Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bemonstering van hersenvocht en bloed uit laterale staartader bij ratten tijdens EEG-opnames

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

Het protocol toont herhaalde cerebrospinale vocht- en bloedafname van epileptische ratten die parallel worden uitgevoerd met continue video-elektro-encefalogram (EEG)-monitoring. Deze zijn van groot belang voor het onderzoeken van mogelijke verbanden tussen veranderingen in verschillende lichaamsvloeistofmoleculen en epileptische activiteit.

Abstract

Omdat de samenstelling van lichaamsvloeistoffen veel fysiologische en pathologische dynamieken weerspiegelt, worden biologische vloeistofmonsters vaak verkregen in veel experimentele contexten om interessante moleculen te meten, zoals hormonen, groeifactoren, eiwitten of kleine niet-coderende RNA's. Een concreet voorbeeld is de bemonstering van biologische vloeistoffen in het onderzoek naar biomarkers voor epilepsie. In deze studies is het wenselijk om de niveaus van moleculen in cerebrospinale vloeistof (CSF) en in plasma te vergelijken, door CSF en plasma parallel te trekken en rekening te houden met de tijdsafstand van de bemonstering van en tot de aanvallen. De gecombineerde CSF- en plasmabemonstering, gekoppeld aan video-EEG-monitoring bij epileptische dieren, is een veelbelovende benadering voor de validatie van vermeende diagnostische en prognostische biomarkers. Hier wordt een procedure beschreven van gecombineerde CSF-terugtrekking uit cisterna magna en bloedafname uit de laterale staartader bij epileptische ratten die continu video-EEG worden gecontroleerd. Deze procedure biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere veelgebruikte technieken. Het maakt snelle bemonstering mogelijk met minimale pijn of invasiviteit en een kortere anesthesietijd. Bovendien kan het worden gebruikt om CSF- en plasmamonsters te verkrijgen in zowel vastgebonden als telemetrie EEG-geregistreerde ratten, en het kan herhaaldelijk worden gebruikt gedurende meerdere dagen van experiment. Door de stress als gevolg van bemonstering te minimaliseren door isofluraananesthesie te verkorten, wordt verwacht dat metingen de werkelijke niveaus van onderzochte moleculen in biovloeistoffen nauwkeuriger weergeven. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een geschikte analytische test, kan deze techniek worden gebruikt om de niveaus van meerdere, verschillende moleculen te meten terwijl tegelijkertijd EEG-registratie wordt uitgevoerd.

Introduction

Cerebrospinale vloeistof (CSF) en bloedafname zijn belangrijk om biomarkers van epilepsie te identificeren en te valideren, zowel in preklinisch als klinisch onderzoek 1,2. Tegenwoordig richten de diagnose van epilepsie en het meeste onderzoek naar epilepsiebiomarkers zich op EEG en neuroimaging 3,4,5. Deze benaderingen brengen echter een aantal beperkingen met zich mee. Afgezien van routinematige hoofdhuidmetingen, vereist EEG in veel gevallen invasieve technieken zoals diepte-elektroden6. Beeldvormingsmethoden van de hersenen hebben een slechte temporele en ruimtelijke resolutie en zijn relatief duur en tijdrovend 7,8. Om deze reden zou de identificatie van niet-invasieve, goedkope en op biovloeistoffen gebaseerde biomarkers een zeer aantrekkelijk alternatief bieden. Bovendien kunnen deze biofluïde biomarkers worden gecombineerd met beschikbare diagnostische benaderingen om hun voorspellend vermogen aan te scherpen.

Patiënten met de diagnose epilepsie worden routinematig onderworpen aan EEG 9,10 en bloedafname 11,12,13,14, en velen ook aan CSF-ontwenning om levensbedreigende oorzaken (d.w.z. acute infecties, auto-immuunencefalitis) uit te sluiten15. Deze bloed- en CSF-monsters kunnen worden gebruikt in klinisch onderzoek dat gericht is op het identificeren van biomarkers voor epilepsie. Hogg en collega's hebben bijvoorbeeld ontdekt dat een toename van drie plasma-tRNA-fragmenten voorafgaat aan het optreden van aanvallen bij menselijke epilepsie14. Evenzo kunnen interleukine-1bèta (IL-1β)-spiegels in menselijke CSF en serum, uitgedrukt als verhouding van IL-1β-niveaus in CSF ten opzichte van serum, de ontwikkeling van posttraumatische epilepsie na traumatisch hersenletsel voorspellen16. Deze studies benadrukken het belang van het bemonsteren van biovloeistoffen voor onderzoek naar epilepsiebiomarkers, maar ze worden geconfronteerd met meerdere beperkingen die inherent zijn aan klinische onderzoeken, bijvoorbeeld de medestichtende factor van anti-epileptica (AED's) in bloed, het frequente gebrek aan etiologische informatie, ontoereikende controles, bescheiden aantallen patiënten en andere17,18.

Preklinisch onderzoek biedt andere mogelijkheden om moleculen in biovloeistoffen te onderzoeken als potentiële biomarkers voor epilepsie. Het is zelfs mogelijk om plasma en/of CSF van dieren af te nemen tijdens het uitvoeren van EEG-opnames. Bovendien kan de bemonstering herhaaldelijk worden uitgevoerd gedurende meerdere dagen van het experiment, en kunnen een aantal leeftijds-, geslachts- en epileptische beledigingscontroles worden gebruikt om de robuustheid van het onderzoek te verbeteren. Hier wordt een flexibele techniek beschreven om CSF te verkrijgen uit cisterna magna met parallelle terugtrekking van plasma uit de staartader bij EEG-gemonitorde ratten. De gepresenteerde techniek heeft verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. Door gebruik te maken van een vlindernaaldbenadering is het mogelijk om CSF meerdere keren te verzamelen zonder de functie van EEG-elektroden of soortgelijke hoofdimplantaten in gevaar te brengen. Dit betekent een verfijning van de procedures voor het terugtrekken van intrathecale katheters, die gepaard gaan met een relatief hoog risico op infectie. Bovendien is de gerapporteerde vrije val-druppelbenadering die wordt gebruikt voor bloedafname superieur aan andere benaderingen van bloedafname in de staartader vanwege het sterk verminderde risico op hemolyse, vanwege het feit dat bloed niet door slangen gaat en er geen vacuümdruk wordt uitgeoefend. Als het onder strikte kiemvrije omstandigheden wordt uitgevoerd, is er een bijzonder laag risico op infectie voor dieren. Bovendien kan de bemonstering meerdere keren worden herhaald door de bloedafname helemaal aan het einde van de staart van de dieren te starten. Dergelijke technieken zijn gemakkelijk onder de knie te krijgen en kunnen worden toegepast in veel preklinische onderzoeken naar aandoeningen van het centrale zenuwstelsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Ferrara en door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (autorisatie: DM 603/2022-PR) in overeenstemming met de richtlijnen van de Richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 24 november 1986 (86/609/EEG) betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Dit protocol is specifiek aangepast voor verdere kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyses van klein niet-coderend ribonucleïnezuur (sncRNA's) in het liquor van ratten en plasma verkregen onder EEG-controle bij epileptische dieren. Zie naar keuze de gerelateerde JoVE-video voor een beter begrip en verbeteringen van de operatie 19,20,21.

1. Voorbereiding van dieren voor chirurgische implantatie van elektroden of telemeters

OPMERKING: De techniek van stereotaxische chirurgie varieert afhankelijk van het gebruikte EEG-systeem. In het volgende gedeelte over de methode vindt u een beschrijving van de stappen die de twee soorten operaties gemeen hebben.

  1. Gebruik Sprague-Dawley (SD) ratten (mannetjes, 7-8 weken oud, met een gewicht van 250-290 g) onderhouden in overeenstemming met de lokale wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Huisvest de dieren onder standaardomstandigheden met gratis toegang tot voedsel en drinkwater.
  2. Ga een paar dagen verder met het hanteren van de ratten voor de operatie en de procedures van het experimentele protocol.
  3. Gebruik een stereotaxisch apparaat voor het implanteren van elektroden of telemeters. Volg de hedendaagse normen voor aseptische operaties. Gebruik steriele en goed werkende elektroden en zenders.
  4. Scheer de kop van het dier met het elektrische scheerapparaat. Induceer anesthesie bij het dier met het mengsel van ketamine (45 mg/kg) en xylazine (7,5 mg/kg) intraperitoneaal (i.p.), voeg vervolgens de isofluraan-anesthesie (1,4% in lucht; 1,2 ml/min) toegediend via een gezichtsmasker en bevestig de kop van het dier in het stereotaxische apparaat.
  5. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door de terugtrekkingsreflex van het pedaal te testen nadat de voetzolen op de achterpoten van beide dieren zijn geknepen en de isofluraananesthesie tot het einde van de operatie te handhaven. Controleer regelmatig de anesthesiediepte gedurende de gehele duur van de procedure.
  6. Breng een voldoende hoeveelheid oogzalf aan op de ogen van beide dieren om schade aan het hoornvlies als gevolg van verlies van knipperreflex veroorzaakt door anesthesie te voorkomen.
  7. Reinig de hoofdhuid van het dier grondig met vloeibaar ontsmettingsmiddel en maak een longitudinale snede van 2 cm lang met een gesteriliseerde scalpel. Open de hoofdhuid en breng chirurgische clips aan op de huidflappen om deze open te houden.
  8. Maak voorzichtig het periosteum los om het bregma en het gebied van de schedel bloot te leggen waardoor de opname-elektrode zal worden ingebracht.

2. Chirurgische implantatie van vastgebonden elektroden

OPMERKING: Alvorens de punctieprocedure voor het terugtrekken van het CSF van dit protocol vast te stellen (zie stap 9 voor details), werden herhaalde CSF-terugtrekkingen via een geleidecanule uitgevoerd bij enkele vrij bewegende niet-verdoofde ratten. Gecanuleerde dieren geïmplanteerd met vastgebonden elektroden werden gebruikt om de impact van dubbelkopimplantaten op langdurige EEG-registratie in combinatie met meervoudige CSF-bemonstering te evalueren. In deze specifieke experimenten werden ratten geïmplanteerd met een dummy-geleidecanule die in de cisterna magna werd geplaatst, waarvan de punt stereotactisch 7 mm erin werd gestoken, volgens eerder gepubliceerde protocollen22. Benaderingen van dubbele implantaatchirurgie waren vergelijkbaar met die welke in het verleden door sommige werknemers werden toegepast voor microdialysegeleidecanules en implantatie van vastgebonden elektroden23,24.

  1. Gebruik een arm van het stereotaxische frame, monteer de elektrodehouder erop en zet de elektrode rechtop in de houder. Beweeg de elektrodepunt precies boven de bregma. Noteer de anteroposterieure en mediolaterale coördinaten van bregma en vertaal ze naar de gewenste coördinaten.
  2. Laat de elektrode zakken totdat de punt bijna de schedel raakt. Markeer de boorplek en boor de schedel op de gemarkeerde plek. Pas op dat u de hersenen en hersenvliezen niet beschadigt.
  3. Maak vier of meer gaten voor het verankeren van schroeven en schroef ze in de schedel. Let op de grootte van de elektrode bij het maken van de gaten voor het verankeren van schroeven. De elektrodemaat mag de geplaatste verankeringsschroeven niet hinderen.
  4. Laat de stereotactische arm die de elektrode op de dorsoventrale as draagt langzaam zakken, ga het hersenweefsel binnen en stop op de gewenste positie. Bevestig de aardingsdraad van de elektrode rond een van de schroeven die in de schedel zijn geschroefd.
  5. Plaats het methacrylcement op de elektrode en schroeven die ongeveer de helft van de hoogte van het elektrodevoetstuk bedekken. Laat de bovenste helft van de elektrode, die past op het uiteinde van de tetheringdraad, kaal.
  6. Maak de elektrode los van de houder en til de stereotactische arm op. Haal het dier uit het stereotaxische apparaat en geef het postoperatieve zorg.
  7. Plaats het dier in een aparte herstelkooi en observeer het elke 10 minuten totdat het wakker en ambulant is. Breng het dier terug naar zijn standaard huisvestingskooi en pas naar een ander niet-verdoofd dierenbedrijf als het volledig hersteld is.

3. Chirurgische implantatie van de telemeters

NOTITIE: Gebruik alleen steriele telemeters. Als telemeters worden hergebruikt, reinig en steriliseer ze dan vóór de operatie volgens de instructies van de fabrikant. In dit protocol werd gebruik gemaakt van een data science International (DSI) telemeter voor EEG-opname.

  1. Schakel de telemetriezender in met behulp van een magneet en test het signaal met een AM-frequentieradio. Controleer voor de operatie op een sterk en duidelijk signaal. Gooi indien nodig de slecht werkende telemeters weg.
  2. Bereid de telemeterkabels voor door deze in te korten tot optimale lengtes voor volwassen ratten. Trek de siliconencoating op twee (negatieve en positieve) draden los, zodat ongeveer 5 mm van de spiraalvormige stalen draad zichtbaar wordt. Maak een lusvormige handgreep van ongeveer 2 mm lang en 1 mm breed aan het uiteinde van de kabels.
  3. Scheer de flank van het dier onder en achter de linkerschouder. Desinfecteer het operatiegebied met ontsmettingsmiddel op basis van gestabiliseerde peroxiden en quaternaire ammoniumactiviteit. Laat het ontsmettingsmiddel 15 minuten inwerken.
  4. Maak ongeveer 2 cm laterale incisie net achter de schouder van het dier en maak een onderhuidse zak van ongeveer 5 cm3 ruimte voor de plaatsing van de zender. Plaats de zender evenwijdig aan de lange as van het lichaam, met de draden naar de rostrale richting gericht.
  5. Bevestig de zender aan de binnenwand van de onderhuidse zak met een 3-0 wattenstaafje. Maak met een stompe schaar de onderhuidse tunnel (ongeveer 2,5 cm lang) door de flank en nek van het dier, waardoor de zenderzak wordt verbonden met de incisie in de middellijn die bij stap 1.6 op de hoofdhuid van het dier is gemaakt.
  6. Neem beide telemeterkabels met een tang en trek ze omhoog door de tunnel, zodat ze uit de incisie-uitlaat van de hoofdhuid steken. Houd de leads uit de incisie van de hoofdhuid met wondclips.
  7. Gebruik het stereotaxische frame om de gewenste coördinaten voor positief (rood) lood te individualiseren en boor het gat in de schedel voor de positieve loodtip (vergelijkbaar met stap 2.1.). Maak nog een gat om de schroef naar boven aan het rostrum te verankeren en schroef deze in de schedel.
  8. Steek de punt van positief lood onder het glidkruid en de dura en leg het op het hersenoppervlak. Haak de lusvormige punt van het negatieve (witte) lood op de schroef. Breng een kleine hoeveelheid methacrylcement aan rond de positieve looduitlaat en de negatieve lood om ze op de schedel te immobiliseren.
  9. Bevestig de draden aan de binnenwand van de schedelhuid met een 3-0 katoenen hechtdraad. Zorg ervoor dat de vaste draden en de bevestigingshechting de plaats van terugtrekking van het CSF niet hinderen (d.w.z. een drukbaar oppervlak met het uiterlijk van een ruit tussen het occipitale uitsteeksel en de wervelkolom van de atlas).
  10. Sluit de incisie in de hoofdhuid en de incisie in de flank met een 3-0 wattenstaafje. Breng ontsmettingsmiddelen aan op de wonden. Pas nadat deze zijn opgedroogd, brengt u een antibiotische crème aan op de gehechte wonden.

4. Postoperatieve zorg

  1. Houd de dieren ongeveer 1 uur na de operatie in de gaten totdat ze rechtop staan en door de kooi bewegen. Bewaar ze op een warmtekussen om onderkoeling te voorkomen. Dien dieren gedurende 2-3 dagen een systemisch antibioticum toe om infectie te voorkomen en een systemische pijnstiller om postoperatieve pijn te voorkomen.
  2. Laat ratten ten minste 7 dagen na chirurgische ingrepen herstellen. Controleer de dieren gedurende 3 dagen ten minste eenmaal per dag op tekenen van pijn of angst.

5. Status epilepticus inductie bij ratten

OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol van status epilepticus (SE) inductie die nodig is om de mesiale temporale kwab epilepsie (mTLE) bij ratten te reproduceren, zie Guarino et al.25.

  1. Na een week postoperatief herstel worden de dieren willekeurig ingedeeld in groepen: (i) controledieren die vehiculum krijgen en (ii) epileptische dieren die pilocarpine krijgen. Gebruik een verhoudingsgewijs hoger aantal dieren voor de epileptische groep, aangezien niet alle ratten die aan pilocarpine worden toegediend zullen overleven of SE zullen ontwikkelen.
  2. Geef de dieren de dag voor de SE-inductie een enkele dosis van 127 mg/kg lithiumchloride opgelost in 0,9% zoutoplossing (3M) als een volume van 1 ml/kg via maagsonde. Dien het lithium van het dier, dat de werkzaamheid van pilocarpine26 verhoogt, ongeveer 14 uur vóór de inductie van SE toe om de variabiliteit in de tijd tot het begin van SE te verminderen.
  3. Geef de ratten ongeveer 14 uur na toediening van lithium een enkele injectie met methylscopolamine (1 mg/kg, subcutaan).
  4. Geef de ratten precies 30 minuten na toediening van methylscopolamine een enkele injectie pilocarpine (50 mg/kg i.p.) om de SE te induceren. Geef methylscopolamine en vehiculum (0,9% NaCl-oplossing) aan de ratten ter controle.
    1. Pilocarpine-injectie induceert typisch gedrag bij dieren: vroege partiële aanvallen (bewegingen van vibrissae en hoofdknikken binnen 5 minuten na toediening van pilocarpine) die evolueren naar terugkerende gegeneraliseerde convulsies (SE) binnen 25-30 minuten. Voor ratten die SE niet binnen 30 minuten ontwikkelen, dient u een extra dosis pilocarpine (25 mg/kg, i.p.) toe, en als ze nog steeds geen SE ontwikkelen, sluit ze dan uit van het onderzoek (SE non-responders).
  5. Observeer en scoor het aanvalsgedrag bij ratten elke 5 minuten, te beginnen onmiddellijk na de pilocarpine-injectie. Gebruik de Racine-schaal om27 te scoren.
  6. Onderbreek de SE 2 uur na het begin door i.p. toediening van een cocktail van geneesmiddelen: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) en scopolamine (1 mg/kg).
  7. Geef de ratten deze cocktail na 4 uur nog een keer. Geef de ratten ten slotte na nog eens 4 uur i.p. het laatste mengsel van geneesmiddelen (diazepam 10 mg/kg plus scopolamine 1 mg/kg) om de aanvalsactiviteit volledig te stoppen.
  8. Injecteer i.p. de dieren met zoutoplossing (1 ml 0,9% NaCl-oplossing, pH aangepast tot 7,0) en voer ze gedurende 2-3 dagen na SE met een 10% sucrose-oplossing om het herstel van het gewichtsverlies dat volgt op SE te bevorderen.
  9. Wijs post-SE overlevende dieren willekeurig toe aan verschillende experimentele groepen volgens de vereisten van het specifieke experimentele protocol. Gebruik de volgende inclusie-/exclusiecriteria voor verdere experimenten bij epileptische ratten: ontwikkeling van convulsieve SE binnen 1 uur na toediening van pilocarpine, gewichtstoename in de eerste week na SE en de juiste positionering van de elektrode in het hersengebied dat van belang is voor EEG-registraties25.

6. Tethered video-EEG bij epileptische ratten en analyses van aanvalsactiviteit

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de experimentele procedure beschreven om EEG-signalen op te nemen bij vrij bewegende ratten met één huis onder standaardomstandigheden. De kooi mag geen voorwerpen bevatten waar het dier of de opnamekabel vast kan komen te zitten. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag die moet worden beantwoord, kunnen verschillende parameters worden geanalyseerd. In het geval van epilepsieonderzoek worden de EEG-sporen gescreend om elektrische en motorische aanvallen te herkennen. De meest voorkomende parameters die worden gebruikt om een aanval te identificeren, zijn de amplitude, frequentie en duur van paroxismale elektrische activiteit.

  1. Plaats het dier in een schone kooi in de opnameruimte om gewenning mogelijk te maken en de stress veroorzaakt door de nieuwe omgeving te verminderen. Plaats de kooi van het dier in een kooi van Faraday om besmetting van het EGG-signaal met het elektromagnetische veld uit de omgeving te voorkomen.
  2. Sluit het ene uiteinde van de opnamekabel aan op het opnameapparaat. Gebruik een voltmeter om het elektrische potentiaal te meten en onderscheid te maken tussen aardings- en referentie-elektroden.
  3. Sluit het andere uiteinde van de opnamekabel aan op de elektrode die op het hoofd van de rat is bevestigd. Houd hiervoor de cementafdekking op de kop van het dier wanneer u de kabelstekker in de elektrodeconnector steekt en oefen geen druk uit op de kop van de rat.
  4. Tegenwicht bieden aan het gewicht van de opnamekabel om vrije beweging van het dier mogelijk te maken en tegelijkertijd het risico van verdraaiing van de kabel te voorkomen. Gebruik hiervoor een contragewichtarm of commutatoren. Zelfs als de opnamekabel een tegenwicht heeft, plaatst u het voer in de kooi in plaats van in een voerhouder, waarin de dieren moeten opstaan om bij het voer te komen.
  5. Controleer voordat u met de registratie begint alle instellingen die zijn gebruikt om de gegevens van het EEG te verkrijgen en te verwerken.
    OPMERKING: Dit protocol biedt geen inleiding tot de apparatuur die nodig is om de EEG-opname uit te voeren, maar er moeten voldoende filter- en bemonsteringsfrequenties worden toegepast om artefacten en ruis in EEG-signalen te voorkomen.
    1. Stel voor een routine-experiment de samplefrequentie in op 500 Hz en de versterkingsversterking op 5000x. Filter het signaal met een 0.005 Hz-filter en een notch-filter om de omringende elektrische activiteit in de 50 Hz-band (specifiek voor Europese landen) weg te gooien.
  6. Start zowel video- als EEG-opnamen en zorg ervoor dat de sporen overeenkomen met een verwacht EEG-signaal door het vermogen in specifieke frequentiebanden gedurende de tijd te controleren. Noteer een basisperiode voordat u met de interventies bij de dieren begint.
  7. Controleer dieren en EEG-sporen periodiek. Het komt niet zelden voor dat een opnamekabel loskomt van de elektrodeconnector in de rattenkop. Als dit gebeurt, sluit u de elektrode in de rattenkop opnieuw aan op een opnamekabel en controleert u of er een duidelijk EEG-signaal is.
  8. Analyseer het EEG-signaal handmatig of automatisch met behulp van in de handel verkrijgbare software. Als u handmatig analyseert, screent u door EEG-opname om aanvalsachtige activiteiten te identificeren. Als er software wordt gebruikt, configureer dan de belangrijkste parameters van een aanval, zoals amplitude, frequentie en duur van elektrische activiteit.
    OPMERKING: Enkelvoudige aanval kan worden gekenmerkt door een elektrische activiteit met een amplitude die 3x hoger is dan de uitgangswaarde, een frequentie gelijk aan of hoger dan 5 Hz en een duur van ten minste 5 s22.
  9. Ongeacht de gebruikte methode, bevestig de mogelijke convulsieve aanvallen door de gesynchroniseerde video-opname te controleren die gelijktijdig met EEG is verzameld.

7. Telemetrie video-EEG bij epileptische ratten en analyse van aanvalsactiviteit

OPMERKING: In dit gedeelte wordt de experimentele procedure beschreven voor het opnemen van radiotelemetrie-EEG-signalen bij vrij bewegende ratten met één huis onder standaardomstandigheden. Het protocol is gebaseerd op een in de handel verkrijgbaar telemetriesysteem. Verschillende telemetriesystemen verschillen echter enigszins in hun functionele en technische specificaties. Het systeem moet worden gekozen afhankelijk van de laboratoriumvereisten en onderzoeksdoelen.

  1. Plaats de thuiskooi van het dier boven de signaalontvanger. Sluit de signaalontvanger aan op het data-acquisitiesysteem en dit op een computer met de acquisitiesoftware.
  2. Schakel het radiofrequente telemetrie-implantaat in door een magneet in de buurt van de telemeter te plaatsen die in de flank van de rat is ingebracht. Test het signaal met behulp van een radioapparaat. Gebruik een universeel radioapparaat om de telemeters te testen en hoor een duidelijke pieptoon die aangeeft dat de telemeter is geactiveerd, terwijl een sissend geluid een niet-geactiveerde telemeter aangeeft.
    NOTITIE: Er moet rekening worden gehouden met de levensduur van de batterij van de radiofrequentiezender voordat de duur van de opnames wordt bepaald.
  3. Stel de acquisitiesoftware in en synchroniseer het telemetriesignaal en het videosysteem om tegelijkertijd EEG- en videogegevens te verkrijgen. Wijs één signaalontvanger toe aan elke geïmplanteerde zender en stel de kalibratiewaarden van de zender in. Stel de samplefrequentie in op 1000 Hz, ruisdetectie tussen -500 mV en +500 mV en het integratie-interval op 100 ms. Gebruik geen laag- en hoogdoorlaatfilters.
  4. Start de telemetrie en video-opnamen. Voer een basisregistratie op lange termijn uit voordat u de epileptische activiteit verwerft. Analyseer het EEG-signaal zoals beschreven in stap 6.8 en 6.9.

8. Procedure voor bloedafname uit de staartader

NOTITIE. Het vacuümbloedafnamesysteem bestaat uit een vlindernaald (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). De bloedafnametechniek kan gemakkelijk door één operator worden uitgevoerd en de procedure duurt ongeveer 5 minuten.

  1. Smeer de vlindernaald en het slangetje kort voor het opzuigen in met 1% K2EDTA in gedestilleerd water, d.w.z. zuig de K2EDTA-oplossing op en verwijder deze uit het systeem met behulp van de spuit van 1 ml. Knip het slangetje net achter de naald door om druppel voor druppel bloed op te vangen, zonder aspiratie (Figuur 1A).
  2. Plaats de rat in een inductiekamer en verdoven hem met isofluraan (1,4% in lucht; 1,2 ml/min). Schakel over naar het stereotaxische frame en handhaaf de anesthesie door middel van een gezichtsmasker. Plaats het verwarmingskussen onder het dier en houd een deel van zijn staart in direct contact met het kussen.
  3. Beweeg de rug van het dier voorzichtig opzij, zodat de laterale staartader aan de bovenkant wordt gehouden.
  4. Dompel de staart 2 minuten in warm water (42 °C) om de laterale ader te verwijden. Veeg de staart af met 70% ethanol om de ader beter zichtbaar te maken. Zet warm licht op de staart met behulp van een gewone gloeilamp.
  5. Steek de vlindernaald 21G in de laterale staartader met een diepte van 5 mm en een hoek van 20°. Verzamel bloed in een vacuümbuis van 500 μl die 5 mg K2EDTA als antistollingsmiddel bevat (Figuur 1B,C).
  6. Verwijder de naald en stop de bloedstroom door druk uit te oefenen op de prikplaats. Breng de rat terug naar zijn thuiskooi.
  7. Keer de buis voorzichtig 10x om om antistollingsmiddel in het bloed te mengen. Maak gaten van ongeveer 1,5 cm diepte in het ijs om plaats te bieden aan de opvangbuizen. Leg het monster voorzichtig en verticaal op ijs.
  8. Centrifugeer het bloedmonster gedurende 10 minuten in een gekoelde centrifuge (4 °C) bij 1300 x g om het plasma te scheiden. Voer deze procedure binnen maximaal 1 uur uit.
  9. Neem ongeveer 200 μL plasma, vermijd de rode en witte bloedcellaag. Doe het opgezogen plasma in de steriele microbuis van 0,2 ml. Indien nodig bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 uur na het centrifugeren.
  10. Houd 5 μL van het monster opzij voor kwaliteitscontrole. Bewaar het monster bij -80 °C tot de analyse.
    OPMERKING: Gebruik het vacuüm niet, zelfs niet als dit door sommige onderzoekers wordt aanbevolen28, en melk de staart niet tijdens de procedures beschreven in stap 8.5 om meer bloed te verkrijgen, omdat dit de monsterkwaliteit voor de volgende sncRNA-kwantificeringsanalyses vermindert (zie de representatieve resultaten voor details). Houd er rekening mee dat bij ratten de maximale hoeveelheid bloed die in één keer kan worden afgenomen <10% van het totale bloedvolume is (d.w.z. ongeveer 1,6-1,9 ml bij een rat van 250-300 g) en <15% van het totale bloedvolume (ongeveer 2,64 ml) in 1 maand29. In dit protocol wordt een maximale bloedafname van 500 μL bij één gelegenheid tot vijf keer bij één dier gebruikt30,31.

9. Procedure voor het verzamelen van CB's

NOTITIE. De techniek kan gemakkelijk worden uitgevoerd door een enkele operator en de procedure duurt ongeveer 2-4 minuten. De materialen die worden gebruikt voor de inzameling van CSF zijn goedkope, vacuümvlindernaalden voor eenmalig gebruik en extractiebuizen. In dit protocol wordt een vlindervleugelinfusieset gebruikt die is aangesloten op een steriele spuit om het vacuüm te creëren (Figuur 2A).

  1. Bereid de 23G-vlindernaald voor en snijd de plastic hulsbescherming zo af dat het uiteinde van de blote naald 7 mm bloot ligt om te voorkomen dat deze tijdens het opzuigen meer dan 7 mm diep in de cisterna magna doordringt (Figuur 2B).
  2. Sluit de vlindernaald met polymeerslang aan op een spuit van 1 ml.
  3. Plaats de rat in een inductiekamer en verdoven hem met isofluraan (1,4% in de lucht; 1,2 ml/min). Schakel de isofluraanstroom over naar het stereotaxische frame en handhaaf de anesthesie die via een gezichtsmasker wordt toegediend. Verwijder de vacht op het achterhoofd en de nek van de rat met een scheermes.
  4. Bevestig de kop van de rat met oorbalken. Laat de kop van het dier ongeveer 45° verticaal naar beneden zakken en beweeg langs de neusbalk van het stereotaxische frame naar beneden (figuur 2C). Inspecteer de achterkop van het dier en zoek een licht ingedrukt, oppervlak met het aspect van een ruit, tussen het achterhoofdsuitsteeksel en de atlaswervelkolom.
  5. Wrijf dit oppervlak in met 70% ethanol om het beter zichtbaar te maken en desinfecteer het.
  6. Steek de vlindernaald verticaal in het midden van het ruitvormige ingezakte oppervlak in de cisterna magna voor CSF-verzameling totdat de beweging wordt geblokkeerd door de plastic hulsbescherming van de naald op maat te knippen (Figuur 2D). Trek de zuiger van de spuit van 1 ml voorzichtig terug om het CSF langzaam door de naald te laten stromen.
  7. Verzamel ongeveer 100 μL van het CSF in polymeerslangen (Figuur 2D). Vermijd het binnendringen van bloed of andere zichtbare besmettingen. Knijp de polymeerslang heel dicht bij de vlindernaald en knip de slang op dit punt door.
  8. Zuig het heldere (onbesmette) monster in de spuit. Gooi het besmette monster weg als er zichtbare verontreiniging in de opvangslang terechtkomt.
  9. Verdween het monster in de steriele microbuis van 0,2 ml en bewaar het maximaal 1 uur op ijs.
  10. Desinfecteer de plaats van terugtrekking van het liquor op de kop van het dier. Haal de rat uit het stereotaxische frame en zet hem terug in zijn kooi.
  11. Houd 2 μL van het monster opzij voor kwaliteitscontrole. Bewaar de rest van het monster bij -80 °C voor verdere analyse.
    OPMERKING: Bij ratten is het aanbevolen volume dat bij elke afname moet worden afgenomen 100 μL32 als er herhaaldelijk meerdere liquor worden afgenomen. In dit protocol werd een maximum van 100 μL CSF bij één gelegenheid gedaan met 5x maximale onttrekking in 15 dagen bij één dier.

10. Spectrofotometrie-analyse van de kwaliteit van het monster

OPMERKING: Na de juiste verzameling van CSF- en plasmamonsters zijn de monsters klaar voor spectrofotometeranalyses en vereisen ze geen specifieke behandeling. Meet de hemoglobine-absorptie door UV-spectrofotometrie bij 414 nm om het hemolyserisico in monsters te evalueren. Gebruik een afkapextinctie van 0,25 in rattenmonsters. De keuze van deze limiet kan afhangen van de daaropvolgende qPCR-analyse en de specifieke vereisten voor de kwantificering van sncRNA's.

  1. Schakel de UV-spectrofotometer in. Selecteer de methode voor de extinctiemeting bij een enkele golflengte van 414 nm voor PLASMA of CSF. Klik op Volgende.
  2. Spoel de cuvet van 1 mm af met gezuiverd water. Breng 5 μL 70% ethanol aan op de meetplek van de cuvetten. Droog af met keukenpapier en wrijf met pluisvrij vloeipapier. Controleer of het perfect transparant is.
  3. Doe 1,5 μL gezuiverd water in de cuvet van 1 mm en sluit deze. Plaats de cuvet in de meetkamer van de spectrofotometer en meet de absorptie van het blanco monster door op de knop Blanco te klikken. Controleer of de extinctiewaarde bij 414 nm 0,000 is.
  4. Droog de cuvet af met keukenpapier en maak hem schoon met pluisvrij vloeipapier. Controleer of het perfect transparant is.
  5. Doe 1,5 μl van het monster in de cuvet van 1 mm en sluit deze. Plaats de cuvet in de meetkamer van de spectrofotometer. Meet het monster en klik op de knop Monster . Controleer de absorptie van het monster bij 414 nm en annoteer het.
  6. Ga verder met het kwantificeren van de hemoglobine-absorptie in alle beschikbare monsters. Meet het blanco monster vóór een plasma- of CSF-monster, door afwisselend op de knoppen Blanco en Monster te klikken.
  7. Bewaar de monsters met A414 nm < 0,25 bij -80 °C en gooi de monsters weg als A414 nm > 0,25.
  8. Spoel de cuvet van 1 mm achtereenvolgens met gezuiverd water en 70% ethanol. Droog de cuvette.
  9. Sluit de lege cuvet in de meetkamer om stofvorming te voorkomen. Schakel de spectrofotometer uit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het resultaat van verschillende CSF- en bloedafnameprocedures uitgevoerd bij 9 controle- en 18 chronische epileptische ratten, allemaal geïmplanteerd met elektroden 1 maand na SE, wordt gerapporteerd in termen van slagingspercentage. Na implantatie werden alle ratten gedurende 1 maand video-EEG gecontroleerd, waarbij de CSF plus bloed 5x per 3 dagen werd afgenomen tijdens de laatste twee weken van het experiment (d.w.z. op dag 52, 55, 58, 61 en 64 na SE; dpSE). Gegevens van meervoudige terugtrekkingen bij verschillende dieren werden gebruikt om het slagingspercentage van CSF-afname bij de tweekoppige implantaat-begiftigde ratten (gecanuleerd voor CSF-terugtrekking) te vergelijken met het slagingspercentage van CSF-afname (uitgevoerd door cisterna magna-punctie) bij dieren die alleen met vastgebonden of telemetrie-elektroden waren geïmplanteerd (tabel 1). Bij verschillende dieren werd de impact van vacuümbloedafname of staartmelken op de kwaliteit van plasmamonsters geëvalueerd (tabel 2). Voor dit doel werd UV-spectrofotometrie-analyse bij 414 nm gebruikt voor de detectie van vrij hemoglobine. Voor statistische analyses werd commerciële software gebruikt en werden Kruskal-Wallis of eenrichtings-ANOVA met post-hoc Tukey's meervoudige vergelijkingstests gebruikt (p<0,05 die als statistisch significant werd beschouwd). De gegevens worden uitgedrukt als een gemiddelde ± SEM.

Slagingspercentage van meervoudige CSF-bemonstering bij gecanuleerde en gepuncteerde ratten
CSF is binnen 2 weken 5x bemonsterd bij 3 groepen ratten: (i) gecanuleerde en vastgebonden elektrode-geïmplanteerde ratten (CT-groep van dieren); hierbij werd de CSF-opname uitgevoerd via een dummy-geleidecanule en PTFE-slangverbinding met een spuit van 1 ml wanneer ze niet verdoofd waren en vrij bewogen onder video-EEG; (ii) doorboorde (stap 9) en vastgebonden elektrode geïmplanteerde ratten (PT-groep); iii) gepuncteerde en met telemetrie-elektroden geïmplanteerde ratten (PTe-groep). In totaal werden 9 dieren per groep (6 epileptische en 3 controleratten) gebruikt. Het aantal succesvolle incasso's over 5 keer werd geëvalueerd. Het slagingspercentage was vergelijkbaar bij doorboorde ratten: 86,7% ± 5,8% bij vastgebonden en 88,9% ± 4,8% bij dieren met telemetrie-elektrode. In plaats daarvan was het percentage bij de gecanuleerde ratten verlaagd, ook al verschilde het niet significant (71,1% ± 8,9%, tabel 1). Dergelijke resultaten duiden erop dat de canule op de kop van dieren de herhaalde bemonstering van het KVP kan verstoren en longitudinaal onderzoek in gevaar kan brengen. De punctietechniek is meer geschikt voor meervoudige CSF-terugtrekkingen bij dieren die met elektroden zijn geïmplanteerd.

Impact van vacuüm- en staartmelken op de plasmaafnamemethode
Bloed werd 5x afgenomen van 9 ratten (6 epileptische en 3 controleratten) op dag 52, 55, 58, 61 en 64 na SE en de plasmakwaliteit werd geëvalueerd voor hemolyse, visueel en door UV-spectrofotometrie bij 414 nm. Om het eerste monster bij elke rat te verkrijgen, werd de vacuümterugtrekking gebruikt via een 21G-vlindernaald die aan een spuit van 1 ml was bevestigd. Bij het tweede monster werden de druppelterugtrekking en het 21G-vlindernaaldsysteem gebruikt bij het gelijktijdig melken van de staart. Om het 3e-5e monster te krijgen, werd de druppelopnameprocedure gebruikt zonder de staart te melken (beschreven in stap 9).

Bij gebruik van een vacuüm was het plasma roze gekleurd onder de visuele inspectie en de gemiddelde absorptiewaarde van de monsters van 9 ratten was 0,647 ± 0,067 (tabel 2, figuur 3). Vergelijkbare resultaten werden verkregen door het gebruik van het staartmelken tijdens de procedure: roze gekleurd plasma met een gemiddelde extinctie van 0,620 ± 0,043 (tabel 2, figuur 3). Daarentegen waren de gemiddelde plasma-absorptiewaarden significant verlaagd (0,226 ± 0,017 bij 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 bij 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 bij 64 dpSE; Tabel 2, figuur 3) met betrekking tot de vacuüm- of staartmelkmethode. Bovendien waren de druppelplasmamonsters voornamelijk transparant. Hogere absorptiewaarden (52 en 55 dpSE) correleerden met de roze kleur van monsters (gegevens niet getoond). Deze resultaten kunnen erop wijzen dat de laatste methode de beste is om monsters van zeer hoge kwaliteit te krijgen voor analyses.

Figure 1
Figuur 1: Belangrijkste stappen van de workflow voor plasmabemonstering. (A) Materialen die nodig zijn voor bloedafname en rat in het stereotaxische frame, klaar voor verzameling; (B, C) Vergrotingen van de staart met 21G vlindernaald ingebracht in de laterale staartader en de bloeddruppel die langs de wanden van de verzamelbuis valt met een antistollingsmiddel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Belangrijkste stappen van de workflow voor het bemonsteren van cerebrospinale vloeistof (CSF). (A) Materialen die nodig zijn voor de terugtrekking van het hersenvocht en de rat in het stereotaxische frame, kort voor de winning; (B) De voorbereiding van de 23G-vlindernaald door de plastic hulsbescherming zo te snijden dat het uiteinde van de blote naald 7 mm zichtbaar is om een correcte penetratie in de cisterna magna te garanderen; (C) De kop van de rat is tijdens het terugtrekken 45° naar beneden gekanteld. (D) Vergroting op de plaats van de ruit met een vlindernaald die in de cisterna magna wordt ingebracht. Let op het CSF dat in de slang omhoog komt, aangegeven door de punt van de markering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Kwaliteitsevaluatie van plasmamonsters. Mate van hemolyse gemeten bij 414 nm voor vrij hemoglobine door middel van UV-spectroscopie in plasmamonsters van 9 dieren op 5 tijdstippen (52, 55, 58, 61 en 64 dagen na status epilepticus, dpSE) met behulp van verschillende methoden: dag 52 - de vacuümtechniek; dag 55 - het staartmelken; Dagen 58-64 werden de drop-technieken toegepast. De afname van vrij hemoglobine in plasma verkregen door druppeltechniek in vergelijking met vacuüm- en staartmelkmethoden was significant (*p <0,05 volgens eenrichtings-ANOVA en post-hoc Tukey's meervoudige vergelijkingstest). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Succespercentages van de uit de markt genomen CB's. Vergelijking van de slagingspercentages van herhaalde stopzetting van het KVP in drie experimentele groepen dieren, uitgedrukt als een percentage van de succesvolle stopzetting gedurende 5 dagen. De waarde 1 werd toegekend aan de succesvolle onttrekking van > 100 μL heldere KVK; de nulwaarde werd toegekend aan onttrekkingen < 100 μl en/of van onduidelijke KVK. Afkortingen: n.v.t. - het ontbreken van inzameling als gevolg van het verlies van de canule tijdens de bemonsteringsprocedure (alleen CT-dieren); CT - gecanuleerd vastgebonden; PT - doorboord vastgebonden; PTe - geperforeerde telemetrie-elektroden geïmplanteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Evaluatie van hemolyse in plasmamonsters. Resultaten van de hemolysemetingen op 5 tijdstippen met behulp van drie verschillende methoden voor bloedafname: dag 52 - de vacuümtechniek; dag 55 - het staartmelken; Dagen 58-64 De Drop Technieken. Waarden >0,3 van absorptie gecorreleerd met roze kleur van monsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige werk illustreert een gemakkelijk te beheersen techniek van CSF en bloedafname bij ratten, die niet alleen nuttig kan zijn voor studies in modellen van epilepsie, maar ook van andere neurologische aandoeningen of ziekten zoals Alzheimer, Parkinson of multiple sclerose. In epilepsieonderzoek zijn beide bemonsteringsprocedures in combinatie met video-EEG ideaal wanneer een correlatie tussen de niveaus van verschillende oplosbare moleculen en aanvalsactiviteit wordt nagestreefd. Om deze specifieke reden werd een continue video-EEG-opname gebruikt: i) om epilepsie correct te diagnosticeren of ii) om de verschillende fasen van de ziekteprogressie te volgen, en/of iii) om bemonstering te correleren met het optreden van spontane aanvallen. Dergelijke bemonsteringstechnieken kunnen worden uitgevoerd bij verdoofde ratten, waardoor minimale stress wordt veroorzaakt.

Kritieke stappen, probleemoplossing, methodebeperkingen
Het protocol heeft een aantal cruciale technische stappen. Ten eerste kan het moeilijk zijn om bij de eerste poging de juiste plaats voor CSF-verzameling te vinden. Als de operator de cisterna magna bij de eerste poging mist, zou elke volgende proef met bloed besmet zijn, omdat het dier uit de naaldwond zal bloeden. Vanuit dit oogpunt is het succes van de inzameling sterk afhankelijk van de vaardigheid van de operator. Ten tweede hebben sommige stappen van bloedafname speciale aandacht nodig. Er is met name een hoog risico op hemolyse als de operator de staart te krachtig met ethanol wrijft, als de temperatuur van het water dat wordt gebruikt voor de vasodilatatie van de staartader hoger is dan 42 °C, of als het bloed in de verzamelbuis te energetisch wordt gemengd met antistollingsmiddel. Een andere eigenaardigheid van bloedafname bij chronische epileptische dieren is de invloed van hun bradycardie op de snelheid waarmee bloed uit de staartader stroomt33. Als dit te langzaam gaat, kan het bloed stollen op de wanden van de verzamelbuis. Om dit probleem te voorkomen, is een optie om de bemonstering te splitsen in twee verzamelbuisjes, waardoor het volume bloed/buis wordt verkleind. Ten slotte is er één valkuil die inherent is aan epilepsiestudies. De stress die wordt veroorzaakt door manipulatie van dieren vóór de bemonstering kan epileptische aanvallen veroorzaken, die op hun beurt de niveaus van de moleculen waarop het onderzoek betrekking heeft, kunnen verstoren34. Plaats waar mogelijk de anesthesie-inductiekamer in de thuiskooi en laat het dier er spontaan in gaan. Als wijziging van het voorgestelde protocol kan een restrainer worden gebruikt om bloedafname uit te voeren zonder isofluraananesthesie. Dit kan echter worden gedaan in telemetrie, maar niet in vastgebonden dieren, omdat vastgebonden ratten tijdens deze procedure hun hoofdimplantaten kunnen verliezen.

Met een goed opgeleide operator en maximale inspanning om stress te voorkomen, is de enige beperking van het huidige protocol het maximale volume dat kan worden onttrokken zonder de gezondheid van het dier in gevaar te brengen. Volgens de huidige normen wordt aanbevolen om gedurende 4x gedurende 15 dagen maximaal 100 μL CSF te verzamelen bij één dier32. Evenzo wordt voorgesteld om minder dan 10% van het totale bloedlichaamsvolume op een enkele bemonstering en minder dan 15% van het totale bloedlichaamvolume in 28 dagen te verzamelen30,31.

Vergelijking van de methode met andere technieken
Voorgestelde benaderingen voor in de tijd opgeloste CSF- en plasmabemonstering hebben verschillende voordelen ten opzichte van bestaande alternatieve methoden. Ten eerste heeft een cisterna magna-punctie die wordt gebruikt om CSF te bemonsteren bij epileptische ratten een lager risico op verlies van hoofdimplantaten in vergelijking met een canulerend systeem indien gekoppeld aan een vastgebonden EEG. In tegenstelling tot punctieprocedures, is de canule die met tandheelkundig cement aan de elektrode is bevestigd (omvangrijk en zwaar voor de koppen van dieren), hoewel gevraagd door herhaalde bevestigingen/loslatingen aan de CSF-opnames, veel vatbaarder voor verlies gedurende meerdere dagen van bemonstering. De resultaten van het succespercentage laten inderdaad zien dat sommige gecanuleerde dieren (n.v.t.) niet aankomen op de geavanceerde bemonsteringstijdstippen, waardoor hun respectieve monsters verloren gaan (tabel 1). Bovendien lijkt de punctiemethode superieur te zijn aan een canulerende benadering in termen van betere steriliteit en verminderde meningeale reactie met een beperkte toename van het cel- en albuminegehalte in CSF, zoals eerder is gedocumenteerd door andere 22,35,36. De mate van CSF-leukocyten- en albuminebesmetting kan belangrijk zijn voor de validiteit van methoden die worden gebruikt voor de kwantificering van epilepsiebiomarkers35. Ten tweede is de vrije val-druppelmethode van bloedplasmabemonstering die wordt gebruikt voor herhaalde metingen superieur aan elke andere onttrekkingsmethode, aangezien deze niet terminaal is (niet-herstel), in tegenstelling tot de onthoofding, hartpunctie, abdominale/thoracale bloedvat of retro-orbitale terugtrekking en meerdere bloedmonsters mogelijk maakt. Het is eenvoudiger dan veel technieken voor het vacuümterugtrekken van het bloed van de staartader, omdat er geen slangen28,37 nodig zijn en hemolysevrije plasmamonsters van hoge kwaliteit worden geproduceerd voor verdere sncRNA-analyses gericht op het identificeren van vermeende biomarkers van epileptogenese38. De afwezigheid van vrij hemoglobine in de monsters, bij toepassing van de druppelbemonsteringstechniek of het vermijden van staartmelken, werd bevestigd door lage absorptieresultaten van de plasmamonsters (tabel 2) in overeenstemming met eerder gepubliceerde procedures die geschikt zijn voor de evaluatie van het sncRNA-plasmagehalte39,40.

Toepassingen en toekomstige richtingen
De hierboven beschreven methoden kunnen worden toegepast om oplosbare moleculen te meten die van belang zijn in elk model van neurologische aandoeningen. Een specifiek voorbeeld is de bemonstering van biologische vloeistoffen voor de identificatie van potentiële/vermeende epilepsiebiomarkers. Er is een dringende onvervulde medische behoefte om deze biomarkers voor mensen met epilepsie te ontdekken, met name prognostische en gevoeligheids-/risicobiomarkers, aangezien deze nog niet bestaan.

Concluderend kan worden gesteld dat het huidige protocol haalbaar is bij ratten, inclusief epileptische ratten, en gemakkelijk te bedienen is voor getrainde personen. Bovendien maakt het meerdere hoogwaardige bemonsteringen mogelijk in longitudinale studies in overeenstemming met het principe van 3V's (d.w.z. vervanging, vermindering en verfijning)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het Horizon 2020-werkprogramma van de Europese Unie (oproep H2020-FETOPEN-2018-2020) in het kader van subsidieovereenkomst 964712 (PRIME; aan M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Cerebrospinale vloeistof bloedafname laterale staartader ratten EEG-opnames biomarkers epilepsieonderzoek liquor terugtrekking cisterna magna video-EEG-monitoring diagnostische biomarkers prognostische biomarkers pijnloze bemonstering minimale invasiviteit verminderde anesthesietijd
Bemonstering van hersenvocht en bloed uit laterale staartader bij ratten tijdens EEG-opnames
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter