerinden birkaç gün önce sıçanların işlenmesine devam edin.
  3. Elektrotlar veya telemetre implantasyonu için stereotaksik bir aparat kullanın. Aseptik ameliyatlar için çağdaş standartları takip edin. Steril ve iyi çalışan elektrotlar ve vericiler kullanın.
  4. Hayvanın kafasını elektrikli tıraş bıçağıyla tıraş edin. İntraperitoneal (i.p.) uygulanan ketamin (45 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) karışımı ile hayvanda anesteziyi indükleyin, daha sonra izofluran anestezisini (havada% 1.4; 1.2 mL / dak) ekleyin bir yüz maskesi ile verilir ve hayvanın kafasını stereotaksik aparata sabitleyin.
  5. Her iki hayvanın arka ayaklarında ayak pedi sıkıştıktan sonra pedal çekme refleksini test ederek yeterli anestezi derinliğini sağlayın ve ameliyatın sonuna kadar izofluran anestezisini koruyun. İşlemin tüm süresi boyunca anestezi derinliğini düzenli olarak kontrol edin.
  6. Anestezinin neden olduğu göz kırpma refleksi kaybı nedeniyle kornea hasarını önlemek için her iki hayvanın gözüne yeterli miktarda göz merhemi sürün.
  7. Hayvanın kafa derisini sıvı dezenfektanla iyice temizleyin ve sterilize edilmiş bir neşter kullanarak uzunlamasına 2 cm uzunluğunda bir kesim yapın. Kafa derisini açın ve açık tutmak için cilt fleplerine cerrahi klipsler uygulayın.
  8. Nazikçe, bregmayı ve kayıt elektrodunun yerleştirileceği kafatası alanını ortaya çıkarmak için periosteuumu ayırın.

2. Bağlı elektrotların cerrahi implantasyonu

NOT: Bu protokolün ponksiyon BOS geri çekme prosedürünü oluşturmadan önce (ayrıntılar için 9. adıma bakın), serbestçe hareket eden anestezi uygulanmamış birkaç sıçanda kılavuz kanül yoluyla tekrarlanan BOS çekimleri gerçekleştirildi. Çift başlı implantların uzun süreli EEG kaydı üzerindeki etkisini değerlendirmek için çoklu BOS örneklemesi ile birlikte bağlı elektrotlarla implante edilen kanüllü hayvanlar kullanıldı. Bu spesifik deneylerde, sıçanlara, daha önce yayınlanmış protokollere göre 7 mm stereotaktik olarak yerleştirilen cisterna magna'ya yerleştirilmiş sahte bir kılavuz kanül implante edildi22. Çift implant cerrahisi yaklaşımları, geçmişte bazı çalışanlar tarafından mikrodiyaliz kılavuz kanülleri ve bağlı elektrot implantasyonu için benimsenenlere benzerdi23,24.

  1. Stereotaksik çerçevenin bir kolunu kullanın, elektrot tutucuyu üzerine monte edin ve elektrodu tutucuya dik olarak yerleştirin. Elektrot ucunu tam olarak bregmanın üzerine getirin. Bregmanın ön-arka ve mediolateral koordinatlarını yazın ve bunları istenen koordinatlara çevirin.
  2. Elektrodu, ucu neredeyse kafatasına değene kadar indirin. Delme noktasını işaretleyin ve kafatasını işaretli noktada delin. Beyne ve beyin zarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
  3. Vidaları sabitlemek için dört veya daha fazla delik açın ve bunları kafatasına vidalayın. Ankraj vidaları için delikler açarken elektrotun boyutuna dikkat edin. Elektrot boyutu, konumlandırılmış ankraj vidalarına müdahale etmemelidir.
  4. Elektrodu taşıyan stereotaktik kolu dorsoventral eksen üzerinde yavaşça indirin, beyin dokusuna girin ve istenilen pozisyonda durun. Elektrot topraklama kablosunu kafatasına vidalanmış vidalardan birinin etrafına sabitleyin.
  5. Metakrilik çimentoyu elektrot üzerine yerleştirin ve elektrot kaide yüksekliğinin yaklaşık yarısını kaplayan vidaları yerleştirin. Elektrotun bağlama telinin ucuna uyan üst yarısını çıplak bırakın.
  6. Elektrodu tutucudan serbest bırakın ve stereotaktik kolu kaldırın. Hayvanı stereotaksik aparattan serbest bırakın ve postoperatif bakım verin.
  7. Hayvanı ayrı bir kurtarma kafesine yerleştirin ve uyanık ve ayakta kalana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin. Hayvanı standart barınak kafesine ve anestezi uygulanmamış başka bir hayvan şirketine ancak tamamen iyileştikten sonra iade edin.

3. Telemetrelerin cerrahi implantasyonu

NOT: Yalnızca steril telemetreler kullanın. Telemetreler tekrar kullanılırsa, ameliyattan önce üretici talimatlarına göre temizleyin ve sterilize edin. Bu protokolde, EEG kaydı için bir veri bilimi Uluslararası (DSI) telemetreleri kullanılmıştır.

  1. Bir mıknatıs kullanarak telemetri vericisini açın ve sinyali bir frekanslı radyo ile test edin. Ameliyattan önce güçlü ve net bir sinyal olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, kötü çalışan telemetreleri atın.
  2. Telemetre uçlarını yetişkin sıçanlar için en uygun uzunluklarda kısaltarak hazırlayın. İki (negatif ve pozitif) uç üzerindeki silikon kaplamayı soyun ve yaklaşık 5 mm sarmal çelik ucu açığa çıkarın. Uçların ucunda yaklaşık 2 mm uzunluğunda ve 1 mm genişliğinde ilmekli bir tutamak oluşturun.
  3. Hayvanın böğrünü sol omzun altından ve arkasından tıraş edin. Ameliyat bölgesini stabilize peroksitlere ve kuaterner amonyum aktivitesine dayalı dezenfektanla dezenfekte edin. Dezenfektanın 15 dakika etki etmesine izin verin.
  4. Hayvanın omzunun hemen arkasında yaklaşık 2 cm'lik yanal kesi yapın ve vericinin yerleştirilmesi için yaklaşık 5cm3'lük bir deri altı cebi yapın. Vericiyi, uçları rostral yöne yönlendirilecek şekilde gövdenin uzun eksenine paralel olarak yerleştirin.
  5. Vericiyi 3-0 pamuklu bir sütür ile deri altı cebin iç duvarına sabitleyin. Künt uçlu makas kullanarak, hayvanın böğrü ve boynu boyunca deri altı tüneli (kabaca 2,5 cm uzunluğunda) oluşturun, böylece verici cebini adım 1.6'da hayvanın kafa derisinde yapılan orta hat kesisi ile bağlayın.
  6. Her iki telemetre ucunu da forseps ile alın ve tünelden yukarı çekin, böylece kafa derisi kesi çıkışından çıkıntı yaparlar. Yara klipsleri ile derivasyondaki kesiden uçları uzak tutun.
  7. Pozitif (kırmızı) kurşun için istenen koordinatları bireyselleştirmek için stereotaksik çerçeveyi kullanın ve pozitif kurşun ucu için kafatasına delik açın (adım 2.1'e benzer). Vidayı kürsüye yukarı doğru sabitlemek için bir delik daha açın ve kafatasına vidalayın.
  8. Pozitif kurşunun ucunu takke ve duranın altına sokun ve beyin yüzeyine koyun. Negatif (beyaz) ucun ilmekli ucunu vidaya bağlayın. Kafatası üzerinde hareketsiz hale getirmek için pozitif kurşun çıkışının ve negatif ucun etrafına az miktarda metakrilik çimento koyun.
  9. Uçları kafatası derisinin iç duvarına 3-0 pamuklu bir sütür ile sabitleyin. Sabit uçların ve sabitleme sütürünün BOS çekilme bölgesine müdahale etmeyeceğinden emin olun (yani, oksipital çıkıntı ile atlasın omurgası arasında eşkenar dörtgen görünümünde bastırılabilir bir yüzey).
  10. Kafa derisi kesisini ve yan kesiyi 3-0 pamuklu bir dikiş kullanarak kapatın. Yaralara dezenfektan uygulayın. Ancak bunlar kuruduktan sonra, dikişli yaraların üzerine antibiyotikli bir krem sürün.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Ameliyattan sonra hayvanları yaklaşık 1 saat boyunca dik durana ve kafesin etrafında hareket edene kadar izleyin. Hipotermiyi önlemek için onları bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Enfeksiyonu önlemek için hayvanlara sistemik bir antibiyotik ve 2-3 gün boyunca ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için sistemik bir analjezik uygulayın.
  2. Sıçanların cerrahi işlemlerden sonra en az 7 gün iyileşmesine izin verin. Hayvanları 3 gün boyunca günde en az bir kez ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin.

5. Sıçanlarda status epileptikus indüksiyonu

NOT: Sıçanlarda mezial temporal lob epilepsisini (mTLE) çoğaltmak için gereken ayrıntılı bir status epileptikus (SE) indüksiyonu protokolü için Guarino ve ark.25'e bakın.

  1. Ameliyat sonrası bir haftalık iyileşmeden sonra, hayvanları rastgele gruplara ayırın: (i) araç alan kontrol hayvanları ve (ii) pilokarpin alacak epileptik hayvanlar. Epileptik grup için orantılı olarak daha fazla sayıda hayvan kullanın, çünkü pilokarpin uygulanan tüm sıçanlar hayatta kalamaz veya SE geliştiremez.
  2. SE indüksiyonundan bir gün önce, hayvanlara gastrik gavaj ile 1 mL / kg'lık bir hacim olarak% 0.9 salin (3M) içinde çözülmüş tek bir doz 127 mg / kg lityum klorür verin. SE başlangıcına kadar geçen süredeki değişkenliği azaltmak için SE indüksiyonundan yaklaşık 14 saat önce pilokarpin etkinliğini26 artıran hayvanın lityumunu uygulayın.
  3. Lityum uygulamasından yaklaşık 14 saat sonra, sıçanlara tek bir metil skopolamin enjeksiyonu (deri altından 1 mg / kg) verin.
  4. Metil skopolamin uygulamasından tam olarak 30 dakika sonra, SE'yi indüklemek için sıçanlara tek bir pilokarpin enjeksiyonu (50 mg / kg, i.p.) verin.
    1. Pilokarpin enjeksiyonu hayvanlarda tipik davranışa neden olur: 25-30 dakika içinde tekrarlayan jeneralize konvülsiyonlara (SE) dönüşen erken kısmi nöbetler (pilokarpin uygulamasından sonra 5 dakika içinde vibrissae hareketleri ve baş sallamaları). 30 dakika içinde SE gelişmeyen sıçanlar için, ek bir pilokarpin dozu (25 mg / kg, i.p.) uygulayın ve hala SE geliştirmezlerse, onları çalışmadan hariç tutun (SE yanıt vermeyenler).
  5. Pilokarpin enjeksiyonundan hemen sonra başlayarak her 5 dakikada bir sıçanlarda nöbet davranışını gözlemleyin ve puanlayın. 27 puanlama için Racine ölçeğini kullanın.
  6. Bir ilaç kokteylinin i.p. uygulanmasından 2 saat sonra SE'yi kesin: diazepam (10 mg / kg), fenobarbital (25 mg / kg) ve skopolamin (1 mg / kg).
  7. Farelere bu kokteyli 4 saat sonra tekrar verin. Son olarak, 4 saat sonra, nöbet aktivitesini tamamen durdurmak için sıçanlara son ilaç karışımını (diazepam 10 mg / kg artı skopolamin 1 mg / kg) verin.
  8. Hayvanlara serum fizyolojik (1 mL %0.9 NaCl çözeltisi, pH 7.0'a ayarlanmış) enjekte edin ve SE'yi takip eden vücut ağırlığı kaybından kurtulmayı desteklemek için SE'den sonra 2-3 gün boyunca %10 sükroz solüsyonu ile besleyin.
  9. SE sonrası hayatta kalan hayvanları, spesifik deney protokolünün gereksinimlerine göre rastgele farklı deney gruplarına atayın. Epileptik sıçanlarda daha ileri deneyler için aşağıdaki dahil etme / dışlama kriterlerini kullanın: pilokarpin uygulamasından sonraki 1 saat içinde konvülsif SE gelişimi, SE'den sonraki ilk hafta kilo alımı ve EEG kayıtları için elektrotun ilgilenilen beyin bölgesinde doğru konumlandırılması25.

6. Epileptik sıçanlarda bağlı video-EEG ve nöbet aktivitesi analizleri

NOT: Bu bölüm, standart koşullar altında tek evli, serbestçe hareket eden sıçanlarda EEG sinyallerini kaydetmek için deneysel prosedürü açıklar. Kafes, hayvanın veya kayıt kablosunun sıkışabileceği nesneler içermemelidir. Ele alınacak bilimsel soruya bağlı olarak, çeşitli parametreler analiz edilebilir. Epilepsi araştırmalarında, EEG izleri elektrik ve motor nöbetleri tanımak için taranır. Bir nöbeti tanımlamak için kullanılan en yaygın parametreler, paroksismal elektriksel aktivitenin genliği, sıklığı ve süresidir.

  1. Alışmaya izin vermek ve yeni ortamın neden olduğu stresi azaltmak için hayvanı kayıt odasında temiz bir kafese yerleştirin. EGG sinyalinin çevresel elektromanyetik alanla kirlenmesini önlemek için hayvanın kafesini bir Faraday kafesine yerleştirin.
  2. Kayıt kablosunun bir ucunu kayıt cihazına bağlayın. Elektrik potansiyelini ölçmek ve toprak ile referans elektrotları arasında ayrım yapmak için bir voltmetre kullanın.
  3. Kayıt kablosunun diğer ucunu farenin kafasına sabitlenmiş elektroda bağlayın. Bu amaçla, kablo fişini elektrot konektörüne takarken çimento kapağını hayvanın kafasında tutun ve farenin kafasına herhangi bir baskı uygulamaktan kaçının.
  4. Kablonun bükülme riskini önlerken hayvanın serbest hareketine izin vermek için kayıt kablosunun ağırlığını dengeleyin. Bunu yapmak için, bir dengeleme kolu veya komütatörler kullanın. Kayıt kablosu dengelenmiş olsa bile, mayı, hayvanların yiyeceğe ulaşmak için yükselmesi gereken bir besleme tutucusu yerine kafesin içine koyun.
  5. Kayda başlamadan önce, EEG'den veri almak ve işlemek için kullanılan tüm ayarları kontrol edin.
    NOT: Bu protokol, EEG kaydını gerçekleştirmek için gerekli aparata bir giriş sağlamaz, ancak EEG sinyallerinde artefaktları ve gürültüyü önlemek için yeterli filtreleme ve örnekleme oranları uygulanmalıdır.
    1. Rutin bir deney için örnekleme hızını 500 Hz'e ve amplifikasyon kazancını 5000x'e ayarlayın. 0.005 Hz bandında (Avrupa ülkelerine özel) çevredeki elektriksel aktiviteyi atmak için bir çentik filtresine ek olarak bir çentik filtresi kullanarak sinyali filtreleyin.
  6. Hem video hem de EEG kayıtlarını başlatın ve zaman boyunca belirli frekans bantlarındaki gücü kontrol ederek izlerin beklenen bir EEG sinyaliyle eşleştiğinden emin olun. Hayvanlarda müdahalelere başlamadan önce bir başlangıç dönemi kaydedin.
  7. Hayvanları ve EEG izlerini periyodik olarak kontrol edin. Bir kayıt kablosunun sıçan kafasındaki elektrot konektöründen ayrılması nadir değildir. Böyle bir durumda, sıçan kafasındaki elektrodu tekrar bir kayıt kablosuna bağlayın ve net bir EEG sinyali olup olmadığını kontrol edin.
  8. Piyasada bulunan yazılımı kullanarak EEG sinyalini manuel veya otomatik olarak analiz edin. Manuel olarak analiz ediyorsanız, nöbet benzeri aktiviteleri belirlemek için EEG kaydı ile tarayın. Yazılım kullanılacaksa, bir nöbet olayının genlik, frekans ve elektriksel aktivite süresi gibi temel parametrelerini yapılandırın.
    NOT: Tek nöbet, taban çizgisinden 3 kat daha yüksek genliğe, 5 Hz'e eşit veya daha yüksek frekansa ve en az 5 s22 süreye sahip bir elektriksel aktivite ile karakterize edilebilir.
  9. Kullanılan yöntem ne olursa olsun, EEG ile eş zamanlı olarak toplanan senkronize video kaydını kontrol ederek olası konvülsif nöbetleri doğrulayın.

7. Epileptik sıçanlarda telemetri video-EEG ve nöbet aktivitesinin analizi

NOT: Bu bölüm, standart koşullar altında tek evli, serbestçe hareket eden sıçanlarda radyotelemetri EEG sinyallerini kaydetmek için deneysel prosedürü açıklar. Protokol, ticari olarak temin edilebilen bir telemetri sistemine dayanmaktadır. Bununla birlikte, birkaç telemetri sistemi işlevsel ve teknik özelliklerinde biraz farklılık gösterir. Sistem, laboratuvar gereksinimlerine ve araştırma hedeflerine bağlı olarak seçilmelidir.

  1. Hayvan ev kafesini sinyal alıcısının üzerine yerleştirin. Sinyal alıcısını veri toplama sistemine bağlayın ve bunu toplama yazılımı olan bir bilgisayara bağlayın.
  2. Sıçan kanadına yerleştirilen telemetrenin yakınına bir mıknatıs yerleştirerek radyofrekans telemetri implantını açın. Bir radyo cihazı kullanarak sinyali test edin. Telemetreleri test etmek için evrensel bir radyo cihazı kullanın ve net bir bip sesi duyun, telemetrenin etkinleştirildiğini gösterirken, cızırtılı bir ses devre dışı bırakılmış bir telemetreyi gösterir.
    NOT: Kayıtların süresi tanımlanmadan önce radyo frekansı verici pilinin ömrü dikkate alınmalıdır.
  3. Toplama yazılımını kurun ve EEG ve video verilerini aynı anda almak için telemetri sinyalini ve video sistemini senkronize edin. İmplante edilen her vericiye bir sinyal alıcısı atayın ve vericinin kalibrasyon değerlerini ayarlayın. Örnekleme hızını 1000 Hz'e, gürültü algılamayı -500 mV ile +500 mV arasında ve entegrasyon aralığını 100 ms'ye ayarlayın. Alçak ve yüksek geçiren filtreler kullanmayın.
  4. Telemetri ve video kayıtlarını başlatın. Epileptik benzeri aktiviteyi elde etmeden önce uzun süreli temel kayıt yapın. EEG sinyalini adım 6.8 ve 6.9'da açıklandığı gibi analiz edin.

8. Kuyruk damarından kan alma prosedürü

NOT. Vakumlu kan alma sistemi bir kelebek iğneden (23 G x 3/4 x 12 (0.8 mm x 19 mm x 305 mm) oluşur. Kan alma tekniği tek operatör tarafından kolaylıkla yapılabilir ve işlem yaklaşık 5 dakika sürer.

  1. Kelebek iğnesini ve hortumunu, çekme işleminden kısa bir süre önce damıtılmış suda %1K2EDTA ile kaplayın, yani 1 mL şırınga kullanarakK2EDTA çözeltisini çekin ve sistemden çıkarın. Aspirasyon olmadan damla damla kan toplamak için iğnenin hemen arkasındaki hortumu kesin (Şekil 1A).
  2. Sıçanı bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran ile uyuşturun (havada% 1.4; 1.2 mL / dak). Stereotaksik çerçeveye geçin ve bir yüz maskesi ile anesteziyi koruyun. Isıtma yastığını, kuyruğunun bir kısmını ped ile doğrudan temas halinde tutarak hayvanın altına koyun.
  3. Yanal kuyruk damarı üstte tutulacak şekilde hayvanın sırtını yavaşça yana doğru hareket ettirin.
  4. Yan damarı genişletmek için kuyruğu 2 dakika ılık suya (42 °C) batırın. Damarı daha görünür hale getirmek için kuyruğu %70 etanol ile silin. Normal bir akkor ampul kullanarak kuyruğa ılık ışık koyun.
  5. 21G kelebek iğneyi 5 mm derinlikte ve 20° açıyla yanal kuyruk damarına sokun. Antikoagülan olarak 5 mgK2EDTAiçeren 500 μL'lik bir vakumlu toplama tüpünde kan toplayın (Şekil 1B, C).
  6. İğneyi çıkarın ve delinme bölgesine baskı uygulayarak kan akışını durdurun. Fareyi ev kafesine geri koyun.
  7. Kandaki antikoagülanı karıştırmak için tüpü yavaşça 10x ters çevirin. Toplama tüplerini yerleştirmek için buzun içine yaklaşık 1,5 cm derinliğinde delikler açın. Numuneyi nazikçe ve dikey olarak buzun üzerine koyun.
  8. Plazmayı ayırmak için kan örneğini soğutmalı bir santrifüjde (4 °C) 1300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Bu işlemi en fazla 1 saat içinde gerçekleştirin.
  9. Kırmızı ve beyaz kan hücresi tabakasından kaçınarak yaklaşık 200 μL plazma alın. Çekilen plazmayı 0.2 mL steril mikrotüpe koyun. Gerekirse, santrifüjlemeden sonra 4 °C'de 1 saate kadar saklayın.
  10. Kalite kontrol için 5 μL numuneyi bir kenara koyun. Numuneyi analize kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bazı araştırmacılar28 tarafından önerilse bile vakumu kullanmayın veya daha fazla kan elde etmek için adım 8.5'te açıklanan prosedürler sırasında kuyruğu sağmayın, çünkü sonraki sncRNA kantifikasyon analizleri için numune kalitesini düşürür (ayrıntılar için lütfen Temsili Sonuçlara bakın). Sıçanlarda, bir seferde çekilebilecek maksimum kan miktarının toplam kan hacminin% <10'u (yani, 250-300 g sıçanda yaklaşık 1.6-1.9 mL) ve 1 ayda toplam kan hacminin% <15'i (yaklaşık 2.64 mL)olduğunu unutmayın 29. Bu protokolde, tek bir hayvanda beş defaya kadar tek seferde maksimum 500 μL kan alınması kullanılır30,31.

9. BOS toplama prosedürü

NOT. Tek bir operatör tarafından kolayca uygulanabilen teknik, yaklaşık 2-4 dakika sürer. BOS'un toplanması için kullanılan malzemeler düşük maliyetli, tek kullanımlık vakumlu kelebek iğneler ve ekstraksiyon tüpleridir. Bu protokolde, vakumu oluşturmak için steril bir şırıngaya bağlı kelebek kanatlı bir infüzyon seti kullanılır (Şekil 2A).

  1. 23G kelebek iğneyi, çekme sırasında cisterna magna'ya 7 mm'den daha derine nüfuz etmesini önlemek için çıplak iğnenin ucu 7 mm açıkta kalacak şekilde plastik manşon korumasını keserek hazırlayın (Şekil 2B).
  2. Polimer boru ile donatılmış kelebek iğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
  3. Sıçanı bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran ile uyuşturun (havada% 1.4; 1.2 mL / dak). İzofluran akışını stereotaksik çerçeveye geçirin ve bir yüz maskesi ile verilen anesteziyi koruyun. Sıçanın arka başındaki ve boynundaki kürkü bir usturayla çıkarın.
  4. Sıçanın kafasını kulak çubuklarıyla sabitleyin. Stereotaksik çerçevenin burun çubuğunu aşağı doğru hareket ettirerek hayvanın başını dikey olarak yaklaşık 45° aşağı indirin (Şekil 2C). Hayvanın arka kafasını inceleyin ve oksipital çıkıntı ile atlas omurgası arasında eşkenar dörtgen yönüyle hafif basık bir yüzey bulun.
  5. Daha görünür hale getirmek ve dezenfekte etmek için bu yüzeyi% 70 etanol ile ovalayın.
  6. Kelebek iğneyi, iğnenin plastik manşon korumasını boyutlandırarak kesilerek hareket engellenene kadar BOS toplama için eşkenar dörtgen şeklindeki bastırılmış yüzeyin ortasına dikey olarak cisterna magna'ya sokun (Şekil 2D). BOS'un iğneden yavaşça akmasına izin vermek için 1 mL şırınga pistonunu yavaşça geri çekin.
  7. Yaklaşık 100 μL BOS'u polimer boruya toplayın (Şekil 2D). Kan veya diğer görünür kontaminasyonlardan kaçının. Polimer boruyu kelebek iğneye çok yakın sıkıştırın ve boruyu bu noktada kesin.
  8. Berrak (kirlenmemiş) numuneyi şırıngaya çekin. Toplama borusuna görünür kontaminasyon girerse, kontamine numuneyi atın.
  9. Numuneyi steril 0,2 mL mikrotüpe boşaltın ve 1 saate kadar buz üzerinde saklayın.
  10. Hayvanın kafasındaki BOS çekilme bölgesini dezenfekte edin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kafesine geri koyun.
  11. Kalite kontrol için numunenin 2 μL'sini bir kenara koyun. Daha fazla analiz için numunenin geri kalanını -80 °C'de saklayın.
    NOT: Sıçanlarda, tekrar tekrar birden fazla BOS çekilmesi gerçekleştirilirse, her koleksiyonda çekilmesi önerilen hacim 100 μL'dir32. Bu protokolde, tek bir hayvanda 15 günde 5x maksimum geri çekilme ile tek seferde maksimum 100 μL BOS yapıldı.

10. Numunenin kalitesinin spektrofotometri analizi

NOT: BOS ve plazma numunelerinin uygun şekilde toplanmasından sonra, numuneler spektrofotometre analizleri için hazırdır ve herhangi bir özel işlem gerektirmez. Numunelerde hemoliz riskini değerlendirmek için 414 nm'de UV spektrofotometrisi ile hemoglobin absorbansını ölçün. Sıçan örneklerinde 0.25'lik bir kesme absorbans değeri kullanın. Bu sınırın seçimi, sonraki qPCR analizine ve sncRNA'ların miktar tayini için özel gereksinimlerine bağlı olabilir.

  1. UV spektrofotometresini açın. PLASMA veya CSF için 414 nm'lik tek bir dalga boyunda absorbans ölçümü için yöntemi seçin. Sonrakine tıkla.
  2. 1 mm'lik küveti arıtılmış suyla durulayın. Küvet ölçüm noktasına 5 μL %70 etanol koyun. Bir kağıt havluyla kurulayın ve tüy bırakmayan kağıt mendille ovalayın. Tamamen şeffaf olup olmadığını kontrol edin.
  3. 1 mm'lik küvetin içine 1,5 μL arıtılmış su koyup kapatınız. Küveti spektrofotometrenin ölçüm odasına yerleştirin ve Boş düğmesine tıklayarak boş numune emilimini ölçün. 414 nm'deki absorbans değerinin 0.000 olduğunu kontrol edin.
  4. Küveti bir kağıt havluyla kurulayın ve tüy bırakmayan kağıt mendille temizleyin. Tamamen şeffaf olup olmadığını kontrol edin.
  5. 1.5 μL numuneyi 1 mm'lik küvete koyun ve kapatın. Küveti spektrofotometrenin ölçüm odasına yerleştirin. Numune düğmesine tıklayarak numuneyi ölçün. Numunenin absorbansını 414 nm'de kontrol edin ve açıklama ekleyin.
  6. Mevcut tüm örneklerde hemoglobin emilimini ölçmeye devam edin. Alternatif olarak Boş ve Numune düğmelerine tıklayarak boş numuneyi herhangi bir plazma veya BOS numunesinden önce ölçün.
  7. Numuneleri -80 °C'de A414 nm < 0.25 ile koruyun ve A414 nm 0.25 > ise numuneleri atın.
  8. 1 mm'lik küveti sırayla arıtılmış su ve %70 etanol ile durulayın. Küveti kurutun.
  9. Tozlanmasını önlemek için boş küveti ölçüm odasına kapatın. Spektrofotometreyi kapatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tümü SE'den 1 ay sonra elektrot implante edilen 9 kontrol ve 18 kronik epileptik sıçanda gerçekleştirilen farklı BOS ve kan alma işlemlerinin sonuçları başarı oranı açısından bildirilmiştir. İmplantasyondan sonra, tüm sıçanlar 1 ay boyunca video-EEG izlendi, bu süre zarfında BOS artı kan, deneyin son iki haftasında her 3 günde bir 5 kez çekildi (yani, 52, 55, 58, 61 ve 64. günlerde; dpSE sonrası). Farklı hayvanlarda çoklu geri çekilmeden elde edilen veriler, çift başlı implant donanımlı sıçanlarda (BOS çekilmesi için kanüllü) BOS toplamanın başarı oranını, sadece bağlı veya telemetri elektrotları implante edilmiş hayvanlarda BOS toplamanın başarı oranı (cisterna magna ponksiyonu ile gerçekleştirilir) ile karşılaştırmak için kullanıldı (Tablo 1). Farklı hayvanlarda, vakumlu kan alma veya kuyruk sağımının plazma örneklerinin kalitesi üzerindeki etkisi değerlendirildi (Tablo 2). Bu amaçla, serbest hemoglobin tespiti için 414 nm'de UV spektrofotometri analizi kullanılmıştır. İstatistiksel analizler için ticari yazılımlar kullanıldı ve Kruskal-Wallis veya post-hoc Tukey'in çoklu karşılaştırma testleri ile tek yönlü varyans analizi kullanıldı (p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir.

Kanüllü ve delinmiş sıçanlarda çoklu BOS örneklemesinin başarı oranı
BOS, 3 sıçan grubunda 2 hafta içinde 5 kez örneklenmiştir: (i) kanüllü ve bağlı elektrot implante edilmiş sıçanlar (CT hayvan grubu); bunlarda, BOS çekilmesi, anestezi uygulanmadığında ve video-EEG altında serbestçe hareket ettiğinde kukla kılavuz kanül ve PTFE boru eklemi yoluyla 1 mL şırıngaya gerçekleştirildi; (ii) delinmiş (adım 9) ve gergin elektrot implante edilmiş sıçanlar (PT grubu); (iii) delinmiş ve telemetri elektrotu implante edilmiş sıçanlar (PTe grubu). Grup başına toplam 9 hayvan (6 epileptik ve 3 kontrol sıçanı) kullanıldı. 5 kattan fazla başarılı koleksiyon sayısı değerlendirildi. Başarı oranı delinmiş sıçanlarda benzerdi: bağlı sıçanlarda% 86.7 ± %5.8 ve telemetri elektrot implante edilmiş hayvanlarda% 88.9 ±% 4.8. Bunun yerine, kanüllü sıçanlarda, önemli ölçüde farklı olmasa bile oran azalmıştır (% 71.1 ±% 8.9, Tablo 1). Bu tür sonuçlar, hayvanların kafalarındaki kanülün tekrarlanan BOS örneklemesine müdahale edebileceğini ve uzunlamasına çalışmaları tehlikeye atabileceğini göstermektedir. Delme tekniği, elektrotlarla implante edilmiş hayvanlarda çoklu BOS çekilmesi için daha uygundur.

Vakum ve kuyruk sağımının plazma toplama yöntemi üzerindeki etkisi
SE sonrası 52, 55, 58, 61 ve 64. günlerde 9 sıçandan (6 epileptik ve 3 kontrol sıçan) 5x kan alındı ve plazma kalitesi hemoliz açısından görsel olarak ve 414 nm'de UV spektrofotometrisi ile değerlendirildi. Her sıçanda ilk numuneyi elde etmek için, 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 21G kelebek iğne ile vakumla geri çekme kullanıldı. İkinci numunede, kuyruk aynı anda sağılırken damla çekme ve 21G kelebek iğne sistemi kullanıldı. 3.-5. numuneyi almak için, kuyruğu sağmadan damla çekme prosedürü (9. adımda açıklanmıştır) kullanıldı.

Vakum kullanıldığında, görsel inceleme altında plazma pembe renkteydi ve 9 sıçan örneğinin ortalama absorbans değeri 0.647 ± 0.067 idi (Tablo 2, Şekil 3). İşlem sırasında kuyruk sağımı kullanıldığında da benzer sonuçlar elde edildi: 0.620 ± 0.043 ortalama absorbansa sahip pembe renkli plazma (Tablo 2, Şekil 3). Buna karşılık, yerçekimi özellikli damla çekme ve 21G kelebek iğne sistemi ile ortalama plazma absorbans değerleri önemli ölçüde azalmıştır (58 dpSE'de 0.226 ± 0.017; 61 dpSE'de 0.223 ± -0.09; 64 dpSE'de 0.226 ± 0.018; Tablo 2, Şekil 3) vakum veya kuyruk sağım yöntemi ile ilgili olarak. Ayrıca, damla plazma örnekleri esas olarak şeffaftı. Daha yüksek absorbans değerleri (52 ve 55 dpSE), numunelerin pembe rengiyle ilişkilidir (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuçlar, analizler için çok yüksek kalitede numuneler elde etmek için son yöntemin en iyisi olduğunu gösterebilir.

Figure 1
Şekil 1: Plazma örnekleme iş akışının temel adımları. (A) Stereotaksik çerçevede kan alma ve sıçan için gerekli malzemeler, toplanmaya hazır; (B, C) Yan kuyruk damarına yerleştirilen 21G kelebek iğne ile kuyruğun büyütülmesi ve kan damlasının bir antikoagülan ile toplama tüpünün duvarlarından aşağı düşmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Beyin omurilik sıvısı (BOS) örnekleme iş akışının temel adımları. (A) Toplamadan kısa bir süre önce BOS çekilmesi ve stereotaksik çerçevede sıçan için gerekli malzemeler; (B) Cisterna magna'ya doğru penetrasyonu sağlamak için çıplak iğnenin ucu 7 mm açıkta kalacak şekilde plastik manşon korumasını keserek 23G kelebek iğne hazırlığı; (C) Sıçan kafası çekilme sırasında 45° aşağı doğru eğimlidir. (D) Cisterna magna'ya sokulan bir kelebek iğnesi ile eşkenar dörtgen bölgede büyütme. İşaretleyicinin ucuyla gösterilen, boruda yükselen BOS'a dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Plazma örneklerinin kalite değerlendirmesi. Serbest hemoglobin için 414 nm'de 5 zaman noktasında (52, 55, 58, 61 ve 64 günlük poststatus epileptikus, dpSE) 9 hayvanın plazma örneklerinde UV spektroskopisi ile farklı yöntemler kullanılarak ölçülen hemoliz derecesi: 52. gün - vakum tekniği; 55. gün - kuyruk sağım; 58-64. günlerde düşürme teknikleri kullanıldı. Damla tekniği ile elde edilen plazmada serbest hemoglobinde vakum ve kuyruk sağım yöntemlerine göre azalma anlamlıydı (*p <0.05 tek yönlü varyans analizi ve post-hoc Tukey'in çoklu karşılaştırma testine göre). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: CSF para çekme işlemlerinin başarı oranları. Üç deney hayvan grubunda tekrarlanan BOS yoksunluğunun başarı oranlarının karşılaştırılması, 5 gün boyunca başarılı geri çekilme yüzdesi olarak ifade edilir. 1 değeri, 100 μL'lik > berrak BOS'un başarılı bir şekilde çekilmesine atandı; sıfır değeri, 100 μL< ve/veya belirsiz BOS'un çekilmesine atandı. Kısaltmalar: Yok - örnekleme prosedürü sırasında kanül kaybı nedeniyle toplama olmaması (yalnızca CT hayvanları); CT - kanüllü bağlı; PT - delinmiş, bağlı; PTe - delinmiş telemetri elektrotları implante edildi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Plazma örneklerinde hemolizin değerlendirilmesi. Üç farklı kan örnekleme yöntemi kullanılarak 5 zaman noktasında hemoliz ölçümlerinin sonuçları: 52. gün - vakum tekniği; 55. gün - kuyruk sağım; 58-64. Günler Damla Teknikleri. >0.3 absorbans değerleri, numunelerin pembe rengi ile ilişkilidir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, sadece epilepsi modellerinde değil, aynı zamanda Alzheimer, Parkinson veya multipl skleroz gibi diğer nörolojik durumlar veya hastalıklar için de yararlı olabilecek, sıçanlarda BOS ve kan toplama konusunda ustalaşması kolay bir tekniği göstermektedir. Epilepsi araştırmalarında, video-EEG ile birleştirilmiş her iki örnekleme prosedürü, farklı çözünür moleküllerin seviyeleri ile nöbet aktivitesi arasında bir korelasyon izlendiğinde idealdir. Bu özel nedenden dolayı, i) epilepsiyi doğru bir şekilde teşhis etmek veya ii) hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarını izlemek ve / veya iii) spontan nöbetlerin ortaya çıkmasıyla örneklemeyi ilişkilendirmek için sürekli bir video-EEG kaydı kullanıldı. Bu tür örnekleme teknikleri anestezi uygulanmış sıçanlarda gerçekleştirilebilir, böylece minimum strese neden olur.

Kritik adımlar, sorun giderme, yöntem sınırlamaları
Protokolün bazı kritik teknik adımları vardır. İlk olarak, ilk denemede BOS toplama için doğru yeri bulmak zor olabilir. Operatör ilk denemede cisterna magna'yı kaçırırsa, hayvan iğne yarasından kanayacağından sonraki herhangi bir deneme kanla kirlenir. Bu açıdan bakıldığında, koleksiyondaki başarı büyük ölçüde operatörün becerisine bağlıdır. İkincisi, kan alımının bazı adımlarına özel dikkat gösterilmesi gerekir. Özellikle, operatör kuyruğu etanol ile çok kuvvetli bir şekilde ovalarsa, kuyruk damarı vazodilatasyonu için kullanılan suyun sıcaklığı 42 °C'den yüksekse veya toplama tüpündeki kan antikoagülan ile çok enerjik bir şekilde karıştırılırsa hemoliz riski yüksektir. Kronik epileptik hayvanlarda kan alımının bir başka özelliği, bradikardilerinin kanın kuyruk damarından düşme hızı üzerindeki etkisidir33. Bu çok yavaşsa, kan toplama tüpünün duvarlarında pıhtılaşabilir. Bu sorunu önlemek için bir seçenek, örneklemeyi iki toplama tüpüne bölmek ve kan/tüp hacmini azaltmaktır. Son olarak, epilepsi çalışmalarına özgü bir tuzak var. Örneklemeden önce hayvan manipülasyonunun neden olduğu stres, nöbetlere neden olabilir ve bu da araştırma altındaki moleküllerin seviyelerine müdahale edebilir34. Mümkün olduğunda, anestezi indüksiyon odasını ev kafesine yerleştirin ve hayvanın kendiliğinden girmesine izin verin. Önerilen protokolün bir modifikasyonu olarak, izofluran anestezisi olmadan kan alımını gerçekleştirmek için bir kısıtlayıcı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu telemetride yapılabilir, ancak bağlı hayvanlarda yapılamaz, çünkü bağlı sıçanlar bu prosedür sırasında kafa implantlarını kaybedebilir.

İyi eğitimli bir operatöre sahip olmak ve stresi önlemek için maksimum çaba sarf etmek, mevcut protokolün tek sınırlaması, hayvanın sağlığından ödün vermeden geri çekilebilecek maksimum hacimdir. Mevcut standartlara göre, tek bir hayvanda 15 gün boyunca 4x için maksimum 100 μL BOS toplanması tavsiye edilir32. Benzer şekilde, tek bir örneklemede toplam kan vücut hacminin %10'undan azının ve 28 günde toplam kan vücut hacminin %15'inden azının toplanması önerilmektedir30,31.

Yöntemin diğer tekniklerle karşılaştırılması
Önerilen zamana bağlı BOS ve plazma örnekleme yaklaşımları, mevcut alternatif yöntemlere göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, epileptik sıçanlarda BOS'u örneklemek için kullanılan bir cisterna magna ponksiyonu, bağlı EEG'ye bağlanırsa kanüllü bir sisteme kıyasla daha düşük bir kafa implantı kaybı riskine sahiptir. Delme prosedürlerinin aksine, elektroda diş çimentosu (hayvanların kafaları için hacimli ve ağır) ile tutturulan kanül, BOS geri çekilmelerine tekrarlanan eklemeler/ayrılmalar tarafından talep edilirken, birkaç günlük numune alma sırasında kaybolmaya çok daha yatkındır. Gerçekten de, başarı oranı sonuçları, bazı kanüllü hayvanların (N/A) gelişmiş örnekleme zaman noktalarına nasıl ulaşmadığını, dolayısıyla ilgili örneklerinin nasıl kaybolduğunu göstermektedir (Tablo 1). Ek olarak, daha önce diğer 22,35,36 tarafından belgelendiği gibi, ponksiyon yöntemi, BOS'ta hücre ve albümin içeriğinin sınırlı artışı ile daha iyi sterilite ve azaltılmış meningeal reaksiyon açısından kanüllü yaklaşımdan daha üstün görünmektedir. BOS lökositlerinin derecesi ve albümin kontaminasyonu, epilepsi biyobelirteçlerinin ölçülmesinde kullanılan yöntemlerin geçerliliği için önemli olabilir35. İkincisi, tekrarlanan ölçümler için kullanılan serbest düşüş damlatma kan plazması örnekleme yöntemi, dekapitasyon, kardiyak ponksiyon, karın/torasik kan damarı veya retro-orbital yoksunluktan farklı olarak terminal (iyileşmesiz) olmadığı için diğer tüm geri çekme yöntemlerinden daha üstündür ve çoklu kan örneklemesine izin verir. Tüp28,37 gerektirmediği ve epileptogenezin varsayılan biyobelirteçlerini belirlemeye odaklanan daha ileri sncRNA analizleri için yüksek kalitede hemolizsiz plazma örnekleri ürettiği için birçok kuyruk damarı kan vakumu çekme tekniğinden daha basittir38. Damla örnekleme tekniği kullanılırken veya kuyruk sağımından kaçınıldığında, örneklerde serbest hemoglobin bulunmadığı, sncRNA plazma içeriğinin değerlendirilmesi için uygun daha önce yayınlanmış prosedürlereuygun olarak plazma örneklerinin düşük absorbans sonuçları (Tablo 2) ile doğrulanmıştır 39,40.

Uygulamalar ve gelecekteki yönler
Yukarıda açıklanan yöntemler, herhangi bir nörolojik hastalık modelinde ilgilenilen çözünür molekülleri ölçmek için uygulanabilir. Spesifik bir örnek, potansiyel/varsayılan epilepsi biyobelirteçlerinin tanımlanması için biyolojik sıvıların örneklenmesidir. Epilepsili kişiler için bu biyobelirteçleri, özellikle prognostik ve duyarlılık/risk biyobelirteçlerini keşfetmek için henüz karşılanmamış acil bir tıbbi ihtiyaç vardır.

Sonuç olarak, mevcut protokol epileptik sıçanlar da dahil olmak üzere sıçanlarda uygulanabilir ve eğitimli bireyler için harekete geçirilmesi kolaydır. Ayrıca, 3R ilkesine (yani değiştirme, azaltma ve iyileştirme) uygun olarak boylamsal çalışmalarda birden fazla yüksek kaliteli örneklemeye izin verir41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Çalışma Programı'ndan (H2020-FETOPEN-2018-2020 çağrısı) 964712 hibe sözleşmesi (PRIME; M. Simonato'ya) hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Beyin Omurilik Sıvısı Kan Örneklemesi Lateral Kuyruk Veni Sıçanlar EEG Kayıtları Biyobelirteçler Epilepsi Araştırmaları BOS Çekilmesi Sarnıç Magna Video-EEG Monitorizasyonu Tanısal Biyobelirteçler Prognostik Biyobelirteçler Ağrısız Örnekleme Minimal İnvazivlik Azaltılmış Anestezi Süresi
EEG Kayıtları Sırasında Sıçanlarda Lateral Kuyruk Veninden Beyin Omurilik Sıvısı ve Kan Örneği Alınması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter