Summary
该协议显示癫痫大鼠的重复脑脊液和血液采集与连续视频脑电图（EEG）监测同时进行。这些有助于探索各种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能联系。
Abstract
由于体液的成分反映了许多生理和病理动力学，因此在许多实验环境中通常获得生物液体样品来测量感兴趣的分子，例如激素、生长因子、蛋白质或小的非编码 RNA。一个具体的例子是在癫痫生物标志物研究中对生物液体进行采样。在这些研究中，希望通过同时提取脑脊液和血浆并考虑从癫痫发作到癫痫发作的采样时间距离来比较脑脊液 （CSF） 和血浆中的分子水平。脑脊液和血浆取样相结合，加上癫痫动物的视频脑电图监测，是验证推定诊断和预后生物标志物的一种有前途的方法。在这里，描述了从大池中撤出脑脊液和从连续视频脑电图监测的癫痫大鼠的侧尾静脉取血的联合程序。与其他常用技术相比，该程序具有显着优势。它允许以最小的疼痛或侵入性快速取样，并减少麻醉时间。此外，它可用于在系留和遥测脑电图记录的大鼠中获取脑脊液和血浆样本，并且可以在多天的实验中重复使用。通过缩短异氟烷麻醉时间，最大限度地减少取样引起的压力，预计测量将更准确地反映生物流体中所研究分子的真实水平。根据适当分析测定的可用性，该技术可用于测量多个不同分子的水平，同时进行脑电图记录。
Introduction
在临床前和临床研究中，脑脊液 （CSF） 和血液采样对于识别和验证癫痫的生物标志物都很重要 1,2。如今，癫痫的诊断和大多数关于癫痫生物标志物的研究都集中在脑电图和神经影像学上 3,4,5。然而，这些方法存在一些局限性。除了常规的头皮测量外，在许多情况下，脑电图还需要深度电极等侵入性技术6.脑成像方法的时间和空间分辨率较差，并且相对昂贵且耗时 7,8。出于这个原因，识别非侵入性、低成本和基于生物流体的生物标志物将提供一种非常有吸引力的替代方案。此外，这些生物流体生物标志物可以与现有的诊断方法相结合，以提高其预测性。
被诊断为癫痫的患者通常接受脑电图9、10 和血液采样11、12、13、14 检查，许多患者还接受脑脊液停药检查，以排除危及生命的病因（即急性感染、自身免疫性脑炎）15。这些血液和脑脊液样本可用于临床研究，旨在识别癫痫的生物标志物。例如，Hogg及其同事发现，在人类癫痫中，三个血浆tRNA片段的增加先于癫痫发作14。同样，人脑脊液和血清中的白细胞介素-1β （IL-1β） 水平，表示为脑脊液中 IL-1β 水平与血清的比率，可以预测创伤性脑损伤后创伤后癫痫的发展16.这些研究强调了生物流体采样对癫痫生物标志物研究的重要性，但它们面临着临床试验固有的多种局限性，例如，血液中抗癫痫药物 （AED） 的共同创始因素、经常缺乏病因信息、控制不足、患者数量适中等17,18。
临床前研究为研究生物流体中的分子作为癫痫的潜在生物标志物提供了其他机会。事实上，在进行脑电图记录时，可以从动物身上提取血浆和/或脑脊液。此外，可以在多天的实验中重复进行采样，并且可以使用一些年龄、性别和癫痫侮辱匹配的对照来提高研究的稳健性。在这里，详细描述了一种从脑电图监测的大鼠尾静脉平行抽取血浆从大池获得脑脊液的灵活技术。与其他方法相比，所提出的技术有几个优点。通过使用蝶形针方法，可以在不影响脑电图电极或类似头部植入物功能的情况下多次收集脑脊液。这代表了鞘内导管拔出手术的改进，鞘内导管拔出手术与相对较高的感染风险相关。此外，据报道，用于采血的自由落体方法优于其他尾静脉抽血方法，因为血液不通过管道且不施加真空压力，溶血风险大大降低。如果在严格的无菌条件下进行，动物感染的风险特别低。此外，通过从动物尾巴的末端开始抽血，可以重复采样几次。这些技术很容易掌握，可以应用于许多中枢神经系统疾病的临床前研究。
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Protocol
根据 1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会关于保护用于实验和其他科学目的的动物的指令 （86/609/EEC） 中概述的指南，所有实验程序均已获得费拉拉大学机构动物护理和使用委员会和意大利卫生部的批准（授权：DM 603/2022-PR）。该方案专门针对在大鼠脑脊液和癫痫动物脑电图控制下获得的血浆中小的非编码核糖核酸（sncRNA）的进一步定量聚合酶链反应（qPCR）分析进行了调整。根据其选择，请参阅相关的 JoVE 视频，以更好地了解和改进手术19、20、21。
1. 准备动物进行电极或遥测仪的手术植入
注意：立体定位手术技术因所使用的脑电图系统而异。以下方法部分描述了这两种手术的共同步骤。
- 使用根据当地实验动物护理和使用法律饲养的Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，7-8周龄，体重250-290克）。将动物饲养在标准条件下，并免费获得食物和饮用水。
- 在手术和实验方案程序前几天继续处理大鼠。
- 使用立体定位装置进行电极或遥测仪植入。遵循无菌手术的现代标准。使用无菌且工作良好的电极和变质器。
- 用电动剃须刀剃掉动物的头。用氯胺酮（45mg / kg）和甲苯噻嗪（7.5mg / kg）的混合物诱导动物麻醉，腹膜内（ip），然后加入异氟烷麻醉剂（空气中1.4%;1.2mL / min）通过面罩输送，并将动物的头部固定到立体定位装置中。
- 通过在两只动物的后脚上捏住脚垫后测试踏板戒断反射来确保足够的麻醉深度，并保持异氟烷麻醉直至手术结束。在整个手术过程中定期检查麻醉深度。
- 在两只动物的眼睛上涂抹足量的眼药膏，以防止因麻醉引起的眨眼反射丧失而导致角膜损伤。
- 用液体消毒剂彻底清洁动物的头皮，并使用消毒手术刀做一个 2 厘米长的纵切口。打开头皮，在皮瓣上贴上手术夹以保持其打开状态。
- 轻轻地分离骨膜，露出前囟和颅骨区域，记录电极将通过该区域插入。
2. 拴留电极的手术植入
注意：在建立本方案的穿刺脑脊液退出程序之前（有关详细信息，请参阅步骤9），在一些自由移动的非麻醉大鼠中通过引导套管重复进行脑脊液退出。使用植入系留电极的置管动物来评估双头植入物对长期脑电图记录和多次脑脊液取样的影响。在这些特定的实验中，根据先前发表的方案22，将大鼠植入放置在大池中的假引导套管，其尖端以立体定向方式插入其中7 mm。双种植手术方法与过去一些工人采用的微透析引导套管和系留电极植入的方法相似23,24。
- 使用立体定位框架的一只臂，将电极支架安装在其上，然后将电极直立放入支架中。将电极尖端正好移动到前囟上方。写下前囟的前后和内侧坐标，并将它们转换为所需的坐标。
- 降低电极，直到其尖端几乎接触颅骨。标记钻孔点并在标记点上钻头骨。注意不要损伤大脑和脑膜。
- 为锚固螺钉打四个或更多孔，然后将它们拧入头骨。在制作锚固螺钉的孔时要注意电极的尺寸。电极尺寸不应干扰定位的锚固螺钉。
- 缓慢降低背腹轴上携带电极的立体定向臂，进入脑组织，并停在所需位置。将电极地线固定在拧入颅骨的一颗螺钉周围。
- 将甲基丙烯酸水泥放在电极上，并覆盖电极基座高度的一半左右。将电极的上半部分（适合系绳末端）裸露在外。
- 从支架上松开电极并抬起立体定向臂。将动物从立体定位装置中释放出来，并给予其术后护理。
- 将动物放在单独的恢复笼中，每 10 分钟观察一次，直到醒来并走动。只有在完全康复后，才能将动物放回其标准饲养笼和另一个未麻醉的动物公司。
3. 遥测仪的手术植入
注意： 仅使用无菌遥测仪。如果遥测仪是重复使用的，请在手术前根据制造商的说明对其进行清洁和消毒。在该协议中，使用了用于脑电图记录的数据科学国际 （DSI） 遥测仪。
- 使用磁铁打开遥测发射器，并使用 AM 频率无线电测试信号。手术前检查是否有强烈而清晰的信号。如果需要，请丢弃工作不良的遥测仪。
- 通过将遥测引线缩短到成年大鼠的最佳长度来准备遥测引线。剥开两根（负极和正极）引线上的硅胶涂层，露出大约 5 毫米的螺旋钢引线。在引线的尖端创建一个长约 2 毫米、宽约 1 毫米的环形手柄。
- 剃掉动物的左肩下方和后面的侧翼。用基于稳定过氧化物和季铵活性的消毒剂对手术区域进行消毒。让消毒剂作用 15 分钟。
- 在动物肩膀后面做一个约2厘米的侧向切口，并做一个约5厘米3 空间的皮下口袋，用于放置发射器。将发射器平行于身体的长轴放置，引线指向喙方向。
- 用 3-0 棉缝线将发射器固定在皮下口袋的内壁上。使用钝头剪刀，在动物的侧腹和颈部创建皮下隧道（约 2.5 厘米长），从而将发射器口袋与步骤 1.6 在动物头皮上做的中线切口连接起来。
- 用镊子取两个遥测仪导线，将它们拉过隧道，使它们从头皮切口突出。用伤口夹将导线从头皮切口中取出。
- 使用立体定位框架个性化正（红色）引线的所需坐标，并在颅骨上钻孔以获得正引线尖端（类似于步骤 2.1）。再打一个孔，将螺丝向上固定在讲台上，然后拧入头骨。
- 将正铅的尖端插入黄芩和硬脑膜下方，并将其放在大脑表面。将负极（白色）引线的环形尖端挂在螺钉上。在正极引线出口周围放少量甲基丙烯酸水泥，负极引线将它们固定在颅骨上。
- 用 3-0 棉缝合线将导线固定到颅骨皮肤的内壁。确保固定导线和固定缝合线不会干扰脑脊液抽取部位（即枕骨突起和寰椎脊柱之间出现菱形的可压表面）。
- 使用 3-0 棉缝合线闭合头皮切口和侧腹切口。在伤口上涂抹消毒剂。只有在这些伤口干燥后，才在缝合的伤口上涂抹抗生素乳膏。
4. 术后护理
- 手术后监测动物约1小时，直至直立并在笼子周围移动。将它们放在加热垫上以防止体温过低。给动物注射全身性抗生素以防止感染，全身性镇痛剂预防术后疼痛 2-3 天。
- 让大鼠在外科手术后至少恢复 7 天。每天至少监测一次动物，持续 3 天，是否有疼痛或痛苦的迹象。
5.大鼠癫痫持续状态诱导
注意：有关在大鼠中重现近中颞叶癫痫 （mTLE） 所需的癫痫持续状态 （SE） 诱导的详细方案，请参阅 Guarino 等人 25。
- 术后恢复一周后，将动物随机分配到各组：（i） 接受载体的对照动物和 （ii） 将接受毛果芸香碱的癫痫动物。对于癫痫组，使用比例更高的动物数量，因为并非所有毛果芸香碱施用的大鼠都能存活或发展SE。
- 在SE诱导的前一天，通过胃管饲法给予动物单剂量的127mg / kg氯化锂溶解在0.9%盐水（3M）中，体积为1mL / kg。施用动物的锂，增加毛果芸香碱的功效26，在诱导SE之前约14小时，以减少SE发作时间的变异性。
- 锂给药后约14小时，给予大鼠单次注射甲基东莨菪碱（1mg / kg，皮下注射）。
- 甲基东莨菪碱给药后30分钟，给予大鼠单次注射毛果芸香碱（50mg / kg，ip）以诱导SE。 给予甲基东莨菪碱和载体（0.9%NaCl溶液）以控制大鼠。
- 毛果芸香碱注射诱导动物的典型行为：早期部分性癫痫发作（毛果芸香碱给药后5分钟内振动和点头的运动）在25-30分钟内演变为复发性全身性抽搐（SE）。对于在30分钟内未发生SE的大鼠，给予额外剂量的毛果芸香碱（25mg / kg，ip），如果它们仍未发生SE，则将其排除在研究之外（SE无反应者）。
- 在毛果芸香碱注射后立即开始，每5分钟观察一次大鼠的癫痫发作行为并对其进行评分。使用 Racine 量表对27 进行评分。
- 在发病后2小时通过腹腔注射药物混合物中断SE：地西泮（10mg / kg），苯巴比妥（25mg / kg）和东莨菪碱（1mg / kg）。
- 4小时后再次给大鼠这种鸡尾酒。最后，再过4小时后，给大鼠腹腔注射最后一种药物混合物（地西泮10mg / kg加上东莨菪碱1mg / kg），以完全停止癫痫发作活动。
- 腹腔注射生理盐水（1mL 0.9%NaCl溶液，pH调节至7.0），并在SE后用10%蔗糖溶液喂养它们2-3天，以促进从SE后的体重减轻中恢复。
- 根据具体实验方案的要求，将SE后存活的动物随机分配到不同的实验组。使用以下纳入/排除标准对癫痫大鼠进行进一步实验：毛果芸香碱给药后 1 小时内发生惊厥性 SE，SE 后第一周体重增加，以及电极在感兴趣的大脑区域的正确定位以进行脑电图登记25。
6. 癫痫大鼠的系留视频脑电图和癫痫发作活动分析
注：本节描述了在标准条件下记录单屋自由移动大鼠脑电图信号的实验程序。笼子不应包含动物或记录电缆可能卡住的物体。根据要解决的科学问题，可以分析几个参数。在癫痫研究的情况下，对脑电图痕迹进行筛查以识别电和运动癫痫发作。用于识别癫痫发作的最常见参数是阵发性电活动的幅度、频率和持续时间。
- 将动物放在录音室干净的笼子里，以适应并减少新环境引起的压力。将动物的笼子放入法拉第笼中，以避免 EGG 信号受到环境电磁场的污染。
- 将录音电缆的一端连接到录音设备。使用电压表测量电势并区分接地电极和参比电极。
- 将记录电缆的另一端连接到固定在大鼠头部的电极上。为此，将电缆插头插入电极连接器时，将水泥盖固定在动物的头上，并避免对大鼠的头部施加任何压力。
- 平衡记录电缆的重量，使动物能够自由移动，同时防止电缆扭曲的风险。为此，请使用平衡臂或换向器。即使记录电缆是平衡的，也要将食物放在笼子里，而不是放在喂食架中，动物必须站起来才能接触到食物。
- 在开始注册之前，请检查用于从 EEG 获取和处理数据的所有设置。
注意：该协议不介绍执行 EEG 记录所需的设备，但是，应应用足够的滤波和采样率以避免 EEG 信号中的伪影和噪声。- 对于常规实验，将采样率设置为 500 Hz，将放大增益设置为 5000 倍。除了陷波滤波器外，还使用 0.005 Hz 滤波器滤波信号，以丢弃 50 Hz 频段（特定于欧洲国家/地区）中的周围电活动。
- 开始视频和脑电图记录，并通过检查特定频段内的功率来确保迹线与预期的脑电图信号相匹配。在开始对动物进行干预之前记录基线期。
- 定期检查动物和脑电图痕迹。记录电缆从大鼠头的电极连接器上脱落的情况并不少见。如果发生这种情况，请再次将大鼠头中的电极重新连接到记录电缆上，并检查是否有清晰的脑电图信号。
- 使用市售软件手动或自动分析脑电信号。如果手动分析，则通过脑电图记录进行筛查以识别癫痫样活动。如果要使用软件，请配置癫痫发作事件的关键参数，例如电活动的振幅、频率和持续时间。
注意：单次癫痫发作的特征可能是振幅比基线高 3 倍，频率等于或高于 5 Hz，持续时间至少为 5 秒22。 - 无论使用何种方法，都应通过检查与脑电图同时收集的同步视频记录来确认潜在的惊厥性癫痫发作。
7. 癫痫大鼠遥测视频脑电图及癫痫发作活动分析
注：本节描述了在标准条件下记录单屋自由移动大鼠的无线电遥测脑电信号的实验程序。该协议基于商用遥测系统。但是，一些遥测系统在功能和技术规格上略有不同。应根据实验室要求和研究目标选择系统。
- 将动物笼子放在信号接收器上方。将信号接收器连接到数据采集系统，并将其连接到带有采集软件的计算机。
- 通过将磁铁放置在插入大鼠侧翼的遥测仪附近来打开射频遥测植入物。使用无线电设备测试信号。使用通用无线电设备测试遥测仪，并听到清晰的哔哔声表示遥测仪已激活，而嘶嘶声表示遥测仪未停用。
注意： 在定义录音的持续时间之前，应考虑射频发射器电池的使用寿命。 - 设置采集软件，同步遥测信号和视频系统，同时采集脑电和视频数据。为每个植入的发射器分配一个信号接收器，并设置发射器的校准值。将采样率设置为1000 Hz，噪声检测在-500 mV至+500 mV之间，积分间隔设置为100 ms。不要使用低通和高通滤波器。
- 启动遥测和视频录制。在获得癫痫样活动之前进行长期基线记录。按照步骤 6.8 和 6.9 中所述分析 EEG 信号。
8. 尾静脉采血程序
注意。真空采血系统由一根蝶形针（23 G x 3/4 x 12 （0.8 mm x 19 mm x 305 mm））组成。采血技术可以由一名操作员轻松执行，该过程大约需要 5 分钟。
- 在取出前不久，用蒸馏水涂覆蝴蝶针及其管子，即使用1mL注射器吸入并排出K2EDTA溶液。切开针头后面的管子，以便逐滴收集血液，无需抽吸（图1A）。
- 将大鼠置于诱导室中，并用异氟烷（空气中1.4%;1.2mL / min）麻醉。切换到立体定位框架并通过面罩保持麻醉。将加热垫放在动物下方，使其尾巴的一部分与加热垫直接接触。
- 轻轻地将动物的背部移到一边，使侧尾静脉保持在顶部。
- 将尾巴浸入温水（42°C）中2分钟以扩张侧静脉。用 70% 乙醇擦拭尾巴，使静脉更明显。使用普通白炽灯泡将暖光放在尾巴上。
- 将 21G 蝴蝶针插入深度为 5 毫米、角度为 20° 的侧尾静脉。在含有5mg K2EDTA作为抗凝剂的500μL真空收集管中收集血液（图1B，C）。
- 取下针头，通过对穿刺部位施加压力来阻止血液流动。将老鼠放回笼子里。
- 轻轻倒置试管 10 次，使抗凝剂混合在血液中。在冰上打约 1.5 厘米深的孔以容纳收集管。轻轻地垂直将样品置于冰上。
- 将血液样品在冷冻离心机（4°C）中以1300× g 离心10分钟以分离血浆。最多在1小时内执行此过程。
- 取约200μL血浆，避开红细胞和白细胞层。将抽出的血浆放入 0.2 mL 无菌微管中。如果需要，离心后在4°C下储存长达1小时。
- 将 5 μL 样品放在一边进行质量控制。将样品储存在-80°C直至分析。
注意：即使一些研究人员建议28 或在步骤 8.5 中描述的程序中挤尾部以获得更多血液，也不要使用真空，因为它会降低下一次 sncRNA 定量分析的样品质量（有关详细信息，请参阅代表性结果）。请记住，在大鼠中，一次可以抽取的最大血液量是其总血容量的<10%（即，在250-300g大鼠中约为1.6-1.9mL）和<15个月总血容量的%（约2.64mL）29。在该协议中，在单个动物中单次最多使用500μL血液收集最多五次30,31。
9. 脑脊液采集程序
注意。该技术可以由单个操作员轻松执行，该过程大约需要 2-4 分钟。用于收集脑脊液的材料是低成本的一次性真空蝶形针和提取管。在该协议中，使用连接到无菌注射器的蝴蝶翼输液器以产生真空（图2A）。
- 准备 23G 蝶形针，切割其塑料套保护，使裸针的末端暴露 7 毫米，以防止其在拔出过程中穿透超过 7 毫米深的脑池（图 2B）。
- 将装有聚合物管的蝶形针头连接到 1 mL 注射器。
- 将大鼠置于诱导室中，并用异氟烷（空气中1.4%;1.2mL / min）麻醉。将异氟醚流切换到立体定位框架并维持通过面罩输送的麻醉。用剃须刀去除老鼠后头和脖子上的皮毛。
- 用耳杆固定大鼠的头部。将动物的头部垂直向下降低约45°，沿着立体定位框架的鼻杆向下移动（图2C）。检查动物的后头部，在枕骨突起和寰椎之间发现一个略微凹陷的菱形表面。
- 用 70% 乙醇擦拭该表面，以使其更明显并对其进行消毒。
- 将蝴蝶针垂直插入菱形凹陷表面的中心，插入大池进行脑脊液收集，直到通过切割成针头的塑料套保护尺寸来阻止运动（图2D）。轻轻拉回 1 mL 注射器活塞，让 CSF 缓慢流过针头。
- 将约100μL的CSF收集到聚合物管中（图2D）。避免进入血液或任何其他可见的污染。将聚合物管非常靠近蝶形针，并在此时切断管。
- 将透明（未受污染的）样品吸入注射器中。如果可见污染物进入收集管，请丢弃受污染的样品。
- 将样品排出到无菌的 0.2 mL 微管中，并在冰上储存长达 1 小时。
- 对动物头部的脑脊液戒断部位进行消毒。将大鼠从立体定位框架中取出并将其放回笼子中。
- 将 2 μL 样品留出用于质量控制。将样品的其余部分储存在-80°C下以进行进一步分析。
注意：在大鼠中，如果重复进行多次脑脊液抽取，则每次收集时抽出的推荐体积为100μL32。在该方案中，单次最多100μL脑脊液，在15天内在单个动物中最大撤出5倍。
10. 样品质量的分光光度法分析
注意：正确收集脑脊液和血浆样品后，样品即可进行分光光度计分析，不需要任何特殊处理。通过紫外分光光度法在414nm处测量血红蛋白吸光度，以评估样品中的溶血风险。在大鼠样品中使用截止吸光度值为0.25。该限值的选择可能取决于后续的qPCR分析及其对sncRNAs定量的具体要求。
- 打开紫外分光光度计。选择在414 nm的单个波长下对PLASMA或CSF进行吸光度测量的方法。单击 “下一步”。
- 用纯净水冲洗 1 毫米比色皿。将 5 μL 70% 乙醇放在比色皿测量点上。用纸巾擦干，然后用无绒纸巾擦拭。检查它是否完全透明。
- 将 1.5 μL 纯净水放入 1 mm 比色皿中并关闭。将比色皿插入分光光度计的测量室，然后单击 空白按钮测量 空白样品吸光度。检查 414 nm 处的吸光度值是否为 0.000。
- 用纸巾擦干比色皿，然后用无绒纸巾清洁。检查它是否完全透明。
- 将 1.5 μL 样品放入 1 mm 比色皿中并关闭。将比色皿插入分光光度计的测量室。测量样品，单击 “样品” 按钮。检查样品在414nm处的吸光度并对其进行注释。
- 继续定量所有可用样品中的血红蛋白吸光度。在任何血浆或脑脊液样本之前测量空白样品，方法是交替单击 空白 和 样品 按钮。
- 在-80°C下保存A414nm <0.25的样品，如果A414nm>0.25，则丢弃样品。
- 依次用纯净水和 70% 乙醇冲洗 1 毫米比色皿。擦干比色皿。
- 将空比色皿关闭到测量室中以防止其除尘。关闭分光光度计。
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Representative Results
在 9 只对照组和 18 只慢性癫痫大鼠中进行的不同 CSF 和抽血手术的结果，均在 SE 后 1 个月植入电极，以成功率报告。植入后，对所有大鼠进行视频脑电图监测1个月，在此期间，在实验的最后两周（即在SE后第52、55、58、61和64天）每3天抽取5次脑脊液加血。来自不同动物的多次拔出的数据用于比较双头植入物捐赠大鼠（插管用于脑脊液退出）的脑脊液采集成功率与仅栓系或遥测电极植入动物的脑脊液采集成功率（通过大池穿刺进行）（表1）。在不同的动物中，评估了真空采血或尾挤对血浆样品质量的影响（表2）。为此，使用414 nm处的紫外分光光度法分析来检测游离血红蛋白。对于统计分析，使用商业软件，并使用 Kruskal-Wallis 或单因素方差分析与事后 Tukey 的多重比较检验（p<0.05 被认为具有统计学意义）。数据表示为SEM±均值。
置管和穿刺大鼠多次脑脊液取样的成功率
在 2 周内对 3 组大鼠进行 5 次脑脊液采样：（i） 插管和系留电极植入大鼠（CT 动物组）;在这些研究中，当脑脊液未麻醉并在视频脑电图下自由移动时，通过假引导套管和 PTFE 管接头到 1 mL 注射器进行脑脊液抽取;（ii）穿刺（步骤9）和拴留电极植入大鼠（PT组）;（iii）穿刺和遥测电极植入大鼠（PTe组）。每组共使用9只动物（6只癫痫大鼠和3只对照大鼠）。评估了超过 5 次的成功收集次数。穿刺大鼠的成功率相似：86.7%±5.8%，遥测电极植入动物为88.9%±4.8%。相反，在插管大鼠中，即使没有显着差异，该比率也降低（71.1%±8.9%， 表1）。这些结果表明，动物头部的套管可能会干扰重复的脑脊液取样并影响纵向研究。穿刺技术更适合电极植入动物的多次脑脊液抽取。
真空和尾液挤奶对血浆采集方法的影响
在 SE 后第 52、55、58、61 和 64 天从 9 只大鼠（6 只癫痫大鼠和 3 只对照大鼠）中收集 5 次血液，并通过 414 nm 处的紫外分光光度法评估血浆质量。为了获得每只大鼠的第一个样品，采用连接到1 mL注射器的21G蝶形针头进行真空抽取。对于第二个样品，在同时挤奶尾部时采用液滴抽取和21G蝶针系统。为了获得第 3-5 个样品，使用了不挤奶尾部的液滴提取程序（如步骤 9 中所述）。
当采用真空时，血浆在目视检查下呈粉红色，9只大鼠样品的平均吸光度值为0.647±0.067（表2，图3）。如果在手术过程中采用尾部挤奶，则获得类似的结果：粉红色血浆，平均吸光度为0.620±0.043（表2，图3）。相比之下，使用重力液滴抽取和 21G 蝶针系统，平均血浆吸光度值显着降低（58 dpSE 时为 0.226 ± 0.017;61 dpSE 时为 0.223 ± -0.09;64 dpSE 时为 0.226 ± 0.018;表2，图3）与真空挤奶或尾挤方法有关。此外，液滴血浆样品主要是透明的。较高的吸光度值（52 和 55 dpSE）与样品的粉红色相关（数据未显示）。这些结果可能表明，最后一种方法是获得非常高质量的样品进行分析的最佳方法。
图 1：血浆采样工作流程的关键步骤。 （A）抽血和大鼠在立体定位框架中所需的材料，准备收集;（乙、丙）将 21G 蝴蝶针插入侧尾静脉，并用抗凝剂将血滴从收集管壁上落下。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：脑脊液 （CSF） 采样工作流程的关键步骤。 （A）采集前不久脑脊液抽取和立体定位框架中的大鼠所需的材料;（B）将23G蝶形针的制备方式切开其塑料套筒保护，使裸针的末端暴露7毫米，以确保正确穿透大池;（C）在退出过程中，大鼠头部向下倾斜45°。（D） 在菱形部位放大，将蝴蝶针插入大池中。注意导管中上升的脑脊液，由标记的尖端指示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：血浆样品的质量评估。 使用不同方法在 5 个时间点（癫痫持续状态后 52、55、58、61 和 64 天，dpSE）通过紫外光谱法在 9 只动物的血浆样品中测量游离血红蛋白在 414 nm 处的溶血程度：第 52 天 - 真空技术;第 55 天 - 尾部挤奶;第 58-64 天采用下降技术。与真空挤奶和尾挤方法相比，通过滴液技术获得的血浆中游离血红蛋白的降低是显着的（*p <0.05，根据单因素方差分析和事后Tukey的多重比较检验）。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：脑脊液戒断的成功率。 比较三组实验动物重复停用脑脊液的成功率，以 5 天内成功停药的百分比表示。值 1 用于成功提取> 100 μL 透明 CSF;零值分配给 100 μL <和/或 CSF 不明确的退出。缩写：N/A - 由于取样过程中套管丢失而无法收集（仅限 CT 动物）;CT - 空管系留;PT - 被刺穿的系留;PTe - 植入的刺穿遥测电极。 请按此下载此表格。
表2：血浆样本溶血的评估。 使用三种不同的血液取样方法在 5 个时间点进行溶血测量的结果：第 52 天 - 真空技术;第 55 天 - 尾部挤奶;第 58-64 天 下降技术。吸光度值>0.3与样品的粉红色相关。 请按此下载此表格。
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Discussion
目前的工作说明了一种易于掌握的大鼠脑脊液和采血技术，该技术不仅可能对癫痫模型的研究有用，而且对其他神经系统疾病或疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化症）的研究也很有用。在癫痫研究中，当追求不同可溶性分子水平与癫痫发作活动之间的相关性时，两种采样程序与视频脑电图相结合都是理想的。出于这个特定原因，采用了连续的视频脑电图记录：i） 为了正确诊断癫痫或 ii） 监测疾病进展的不同阶段，和/或 iii） 将采样与自发性癫痫发作的发生相关联。这种采样技术可以在麻醉的大鼠中进行，从而产生最小的压力。
关键步骤、故障排除、方法限制
该协议有一些关键的技术步骤。首先，在第一次尝试时可能很难找到正确的脑脊液采集位置。如果操作者在第一次尝试时错过了大池，则任何后续试验都将受到血液污染，因为动物会因针头伤口而流血。从这个角度来看，收集的成功很大程度上取决于操作员的技能。其次，抽血的一些步骤需要特别注意。特别是，如果操作者用乙醇用力摩擦尾部，如果用于尾静脉血管舒张的水温度高于42°C，或者如果收集管中的血液与抗凝剂混合得太用力，则溶血的风险很高。慢性癫痫动物采血的另一个特点是它们的心动过缓对血液从尾静脉滴出的速度的影响33.如果速度太慢，血液可能会凝固在收集管壁上。为了避免这个问题，一种选择是将采样分成两个收集管，减少血液/管的体积。最后，癫痫研究固有一个陷阱。取样前动物操作引起的压力可能会诱发癫痫发作，这反过来又可能干扰所研究的分子水平34。只要有可能，将麻醉诱导室放入家庭笼子中，让动物自发进入笼子。作为对拟议方案的修改，限制器可用于在没有异氟烷麻醉的情况下进行抽血。然而，这可以在遥测中完成，但不能在系留动物中完成，因为系留的大鼠可能会在此过程中失去头部植入物。
拥有训练有素的操作员并尽最大努力避免压力，本协议的唯一限制是可以在不损害动物健康的情况下提取的最大体积。根据现行标准，建议在单个动物中收集最多 100 μL 的 CSF，持续 4 次，持续 15 天32。同样，建议在单次采样中收集少于 10% 的总血容量，并在 28 天内收集少于 15% 的总血容量30,31。
该方法与其他技术的比较
与现有的替代方法相比，所提出的时间分辨脑脊液和血浆采样方法具有几个优点。首先，如果与系留脑电图相结合，与插管系统相比，用于对癫痫大鼠脑脊液进行脑脊液采样的脑池穿刺具有较低的头部植入物丢失风险。与穿刺手术相比，通过牙科水泥（对于动物头部来说笨重而沉重）连接到电极的套管，虽然通过反复附着/脱离脑脊液抽取，但在多天的取样中更容易丢失。事实上，成功率结果表明，一些置管动物（N/A）没有到达先进的采样时间点，因此它们各自的样本丢失了（表1）。此外，穿刺方法似乎优于空管方法，具有更好的无菌性和减少脑膜反应，脑脊液中细胞和白蛋白含量的增加有限，正如先前其他 22,35,36 所记录的那样。脑脊液白细胞和白蛋白污染的程度对于用于癫痫生物标志物定量的方法的有效性可能很重要35.其次，用于重复测量的血浆取样的自由落体滴落方法优于任何其他戒断方法，因为它不是终末期（非恢复），不像斩首、心脏穿刺、腹部/胸腔血管或眼眶后戒断，并且允许多次采血。它比许多尾静脉血液真空抽取技术更简单，因为它不需要管路28,37 并产生高质量的无溶血血浆样本，用于进一步的 sncRNA 分析，重点是识别癫痫发生的推定生物标志物38。当采用滴采样技术或避免尾部挤奶时，样品中游离血红蛋白的缺失通过血浆样品的低吸光度结果（表2）得到证实，这与先前发表的适用于评估sncRNA血浆含量的程序一致39,40。
应用和未来发展方向
上述方法可用于测量任何神经系统疾病模型中感兴趣的可溶性分子。一个具体的例子是生物液体取样，用于识别潜在/推定的癫痫生物标志物。为癫痫患者发现这些生物标志物，尤其是预后和易感性/风险生物标志物，迫切需要未得到满足的医学需求，因为它们尚不存在。
总之，本方案在大鼠（包括癫痫大鼠）中是可行的，并且对于训练有素的个体易于启动。此外，它允许在符合 3R 原则（即替换、减少和改进）41 的纵向研究中进行多次高质量采样。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了欧盟地平线 2020 工作计划（称为 H2020-FETOPEN-2018-2020）的赠款支持，赠款协议 964712 （PRIME; 给 M. Simonato）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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