Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Prøveudtagning af cerebrospinalvæske og blod fra lateral halevene hos rotter under EEG-optagelser

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

Protokollen viser gentagne cerebrospinalvæske og blodsamlinger fra epileptiske rotter udført parallelt med kontinuerlig video-elektroencefalogram (EEG) overvågning. Disse er medvirkende til at udforske mulige forbindelser mellem ændringer i forskellige kropsvæskemolekyler og anfaldsaktivitet.

Abstract

Fordi sammensætningen af kropsvæsker afspejler mange fysiologiske og patologiske dynamikker, opnås biologiske væskeprøver almindeligvis i mange eksperimentelle sammenhænge for at måle molekyler af interesse, såsom hormoner, vækstfaktorer, proteiner eller små ikke-kodende RNA'er. Et specifikt eksempel er prøveudtagning af biologiske væsker i forskningen af biomarkører for epilepsi. I disse undersøgelser er det ønskeligt at sammenligne niveauerne af molekyler i cerebrospinalvæske (CSF) og plasma ved at trække CSF og plasma parallelt og overveje prøvetagningens tidsafstand fra og til anfald. Den kombinerede CSF og plasmaprøvetagning kombineret med video-EEG-overvågning i epileptiske dyr er en lovende tilgang til validering af formodede diagnostiske og prognostiske biomarkører. Her beskrives en procedure med kombineret CSF-tilbagetrækning fra cisterna magna og blodprøvetagning fra den laterale halevene hos epileptiske rotter, der kontinuerligt overvåges video-EEG. Denne procedure giver betydelige fordele i forhold til andre almindeligt anvendte teknikker. Det tillader hurtig prøveudtagning med minimal smerte eller invasivitet og reduceret anæstesitid. Derudover kan det bruges til at opnå CSF- og plasmaprøver i både tøjrede og telemetri EEG-registrerede rotter, og det kan bruges gentagne gange på tværs af flere dages eksperiment. Ved at minimere stress på grund af prøvetagning ved at forkorte isofluranæstesi forventes foranstaltningerne mere nøjagtigt at afspejle de sande niveauer af undersøgte molekyler i biofluider. Afhængigt af tilgængeligheden af et passende analytisk assay kan denne teknik anvendes til at måle niveauerne af flere forskellige molekyler, mens EEG-registrering udføres på samme tid.

Introduction

Cerebrospinalvæske (CSF) og blodprøvetagning er vigtige for at identificere og validere biomarkører for epilepsi i både præklinisk og klinisk forskning 1,2. I dag fokuserer diagnosen epilepsi og det meste af forskningen på epilepsibiomarkører på EEG og neuroimaging 3,4,5. Disse tilgange har imidlertid flere begrænsninger. Bortset fra rutinemæssige hovedbundsmålinger kræver EEG i mange tilfælde invasive teknikker som dybdeelektroder6. Hjernebilleddannelsesmetoder har dårlig tidsmæssig og rumlig opløsning og er relativt dyre og tidskrævende 7,8. Af denne grund ville identifikation af ikke-invasive, billige og biofluidbaserede biomarkører være et meget attraktivt alternativ. Derudover kan disse biofluid biomarkører kombineres med tilgængelige diagnostiske tilgange for at skærpe deres forudsigelighed.

Patienter diagnosticeret med epilepsi indsendes rutinemæssigt til EEG 9,10 og blodprøvetagning 11,12,13,14, og mange også til CSF-tilbagetrækning for at udelukke livstruende årsager (dvs. akutte infektioner, autoimmun encephalitis)15. Disse blod- og CSF-prøver kan bruges i klinisk forskning, der sigter mod at identificere biomarkører for epilepsi. For eksempel har Hogg og kolleger fundet ud af, at en stigning i tre plasma tRNA-fragmenter går forud for anfaldsforekomst i human epilepsi14. Tilsvarende kan interleukin-1beta (IL-1β) niveauer i human CSF og serum, udtrykt som forholdet mellem IL-1β niveauer i CSF over serum, forudsige posttraumatisk epilepsiudvikling efter traumatisk hjerneskade16. Disse undersøgelser fremhæver vigtigheden af prøveudtagning af biofluider til forskning i epilepsibiomarkører, men de står over for flere begrænsninger, der er iboende for kliniske forsøg, f.eks. den medstiftende faktor for antiepileptiske lægemidler (AED'er) i blod, den hyppige mangel på ætiologiinformation, utilstrækkelig kontrol, beskedent antal patienter og andre 17,18.

Præklinisk forskning giver andre muligheder for at undersøge molekyler i biofluider som potentielle biomarkører for epilepsi. Faktisk er det muligt at trække plasma og / eller CSF fra dyr, mens du udfører EEG-optagelser. Desuden kan prøveudtagning udføres gentagne gange over flere dage af eksperimentet, og en række alders-, køns- og epileptiske fornærmelsesmatchede kontroller kan bruges til at forbedre undersøgelsens robusthed. Her beskrives en fleksibel teknik til opnåelse af CSF fra cisterna magna med parallel tilbagetrækning af plasma fra halevenen hos EEG-overvågede rotter detaljeret. Den præsenterede teknik har flere fordele i forhold til alternative metoder. Ved at bruge en sommerfuglenålstilgang er det muligt at indsamle CSF flere gange uden at gå på kompromis med funktionen af EEG-elektroder eller lignende hovedimplantater. Dette repræsenterer en forfining af intratekale kateterudtagningsprocedurer, som er forbundet med en relativt høj infektionsrisiko. Derudover er den rapporterede fritfaldsmetode, der anvendes til blodindsamling, bedre end andre tilgange til tilbagetrækning af haleveneblod på grund af den stærkt reducerede risiko for hæmolyse på grund af det faktum, at blod ikke passerer gennem slanger, og der ikke påføres vakuumtryk. Hvis det udføres under strenge bakteriefrie forhold, er der en særlig lav risiko for infektion for dyr. Derudover kan prøveudtagningen gentages flere gange ved at starte blodudtagningerne i slutningen af dyrenes haler. Sådanne teknikker er lette at mestre og kan anvendes i mange prækliniske undersøgelser af lidelser i centralnervesystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer er godkendt af University of Ferrara Institutional Animal Care and Use Committee og af det italienske sundhedsministerium (autorisation: D.M. 603/2022-PR) i overensstemmelse med retningslinjerne i De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv af 24. november 1986 (86/609/EØF) om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål. Denne protokol er specifikt justeret for yderligere kvantitative polymerasekædereaktionsanalyser (qPCR) af små ikke-kodende ribonukleinsyre (sncRNA'er) i rotte-CSF og plasma opnået under EEG-kontrol hos epileptiske dyr. Efter eget valg kan du se den relaterede JoVE-video for en bedre forståelse og forbedringer af operationen 19,20,21.

1. Forberedelse af dyr til kirurgisk implantation af elektroder eller telemetre

BEMÆRK: Den stereotaksiske kirurgiske teknik varierer afhængigt af det anvendte EEG-system. Følgende metodeafsnit indeholder en beskrivelse af trin, der er fælles for de to typer operationer.

  1. Brug Sprague-Dawley (SD) rotter (hanner, 7-8 uger gamle, vejer 250-290 g) vedligeholdt i overensstemmelse med lokale love for pleje og brug af forsøgsdyr. Opstalde dyrene under standardbetingelser med fri adgang til mad og drikkevand.
  2. Fortsæt med at håndtere rotterne i et par dage før operationen og de eksperimentelle protokolprocedurer.
  3. Brug et stereotaksisk apparat til implantation af elektroder eller telemetre. Følg de moderne standarder for aseptiske operationer. Brug sterile og velfungerende elektroder og sendere.
  4. Barber dyrets hoved med den elektriske barbermaskine. Inducer anæstesi hos dyret med blandingen af ketamin (45 mg / kg) og xylazin (7,5 mg / kg) administreret intraperitoneal (i.p.), tilsæt derefter isofluranbedøvelsen (1,4% i luft; 1,2 ml / min) leveret gennem en ansigtsmaske og fastgør dyrets hoved i stereotaksapparatet.
  5. Sørg for tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at teste pedaludtagningsrefleks efter fodpudeklemme på begge dyrs bagfødder og opretholde isofluranbedøvelse indtil operationens afslutning. Kontroller regelmæssigt bedøvelsesdybden for hele procedurens varighed.
  6. Påfør en tilstrækkelig mængde øjensalve på begge dyrs øjne for at forhindre hornhindeskader på grund af tab af blinkrefleks forårsaget af anæstesi.
  7. Rens dyrets hovedbund grundigt med flydende desinfektionsmiddel og lav et langsgående 2 cm langt snit ved hjælp af en steriliseret skalpel. Åbn hovedbunden og påfør kirurgiske klip på hudflapperne for at holde den åben.
  8. Fjern forsigtigt periosteum for at udsætte bregma og det område af kraniet, gennem hvilket optageelektroden vil blive indsat.

2. Kirurgisk implantation af bundne elektroder

BEMÆRK: Før fastlæggelsen af punkterings-CSF-tilbagetrækningsproceduren for denne protokol (se trin 9 for detaljer) blev der udført gentagne CSF-tilbagetrækninger via guidekanyle hos nogle få frit bevægelige ikke-bedøvede rotter. Kanylerede dyr implanteret med fastgjorte elektroder blev brugt til at evaluere virkningen af dobbelthovedimplantater på langvarig EEG-registrering kombineret med flere CSF-prøver. I disse specifikke eksperimenter blev rotter implanteret med en dummy guide kanyle placeret i cisterna magna, hvis spids blev indsat 7 mm i det stereotaktisk i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller22. Metoder til dobbeltimplantatkirurgi lignede dem, som nogle arbejdere tidligere har vedtaget for mikrodialyseguidekanyler og fastgjorte elektrodeimplantation23,24.

  1. Brug den ene arm på den stereotaksiske ramme, monter elektrodeholderen på den, og sæt elektroden lodret ind i holderen. Flyt elektrodespidsen nøjagtigt over bregmaen. Skriv ned de anteroposterior og mediolaterale koordinater for bregma og oversæt dem til de ønskede koordinater.
  2. Sænk elektroden, indtil dens spids næsten rører kraniet. Marker borestedet og bor kraniet på det markerede sted. Pas på ikke at skade hjernen og meninges.
  3. Lav fire eller flere huller til forankringsskruer og skru dem ind i kraniet. Vær opmærksom på elektrodens størrelse, når du laver hullerne til forankringsskruer. Elektrodestørrelsen bør ikke forstyrre de placerede forankringsskruer.
  4. Sænk langsomt den stereotaktiske arm, der bærer elektroden på den dorsoventrale akse, kom ind i hjernevævet og stop i den ønskede position. Fastgør elektrodejordledningen omkring en af skruerne, der er skruet ind i kraniet.
  5. Sæt methacrylcementen på elektroden og skruer, der dækker ca. halvdelen af elektrodepiedestalhøjden. Lad den øverste halvdel af elektroden, som passer til tøjringstrådens ende, være bar.
  6. Frigør elektroden fra holderen, og løft den stereotaktiske arm. Frigør dyret fra stereotaxisk apparat og giv det postoperativ pleje.
  7. Placer dyret i et separat genopretningsbur og observer det hvert 10. minut, indtil det er vågent og ambulant. Returner dyret til dets standardbur og til et andet ikke-bedøvet dyrs firma først, når det er fuldt genoprettet.

3. Kirurgisk implantation af telemetrene

BEMÆRK: Brug kun sterile telemetre. Hvis telemetre genbruges, skal du rengøre og sterilisere dem før operationen i henhold til producentens anvisninger. I denne protokol blev der anvendt et datalogi internationalt (DSI) telemetre til EEG-optagelse.

  1. Tænd telemetrisenderen ved hjælp af en magnet, og test signalet med en AM-frekvensradio. Kontroller for et stærkt og klart signal før operationen. Kassér om nødvendigt de dårligt fungerende telemetre.
  2. Forbered telemeterledningerne ved at forkorte disse til optimale længder for voksne rotter. Træk silikonebelægningen tilbage på to (negative og positive) ledninger, idet ca. 5 mm af den spiralformede stålledning blotlægges. Opret et sløjfehåndtag på ca. 2 mm i længden og 1 mm i bredden ved spidsen af ledningerne.
  3. Barber dyrets flanke under og bag venstre skulder. Desinficer operationsområdet med desinfektionsmiddel baseret på stabiliserede peroxider og kvaternær ammoniumaktivitet. Lad desinfektionsmidlet virke i 15 min.
  4. Lav ca. 2 cm sideværts snit lige bag dyrets skulder og lav en subkutan lomme på ca. 5 cm3 plads til senderplaceringen. Placer senderen parallelt med kroppens lange akse med ledningerne rettet mod rostral retning.
  5. Fastgør senderen til indersiden af den subkutane lomme med en 3-0 bomuldsutur. Ved hjælp af en stump saks oprettes den subkutane tunnel (ca. 2,5 cm lang) gennem dyrets flanke og hals, hvorved senderlommen forbindes med midterlinjesnittet i dyrets hovedbund i trin 1.6.
  6. Tag begge telemetreledninger med tang og træk dem op gennem tunnelen, så de stikker ud fra hovedbundens snitudløb. Hold ledningerne ud af hovedbundens snit med sårklip.
  7. Brug den stereotaksiske ramme til at individualisere de ønskede koordinater for positiv (rød) bly, og bor hullet ind i kraniet for den positive blyspids (svarende til trin 2.1.). Lav endnu et hul til forankring af skruen opad til talerstolen og skru den ind i kraniet.
  8. Indsæt spidsen af positivt bly under kraniet og dura og læg det ned på hjerneoverfladen. Tilslut den sløjfede spids af negativ (hvid) ledning på skruen. Sæt en lille mængde methacrylcement omkring det positive blyudløb og det negative bly for at immobilisere dem på kraniet.
  9. Fastgør ledningerne til den indre væg af kraniehuden med en 3-0 bomuldsutur. Sørg for, at de faste ledninger og fastgørelsesutur ikke forstyrrer stedet for CSF-tilbagetrækning (dvs. en depressibel overflade med udseende af en rhombus mellem den occipitale fremspring og atlasens rygsøjle).
  10. Luk hovedbundens snit og flankesnit ved hjælp af en 3-0 bomuldsutur. Påfør desinfektionsmidler på sårene. Først efter at disse er tørret, påføres en antibiotisk creme på de suturerede sår.

4. Postoperativ pleje

  1. Overvåg dyrene i ca. 1 time derefter operationen, indtil de er oprejst og bevæger sig rundt i buret. Opbevar dem på en varmepude for at forhindre hypotermi. Administrer dyr med et systemisk antibiotikum for at forhindre infektion og et systemisk smertestillende middel for at forhindre postkirurgisk smerte i 2-3 dage.
  2. Lad rotter komme sig i mindst 7 dage efter kirurgiske procedurer. Overvåg dyrene mindst én gang dagligt i 3 dage for tegn på smerte eller angst.

5. Status epilepticus induktion hos rotter

BEMÆRK: For en detaljeret protokol for status epilepticus (SE) induktion, der er nødvendig for at reproducere mesial temporal lobe epilepsi (mTLE) hos rotter, henvises til Guarino et al.25.

  1. Efter en uges postkirurgisk bedring fordeles dyrene tilfældigt i grupper: (i) kontroldyr, der modtager køretøj, og (ii) epileptiske dyr, der får pilocarpin. Brug et forholdsmæssigt højere antal dyr til den epileptiske gruppe, da ikke alle de pilocarpin-administrerede rotter vil overleve eller udvikle SE.
  2. Dagen før SE-induktionen gives dyrene en enkelt dosis på 127 mg/kg lithiumchlorid opløst i 0,9% saltvand (3M) som et volumen på 1 ml/kg med gastrisk sonde. Administrer dyrets lithium, hvilket øger pilocarpineffekten26, ca. 14 timer før induktion af SE for at reducere variabiliteten i tid til SE-debut.
  3. Ca. 14 timer efter administration af lithium gives rotterne en enkelt injektion af methylscopolamin (1 mg/kg, subkutant).
  4. Præcis 30 minutter efter administration af methylscopolamin gives rotterne en enkelt injektion af pilocarpin (50 mg/kg, i.p.) for at inducere SE. Giv methylscopolamin og vehikel (0,9% NaCl-opløsning) til bekæmpelse af rotter.
    1. Pilocarpin injektion inducerer typisk adfærd hos dyr: tidlige partielle anfald (bevægelser af vibrissae og hovednikker inden for 5 minutter efter pilocarpin administration) udvikler sig til tilbagevendende generaliserede kramper (SE) inden for 25-30 min. For rotter, der ikke udvikler SE inden for 30 minutter, skal du administrere en ekstra dosis pilocarpin (25 mg/kg, i.p.), og hvis de stadig ikke udvikler SE, skal du udelukke dem fra studiet (SE non-responders).
  5. Overhold og score anfaldsadfærden hos rotter hvert 5. minut begyndende umiddelbart efter pilocarpininjektionen. Brug Racine-skalaen til at score27.
  6. Afbryd SE 2 timer efter indtræden ved i.p. administration af en cocktail af lægemidler: diazepam (10 mg / kg), phenobarbital (25 mg / kg) og scopolamin (1 mg / kg).
  7. Giv rotterne denne cocktail igen efter 4 timer. Endelig, efter yderligere 4 timer, giv rotterne i.p. den sidste blanding af lægemidler (diazepam 10 mg / kg plus scopolamin 1 mg / kg) for helt at stoppe anfaldsaktiviteten.
  8. Injicer i.p. dyrene med saltvand (1 ml 0,9% NaCl-opløsning, pH justeret til 7,0) og fodre dem med en 10% saccharoseopløsning i 2-3 dage efter SE for at favorisere genopretning fra vægttabet, der følger SE.
  9. Tildel overlevende dyr efter SE tilfældigt til forskellige forsøgsgrupper i henhold til kravene i den specifikke forsøgsprotokol. Brug følgende inklusions-/eksklusionskriterier til yderligere forsøg med epileptiske rotter: udvikling af konvulsiv SE inden for 1 time efter administration af pilocarpin, vægtøgning i den første uge efter SE og korrekt placering af elektroden i hjerneområdet af interesse for EEG-registreringer25.

6. Tøjret video-EEG hos epileptiske rotter og analyser af anfaldsaktivitet

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver forsøgsproceduren til registrering af EEG-signaler i enkelthusede, frit bevægelige rotter under standardbetingelser. Buret bør ikke indeholde genstande, hvor dyret eller optagekablet kan sidde fast. Afhængigt af det videnskabelige spørgsmål, der skal behandles, kan flere parametre analyseres. I tilfælde af epilepsiforskning screenes EEG-sporene for at genkende elektriske og motoriske anfald. De mest almindelige parametre, der bruges til at identificere et anfald, er amplitude, frekvens og varighed af paroxysmal elektrisk aktivitet.

  1. Anbring dyret i et rent bur i registreringsrummet for at tillade tilvænning og reducere stress forårsaget af det nye miljø. Placer dyrets bur i et Faraday-bur for at undgå forurening af EGG-signalet med det elektromagnetiske miljøfelt.
  2. Tilslut den ene ende af optagekablet til optageenheden. Brug et voltmeter til at måle det elektriske potentiale og skelne mellem jord- og referenceelektroder.
  3. Tilslut den anden ende af optagekablet til elektroden, der er fastgjort på rottens hoved. Til dette formål skal du holde cementdækslet på dyrets hoved, når du sætter kabelstikket i elektrodestikket, og undgå at lægge pres på rottens hoved.
  4. Modvægt optagekablets vægt for at tillade dyrets frie bevægelse og samtidig forhindre risikoen for at vride kablet. For at gøre dette skal du bruge en modvægtarm eller kommutatorer. Selvom optagekablet er kontrabalanceret, skal du placere maden inde i buret i stedet for i en foderholder, hvor dyrene skal rejse sig for at nå maden.
  5. Før du starter registreringen, skal du kontrollere alle de indstillinger, der bruges til at erhverve og behandle dataene fra EEG.
    BEMÆRK: Denne protokol giver ikke en introduktion til det apparat, der kræves for at udføre EEG-optagelsen, men der bør anvendes passende filtrerings- og samplingshastigheder for at undgå artefakter og støj i EEG-signaler.
    1. For et rutinemæssigt eksperiment skal du indstille samplinghastigheden til 500 Hz og forstærkningsforstærkningen til 5000x. Filtrer signalet ved hjælp af et 0,005 Hz filter ud over et hakfilter for at kassere den omgivende elektriske aktivitet i 50 Hz-båndet (specifikt for europæiske lande).
  6. Start både video- og EEG-optagelser, og sørg for, at sporene matcher et forventet EEG-signal ved at kontrollere effekten i bestemte frekvensbånd over tid. Der registreres en basisperiode, inden interventionerne i dyrene påbegyndes.
  7. Kontroller dyr og EEG-spor med jævne mellemrum. Det er ikke sjældent, at et optagekabel løsnes fra elektrodestikket i rottehovedet. Hvis dette sker, skal du tilslutte elektroden i rottehovedet til et optagekabel igen og kontrollere, om EEG-signalet er klart.
  8. Analyser EEG-signalet manuelt eller automatisk ved hjælp af kommercielt tilgængelig software. Hvis du analyserer manuelt, skal du screene gennem EEG-optagelse for at identificere anfaldslignende aktiviteter. Hvis der skal bruges software, skal du konfigurere nøgleparametre for en anfaldshændelse, såsom amplitude, frekvens og varighed af elektrisk aktivitet.
    BEMÆRK: Enkelt anfald kan karakteriseres ved en elektrisk aktivitet med en amplitude 3x højere end baseline, frekvens lig med eller højere end 5 Hz og varighed på mindst 5 s22.
  9. Uanset hvilken metode der anvendes, skal du bekræfte de potentielle konvulsive anfald ved at kontrollere den synkroniserede videooptagelse, der indsamles samtidigt med EEG.

7. Telemetrivideo-EEG hos epileptiske rotter og analyse af anfaldsaktivitet

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver den eksperimentelle procedure til registrering af radiotelemetri EEG-signaler i enkelthusede, frit bevægelige rotter under standardbetingelser. Protokollen er baseret på et kommercielt tilgængeligt telemetrisystem. Imidlertid adskiller flere telemetrisystemer sig lidt i deres funktionelle og tekniske specifikationer. Systemet bør vælges afhængigt af laboratoriekrav og forskningsmål.

  1. Placer dyrets hjemmebur over signalmodtageren. Tilslut signalmodtageren til dataindsamlingssystemet og dette til en computer med anskaffelsessoftwaren.
  2. Tænd for radiofrekvenstelemetriimplantatet ved at placere en magnet i nærheden af telemeteret, der er indsat i rotteflanken. Test signalet ved hjælp af en radioenhed. Brug en universel radioenhed til at teste telemetrene, og hør et klart bip angiver, at telemeteret er aktiveret, mens en sydende lyd indikerer et inaktiveret telemeter.
    BEMÆRK: Radiofrekvenssenderbatteriets levetid skal tages i betragtning, før varigheden af optagelserne defineres.
  3. Konfigurer anskaffelsessoftwaren, og synkroniser telemetrisignalet og videosystemet for samtidig at hente EEG- og videodata. Tildel en signalmodtager til hver implanteret sender, og indstil senderens kalibreringsværdier. Indstil samplinghastigheden til 1000 Hz, støjdetektering mellem -500 mV og +500 mV og integrationsintervallet til 100 ms. Brug ikke lav- og højpasfiltre.
  4. Start telemetri og videooptagelser. Udfør langsigtet baseline-optagelse, før du erhverver den epileptisk-lignende aktivitet. Analyser EEG-signalet som beskrevet i trin 6.8 og 6.9.

8. Procedure for blodindsamling fra halevenen

SEDDEL. Vakuumblodopsamlingssystemet består af en sommerfuglenål (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). Blodindsamlingsteknikken kan let udføres af en operatør, og proceduren tager ca. 5 minutter.

  1. Overtræk sommerfuglenålen og dens slange med 1% K2EDTA i destilleret vand kort før udtagningerne, dvs. træk K2EDTA-opløsningen ind og fjern den fra systemet ved hjælp af 1 ml sprøjten. Skær slangen lige bag nålen for at opsamle blod dråbe for dråbe uden aspiration (figur 1A).
  2. Anbring rotten i et induktionskammer og bedøm den med isofluran (1,4% i luft; 1,2 ml / min). Skift til den stereotaksiske ramme og vedligehold anæstesi gennem en ansigtsmaske. Sæt varmepuden under dyret, og hold en del af halen i direkte kontakt med puden.
  3. Flyt forsigtigt dyrets ryg til siden, så den laterale halevene holdes øverst.
  4. Dyp halen i varmt vand (42 °C) i 2 minutter for at udvide sidevenen. Tør halen af med 70% ethanol for at gøre venen mere synlig. Sæt varmt lys på halen ved hjælp af en almindelig glødepære.
  5. Indsæt 21G sommerfuglenålen i den laterale halevene med en dybde på 5 mm og en vinkel på 20°. Opsaml blod i et 500 μL vakuumopsamlingsrør, der indeholder 5 mgK2EDTA som antikoagulant (figur 1B, C).
  6. Fjern nålen og stop blodstrømmen ved at lægge pres på punkteringsstedet. Sæt rotten tilbage i sit hjemmebur.
  7. Vend forsigtigt røret 10x for at blande antikoagulant i blodet. Lav huller på ca. 1,5 cm dybde i isen for at rumme opsamlingsrørene. Sæt forsigtigt og lodret prøven på is.
  8. Blodprøven centrifugeres i en nedkølet centrifuge (4 °C) ved 1300 x g i 10 minutter for at separere plasma. Udfør denne procedure inden for højst 1 time.
  9. Tag ca. 200 μL plasma, undgå det røde og hvide blodlegemer. Sæt det udtrukne plasma i det 0,2 ml sterile mikrorør. Opbevares om nødvendigt ved 4 °C i op til 1 time efter centrifugering.
  10. 5 μL af prøven lægges til side til kvalitetskontrol. Prøven opbevares ved -80 °C indtil analysen.
    BEMÆRK: Brug ikke vakuumet, selvom det anbefales af nogle forskere28, eller malk halen under procedurerne beskrevet i trin 8.5 for at opnå mere blod, da det reducerer prøvekvaliteten til de næste sncRNA-kvantificeringsanalyser (se de repræsentative resultater for detaljer). Husk, at hos rotter er den maksimale mængde blod, der kan trækkes tilbage ad gangen, <10% af dets samlede blodvolumen (dvs. ca. 1,6-1,9 ml i en 250-300 g rotte) og <15% af det totale blodvolumen (ca. 2,64 ml) i 1 måned29. I denne protokol anvendes maksimalt 500 μL blodtapning ved en enkelt lejlighed for op til fem gange i et enkelt dyr30,31.

9. Procedure for opkrævning af FSR

SEDDEL. Teknikken kan nemt udføres af en enkelt operatør, og proceduren kræver ca. 2-4 min. De materialer, der anvendes til indsamling af CSF, er billige vakuum sommerfuglnåle til engangsbrug og ekstraktionsrør. I denne protokol anvendes et sommerfuglvinget infusionssæt forbundet til en steril sprøjte for at skabe vakuum (figur 2A).

  1. Klargør 23G sommerfuglenålen, og skær dens plastikhylsterbeskyttelse, så enden af den blotte nål er udsat med 7 mm for at forhindre, at den trænger mere end 7 mm dybt ind i cisterna magna under tilbagetrækning (figur 2B).
  2. Tilslut sommerfuglenålen udstyret med polymerslange til en 1 ml sprøjte.
  3. Anbring rotten i et induktionskammer og bedøvelse den med isofluran (1,4% i luften; 1,2 ml/min). Skift isofluranstrømmen til den stereotaksiske ramme og vedligehold anæstesi leveret gennem en ansigtsmaske. Fjern pelsen på rottens bageste hoved og hals med en barbermaskine.
  4. Fastgør rottens hoved med ørestænger. Dyrets hoved sænkes ca. 45° lodret, og næsestangen på stereotaksrammen bevæges ned (figur 2C). Undersøg dyrets baghoved og find en let deprimeret overflade med aspektet af en rhombus, mellem den occipitale fremspring og atlasryggen.
  5. Gnid denne overflade med 70% ethanol for at gøre den mere synlig og desinficere den.
  6. Indsæt sommerfuglenålen lodret i midten af den rombeformede deprimerede overflade i cisterna magna til CSF-indsamling, indtil bevægelsen er blokeret ved at skære i størrelse plasthylsterbeskyttelse af nålen (figur 2D). Træk forsigtigt 1 ml sprøjtestemplet tilbage for at lade CSF langsomt strømme gennem nålen.
  7. Ca. 100 μL af CSF samles i polymerrør (figur 2D). Undgå at komme ind i blod eller anden synlig forurening. Klem polymerslangen meget tæt på sommerfuglenålen, og skær slangen på dette tidspunkt.
  8. Træk den klare (ikke-kontaminerede) prøve ind i sprøjten. Kassér den kontaminerede prøve, hvis der kommer synlig kontaminering ind i opsamlingsslangen.
  9. Prøven presses ud i det sterile 0,2 ml mikrorør og opbevares på is i op til 1 time.
  10. Desinficere stedet for CSF tilbagetrækning på dyrets hoved. Fjern rotten fra stereotaksisk ramme og sæt den tilbage i buret.
  11. Sæt 2 μL af prøven til side til kvalitetskontrol. Resten af prøven opbevares ved -80 °C til yderligere analyse.
    BEMÆRK: Hos rotter, hvis flere CSF-tilbagetrækninger udføres gentagne gange, er det anbefalede volumen, der skal trækkes tilbage ved hver indsamling, 100 μL32. I denne protokol blev der foretaget maksimalt 100 μL CSF ved en enkelt lejlighed med 5x maksimal tilbagetrækning på 15 dage i et enkelt dyr.

10. Spektrofotometrianalyse af prøvens kvalitet

BEMÆRK: Efter korrekt indsamling af CSF- og plasmaprøver er prøverne klar til spektrofotometeranalyser og kræver ingen specifik håndtering. Mål hæmoglobinabsorbansen ved UV-spektrofotometri ved 414 nm for at evaluere hæmolyserisikoen i prøver. Der anvendes en afskåret absorbansværdi på 0,25 i rotteprøver. Valget af denne grænse kan afhænge af efterfølgende qPCR-analyse og dens specifikke krav til kvantificering af sncRNA'er.

  1. Tænd for UV-spektrofotometeret. Vælg metoden til absorbansmåling ved en enkelt bølgelængde på 414 nm for PLASMA eller CSF. Klik på Næste.
  2. Skyl 1 mm kuvetten med renset vand. Sæt 5 μL 70% ethanol på kuvettens målested. Tør med et køkkenrulle og gnid med fnugfrit silkepapir. Kontroller, om det er helt gennemsigtigt.
  3. Kom 1,5 μL renset vand i 1 mm kuvetten og luk den. Kuvetten indsættes i spektrofotometrets målekammer, og blindprøveabsorbansen måles ved at klikke på knappen Blank . Absorbansværdien ved 414 nm kontrolleres at være 0,000.
  4. Tør kuvetten med et køkkenrulle og rengør den med fnugfrit silkepapir. Kontroller, om det er helt gennemsigtigt.
  5. Sæt 1,5 μL af prøven i 1 mm kuvetten og luk den. Kuvetten indsættes i spektrofotometerets målekammer. Mål prøven ved at klikke på knappen Sample . Prøvens absorbans kontrolleres ved 414 nm, og den kommenteres.
  6. Fortsæt kvantificering af hæmoglobinabsorbans i alle tilgængelige prøver. Mål blindprøven foran enhver plasma- eller CSF-prøve ved at klikke alternativt på knapperne Blank og Sample .
  7. Prøverne opbevares med A414 nm < 0,25 ved -80 °C, og prøverne kasseres, hvis A414 nm > 0,25.
  8. Skyl 1 mm kuvetten med renset vand og 70% ethanol sekventielt. Tør kuvetten.
  9. Luk den tomme kuvette i målekammeret for at forhindre, at den støves af. Sluk for spektrofotometeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatet af forskellige CSF- og blodudtagningsprocedurer udført hos 9 kontrolrotter og 18 kroniske epileptiske rotter, alle implanteret med elektroder 1 måned efter SE, rapporteres med hensyn til succesrate. Efter implantation blev alle rotter video-EEG overvåget i 1 måned, hvor CSF plus blod blev trukket tilbage 5x hver 3. dag i løbet af de to sidste uger af eksperimentet (dvs. på dag 52, 55, 58, 61 og 64 efter SE; dpSE). Data fra flere tilbagetrækninger i forskellige dyr blev brugt til at sammenligne succesraten for CSF-indsamling hos rotter med dobbelt hoved (kanyleret til CSF-tilbagetrækning) med succesraten for CSF-indsamling (udført ved cisterna magna-punktering) i kun bundne eller telemetrielektroder implanterede dyr (tabel 1). Hos forskellige dyr blev virkningen af vakuumblodindsamling eller halemalkning på kvaliteten af plasmaprøver evalueret (tabel 2). Til dette formål blev UV-spektrofotometrianalyse ved 414 nm anvendt til påvisning af frit hæmoglobin. Til statistiske analyser blev der anvendt kommerciel software, og Kruskal-Wallis eller envejs ANOVA med post-hoc Tukeys multiple sammenligningstest blev anvendt (s<0,05 betragtes som statistisk signifikant). Dataene udtrykkes som et gennemsnit ± SEM.

Succesrate for flere CSF-prøver i kanylerede og punkterede rotter
CSF er blevet udtaget 5x inden for 2 uger i 3 grupper af rotter: (i) kanylerede og bundne elektrodeimplanterede rotter (CT-gruppe af dyr); i disse blev CSF-tilbagetrækningen udført via dummy guide kanyle og PTFE slangeled til 1 ml sprøjte, når de var ikke-bedøvede og frit bevægede sig under video-EEG; ii) punkterede (trin 9) og fastgjorte elektrodeimplanterede rotter (PT-gruppe) iii) punkterede og telemetrielektrodeimplanterede rotter (PTe-gruppe). Der blev anvendt i alt 9 dyr pr. gruppe (6 epileptiske rotter og 3 kontrolrotter). Antallet af vellykkede samlinger over 5 gange blev evalueret. Succesraten var den samme hos punkterede rotter: 86,7% ± 5,8% hos tøjrede og 88,9% ± 4,8% hos telemetrielektrodeimplanterede dyr. I stedet blev raten reduceret hos de kanylerede rotter, selvom den ikke var signifikant anderledes (71,1% ± 8,9%, tabel 1). Sådanne resultater indikerer, at kanylen på dyrenes hoveder kan forstyrre gentagne CSF-prøveudtagninger og kompromittere langsgående undersøgelser. Punkteringsteknikken er mere velegnet til flere CSF-udtagninger i elektroder implanterede dyr.

Virkningen af vakuum og halemalkning på plasmaopsamlingsmetoden
Blod blev indsamlet 5x fra 9 rotter (6 epileptiske og 3 kontrolrotter) på dag 52, 55, 58, 61 og 64 efter SE, og plasmakvaliteten blev evalueret for hæmolyse visuelt og ved UV-spektrofotometri ved 414 nm. For at opnå den første prøve i hver rotte blev vakuumudtagningen via en 21G sommerfuglenål fastgjort til en 1 ml sprøjte anvendt. Med den anden prøve blev dråbeudtagningen og 21G sommerfuglnålesystemet anvendt ved malkning af halen samtidigt. For at få 3.-5. prøve blev dråbeudtagningsproceduren uden malkning af halen (beskrevet i trin 9) brugt.

Ved anvendelse af vakuum var plasmaet lyserødt farvet under den visuelle inspektion, og den gennemsnitlige absorbansværdi for 9 rotters prøver var 0,647 ± 0,067 (tabel 2, figur 3). Lignende resultater blev opnået, hvis halemalkningen blev anvendt under proceduren: lyserødt plasma med 0,620 ± 0,043 gennemsnitlig absorbans (tabel 2, figur 3). I modsætning hertil blev de gennemsnitlige plasmaabsorbansværdier signifikant reduceret med tyngdekraftsaktiveret dråbetilbagetrækning og 21G sommerfuglenålesystem (0,226 ± 0,017 ved 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 ved 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 ved 64 dpSE; Tabel 2, figur 3) med hensyn til vakuum- eller halemalkningsmetoden. Desuden var dråbeplasmaprøverne hovedsageligt gennemsigtige. Højere absorbansværdier (52 og 55 dpSE) korrelerede med prøvernes lyserøde farve (data ikke vist). Disse resultater kan tyde på, at den sidste metode er den bedste til at få prøver af meget høj kvalitet til analyser.

Figure 1
Figur 1: De vigtigste trin i arbejdsgangen for plasmaprøvetagning. A) Materialer, der er nødvendige for udtagning af blod og rotter i stereotaksisk ramme, klar til opsamling. (B, C) Forstørrelser af halen med 21G sommerfuglnål indsat i den laterale halevene og bloddråben falder ned ad væggene i opsamlingsrøret med et antikoagulant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vigtige trin i arbejdsgangen for prøveudtagning af cerebrospinalvæske (CSF). A) Materialer, der er nødvendige for CSF-tilbagetrækning og rotte i stereotaxic-rammen, kort før indsamlingen. (B) 23G butterfly nål præparat ved at skære sin plasthylster beskyttelse, så enden af den bare nål er udsat i 7 mm for at sikre korrekt indtrængning i cisterna magna; (C) Rottehovedet hælder 45° nedad under tilbagetrækningen. (D) Forstørrelse på rhomboidstedet med en sommerfuglenål indsat i cisterna magna. Bemærk CSF, der stiger i slangen, angivet med spidsen af markøren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsevaluering af plasmaprøver. Hæmolysegrad målt ved 414 nm for frit hæmoglobin ved UV-spektroskopi i plasmaprøver af 9 dyr på 5 tidspunkter (52, 55, 58, 61 og 64 dages poststatus epilepticus, dpSE) ved hjælp af forskellige metoder: dag 52 - vakuumteknikken; dag 55 - halemalkningen; Dag 58-64 blev dropteknikkerne anvendt. Faldet i frit hæmoglobin i plasma opnået ved dråbeteknik sammenlignet med vakuum- og halemalkemetoder var signifikant (*p <0,05 ifølge envejs ANOVA og post-hoc Tukeys multiple sammenligningstest). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Succesrater for tilbagekøb fra FSR. Sammenligning af succesraterne for gentagne CSF-tilbagetrækninger i tre forsøgsgrupper af dyr udtrykt som en procentdel af vellykkede tilbagetrækninger over 5 dage. Værdien 1 blev tildelt vellykket tilbagetrækning af > 100 μL klar FSR; Nulværdien blev tildelt tilbagekøb < 100 μL og/eller uklare EFSR'er. Forkortelser: N/A - manglende indsamling på grund af tab af kanyle under prøveudtagningsproceduren (kun CT-dyr); CT - kanyleret tøjret; PT - punkteret tøjret; PTe - punkterede telemetrielektroder implanteret. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Evaluering af hæmolyse i plasmaprøver. Resultater af hæmolysemålinger på 5 tidspunkter ved hjælp af tre forskellige metoder til blodprøvetagning: dag 52 - vakuumteknikken; dag 55 - halemalkningen; Dag 58-64 Dråbeteknikkerne. Værdier >0,3 af absorbans korreleret med lyserød farve af prøver. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbejde illustrerer en let at mestre teknik til CSF og blodindsamling hos rotter, som kan være nyttig ikke kun til undersøgelser i modeller af epilepsi, men også af andre neurologiske tilstande eller sygdomme som Alzheimer, Parkinson eller multipel sklerose. I epilepsiforskning er begge prøveudtagningsprocedurer kombineret med video-EEG ideelle, når en sammenhæng mellem niveauerne af forskellige opløselige molekyler og anfaldsaktivitet forfølges. Af denne specifikke grund blev der anvendt en kontinuerlig video-EEG-optagelse: i) for korrekt diagnosticering af epilepsi eller ii) for at overvåge de forskellige faser af sygdomsprogressionen og/eller iii) for at korrelere prøveudtagning med forekomsten af spontane anfald. Sådanne prøveudtagningsteknikker kan udføres hos bedøvede rotter, hvilket forårsager minimal stress.

Kritiske trin, fejlfinding, metodebegrænsninger
Protokollen har nogle kritiske tekniske trin. For det første kan det være svært at finde det rigtige sted til CSF-indsamling ved første forsøg. Hvis operatøren savner cisterna magna ved første forsøg, vil ethvert efterfølgende forsøg være blodforurenet, da dyret vil bløde fra nålesåret. Fra dette synspunkt er succesen i samlingen stærkt afhængig af operatørens dygtighed. For det andet kræver nogle trin af blodudtagning særlig opmærksomhed. Især er der stor risiko for hæmolyse, hvis operatøren gnider halen for kraftigt med ethanol, hvis temperaturen på vandet, der anvendes til halevenens vasodilatation, er højere end 42 ° C, eller hvis blodet i opsamlingsrøret blandes med antikoagulant for energisk. En anden ejendommelighed ved blodindsamling hos kroniske epileptiske dyr er indflydelsen af deres bradykardi på den hastighed, hvormed blod falder ud af halevenen33. Hvis dette er for langsomt, kan blodet koagulere på væggene i opsamlingsrøret. For at undgå dette problem er en mulighed at opdele prøveudtagningen i to opsamlingsrør, hvilket reducerer mængden af blod / rør. Endelig er der en faldgrube, der er iboende for epilepsiundersøgelser. Den stress, der fremkaldes af dyremanipulation før prøveudtagning, kan fremkalde anfald, hvilket igen kan forstyrre niveauerne af molekyler, der er omfattet af undersøgelsen34. Når det er muligt, skal du placere anæstesiinduktionskammeret i hjemmeburet og lade dyret komme ind i det spontant. Som en ændring af den foreslåede protokol kan en restrainer anvendes til at udføre blodudtagning uden isofluranbedøvelse. Dette kan dog gøres i telemetri, men ikke i tøjrede dyr, fordi tøjrede rotter kan miste deres hovedimplantater under denne procedure.

Med en veluddannet operatør og maksimal indsats for at undgå stress er den eneste begrænsning i denne protokol den maksimale mængde, der kan trækkes tilbage uden at kompromittere dyrets helbred. I henhold til gældende standarder anbefales det at indsamle maksimalt 100 μL CSF i 4x over 15 dage i et enkelt dyr32. Tilsvarende foreslås det at indsamle mindre end 10% af det samlede blodkropsvolumen på en enkelt prøveudtagning og mindre end 15% af det samlede blodkropsvolumen på 28 dage30,31.

Sammenligning af metoden med andre teknikker
Foreslåede tidsopløste CSF- og plasmaprøvetagningsmetoder har flere fordele i forhold til eksisterende alternative metoder. For det første har en cisterna magna punktering, der bruges til at prøve CSF hos epileptiske rotter, en lavere risiko for tab af hovedimplantat sammenlignet med et kanyleret system, hvis det kobles til bundet EEG. I modsætning til punkteringsprocedurer er kanylen, der er fastgjort til elektroden med tandcement (voluminøs og tung for dyrenes hoveder), mens den anmodes om gentagne fastgørelser / løsrivelser til CSF-tilbagetrækningerne, meget mere tilbøjelig til at gå tabt over flere dages prøveudtagning. Resultaterne af succesraten viser faktisk, at nogle kanylerede dyr (I/T) ikke når frem til de fremskredne prøvetagningstidspunkter, og at deres respektive prøver går tabt (tabel 1). Derudover synes punkteringsmetoden at være bedre end kanyleret tilgang med hensyn til bedre sterilitet og reduceret meningeal reaktion med begrænset stigning i celle- og albuminindhold i CSF, som tidligere er dokumenteret af andre 22,35,36. Graden af CSF-leukocytter og albuminforurening kan være vigtig for validiteten af metoder, der anvendes til kvantificering af epilepsibiomarkører35. For det andet er metoden til dråbe af frit fald til blodprøvetagning, der anvendes til gentagne målinger, bedre end enhver anden tilbagetrækningsmetode, da den ikke er terminal (ikke-genopretning), i modsætning til halshugning, hjertepunktur, abdominal/thoraxblodkar eller retro-orbital tilbagetrækning og tillader multipel blodprøvetagning. Det er enklere end mange haleveneblodvakuumudtagningsteknikker, da det ikke kræver slanger28,37 og producerer hæmolysefrie plasmaprøver af høj kvalitet til yderligere sncRNA-analyser med fokus på at identificere formodede biomarkører for epileptogenese38. Fraværet af frit hæmoglobin i prøverne ved anvendelse af dråbeprøvetagningsteknikken eller undgåelse af halemalkning blev bekræftet af lave absorbansresultater af plasmaprøverne (tabel 2) i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte procedurer, der er egnede til evaluering af sncRNA-plasmaindhold39,40.

Applikationer og fremtidige retninger
De ovenfor beskrevne metoder kan anvendes til at måle opløselige molekyler af interesse i enhver model af neurologiske sygdomme. Et specifikt eksempel er prøveudtagning af biologiske væsker til identifikation af potentielle/formodede epilepsibiomarkører. Der er et presserende uopfyldt medicinsk behov for at opdage disse biomarkører for mennesker med epilepsi, især prognostiske og modtageligheds-/risikobiomarkører, da de endnu ikke eksisterer.

Afslutningsvis er den nuværende protokol mulig hos rotter, herunder epileptiske rotter, og er let at aktivere for trænede personer. Desuden tillader det flere prøveudtagninger af høj kvalitet i longitudinelle undersøgelser i overensstemmelse med princippet om 3R'er (dvs. erstatning, reduktion og forfinelse)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Den Europæiske Unions Horizon 2020-arbejdsprogram (indkaldelse af forslag H2020-FETOPEN-2018-2020) i henhold til tilskudsaftale 964712 (PRIME; til M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Cerebrospinalvæske blodprøvetagning lateral halevene rotter EEG-optagelser biomarkører epilepsiforskning CSF-tilbagetrækning cisternamagna video-EEG-overvågning diagnostiske biomarkører prognostiske biomarkører smertefri prøveudtagning minimal invasivitet reduceret anæstesitid
Prøveudtagning af cerebrospinalvæske og blod fra lateral halevene hos rotter under EEG-optagelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter