Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

El protocolo muestra repetidas recolecciones de líquido cefalorraquídeo y sangre de ratas epilépticas realizadas en paralelo con un monitoreo continuo de video-electroencefalograma (EEG). Estos son fundamentales para explorar posibles vínculos entre los cambios en varias moléculas de fluidos corporales y la actividad convulsiva.

Abstract

Debido a que la composición de los fluidos corporales refleja muchas dinámicas fisiológicas y patológicas, las muestras líquidas biológicas se obtienen comúnmente en muchos contextos experimentales para medir moléculas de interés, como hormonas, factores de crecimiento, proteínas o pequeños ARN no codificantes. Un ejemplo concreto es el muestreo de líquidos biológicos en la investigación de biomarcadores para la epilepsia. En estos estudios, es deseable comparar los niveles de moléculas en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en el plasma, mediante la extracción de LCR y plasma en paralelo y considerando la distancia temporal de la muestra desde y hacia las convulsiones. La combinación de muestras de LCR y plasma, junto con la monitorización por video-EEG en animales epilépticos, es un enfoque prometedor para la validación de biomarcadores diagnósticos y pronósticos putativos. Aquí, se describe un procedimiento combinado de extracción de LCR de la cisterna magna y la toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola en ratas epilépticas que se monitorean continuamente por video-EEG. Este procedimiento ofrece ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas. Permite una toma de muestras rápida con un mínimo de dolor o invasividad, y un tiempo de anestesia reducido. Además, se puede utilizar para obtener muestras de LCR y plasma en ratas ancladas y registradas en EEG por telemetría, y se puede utilizar repetidamente durante varios días de experimento. Al minimizar el estrés debido al muestreo mediante el acortamiento de la anestesia con isoflurano, se espera que las medidas reflejen con mayor precisión los niveles reales de las moléculas investigadas en los biofluidos. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico adecuado, esta técnica se puede utilizar para medir los niveles de múltiples moléculas diferentes mientras se realiza el registro de EEG al mismo tiempo.

Introduction

La toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre son importantes para identificar y validar biomarcadores de epilepsia, tanto en la investigación preclínica como en la clínica 1,2. Hoy en día, el diagnóstico de la epilepsia y la mayor parte de la investigación sobre biomarcadores de epilepsia se centra en el EEG y la neuroimagen 3,4,5. Estos enfoques, sin embargo, presentan varias limitaciones. Además de las mediciones rutinarias del cuero cabelludo, en muchos casos, el EEG requiere técnicas invasivas como electrodos de profundidad6. Los métodos de imagen cerebral tienen poca resolución temporal y espacial y son relativamente caros y requieren mucho tiempo 7,8. Por esta razón, la identificación de biomarcadores no invasivos, de bajo costo y basados en biofluidos proporcionaría una alternativa muy atractiva. Además, estos biomarcadores de biofluidos podrían combinarse con los enfoques diagnósticos disponibles para mejorar su capacidad de predicción.

Los pacientes diagnosticados de epilepsia son sometidos rutinariamente a EEG 9,10 y muestras de sangre 11,12,13,14, y muchos también a la retirada del LCR para excluir causas potencialmente mortales (i.e., infecciones agudas, encefalitis autoinmune)15. Estas muestras de sangre y LCR se pueden utilizar en investigaciones clínicas con el objetivo de identificar biomarcadores de epilepsia. Por ejemplo, Hogg y sus colaboradores han encontrado que un aumento en tres fragmentos plasmáticos de ARNt precede a la aparición de convulsionesen la epilepsia humana. Del mismo modo, los niveles de interleucina-1beta (IL-1β) en el LCR y el suero humanos, expresados como proporción de los niveles de IL-1β en el LCR sobre el suero, pueden predecir el desarrollo de epilepsia postraumática después de una lesión cerebral traumática16. Estos estudios destacan la importancia del muestreo de biofluidos para la investigación de biomarcadores de epilepsia, pero enfrentan múltiples limitaciones intrínsecas a los ensayos clínicos, por ejemplo, el factor cofundador de los fármacos antiepilépticos (FAE) en sangre, la frecuente falta de información etiológica, los controles inadecuados, el número modesto de pacientes y otros17,18.

La investigación preclínica ofrece otras oportunidades para investigar moléculas en biofluidos como posibles biomarcadores de epilepsia. De hecho, es posible extraer plasma y/o LCR de animales mientras se realizan registros de EEG. Además, el muestreo se puede realizar repetidamente a lo largo de varios días del experimento, y se puede utilizar una serie de controles emparejados por edad, sexo y agresiones epilépticas para mejorar la solidez del estudio. Aquí, se describe en detalle una técnica flexible para obtener LCR de cisterna magna con extracción paralela de plasma de la vena de la cola en ratas monitoreadas por EEG. La técnica presentada tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos. Mediante el uso de un enfoque de aguja de mariposa, es posible recolectar LCR varias veces sin comprometer la función de los electrodos de EEG o implantes de cabeza similares. Esto representa un refinamiento de los procedimientos de retirada del catéter intratecal, que se asocian con un riesgo relativamente alto de infección. Además, el enfoque de caída libre utilizado para la extracción de sangre es superior a otros enfoques de extracción de sangre en la vena de cola debido al riesgo altamente reducido de hemólisis, debido al hecho de que la sangre no pasa a través de tubos y no se aplica presión de vacío. Si se realiza en condiciones estrictas libres de gérmenes, existe un riesgo particularmente bajo de infección para los animales. Además, al iniciar las extracciones de sangre al final de la cola de los animales, el muestreo se puede repetir varias veces. Estas técnicas son fáciles de dominar y se pueden aplicar en muchos estudios preclínicos de trastornos del sistema nervioso central.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ferrara y por el Ministerio de Salud italiano (autorización: D.M. 603/2022-PR) de acuerdo con las directrices descritas en la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Este protocolo se ajusta específicamente para análisis adicionales de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de pequeños ácidos ribonucleicos no codificantes (sncRNA) en el LCR de rata y plasma obtenidos bajo control de EEG en animales epilépticos. A su elección, vea el video de JoVE relacionado para una mejor comprensión y mejoras de la cirugía 19,20,21.

1. Preparación de animales para implantación quirúrgica de electrodos o telémetros

NOTA: La técnica de cirugía estereotáxica varía según el sistema de EEG utilizado. La siguiente sección de métodos proporciona una descripción de los pasos que son comunes para los dos tipos de cirugías.

  1. Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) (machos, de 7 a 8 semanas de edad, con un peso de 250 a 290 g) mantenidas de acuerdo con las leyes locales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Alojar a los animales en condiciones estándar con libre acceso a comida y agua potable.
  2. Proceda con el manejo de las ratas durante unos días antes de la cirugía y los procedimientos del protocolo experimental.
  3. Utilizar un aparato estereotáxico para la implantación de electrodos o telémetros. Siga los estándares contemporáneos para cirugías asépticas. Utilice electrodos y transmisores estériles y que funcionen bien.
  4. Afeita la cabeza del animal con la maquinilla de afeitar eléctrica. Inducir la anestesia en el animal con la mezcla de ketamina (45 mg/kg) y xilacina (7,5 mg/kg) administrada por vía intraperitoneal (i.p.), luego añadir la anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) administrada a través de una máscara facial y fijar la cabeza del animal en el aparato estereotáxico.
  5. Asegure la profundidad adecuada de la anestesia probando el reflejo de retirada del pedal después de pellizcar las almohadillas de los pies en las patas traseras de ambos animales y mantenga la anestesia con isoflurano hasta el final de la cirugía. Compruebe regularmente la profundidad anestésica durante todo el procedimiento.
  6. Aplique una cantidad suficiente de ungüento ocular en los ojos de ambos animales para evitar daños en la córnea debido a la pérdida del reflejo de parpadeo causada por la anestesia.
  7. Limpiar a fondo el cuero cabelludo del animal con desinfectante líquido y realizar un corte longitudinal de 2 cm de largo con un bisturí esterilizado. Abra el cuero cabelludo y aplique clips quirúrgicos en los colgajos de piel para mantenerlo abierto.
  8. Suavemente, separe el periostio para exponer el bregma y el área del cráneo a través de la cual se insertará el electrodo de registro.

2. Implantación quirúrgica de electrodos anclados

NOTA: Antes de establecer el procedimiento de extracción de LCR por punción de este protocolo (ver paso 9 para más detalles), se realizaron extracciones repetidas de LCR a través de una cánula guía en algunas ratas no anestesiadas que se movían libremente. Se utilizaron animales canulados a los que se les implantaron electrodos atados para evaluar el impacto de los implantes de doble cabezal en el registro de EEG a largo plazo junto con múltiples muestras de LCR. En estos experimentos específicos, a las ratas se les implantó una cánula guía ficticia colocada en la cisterna magna, cuya punta se insertó 7 mm en ella estereotácticamente, de acuerdo con protocolos publicados previamente22. Los abordajes de la cirugía de doble implante fueron similares a los adoptados por algunos trabajadores en el pasado para las cánulas guía de microdiálisis y el implante de electrodos atados23,24.

  1. Use un brazo del marco estereotáxico, monte el portaelectrodos en él y coloque el electrodo en posición vertical en el soporte. Mueva la punta del electrodo exactamente por encima del bregma. Anota las coordenadas anteroposteriores y mediolaterales del bregma y tradúcelas a las coordenadas deseadas.
  2. Baje el electrodo hasta que su punta casi toque el cráneo. Marque el punto de perforación y taladre el cráneo en el lugar marcado. Tenga cuidado de no dañar el cerebro y las meninges.
  3. Haz cuatro o más agujeros para anclar los tornillos y atorníllalos en el cráneo. Preste atención al tamaño del electrodo al hacer los orificios para los tornillos de anclaje. El tamaño del electrodo no debe interferir con los tornillos de anclaje colocados.
  4. Baje lentamente el brazo estereotáctico que lleva el electrodo en el eje dorsoventral, ingrese al tejido cerebral y deténgase en la posición deseada. Fije el cable de tierra del electrodo alrededor de uno de los tornillos atornillados en el cráneo.
  5. Coloque el cemento metacrílico en el electrodo y los tornillos que cubran aproximadamente la mitad de la altura del pedestal del electrodo. Deje al descubierto la mitad superior del electrodo, que encaja en el extremo del cable de anclaje.
  6. Suelte el electrodo del soporte y levante el brazo estereotáctico. Liberar al animal del aparato estereotáxico y darle cuidados postoperatorios.
  7. Coloque al animal en una jaula de recuperación separada y obsérvelo cada 10 minutos hasta que esté despierto y deambulatorio. Regrese el animal a su jaula de alojamiento estándar y a otra compañía de animales no anestesiados solo después de que se haya recuperado por completo.

3. Implantación quirúrgica de los telémetros

NOTA: Utilice únicamente telémetros estériles. Si se reutilizan los telémetros, límpielos y esterilícelos antes de la cirugía de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este protocolo, se utilizó un telémetro de ciencia de datos (DSI) para el registro de EEG.

  1. Encienda el transmisor de telemetría con un imán y pruebe la señal con una radio de frecuencia AM. Verifique si hay una señal fuerte y clara antes de la cirugía. Si es necesario, deseche los telémetros que no funcionen.
  2. Prepare los cables del telémetro acortándolos a longitudes óptimas para ratas adultas. Despegue el recubrimiento de silicona de dos cables (negativo y positivo), exponiendo aproximadamente 5 mm del cable de acero helicoidal. Cree un mango en bucle de unos 2 mm de largo y 1 mm de ancho en la punta de los cables.
  3. Afeita el flanco del animal por debajo y por detrás del hombro izquierdo. Desinfectar el área de cirugía con desinfectante a base de peróxidos estabilizados y actividad de amonio cuaternario. Deja actuar el desinfectante durante 15 min.
  4. Realizar una incisión lateral de unos 2 cm justo detrás del hombro del animal y hacer una bolsa subcutánea de unos 5 cm3 de espacio para la colocación del transmisor. Coloque el transmisor paralelo al eje longitudinal del cuerpo, con los cables dirigidos hacia la dirección rostral.
  5. Fije el transmisor a la pared interna de la bolsa subcutánea con una sutura de algodón 3-0. Con unas tijeras de punta roma, cree el túnel subcutáneo (de aproximadamente 2,5 cm de longitud) a través del flanco y el cuello del animal, conectando así el bolsillo del transmisor con la incisión de la línea media realizada en el cuero cabelludo del animal en el paso 1.6.
  6. Tome ambos cables telemétricos con pinzas y tire de ellos hacia arriba a través del túnel, de modo que sobresalgan de la salida de la incisión del cuero cabelludo. Sostenga los cables fuera de la incisión del cuero cabelludo con pinzas para heridas.
  7. Utilice el marco estereotáxico para individualizar las coordenadas deseadas para el plomo positivo (rojo) y taladre el orificio en el cráneo para la punta del plomo positivo (similar al paso 2.1.). Haz un agujero más para anclar el tornillo hacia arriba a la tribuna y atorníllalo en el cráneo.
  8. Inserte la punta de plomo positivo debajo de la escutelaria y la duramadre y colóquela sobre la superficie del cerebro. Enganche la punta en bucle del cable negativo (blanco) en el tornillo. Coloque una pequeña cantidad de cemento metacrílico alrededor de la salida del cable positivo y el cable negativo para inmovilizarlos en el cráneo.
  9. Fije los cables a la pared interna de la piel del cráneo con una sutura de algodón 3-0. Asegúrese de que los cables fijos y la sutura de fijación no interfieran con el sitio de extracción del LCR (es decir, una superficie depresible con la apariencia de un rombo entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas).
  10. Cierre la incisión del cuero cabelludo y la incisión del flanco con una sutura de algodón 3-0. Aplica desinfectantes en las heridas. Solo después de que se hayan secado, aplique una crema antibiótica sobre las heridas suturadas.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Monitoree a los animales durante aproximadamente 1 hora después de la cirugía hasta que estén erguidos y moviéndose alrededor de la jaula. Manténgalos sobre una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Administrar a los animales un antibiótico sistémico para prevenir la infección y un analgésico sistémico para prevenir el dolor postquirúrgico durante 2-3 días.
  2. Permita que las ratas se recuperen durante al menos 7 días después de los procedimientos quirúrgicos. Vigile a los animales al menos una vez al día durante 3 días para detectar signos de dolor o angustia.

5. Inducción del estado epiléptico en ratas

NOTA: Para un protocolo detallado de inducción del estado epiléptico (EE) necesario para reproducir la epilepsia del lóbulo temporal mesial (mTLE) en ratas, consultar Guarino et al.25.

  1. Después de una semana de recuperación postquirúrgica, asignar los animales aleatoriamente a los grupos: (i) animales control que recibirán vehículo y (ii) animales epilépticos que recibirán pilocarpina. Utilizar un número proporcionalmente mayor de animales para el grupo epiléptico, ya que no todas las ratas a las que se les administró pilocarpina sobrevivirán o desarrollarán SE.
  2. El día antes de la inducción de SE, administrar a los animales una dosis única de 127 mg/kg de cloruro de litio disuelto en solución salina al 0,9% (3M) como un volumen de 1 mL/kg por sonda gástrica. Administrar el litio del animal, que aumenta la eficacia de la pilocarpina26, aproximadamente 14 h antes de la inducción de EE con el fin de disminuir la variabilidad en el tiempo de inicio de la EE.
  3. Aproximadamente 14 h después de la administración de litio, administrar a las ratas una sola inyección de metilescopolamina (1 mg/kg, por vía subcutánea).
  4. Exactamente 30 minutos después de la administración de metilescopolamina, administre a las ratas una sola inyección de pilocarpina (50 mg/kg, i.p.) para inducir el SE. Administre metilescopolamina y vehículo (solución de NaCl al 0,9%) a las ratas de control.
    1. La inyección de pilocarpina induce un comportamiento típico en animales: convulsiones parciales tempranas (movimientos de vibrisas y movimientos de cabeza dentro de los 5 minutos posteriores a la administración de pilocarpina) que evolucionan a convulsiones generalizadas recurrentes (EE) dentro de los 25-30 minutos. En el caso de las ratas que no desarrollen EE en un plazo de 30 minutos, administrar una dosis adicional de pilocarpina (25 mg/kg, i.p.) y, si aún no desarrollan EE, excluirlas del estudio (EE no respondedoras).
  5. Observe y puntúe el comportamiento convulsivo en ratas cada 5 minutos a partir de inmediatamente después de la inyección de pilocarpina. Usa la escala de Racine para obtener una puntuaciónde 27.
  6. Interrumpir la EE 2h después del inicio mediante la administración i.p. de un cóctel de fármacos: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) y escopolamina (1 mg/kg).
  7. Vuelve a dar a las ratas este cóctel después de 4 h. Finalmente, después de otras 4 h, administrar a las ratas i.p. la última mezcla de fármacos (diazepam 10 mg/kg más escopolamina 1 mg/kg) para detener completamente la actividad convulsiva.
  8. Inyectar solución salina a los animales (1 ml de solución de NaCl al 0,9%, pH ajustado a 7,0) y alimentarlos con una solución de sacarosa al 10% durante 2-3 días después de la SE para favorecer la recuperación de la pérdida de peso corporal que sigue a la SE.
  9. Asigne aleatoriamente a los animales supervivientes post-SE a diferentes grupos experimentales de acuerdo con los requisitos del protocolo experimental específico. Utilizar los siguientes criterios de inclusión/exclusión para experimentos posteriores en ratas epilépticas: desarrollo de EE convulsiva dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina, aumento de peso en la primera semana después de la EE y la posición correcta del electrodo en el área cerebral de interés para los registros de EEG25.

6. Video-EEG atado en ratas epilépticas y análisis de la actividad convulsiva

NOTA: Esta sección describe el procedimiento experimental para registrar las señales de EEG en ratas de una sola casa que se mueven libremente en condiciones estándar. La jaula no debe contener objetos en los que el animal o el cable de grabación puedan atascarse. Dependiendo de la cuestión científica a abordar, se pueden analizar varios parámetros. En el caso de la investigación de la epilepsia, los trazos del EEG se examinan para reconocer las convulsiones eléctricas y motoras. Los parámetros más comunes utilizados para identificar una convulsión son la amplitud, la frecuencia y la duración de la actividad eléctrica paroxística.

  1. Coloque al animal en una jaula limpia en la sala de grabación para permitir la habituación y reducir el estrés inducido por el nuevo entorno. Coloque la jaula del animal en una jaula de Faraday para evitar la contaminación de la señal EGG con el campo electromagnético ambiental.
  2. Conecte un extremo del cable de grabación al dispositivo de grabación. Utilice un voltímetro para medir el potencial eléctrico y diferenciar entre electrodos de tierra y de referencia.
  3. Conecte el otro extremo del cable de grabación al electrodo fijado en la cabeza de la rata. Para este objetivo, sostenga la cubierta de cemento en la cabeza del animal cuando inserte el enchufe del cable en el conector del electrodo y evite aplicar presión sobre la cabeza de la rata.
  4. Contrarreste el peso del cable de grabación para permitir el libre movimiento del animal y evitar el riesgo de torcer el cable. Para ello, utilice un brazo de contrapeso o conmutadores. Incluso si el cable de grabación está contrapesado, coloque la comida dentro de la jaula en lugar de en un soporte de alimentación, en el que los animales tienen que levantarse para alcanzar la comida.
  5. Antes de iniciar el registro, verifique todos los ajustes utilizados para adquirir y procesar los datos del EEG.
    NOTA: Este protocolo no proporciona una introducción al aparato requerido para realizar el registro de EEG, sin embargo, se deben aplicar filtraciones y frecuencias de muestreo adecuadas para evitar artefactos y ruido en las señales de EEG.
    1. Para un experimento de rutina, ajuste la frecuencia de muestreo a 500 Hz y la ganancia de amplificación a 5000x. Filtre la señal utilizando un filtro de 0,005 Hz además de un filtro de muesca para descartar la actividad eléctrica circundante en la banda de 50 Hz (específica para países europeos).
  6. Inicie las grabaciones de video y EEG y asegúrese de que los rastros coincidan con una señal de EEG esperada verificando la potencia en bandas de frecuencia específicas a lo largo del tiempo. Registre un período de referencia antes de iniciar las intervenciones en los animales.
  7. Revise periódicamente los rastros de animales y EEG. No es raro que un cable de grabación se desprenda del conector del electrodo en la cabeza de la rata. Si esto sucede, vuelva a conectar el electrodo en la cabeza de la rata a un cable de grabación y verifique si hay una señal de EEG clara.
  8. Analice la señal de EEG de forma manual o automática utilizando software disponible en el mercado. Si se analiza manualmente, realice una pantalla a través del registro de EEG para identificar actividades similares a las convulsiones. Si se va a utilizar software, configure los parámetros clave de un evento de convulsión, como la amplitud, la frecuencia y la duración de la actividad eléctrica.
    NOTA: La convulsión única puede caracterizarse por una actividad eléctrica con una amplitud 3 veces superior a la basal, una frecuencia igual o superior a 5 Hz y una duración de al menos 5 s22.
  9. Independientemente del método utilizado, confirme las posibles convulsiones comprobando la grabación de vídeo sincronizada recogida simultáneamente con el EEG.

7. Video-EEG de telemetría en ratas epilépticas y análisis de la actividad convulsiva

NOTA: En esta sección se describe el procedimiento experimental para registrar las señales de EEG de radiotelemetría en ratas de una sola casa que se mueven libremente en condiciones estándar. El protocolo se basa en un sistema de telemetría disponible comercialmente. Sin embargo, varios sistemas de telemetría difieren ligeramente en sus especificaciones funcionales y técnicas. El sistema debe elegirse en función de los requisitos del laboratorio y los objetivos de la investigación.

  1. Coloque la jaula del hogar del animal sobre el receptor de señal. Conecte el receptor de señal al sistema de adquisición de datos y éste a un ordenador con el software de adquisición.
  2. Encienda el implante de telemetría de radiofrecuencia colocando un imán cerca del telémetro insertado en el flanco de la rata. Pruebe la señal con un dispositivo de radio. Use un dispositivo de radio universal para probar los telémetros y escuche un pitido claro que indica que el telémetro está activado, mientras que un sonido chisporroteante indica que el telémetro está desactivado.
    NOTA: Se debe tener en cuenta la vida útil de la batería del transmisor de radiofrecuencia antes de definir la duración de las grabaciones.
  3. Configure el software de adquisición y sincronice la señal de telemetría y el sistema de video para adquirir simultáneamente EEG y datos de video. Asigne un receptor de señal a cada transmisor implantado y establezca los valores de calibración del transmisor. Ajuste la frecuencia de muestreo a 1000 Hz, la detección de ruido entre -500 mV y +500 mV, y el intervalo de integración a 100 ms. No utilice filtros de paso bajo y alto.
  4. Inicie las grabaciones de telemetría y vídeo. Realizar un registro basal a largo plazo antes de adquirir la actividad epiléptica. Analice la señal de EEG como se describe en los pasos 6.8 y 6.9.

8. Procedimiento de extracción de sangre de la vena de la cola

NOTA. El sistema de extracción de sangre al vacío consiste en una aguja de mariposa (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). La técnica de extracción de sangre puede ser realizada fácilmente por un operador y el procedimiento dura unos 5 minutos.

  1. Cubra la aguja de mariposa y su tubo con 1% de K2EDTA en agua destilada poco antes de las extracciones, es decir, aspire y expulse la solución de K2EDTA del sistema utilizando la jeringa de 1 ml. Cortar el tubo justo detrás de la aguja para recoger la sangre gota a gota, sin aspiración (Figura 1A).
  2. Colocar a la rata en una cámara de inducción y anestesiarla con isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min). Cambie al marco estereotáxico y mantenga la anestesia a través de una máscara facial. Coloque la almohadilla térmica debajo del animal, manteniendo una parte de su cola en contacto directo con la almohadilla.
  3. Mueva suavemente la espalda del animal hacia un lado para que la vena lateral de la cola se mantenga en la parte superior.
  4. Sumerja la cola en agua tibia (42 °C) durante 2 minutos para dilatar la vena lateral. Limpie la cola con etanol al 70% para que la vena sea más visible. Ponga una luz cálida en la cola con una bombilla incandescente normal.
  5. Inserte la aguja de mariposa 21G en la vena lateral de la cola con una profundidad de 5 mm y un ángulo de 20°. Recolectar sangre en un tubo de recolección al vacío de 500 μL que contenga 5 mg de K2EDTA como anticoagulante (Figura 1B, C).
  6. Retire la aguja y detenga el flujo de sangre ejerciendo presión en el lugar de la punción. Regresa a la rata a su jaula de origen.
  7. Invierta suavemente el tubo 10 veces para mezclar el anticoagulante en la sangre. Haz agujeros de aproximadamente 1,5 cm de profundidad en el hielo para acomodar los tubos de recolección. Coloque la muestra en hielo de forma suave y vertical.
  8. Centrifugar la muestra de sangre en una centrífuga refrigerada (4 °C) a 1300 x g durante 10 min para separar el plasma. Realice este procedimiento en un plazo máximo de 1 hora.
  9. Tome unos 200 μL de plasma, evitando la capa de glóbulos rojos y blancos. Coloque el plasma extraído en el microtubo estéril de 0,2 ml. Si es necesario, almacenar a 4 °C hasta 1 h después de la centrifugación.
  10. Reserve 5 μL de la muestra para el control de calidad. Almacenar la muestra a -80 °C hasta el análisis.
    NOTA: No utilice la aspiradora, incluso si algunos investigadores lo recomiendan28, ni ordeña la cola durante los procedimientos descritos en el paso 8.5 para obtener más sangre, ya que disminuye la calidad de la muestra para los próximos análisis de cuantificación de sncRNA (consulte los Resultados representativos para obtener más detalles). Hay que tener en cuenta que en ratas, la cantidad máxima de sangre que se puede extraer a la vez es <10% de su volumen sanguíneo total (es decir, alrededor de 1,6-1,9 ml en una rata de 250-300 g) y <15% del volumen sanguíneo total (alrededor de 2,64 ml) en 1 mes29. En este protocolo, se utiliza un máximo de 500 μL de extracción de sangre en una sola ocasión hasta cinco veces en un solo animal30,31.

9. Procedimiento de recogida del líquido porcina clásica

NOTA. La técnica puede ser realizada fácilmente por un solo operador, y el procedimiento requiere alrededor de 2-4 minutos. Los materiales utilizados para la recolección de LCR son agujas de mariposa de vacío de bajo costo y de un solo uso y tubos de extracción. En este protocolo, se utiliza un equipo de infusión con alas de mariposa conectado a una jeringa estéril para crear el vacío (Figura 2A).

  1. Prepare la aguja de mariposa 23G, cortando su protección de manga de plástico de modo que el extremo de la aguja desnuda quede expuesto 7 mm para evitar que penetre más de 7 mm de profundidad en la cisterna magna durante la extracción (Figura 2B).
  2. Conecte la aguja de mariposa equipada con un tubo de polímero a una jeringa de 1 ml.
  3. Colocar a la rata en una cámara de inducción y anestesiarla con isoflurano (1,4% en el aire; 1,2 mL/min). Cambie el flujo de isoflurano al marco estereotáxico y mantenga la anestesia administrada a través de una máscara facial. Retira el pelaje de la parte trasera, la cabeza y el cuello de la rata con una navaja.
  4. Fija la cabeza de la rata con barras en las orejas. Baje la cabeza del animal hacia abajo aproximadamente 45° verticalmente, bajando por la barra nasal del marco estereotáxico (Figura 2C). Inspeccione la parte posterior de la cabeza del animal y encuentre una superficie ligeramente deprimida con aspecto de rombo, entre la protuberancia occipital y la espina del atlas.
  5. Frote esta superficie con etanol al 70% para hacerla más visible y desinfectarla.
  6. Inserte la aguja de mariposa verticalmente en el centro de la superficie deprimida en forma de rombo en la cisterna magna para la recolección de LCR hasta que se bloquee el movimiento cortando a medida la protección de la aguja de la manga de plástico (Figura 2D). Retire suavemente el pistón de la jeringa de 1 ml para permitir que el líquido cefalorraquídeo fluya lentamente a través de la aguja.
  7. Recoja aproximadamente 100 μl del líquido cefalorraquídeo en un tubo de polímero (Figura 2D). Evite la entrada de sangre o cualquier otra contaminación visible. Pellizca el tubo de polímero muy cerca de la aguja de mariposa y corta el tubo en este punto.
  8. Introduzca la muestra clara (no contaminada) en la jeringa. Deseche la muestra contaminada, si la contaminación visible entra en el tubo colector.
  9. Expulsar la muestra en el microtubo estéril de 0,2 ml y almacenar en hielo durante un máximo de 1 h.
  10. Desinfecte el sitio de extracción del líquido cefalorraquídeo en la cabeza del animal. Retira a la rata del marco estereotáxico y vuelve a colocarla en su jaula.
  11. Reserve 2 μL de la muestra para el control de calidad. Almacene el resto de la muestra a -80 °C para su posterior análisis.
    NOTA: En ratas, si se realizan múltiples extracciones de LCR repetidamente, el volumen recomendado que se debe extraer en cada recolección es de 100 μL32. En este protocolo, se realizó un máximo de 100 μL de LCR en una sola ocasión con 5 veces la retirada máxima en 15 días en un solo animal.

10. Análisis espectrofotométrico de la calidad de la muestra

NOTA: Después de la recolección adecuada de muestras de LCR y plasma, las muestras están listas para análisis de espectrofotómetro y no requieren ningún manejo específico. Medir la absorbancia de hemoglobina mediante espectrofotometría UV a 414 nm para evaluar el riesgo de hemólisis en las muestras. Utilice un valor de absorbancia de corte de 0,25 en muestras de ratas. La elección de este límite puede depender del análisis posterior de qPCR y de sus requisitos específicos para la cuantificación de sncRNAs.

  1. Encienda el espectrofotómetro UV. Seleccione el método para la medición de la absorbancia en una sola longitud de onda de 414 nm para PLASMA o CSF. Haga clic en Siguiente.
  2. Enjuague la cubeta de 1 mm con agua purificada. Coloque 5 μL de etanol al 70% en el punto de medición de la cubeta. Secar con una toalla de papel y frotar con papel de seda sin pelusa. Comprueba si es perfectamente transparente.
  3. Poner 1,5 μL de agua purificada en la cubeta de 1 mm y cerrarla. Inserte la cubeta en la cámara de medición del espectrofotómetro y mida la absorbancia de la muestra en blanco haciendo clic en el botón Blank . Compruebe que el valor de absorbancia a 414 nm es de 0,000.
  4. Seque la cubeta con una toalla de papel y límpiela con papel de seda sin pelusa. Comprueba si es perfectamente transparente.
  5. Coloque 1,5 μL de la muestra en la cubeta de 1 mm y ciérrela. Inserte la cubeta en la cámara de medición del espectrofotómetro. Mida la muestra, haciendo clic en el botón Muestra . Compruebe la absorbancia de la muestra a 414 nm y anótela.
  6. Proceder a cuantificar la absorbancia de hemoglobina en todas las muestras disponibles. Mida la muestra en blanco antes que cualquier muestra de plasma o LCR, haciendo clic alternativamente en los botones Blanco y Muestra .
  7. Conserve las muestras con A414 nm < 0,25 a -80 °C y deseche las muestras si A414 nm > 0,25.
  8. Enjuague la cubeta de 1 mm con agua purificada y etanol al 70%, secuencialmente. Seca la cubeta.
  9. Cierre la cubeta vacía en la cámara de medición para evitar que se forme polvo. Apague el espectrofotómetro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El resultado de diferentes procedimientos de LCR y extracción de sangre realizados en 9 ratas control y 18 ratas epilépticas crónicas, todas ellas implantadas con electrodos al mes post-EE, se informa en términos de tasa de éxito. Después de la implantación, todas las ratas fueron monitoreadas por video-EEG durante 1 mes, durante el cual se extrajo el LCR más sangre 5 veces cada 3 días durante las dos últimas semanas del experimento (es decir, en los días 52, 55, 58, 61 y 64 después de la EE; dpSE). Se utilizaron datos de extracciones múltiples en diferentes animales para comparar la tasa de éxito de la recolección de LCR en las ratas con implantes de doble cabeza (canuladas para la extracción de LCR) con la tasa de éxito de la recolección de LCR (realizada mediante punción de cisterna magna) solo en animales implantados con electrodos atados o de telemetría (Tabla 1). En diferentes animales, se evaluó el impacto de la extracción de sangre al vacío o el ordeño de cola en la calidad de las muestras de plasma (Tabla 2). Para ello, se utilizó el análisis de espectrofotometría UV a 414 nm para la detección de hemoglobina libre. Para los análisis estadísticos se utilizó software comercial y se utilizó el ANOVA de Kruskal-Wallis o de una vía con pruebas de comparación múltiple de Tukey post-hoc (p<0,05 considerada estadísticamente significativa). Los datos se expresan como media ± SEM.

Tasa de éxito de múltiples muestreos de LCR en ratas canuladas y punzadas
Se han muestreado LCR 5 veces en 2 semanas en 3 grupos de ratas: (i) ratas con implantes de electrodos canulados y atados (grupo de animales con TC); en estos, la extracción del LCR se realizó a través de una cánula guía ficticia y una unión de tubo de PTFE a una jeringa de 1 mL cuando no estaban anestesiados y se movían libremente bajo video-EEG; (ii) ratas perforadas (paso 9) e implantadas con electrodos atados (grupo PT); (iii) ratas con electrodos punzantes e implantados con electrodos de telemetría (grupo PTe). Se utilizaron un total de 9 animales por grupo (6 ratas epilépticas y 3 control). Se evaluó el número de cobros exitosos más de 5 veces. La tasa de éxito fue similar en ratas perforadas: 86,7% ± 5,8% en animales atados y 88,9% ± 4,8% en animales implantados con electrodos de telemetría. En cambio, en las ratas canuladas, la tasa se redujo aunque no fue significativamente diferente (71,1% ± 8,9%, Tabla 1). Estos resultados indican que la cánula en la cabeza de los animales puede interferir con la toma repetida de muestras de LCR y comprometer los estudios longitudinales. La técnica de punción es más adecuada para extracciones múltiples de LCR en animales implantados con electrodos.

Impacto del ordeño al vacío y de cola en el método de recolección de plasma
Se recolectó sangre 5 veces de 9 ratas (6 epilépticas y 3 ratas control) a los días 52, 55, 58, 61 y 64 post-SE y la calidad del plasma se evaluó para hemólisis visualmente y por espectrofotometría UV a 414 nm. Para obtener la primera muestra en cada rata, se empleó la extracción al vacío a través de una aguja de mariposa de 21G unida a una jeringa de 1 mL. Con la segunda muestra, se empleó el sistema de extracción de gotas y agujas de mariposa 21G al ordeñar la cola simultáneamente. Para obtener la 3ª-5ª muestra, se utilizó el procedimiento de retirada de gotas sin ordeñar la cola (descrito en el paso 9).

Cuando se empleó un vacío, el plasma fue de color rosa bajo la inspección visual, y el valor medio de absorbancia de las muestras de 9 ratas fue de 0,647 ± 0,067 (Tabla 2, Figura 3). Resultados similares se obtuvieron si se empleó el ordeño de cola durante el procedimiento: plasma de color rosado con absorbancia media de 0,620 ± 0,043 (Tabla 2, Figura 3). Por el contrario, con la extracción de gotas habilitada por la gravedad y el sistema de aguja de mariposa de 21 G, los valores medios de absorbancia plasmática se redujeron significativamente (0,226 ± 0,017 a 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 a 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 a 64 dpSE; Tabla 2, Figura 3) con respecto al método de ordeño al vacío o de cola. Además, las muestras de plasma en gota eran principalmente transparentes. Los valores más altos de absorbancia (52 y 55 dpSE) se correlacionaron con el color rosado de las muestras (datos no mostrados). Estos resultados pueden sugerir que el último método es el mejor para obtener muestras de muy alta calidad para los análisis.

Figure 1
Figura 1: Pasos clave del flujo de trabajo de muestreo de plasma. (A) Materiales necesarios para la extracción de sangre y rata en el marco estereotáxico, listos para la recolección; (B, C) Aumentos de la cola con aguja de mariposa de 21G insertada en la vena lateral de la cola y la gota de sangre cayendo por las paredes del tubo de recolección con un anticoagulante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos clave del flujo de trabajo de toma de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR). (A) Materiales necesarios para la extracción del LCR y rata en el marco estereotáxico, poco antes de la recolección; (B) La preparación de la aguja de mariposa 23G cortando su protección de manga de plástico de modo que el extremo de la aguja desnuda quede expuesto durante 7 mm para garantizar una penetración correcta en la cisterna magna; (C) La cabeza de la rata se inclina hacia abajo 45° durante la retirada. (D) Aumento en el sitio romboidal con una aguja de mariposa insertada en la cisterna magna. Observe el líquido cefalorraquídeo que se eleva en el tubo, indicado por la punta del marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la calidad de las muestras de plasma. Grado de hemólisis medido a 414 nm para hemoglobina libre por espectroscopia UV en muestras de plasma de 9 animales en 5 puntos temporales (52, 55, 58, 61 y 64 días post estado epiléptico, dpSE) utilizando diferentes métodos: día 52 - la técnica de vacío; Día 55 - El ordeño de la cola; En los días 58-64 se emplearon las técnicas de caída. La disminución de la hemoglobina libre en plasma obtenida por la técnica de gota en comparación con los métodos de vacío y ordeño de cola fue significativa (*p <0,05 según ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Tasas de éxito de los retiros de LCR. Comparación de las tasas de éxito de la retirada repetida del LCR en tres grupos experimentales de animales, expresada como porcentaje de retiradas exitosas a lo largo de 5 días. El valor 1 se asignó a la extracción exitosa de > 100 μL de LCR transparente; el valor cero se asignó a los retiros < 100 μL y/o de LCR poco claro. Abreviaturas: N/A - la ausencia de recogida debido a la pérdida de cánula durante el procedimiento de muestreo (sólo animales de TC); TC - canulada y atada; PT - perforado atado; PTe - electrodos de telemetría perforados implantados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Evaluación de la hemólisis en muestras de plasma. Resultados de las mediciones de hemólisis en 5 puntos temporales utilizando tres métodos diferentes de muestreo de sangre: día 52 - la técnica de vacío; Día 55 - El ordeño de la cola; Días 58-64 Las técnicas de caída. Los valores >0,3 de absorbancia se correlacionaron con el color rosado de las muestras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El presente trabajo ilustra una técnica fácil de dominar de la recolección de LCR y sangre en ratas, que puede ser útil no solo para estudios en modelos de epilepsia, sino también de otras afecciones o enfermedades neurológicas como el Alzheimer, el Parkinson o la esclerosis múltiple. En la investigación de la epilepsia, ambos procedimientos de muestreo junto con el video-EEG son ideales cuando se busca una correlación entre los niveles de diferentes moléculas solubles y la actividad convulsiva. Por esta razón, se empleó un registro continuo de video-EEG: i) para diagnosticar correctamente la epilepsia o ii) para monitorear las diferentes fases de la progresión de la enfermedad, y/o iii) para correlacionar el muestreo con la ocurrencia de crisis espontáneas. Estas técnicas de muestreo se pueden realizar en ratas anestesiadas, lo que provoca un estrés mínimo.

Pasos críticos, solución de problemas, limitaciones del método
El protocolo tiene algunos pasos técnicos críticos. En primer lugar, puede ser difícil encontrar el lugar correcto para la recolección de LCR en el primer intento. Si el operador pierde la cisterna magna en el primer intento, cualquier ensayo posterior estaría contaminado con la sangre, ya que el animal sangrará por la herida de la aguja. Desde este punto de vista, el éxito en la recolección depende en gran medida de la habilidad del operador. En segundo lugar, algunos pasos de la extracción de sangre necesitan una atención especial. En particular, existe un alto riesgo de hemólisis si el operador frota la cola con demasiada fuerza con etanol, si la temperatura del agua utilizada para la vasodilatación de la vena de la cola es superior a 42 °C o si la sangre en el tubo de recolección se mezcla con anticoagulante de manera demasiado enérgica. Otra peculiaridad de la recolección de sangre en animales epilépticos crónicos es la influencia de su bradicardia en la velocidad a la que la sangre sale de la vena de la cola33. Si esto es demasiado lento, la sangre puede coagularse en las paredes del tubo de recolección. Para evitar este problema, una opción es dividir la muestra en dos tubos de recolección, reduciendo el volumen de sangre/tubo. Por último, hay un escollo que es intrínseco a los estudios sobre la epilepsia. El estrés provocado por la manipulación animal antes del muestreo puede inducir convulsiones, lo que a su vez puede interferir con los niveles de moléculas objeto de investigación34. Siempre que sea posible, coloque la cámara de inducción de anestesia en la jaula de la casa y permita que el animal entre en ella espontáneamente. Como modificación del protocolo propuesto, se puede utilizar un retenedor para realizar la extracción de sangre sin anestesia con isoflurano. Sin embargo, esto se puede hacer en telemetría, pero no en animales atados, porque las ratas atadas pueden perder sus implantes de cabeza durante este procedimiento.

Al contar con un operador bien entrenado y con el máximo esfuerzo para evitar el estrés, la única limitación del presente protocolo es el volumen máximo que se puede retirar sin comprometer la salud del animal. De acuerdo con las normas actuales, se recomienda recolectar un máximo de 100 μL de LCR durante 4 veces durante 15 días en un solo animal32. Del mismo modo, se sugiere recolectar menos del 10% del volumen total del cuerpo sanguíneo en una sola muestra y menos del 15% del volumen total del cuerpo sanguíneo en 28 días30,31.

Comparación del método con otras técnicas
Los enfoques propuestos para la toma de muestras de LCR y plasma con resolución temporal tienen varias ventajas con respecto a los métodos alternativos existentes. En primer lugar, una punción de cisterna magna utilizada para tomar muestras de líquido cefalorraquídeo en ratas epilépticas tiene un menor riesgo de pérdida del implante de la cabeza en comparación con un sistema canulado si se acopla a un EEG atado. A diferencia de los procedimientos de punción, la cánula unida al electrodo por cemento dental (voluminosa y pesada para las cabezas de los animales), aunque solicitada por adiciones/desprendimientos repetidos a las extracciones de LCR, es mucho más propensa a perderse durante varios días de muestreo. De hecho, los resultados de la tasa de éxito muestran cómo algunos animales canulados (N/A) no llegan a los puntos de tiempo de muestreo avanzados, por lo que sus respectivas muestras se pierden (Tabla 1). Además, el método de punción parece ser superior al abordaje canulado en términos de mejor esterilidad y reducción de la reacción meníngea con un aumento limitado del contenido de células y albúmina en el LCR, como se ha documentado previamente por otros 22,35,36. El grado de contaminación de leucocitos y albúmina en LCR puede ser importante para la validez de los métodos utilizados para la cuantificación de biomarcadores de epilepsia35. En segundo lugar, el método de caída libre de la toma de muestras de plasma sanguíneo utilizado para medidas repetidas es superior a cualquier otro método de retirada, ya que no es terminal (no se recupera), a diferencia de la decapitación, la punción cardíaca, el vaso sanguíneo abdominal/torácico o la extracción retroorbitaria y permite la toma de muestras de sangre múltiples. Es más simple que muchas técnicas de extracción de vacío sanguíneo en la vena de cola, ya que no requiere tubos28,37 y produce muestras de plasma libre de hemólisis de alta calidad para análisis posteriores de sncRNA enfocados en la identificación de biomarcadores putativos de epileptogénesis38. La ausencia de hemoglobina libre en las muestras, al emplear la técnica de muestreo por gotas o evitar el ordeño de la cola, fue confirmada por los resultados de baja absorbancia de las muestras plasmáticas (Tabla 2) en línea con los procedimientos previamente publicados adecuados para la evaluación del contenido plasmático de sncRNA39,40.

Aplicaciones y direcciones futuras
Los métodos descritos anteriormente se pueden aplicar para medir moléculas solubles de interés en cualquier modelo de enfermedades neurológicas. Un ejemplo concreto es la toma de muestras de líquidos biológicos para la identificación de biomarcadores de epilepsia potenciales/putativos. Existe una necesidad médica urgente no cubierta de descubrir estos biomarcadores para las personas con epilepsia, especialmente los biomarcadores pronósticos y de susceptibilidad/riesgo, ya que aún no existen.

En conclusión, el presente protocolo es factible en ratas, incluidas las ratas epilépticas, y es fácil de accionar para individuos entrenados. Además, permite múltiples muestreos de alta calidad en estudios longitudinales de acuerdo con el principio de las 3R (es decir, reemplazo, reducción y refinamiento)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio contó con el apoyo de una subvención del Programa de Trabajo Horizonte 2020 de la Unión Europea (convocatoria H2020-FETOPEN-2018-2020) en virtud del acuerdo de subvención 964712 (PRIME; a M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Líquido cefalorraquídeo Muestreo de sangre Vena lateral de la cola Ratas Registros de EEG Biomarcadores Investigación de la epilepsia Retirada del LCR Cisterna magna Monitorización de video-EEG Biomarcadores de diagnóstico Biomarcadores pronósticos Muestreo indoloro Mínima invasividad Reducción del tiempo de anestesia
Toma de muestras de líquido cefalorraquídeo y sangre de la vena lateral de la cola en ratas durante los registros de EEG
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter