Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Provtagning av cerebrospinalvätska och blod från lateral svansven hos råttor under EEG-inspelningar

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65636
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

Summary

Protokollet visar upprepade cerebrospinalvätske- och blodinsamlingar från epileptiska råttor utförda parallellt med kontinuerlig övervakning med videoelektroencefalogram (EEG). Dessa är avgörande för att utforska möjliga kopplingar mellan förändringar i olika kroppsvätskemolekyler och anfallsaktivitet.

Abstract

Eftersom sammansättningen av kroppsvätskor återspeglar många fysiologiska och patologiska dynamiker, erhålls vanligtvis biologiska vätskeprover i många experimentella sammanhang för att mäta molekyler av intresse, såsom hormoner, tillväxtfaktorer, proteiner eller små icke-kodande RNA. Ett konkret exempel är provtagning av biologiska vätskor i forskningen om biomarkörer för epilepsi. I dessa studier är det önskvärt att jämföra molekylnivåerna i cerebrospinalvätska (CSF) och i plasma, genom att dra tillbaka CSF och plasma parallellt och beakta tidsavståndet för provtagningen från och till kramper. Den kombinerade CSF- och plasmaprovtagningen, i kombination med video-EEG-övervakning på epileptiska djur, är ett lovande tillvägagångssätt för validering av förmodade diagnostiska och prognostiska biomarkörer. Här beskrivs en procedur med kombinerad CSF-utsättning från cisterna magna och blodprovstagning från den laterala svansvenen hos epileptiska råttor som kontinuerligt video-EEG-övervakas. Denna procedur ger betydande fördelar jämfört med andra vanliga tekniker. Det möjliggör snabb provtagning med minimal smärta eller invasivitet och minskad anestesitid. Dessutom kan den användas för att erhålla CSF- och plasmaprover hos både tjudrade och telemetri-EEG-registrerade råttor, och den kan användas upprepade gånger under flera dagars experiment. Genom att minimera stressen på grund av provtagning genom att förkorta isoflurananestesi, förväntas mätningarna mer exakt återspegla de verkliga nivåerna av undersökta molekyler i biovätskor. Beroende på tillgången till en lämplig analytisk analys kan denna teknik användas för att mäta nivåerna av flera olika molekyler samtidigt som EEG-registrering utförs.

Introduction

Cerebrospinalvätska (CSF) och blodprovstagning är viktiga för att identifiera och validera biomarkörer för epilepsi, i både preklinisk och klinisk forskning 1,2. Numera fokuserar diagnosen epilepsi och det mesta av forskningen om epilepsibiomarkörer på EEG och neuroimaging 3,4,5. Dessa metoder har dock flera begränsningar. Förutom rutinmässiga skalpmätningar kräver EEG i många fall invasiva tekniker som djupelektroder6. Hjärnavbildningsmetoder har dålig tids- och rumsupplösning och är relativt dyra och tidskrävande 7,8. Av denna anledning skulle identifiering av icke-invasiva, billiga och biofluidbaserade biomarkörer vara ett mycket attraktivt alternativ. Dessutom kan dessa biomarkörer kombineras med tillgängliga diagnostiska metoder för att skärpa deras prediktivitet.

Patienter som diagnostiserats med epilepsi genomgår rutinmässigt EEG 9,10 och blodprovstagning 11,12,13,14, och många även CSF-abstinens för att utesluta livshotande orsaker (t.ex. akuta infektioner, autoimmun encefalit)15. Dessa blod- och CSF-prover kan användas i klinisk forskning som syftar till att identifiera biomarkörer för epilepsi. Till exempel har Hogg och medarbetare funnit att en ökning av tre plasma-tRNA-fragment föregår anfallsförekomst vid human epilepsi14. På liknande sätt kan interleukin-1beta (IL-1β) nivåer i human cerebrospinalvätska och serum, uttryckt som förhållandet mellan IL-1β-nivåerna i cerebrospinalvätska och serum, förutsäga posttraumatisk epilepsiutveckling efter traumatisk hjärnskada16. Dessa studier belyser vikten av provtagning av biovätskor för forskning om biomarkörer för epilepsi, men de står inför flera begränsningar som är inneboende i kliniska prövningar, t.ex. den medgrundande faktorn för antiepileptiska läkemedel (AED) i blod, den frekventa bristen på etiologiinformation, otillräckliga kontroller, ett blygsamt antal patienter och andra17,18.

Preklinisk forskning erbjuder andra möjligheter att undersöka molekyler i biovätskor som potentiella biomarkörer för epilepsi. Faktum är att det är möjligt att ta plasma och/eller cerebrospinalvätska från djur samtidigt som EEG-registreringar utförs. Dessutom kan provtagning utföras upprepade gånger under flera dagar av experimentet, och ett antal ålders-, köns- och epileptiska förolämpningsmatchade kontroller kan användas för att förbättra studiens robusthet. Här beskrivs en flexibel teknik för att få fram cerebrospinalvätska från cisterna magna med parallell tillbakadragning av plasma från svansvenen hos EEG-övervakade råttor. Den presenterade tekniken har flera fördelar jämfört med alternativa metoder. Genom att använda fjärilsnål är det möjligt att samla in ryggmärgsvätska flera gånger utan att äventyra funktionen hos EEG-elektroder eller liknande huvudimplantat. Detta innebär en förfining av intratekala kateterutdragningsprocedurer, som är förknippade med en relativt hög infektionsrisk. Dessutom är den rapporterade metoden med fritt fall som används för blodinsamling överlägsen andra metoder för bloduttag i svansvenen på grund av den kraftigt minskade risken för hemolys, på grund av det faktum att blod inte passerar genom slangar och inget vakuumtryck appliceras. Om det utförs under strikt bakteriefria förhållanden är risken för infektion särskilt låg för djur. Genom att börja ta blodprov alldeles i slutet av djurens svans kan provtagningen dessutom upprepas flera gånger. Sådana tekniker är lätta att behärska och kan tillämpas i många prekliniska studier av sjukdomar i centrala nervsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försöksmetoder har godkänts av University of Ferrara Institutional Animal Care and Use Committee och av det italienska hälsoministeriet (tillstånd: D.M. 603/2022-PR) i enlighet med riktlinjerna i Europeiska gemenskapernas råds direktiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG) om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål. Detta protokoll är specifikt anpassat för ytterligare kvantitativa analyser av polymeraskedjereaktioner (qPCR) av små icke-kodande ribonukleinsyra (sncRNA) i cerebrospinalvätska och plasma från råtta som erhållits under EEG-kontroll hos epileptiska djur. Om du väljer det, se den relaterade JoVE-videon för en bättre förståelse och förbättringar av operationen 19,20,21.

1. Förberedelse av djur för kirurgisk implantation av elektroder eller telemetrar

OBS: Den stereotaktiska kirurgitekniken varierar beroende på vilket EEG-system som används. Följande metodavsnitt innehåller en beskrivning av steg som är gemensamma för de två typerna av operationer.

  1. Använd Sprague-Dawley (SD) råttor (hanar, 7-8 veckor gamla, väger 250-290 g) som hålls i enlighet med lokala lagar för vård och användning av försöksdjur. Inhys djuren under standardförhållanden med fri tillgång till mat och dricksvatten.
  2. Fortsätt med att hantera råttorna i några dagar före operationen och de experimentella protokollprocedurerna.
  3. Använd en stereotaktisk apparat för implantation av elektroder eller telemetrar. Följ de moderna standarderna för aseptiska operationer. Använd sterila och väl fungerande elektroder och transmittrar.
  4. Raka djurets huvud med den elektriska rakhyveln. Inducera anestesi hos djuret med blandningen av ketamin (45 mg/kg) och xylazin (7,5 mg/kg) administrerat intraperitonealt (i.p.), tillsätt sedan isoflurananestesin (1,4 % i luft; 1,2 ml/min) som tillförs genom en ansiktsmask och fixera djurets huvud i den stereotaktiska apparaten.
  5. Säkerställ tillräckligt djup av anestesi genom att testa pedalutdragningsreflexen efter att trampdynan nypts på båda djurens baktassar och bibehåll isofluranbedövning till slutet av operationen. Kontrollera anestesidjupet regelbundet under hela ingreppet.
  6. Applicera en tillräcklig mängd ögonsalva på båda djurens ögon för att förhindra skador på hornhinnan på grund av förlust av blinkreflex orsakad av anestesi.
  7. Rengör djurets hårbotten noggrant med flytande desinfektionsmedel och gör ett längsgående 2 cm långt snitt med en steriliserad skalpell. Öppna hårbotten och applicera kirurgiska klämmor på hudflikarna för att hålla den öppen.
  8. Lossa försiktigt benhinnan för att exponera bregman och det område av skallen genom vilket inspelningselektroden kommer att föras in.

2. Kirurgisk implantation av bundna elektroder

OBS: Innan punktionsproceduren för CSF-uttag i detta protokoll etablerades (se steg 9 för detaljer), utfördes upprepade CSF-uttag via guidekanyl på några fritt rörliga icke-sövda råttor. Kanylerade djur implanterade med bundna elektroder användes för att utvärdera effekten av dubbelhuvudimplantat på långtids-EEG-registrering i kombination med multipel provtagning av cerebrospinalvätska. I dessa specifika experiment implanterades råttor med en attrappstyrkanyl som placerades i cisterna magna, vars spets fördes in 7 mm i den stereotaktiskt, enligt tidigare publicerade protokoll22. Metoder för dubbelimplantatkirurgi liknade dem som tidigare använts av vissa arbetare för mikrodialysstyrkanyler och implantation av bundna elektroder23,24.

  1. Använd en arm på den stereotaktiska ramen, montera elektrodhållaren på den och sätt elektroden upprätt i hållaren. Flytta elektrodspetsen exakt ovanför bråmman. Skriv ner de anteroposteriora och mediolaterala koordinaterna för bregma och översätt dem till önskade koordinater.
  2. Sänk elektroden tills dess spets nästan nuddar skallen. Markera borrplatsen och borra skallen på den markerade platsen. Var försiktig så att du inte skadar hjärnan och hjärnhinnorna.
  3. Gör fyra eller fler hål för förankringsskruvar och skruva fast dem i skallen. Var uppmärksam på elektrodens storlek när du gör hålen för förankringsskruvar. Elektrodstorleken bör inte störa de placerade förankringsskruvarna.
  4. Sänk långsamt den stereotaktiska armen som bär elektroden på den dorsoventrala axeln, gå in i hjärnvävnaden och stanna vid önskad position. Fäst elektrodjordledningen runt en av skruvarna som skruvas fast i skallen.
  5. Sätt metakrylcementen på elektroden och skruva fast dem som täcker ungefär hälften av elektrodpiedestalens höjd. Låt den övre halvan av elektroden, som passar tjudertrådens ände, vara bar.
  6. Lossa elektroden från hållaren och höj den stereotaktiska armen. Släpp djuret från den stereotaktiska apparaten och ge det postoperativ vård.
  7. Placera djuret i en separat uppvakningsbur och observera det var 10:e minut tills det är vaket och ambulerande. Lämna tillbaka djuret till sin vanliga bur och till ett annat icke-bedövat djurs sällskap först efter att det har återhämtat sig helt.

3. Kirurgisk implantation av telemetrarna

OBS: Använd endast sterila telemetrar. Om telemetrar återanvänds, rengör och sterilisera dem före operationen enligt tillverkarens instruktioner. I detta protokoll användes en datavetenskap International (DSI) telemetrar för EEG-registrering.

  1. Slå på telemetrisändaren med en magnet och testa signalen med en AM-frekvensradio. Kontrollera om det finns en stark och tydlig signal före operationen. Om det behövs, kassera de dåligt fungerande telemetrarna.
  2. Förbered telemeterkablarna genom att förkorta dem till optimala längder för vuxna råttor. Dra av silikonbeläggningen på två (negativa och positiva) ledningar och exponera cirka 5 mm av den spiralformade stålledningen. Skapa ett öglat handtag på cirka 2 mm i längd och 1 mm i bredd i spetsen av ledningarna.
  3. Raka djurets flank under och bakom vänster axel. Desinficera operationsområdet med desinfektionsmedel baserat på stabiliserade peroxider och kvartär ammoniumaktivitet. Låt desinfektionsmedlet verka i 15 min.
  4. Gör ca 2 cm lateralt snitt precis bakom bogen på djuret och gör en subkutan ficka på ca 5 cm3 utrymme för sändarens placering. Placera sändaren parallellt med kroppens långa axel, med ledningarna riktade mot rostralriktningen.
  5. Fäst sändaren på innerväggen i den subkutana fickan med en 3-0 bomullssutur. Använd en trubbig sax för att skapa den subkutana tunneln (ungefär 2,5 cm lång) genom djurets flank och hals och på så sätt ansluta sändarfickan till mittlinjesnittet som görs på djurets hårbotten i steg 1.6.
  6. Ta båda telemetrarna med pincett och dra upp dem genom tunneln, så att de sticker ut från hårbottensnittets utlopp. Håll ut ledningarna ur hårbottensnittet med sårklämmor.
  7. Använd den stereotaktiska ramen för att individualisera de önskade koordinaterna för positiv (röd) ledning och borra hålet i skallen för den positiva blyspetsen (liknande steg 2.1.). Gör ytterligare ett hål för att förankra skruven uppåt i talarstolen och skruva fast den i skallen.
  8. För in spetsen av bly under kalotten och duran och lägg den på hjärnytan. Haka fast den öglade spetsen på den negativa (vita) ledningen på skruven. Lägg en liten mängd metakrylcement runt det positiva blyutloppet och det negativa blyet för att immobilisera dem på skallen.
  9. Fäst ledningarna på den inre väggen av skallhuden med en 3-0 bomullssutur. Se till att de fasta ledningarna och fixeringssuturen inte kommer att störa platsen för CSF-uttag (dvs. en nedtryckbar yta med utseendet av en romb mellan occipital utbuktning och atlasryggraden).
  10. Stäng hårbottensnittet och flanksnittet med en 3-0 bomullssutur. Applicera desinfektionsmedel på såren. Först efter att dessa har torkat, applicera en antibiotikakräm på de suturerade såren.

4. Postoperativ vård

  1. Övervaka djuren i ca 1 timme därefter tills de står upprätt och rör sig runt buren. Förvara dem på en värmedyna för att förhindra hypotermi. Administrera djur med ett systemiskt antibiotikum för att förhindra infektion och ett systemiskt smärtstillande medel för att förhindra postoperativ smärta i 2-3 dagar.
  2. Låt råttorna återhämta sig i minst 7 dagar efter kirurgiska ingrepp. Övervaka djuren minst en gång dagligen i 3 dagar för tecken på smärta eller lidande.

5. Induktion av status epilepticus hos råttor

OBS: För ett detaljerat protokoll för status epilepticus (SE) induktion som behövs för att reproducera mesial temporallobsepilepsi (mTLE) hos råttor, se Guarino et al.25.

  1. Efter en veckas återhämtning efter operationen delas djuren slumpmässigt in i grupper: (i) kontrolldjur som får vehikel och (ii) epileptiska djur som kommer att få pilokarpin. Använd ett proportionellt högre antal djur för den epileptiska gruppen, eftersom inte alla pilokarpinadministrerade råttor kommer att överleva eller utveckla SE.
  2. Dagen före SE-induktionen ges djuren en engångsdos på 127 mg/kg litiumklorid löst i 0,9 % koksaltlösning (3M) som en volym på 1 ml/kg genom magsondmatning. Administrera djurets litium, vilket ökar pilokarpineffekten26, cirka 14 timmar före induktion av SE för att minska variabiliteten i tid till SE-debut.
  3. Cirka 14 timmar efter administrering av litium ges råttorna en engångsinjektion av metylskopolamin (1 mg/kg, subkutant).
  4. Exakt 30 minuter efter administrering av metylskopolamin ges råttorna en engångsinjektion av pilokarpin (50 mg/kg, i.p.) för att inducera SE. Ge metylskopolamin och vehikel (0,9 % NaCl-lösning) till kontrollråttorna.
    1. Pilokarpininjektion inducerar typiskt beteende hos djur: tidiga partiella anfall (vibrissae och huvudnickningar inom 5 minuter efter pilokarpinadministrering) som utvecklas till återkommande generaliserade kramper (SE) inom 25-30 minuter. För råttor som inte utvecklar SE inom 30 minuter, administrera en extra dos pilokarpin (25 mg/kg, i.p.), och om de fortfarande inte utvecklar SE, exkludera dem från studien (SE non-responders).
  5. Observera och poängsätt anfallsbeteendet hos råttor var 5:e minut med början omedelbart efter pilokarpininjektionen. Använd Racine-skalan för att få27 poäng.
  6. Avbryt SE 2 timmar efter insättande av intravenös administrering av en cocktail av läkemedel: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) och skopolamin (1 mg/kg).
  7. Ge råttorna denna cocktail igen efter 4 timmar. Slutligen, efter ytterligare 4 timmar, ge råttorna i.p. den sista blandningen av läkemedel (diazepam 10 mg/kg plus skopolamin 1 mg/kg) för att helt stoppa anfallsaktiviteten.
  8. Injicera i.p. djuren med koksaltlösning (1 ml 0,9 % NaCl-lösning, pH justerat till 7,0) och mata dem med en 10 % sackaroslösning i 2-3 dagar efter SE för att främja återhämtning från den viktminskning som följer SE.
  9. Tilldela överlevande djur efter SE slumpmässigt till olika försöksgrupper i enlighet med kraven i det specifika försöksprotokollet. Använd följande inklusions-/exklusionskriterier för ytterligare experiment på epileptiska råttor: utveckling av konvulsivt SE inom 1 timme efter administrering av pilokarpin, viktökning under den första veckan efter SE och korrekt placering av elektroden i det hjärnområde som är av intresse för EEG-registreringar25.

6. Uppbundna video-EEG hos epileptiska råttor och analyser av anfallsaktivitet

OBS: I detta avsnitt beskrivs den experimentella proceduren för att registrera EEG-signaler hos råttor som hålls i ett hus och som rör sig fritt under standardförhållanden. Buren får inte innehålla föremål där djuret eller inspelningskabeln kan fastna. Beroende på vilken vetenskaplig frågeställning som ska behandlas kan flera parametrar analyseras. När det gäller epilepsiforskning screenas EEG-spåren för att känna igen elektriska och motoriska anfall. De vanligaste parametrarna som används för att identifiera ett anfall är amplituden, frekvensen och varaktigheten av paroxysmal elektrisk aktivitet.

  1. Placera djuret i en ren bur i inspelningsrummet för att möjliggöra tillvänjning och minska den stress som den nya miljön orsakar. Placera djurets bur i en Faraday-bur för att undvika kontaminering av EGGet-signalen med det elektromagnetiska fältet i omgivningen.
  2. Anslut ena änden av inspelningskabeln till inspelningsenheten. Använd en voltmeter för att mäta den elektriska potentialen och skilja mellan jord- och referenselektroder.
  3. Anslut den andra änden av inspelningskabeln till elektroden som är fäst på råttans huvud. För detta ändamål, håll cementskyddet på djurets huvud när du sätter in kabelkontakten i elektrodkontakten och undvik att utöva något tryck på råttans huvud.
  4. Balansera inspelningskabelns vikt så att djuret kan röra sig fritt samtidigt som risken för att kabeln vrids förhindras. För att göra detta, använd en motviktsarm eller kommutatorer. Även om inspelningskabeln är motviktad, lägg fodret inuti buren istället för i en foderhållare, där djuren måste resa sig för att nå maten.
  5. Innan du påbörjar registreringen, kontrollera alla inställningar som används för att samla in och bearbeta data från EEG.
    OBS: Detta protokoll ger ingen introduktion till den apparatur som krävs för att utföra EEG-registreringen, men adekvata filtrerings- och samplingshastigheter bör tillämpas för att undvika artefakter och brus i EEG-signaler.
    1. För ett rutinexperiment, ställ in samplingsfrekvensen till 500 Hz och förstärkningsförstärkningen till 5000x. Filtrera signalen med ett 0,005 Hz-filter utöver ett notch-filter för att kassera den omgivande elektriska aktiviteten i 50 Hz-bandet (specifikt för europeiska länder).
  6. Starta både video- och EEG-inspelningar och se till att spåren matchar en förväntad EEG-signal genom att kontrollera effekten i specifika frekvensband över tiden. Anteckna en referensperiod innan ingreppen på djuren påbörjas.
  7. Kontrollera djur och EEG-spår med jämna mellanrum. Det är inte ovanligt att en inspelningskabel lossnar från elektrodkontakten i råtthuvudet. Om detta händer, anslut elektroden i råtthuvudet till en inspelningskabel igen och kontrollera om det finns en tydlig EEG-signal.
  8. Analysera EEG-signalen manuellt eller automatiskt med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara. Om du analyserar manuellt, screena igenom EEG-registrering för att identifiera anfallsliknande aktiviteter. Om programvara ska användas, konfigurera nyckelparametrar för en anfallshändelse, som amplitud, frekvens och varaktighet av elektrisk aktivitet.
    OBS: Enstaka anfall kan karakteriseras av en elektrisk aktivitet med en amplitud 3 gånger högre än baslinjen, frekvens lika med eller högre än 5 Hz och varaktighet på minst 5 s22.
  9. Oavsett vilken metod som används, bekräfta de potentiella krampanfallen genom att kontrollera den synkroniserade videoinspelningen som samlats in samtidigt med EEG.

7. Telemetrivideo-EEG hos epileptiska råttor och analys av anfallsaktivitet

OBS: I detta avsnitt beskrivs den experimentella proceduren för att registrera EEG-signaler med radiotelemetri hos råttor som hålls i ett stall och rör sig fritt under standardförhållanden. Protokollet är baserat på ett kommersiellt tillgängligt telemetrisystem. Flera telemetrisystem skiljer sig dock något åt i sina funktionella och tekniska specifikationer. Systemet bör väljas beroende på laboratoriets krav och forskningsmål.

  1. Placera djurets hembur ovanför signalmottagaren. Anslut signalmottagaren till datainsamlingssystemet och detta till en dator med insamlingsprogrammet.
  2. Slå på radiofrekvenstelemetriimplantatet genom att placera en magnet i närheten av telemetern som sätts in i råttflanken. Testa signalen med en radioenhet. Använd en universell radioenhet för att testa telemetrarna och hör ett tydligt pip indikerar att telemetern är aktiverad, medan ett fräsande ljud indikerar en inaktiverad telemeter.
    OBS: Livslängden för radiofrekvenssändarens batteri bör beaktas innan inspelningarnas varaktighet definieras.
  3. Ställ in insamlingsprogramvaran och synkronisera telemetrisignalen och videosystemet för att samtidigt samla in EEG- och videodata. Tilldela en signalmottagare till varje implanterad sändare och ställ in kalibreringsvärdena för sändaren. Ställ in samplingsfrekvensen på 1000 Hz, brusdetektering mellan -500 mV och +500 mV och integrationsintervallet på 100 ms. Använd inte låg- och högpassfilter.
  4. Starta telemetri- och videoinspelningarna. Utför långtidsregistrering av baslinjen innan du förvärvar den epileptiska aktiviteten. Analysera EEG-signalen enligt beskrivningen i steg 6.8 och 6.9.

8. Förfarande för bloduppsamling från svansvenen

NOT. Vakuumsystemet består av en fjärilsnål (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). Blodinsamlingstekniken kan enkelt utföras av en operatör och proceduren tar cirka 5 minuter.

  1. Täck fjärilsnålen och dess slang med 1 %K2EDTA i destillerat vatten strax före uttagningen, dvs. dra in och stöt utK2EDTA-lösningen från systemet med hjälp av 1 ml sprutan. Klipp av slangen precis bakom nålen för att samla upp blod droppe för droppe, utan aspiration (Figur 1A).
  2. Placera råttan i en induktionskammare och bedöva den med isofluran (1,4 % i luft; 1,2 ml/min). Byt till den stereotaktiska ramen och upprätthåll anestesi genom en ansiktsmask. Lägg värmedynan under djuret och håll en del av svansen i direkt kontakt med dynan.
  3. Flytta försiktigt djurets rygg åt sidan så att den laterala svansvenen hålls upptill.
  4. Doppa svansen i varmt vatten (42 °C) i 2 minuter för att vidga sidovenen. Torka av svansen med 70% etanol för att göra venen mer synlig. Sätt varmt ljus på svansen med en vanlig glödlampa.
  5. Stick in fjärilsnålen 21G i den laterala svansvenen med ett djup på 5 mm och en vinkel på 20°. Samla blod i ett 500 μL vakuumuppsamlingsrör som innehåller 5 mg K2EDTA som antikoagulantia (Figur 1B,C).
  6. Ta bort nålen och stoppa blodflödet genom att trycka på stickstället. Sätt tillbaka råttan i sin hembur.
  7. Vänd försiktigt upp och ner på slangen 10 gånger för att blanda antikoagulantia i blodet. Gör hål på ca 1,5 cm djup i isen för att få plats med uppsamlingsrören. Lägg provet försiktigt och vertikalt på is.
  8. Centrifugera blodprovet i en kyld centrifug (4 °C) vid 1300 x g i 10 minuter för att separera plasma. Utför denna procedur inom högst 1 timme.
  9. Ta cirka 200 μL plasma, undvik det röda och vita blodkroppsskiktet. Placera den uppdragna plasman i det 0,2 ml sterila mikroröret. Förvara vid behov vid 4 °C i upp till 1 timme efter centrifugering.
  10. Lägg 5 μL av provet åt sidan för kvalitetskontroll. Förvara provet vid -80 °C fram till analys.
    OBS: Använd inte vakuum även om det rekommenderas av vissa forskare28 eller mjölka svansen under procedurerna som beskrivs i steg 8.5 för att få mer blod, eftersom det minskar provkvaliteten för nästa sncRNA-kvantifieringsanalyser (se de representativa resultaten för detaljer). Tänk på att hos råtta är den maximala mängden blod som kan tas ut på en gång <10 % av dess totala blodvolym (dvs. cirka 1,6-1,9 ml hos en råtta på 250-300 g) och <15 % av den totala blodvolymen (cirka 2,64 ml) på 1 månad29. I detta protokoll används högst 500 μl bloduppsamling vid ett och samma tillfälle upp till fem gånger till ett och samma djur30,31.

9. Förfarande för insamling av GSR

NOT. Tekniken kan enkelt utföras av en enda operatör, och proceduren tar cirka 2-4 minuter. Materialen som används för insamling av CSF är billiga vakuumfjärilsnålar och extraktionsrör för engångsbruk. I detta protokoll används ett fjärilsvingat infusionsset anslutet till en steril spruta för att skapa vakuum (Figur 2A).

  1. Förbered fjärilsnålen 23G genom att klippa av plasthylsan så att änden av den nakna nålen exponeras 7 mm för att förhindra att den tränger in mer än 7 mm djupt in i cisterna magna under uppdragningen (Figur 2B).
  2. Anslut fjärilsnålen utrustad med polymerslang till en 1 ml spruta.
  3. Placera råttan i en induktionskammare och bedöva den med isofluran (1,4 % i luften; 1,2 ml/min). Växla isofluranflödet till den stereotaktiska ramen och upprätthåll anestesi som levereras genom en ansiktsmask. Ta bort pälsen på råttans bakre huvud och hals med en rakhyvel.
  4. Fäst råttans huvud med öronstänger. Sänk ner djurets huvud cirka 45° vertikalt och rör dig nedåt i nosstången på den stereotaktiska ramen (Figur 2C). Inspektera djurets bakre huvud och hitta en något nedtryckt yta med en romb, mellan nackutbuktningen och atlasryggraden.
  5. Gnid in denna yta med 70 % etanol för att göra den mer synlig och desinficera den.
  6. Stick in fjärilsnålen vertikalt i mitten av den rombformade nedtryckta ytan i cisterna magna för CSF-uppsamling tills rörelsen blockeras genom att skära till nålens plasthylsskydd (Figur 2D). Dra försiktigt tillbaka 1 ml sprutkolv så att den cerebrospinalvätska långsamt kan rinna genom nålen.
  7. Samla upp cirka 100 μl av den cerebrospinalvätska i polymerslangar (figur 2D). Undvik att komma in i blod eller annan synlig kontaminering. Nyp ihop polymerslangen mycket nära fjärilsnålen och klipp av slangen vid denna tidpunkt.
  8. Dra upp det klara (okontaminerade) provet i sprutan. Kassera den förorenade sample om synlig kontaminering kommer in i uppsamlingsslangen.
  9. Skjut ut provet i det sterila 0,2 ml mikroröret och förvara på is i upp till 1 timme.
  10. Desinficera platsen för CSF-uttaget på djurets huvud. Ta bort råttan från stereotaxisk ram och sätt tillbaka den i buren.
  11. Lägg 2 μL av provet åt sidan för kvalitetskontroll. Förvara resten av provet vid -80 °C för vidare analys.
    OBS: Om flera uttag av cerebrospinalvätska utförs upprepade gånger hos råttor är den rekommenderade volymen som ska dras upp vid varje samling 100 μL32. I detta protokoll gjordes maximalt 100 μl cerebrospinalvätska vid ett enda tillfälle med 5x maximal utsättning på 15 dagar till ett enda djur.

10. Spektrofotometrianalys av provets kvalitet

OBS: Efter korrekt insamling av CSF och plasmaprover är proverna klara för spektrofotometeranalyser och kräver ingen särskild hantering. Mät hemoglobinabsorbansen med UV-spektrofotometri vid 414 nm för att utvärdera hemolysrisken i prover. Använd ett cut-off-absorbansvärde på 0.25 i råttprover. Valet av detta gränsvärde kan bero på efterföljande qPCR-analys och dess specifika krav för sncRNA-kvantifiering.

  1. Slå på UV-spektrofotometern. Välj metod för absorbansmätning vid en våglängd på 414 nm för PLASMA eller CSF. Klicka på Nästa.
  2. Skölj 1 mm kyvetten med renat vatten. Häll 5 μL 70 % etanol på kyvettens mätpunkt. Torka med en pappershandduk och gnugga med luddfritt silkespapper. Kontrollera om det är helt transparent.
  3. Häll 1,5 μL renat vatten i 1 mm kyvetten och stäng den. Sätt in kyvetten i spektrofotometerns mätkammare och mät det tomma provets absorbans genom att klicka på knappen Tom . Kontrollera att absorbansvärdet vid 414 nm är 0,000.
  4. Torka kyvetten med en pappershandduk och rengör den med luddfritt silkespapper. Kontrollera om det är helt transparent.
  5. Häll 1,5 μl av provet i 1 mm kyvetten och stäng den. Sätt in kyvetten i spektrofotometerns mätkammare. Mät provet genom att klicka på knappen Sample . Kontrollera provets absorbans vid 414 nm och annotera det.
  6. Fortsätt kvantifiera hemoglobinabsorbansen i alla tillgängliga samples. Mät det tomma provet före varje plasma- eller CSF-prov, genom att klicka alternativt på knapparna Tom och Sample .
  7. Konservera proverna med A414 nm < 0,25 vid -80 °C och kassera proverna om A414 nm > 0,25.
  8. Skölj 1 mm kyvetten med renat vatten och 70 % etanol, sekventiellt. Torka kyvetten.
  9. Stäng den tomma kyvetten i mätkammaren för att förhindra att den dammas. Stäng av spektrofotometern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatet av olika CSF- och bloduttagsprocedurer utförda på 9 kontroll- och 18 kroniska epileptiska råttor, alla implanterade med elektroder 1 månad efter SE, rapporteras i termer av framgångsfrekvens. Efter implantationen video-EEG övervakades alla råttor under 1 månad, under vilken CSF plus blod drogs ut 5 gånger var tredje dag under de två sista veckorna av experimentet (dvs. vid dag 52, 55, 58, 61 och 64 efter SE; dpSE). Data från multipla utsättningar hos olika djur användes för att jämföra framgångsfrekvensen för insamling av cerebrospinalvätska hos råttor med dubbla huvudimplantat (kanylerad för CSF-utsättning) med framgångsfrekvensen för insamling av cerebrospinalvätska (utförd med cisterna magna-punktion) hos djur som endast hade tjudrats eller implanterats med telemetrielektroder (tabell 1). Hos olika djur utvärderades effekten av blodprovstagning med vakuum eller svansmjölkning på plasmaprovernas kvalitet (tabell 2). För detta ändamål användes UV-spektrofotometrianalys vid 414 nm för detektion av fritt hemoglobin. För statistiska analyser användes kommersiell programvara, och Kruskal-Wallis eller envägs ANOVA med post-hoc Tukeys multipla jämförelsetester användes (p<0,05 anses vara statistiskt signifikant). Uppgifterna uttrycks som ett medelvärde ± SEM.

Framgångsfrekvens för multipel CSF-provtagning hos kanylerade och punkterade råttor
CSF har provtagits 5 gånger inom 2 veckor i 3 grupper av råttor: i) kanylerade och bundna elektrodimplanterade råttor (CT-gruppen av djur); i dessa utfördes CSF-utsättningen via overksam styrkanyl och PTFE-slangled till 1 ml spruta när de var icke-bedövade och rörde sig fritt under video-EEG; ii) Råttor med punktering (steg 9) och fastbundna elektroder (PT-gruppen). iii) Råttor med punktering och telemetrielektrod (PTe-gruppen). Totalt användes 9 djur per grupp (6 epileptiska och 3 kontrollråttor). Antalet lyckade insamlingar över 5 gånger utvärderades. Framgångsfrekvensen var likartad hos punkterade råttor: 86,7 % ± 5,8 % hos tjudrade och 88,9 % ± 4,8 % hos djur med telemetrielektrodimplantat. I stället minskade frekvensen hos de kanylerade råttorna, även om den inte skilde sig signifikant (71,1 % ± 8,9 %, tabell 1). Sådana resultat tyder på att kanylen på djurens huvud kan störa upprepad provtagning av cerebrospinalvätska och äventyra longitudinella studier. Punktionstekniken är mer lämplig för multipla CSF-uttag i elektroder implanterade djur.

Inverkan av vakuum och svansmjölkning på plasmauppsamlingsmetoden
Blod samlades in 5 gånger från 9 råttor (6 epileptiska och 3 kontrollråttor) vid dag 52, 55, 58, 61 och 64 post-SE och plasmakvaliteten utvärderades med avseende på hemolys visuellt och med UV-spektrofotometri vid 414 nm. För att få det första provet på varje råtta användes vakuumuttag via en 21G fjärilsnål fäst vid en 1 ml spruta. I det andra provet användes dropputtaget och 21G fjärilsnålssystemet vid mjölkning av svansen samtidigt. För att få det 3:e-5:e provet användes dropputtagsproceduren utan att mjölka svansen (beskriven i steg 9).

Vid användning av vakuum var plasman rosafärgad under den visuella inspektionen, och det genomsnittliga absorbansvärdet för 9 råttors prover var 0,647 ± 0,067 (tabell 2, figur 3). Liknande resultat erhölls om svansmjölkning användes under proceduren: rosafärgad plasma med 0,620 ± 0,043 genomsnittlig absorbans (tabell 2, figur 3). Däremot, med gravitationsaktiverad dropputsättning och 21G fjärilsnålsystem, reducerades de genomsnittliga plasmaabsorbansvärdena signifikant (0,226 ± 0,017 vid 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 vid 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 vid 64 dpSE; Tabell 2, figur 3) med avseende på vakuum- eller svansmjölkningsmetod. Dessutom var droppplasmaproverna huvudsakligen transparenta. Högre absorbansvärden (52 och 55 dpSE) korrelerade med den rosa färgen på proverna (data visas inte). Dessa resultat kan tyda på att den senare metoden är den bästa för att få prover av mycket hög kvalitet för analyser.

Figure 1
Figur 1: De viktigaste stegen i arbetsflödet för plasmaprovtagning. A) Material som behövs för bloduttagning och råtta i stereotaktisk ram, färdiga för uppsamling. (B, C) Förstoring av svansen med 21G fjärilsnål insatt i den laterala svansvenen och bloddroppen som faller ner längs väggarna i uppsamlingsröret med ett antikoagulantia. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Viktiga steg i arbetsflödet för provtagning av cerebrospinalvätska (CSF). A) Material som behövs för att dra ut cerebrospinalvätska och råtta i stereotaktisk ram, strax före insamlingen. B) Preparering av 23G-fjärilsnålen genom att skära av plasthylsskyddet så att den nakna nålens ände är exponerad 7 mm för att säkerställa korrekt penetration i cisterna magna. (C) Råtthuvudet lutas nedåt med 45° när det dras ut. (D) Förstoring på rombstället med en fjärilsnål instucken i cisterna magna. Notera CSF som stiger i slangen, indikerad av spetsen på markören. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsbedömning av plasmaprover. Grad av hemolys uppmätt vid 414 nm för fritt hemoglobin med UV-spektroskopi i plasmaprover av 9 djur vid 5 tidpunkter (52, 55, 58, 61 och 64 dagar efter status epilepticus, dpSE) med olika metoder: dag 52 - vakuumtekniken; Dag 55 - svansmjölkningen; Dagarna 58-64 användes droppteknikerna. Minskningen av fritt hemoglobin i plasma erhållet med droppteknik jämfört med vakuum- och svansmjölkningsmetoder var signifikant (*p <0,05 enligt envägs ANOVA och post-hoc Tukeys multipla jämförelsetest). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Framgångsfrekvens för uttag från GSR. Jämförelse av framgångsfrekvensen för upprepad utsättning av cerebrospinalvätska i tre försöksgrupper av djur, uttryckt i procent av framgångsrika utsättningar under 5 dagar. Värdet 1 tilldelades ett framgångsrikt uttag av > 100 μl klar CSF. nollvärdet tilldelades uttag < 100 μl och/eller oklar CSF. Förkortningar: Ej tillämpligt - utebliven uppsamling på grund av förlust av kanyl under provtagningsförfarandet (endast CT-djur). CT - kanylerad bunden; PT - punkterad tjudrad; PTe - punkterade telemetrielektroder implanterade. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Utvärdering av hemolys i plasmaprover. Resultat av hemolysmätningarna vid 5 tidpunkter med hjälp av tre olika metoder för blodprovstagning: dag 52 - vakuumtekniken; Dag 55 - svansmjölkningen; Dag 58-64 droppteknikerna. Värden >0,3 absorbans korrelerade med rosa färg på prover. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det aktuella arbetet illustrerar en teknik som är lätt att behärska för ryggmärgsvätska och blodinsamling hos råttor, vilket kan vara användbart inte bara för studier i modeller av epilepsi utan också av andra neurologiska tillstånd eller sjukdomar som Alzheimer, Parkinson eller multipel skleros. Inom epilepsiforskning är båda provtagningsprocedurerna i kombination med video-EEG idealiska när man försöker hitta en korrelation mellan nivåerna av olika lösliga molekyler och anfallsaktivitet. Av denna specifika anledning användes en kontinuerlig video-EEG-inspelning: i) för att korrekt diagnostisera epilepsi eller ii) för att övervaka de olika faserna av sjukdomsprogressionen, och/eller iii) för att korrelera provtagning med förekomsten av spontana anfall. Sådana provtagningstekniker kan utföras på sövda råttor och orsakar därmed minimal stress.

Kritiska steg, felsökning, metodbegränsningar
Protokollet har några kritiska tekniska steg. För det första kan det vara svårt att hitta rätt plats för insamling av CSF vid första försöket. Om operatören missar cisterna magna vid första försöket skulle alla efterföljande försök vara blodkontaminerade, eftersom djuret kommer att blöda från nålsåret. Ur denna synvinkel är framgången i samlingen starkt beroende av operatörens skicklighet. För det andra kräver vissa steg i bloduttagningen särskild uppmärksamhet. I synnerhet finns det en hög risk för hemolys om operatören gnuggar svansen för kraftigt med etanol, om temperaturen på vattnet som används för svansvenens vasodilatation är högre än 42 °C, eller om blodet i uppsamlingsröret blandas med antikoagulantia för energiskt. En annan egenhet med blodinsamling hos kroniska epileptiska djur är inflytandet av deras bradykardi på den hastighet med vilken blodet faller ut ur svansvenen33. Om detta går för långsamt kan blodet koagulera på uppsamlingsrörets väggar. För att undvika detta problem är ett alternativ att dela upp provtagningen i två uppsamlingsrör, vilket minskar volymen blod/rör. Slutligen finns det en fallgrop som är inneboende i epilepsistudier. Den stress som framkallas av djurmanipulation före provtagning kan framkalla kramper, vilket i sin tur kan påverka nivåerna av molekyler som omfattas av undersökningen34. När det är möjligt, placera anestesiinduktionskammaren i hemburen och låt djuret komma in i den spontant. Som en modifiering av det föreslagna protokollet kan en fasthållningsanordning användas för att utföra bloduttag utan isoflurananebedövning. Detta kan dock göras i telemetri, men inte i bundna djur, eftersom tjudrade råttor kan förlora sina huvudimplantat under denna procedur.

Med en välutbildad operatör och maximal ansträngning för att undvika stress, är den enda begränsningen i det nuvarande protokollet den maximala volymen som kan dras tillbaka utan att äventyra djurets hälsa. Enligt gällande standarder rekommenderas att högst 100 μl cerebrospinalvätska samlas in 4 gånger under 15 dagar hos ett enda djur32. På samma sätt föreslås det att samla in mindre än 10 % av den totala blodkroppsvolymen vid en enda provtagning och mindre än 15 % av den totala blodkroppsvolymen på 28 dagar30,31.

Jämförelse av metoden med andra tekniker
Föreslagna tidsupplösta CSF- och plasmaprovtagningsmetoder har flera fördelar jämfört med befintliga alternativa metoder. För det första har en cisterna magna-punktion som används för att ta prov på cerebrospinalvätska hos epileptiska råttor en lägre risk för förlust av huvudimplantat jämfört med ett kanylerat system om det är kopplat till tjudrat EEG. Till skillnad från punktionsprocedurer är kanylen som fästs vid elektroden med tandcement (skrymmande och tung för djurens huvuden), även om den begärs genom upprepade fastsättningar/avlossningar till CSF-uttagen, mycket mer benägen att gå förlorad under flera dagars provtagning. Resultaten av framgångsfrekvensen visar att vissa kanylerade djur (N/A) inte kommer fram till de avancerade provtagningstidpunkterna, vilket innebär att deras respektive prover går förlorade (tabell 1). Dessutom verkar punktionsmetoden vara överlägsen kanylerad metod när det gäller bättre sterilitet och minskad hjärnhinnereaktion med begränsad ökning av cell- och albumininnehåll i CSF, vilket tidigare har dokumenterats av andra 22,35,36. Graden av leukocyter och albuminkontamination i cerebrospinalvätskan kan vara av betydelse för validiteten hos de metoder som används för kvantifiering av epilepsibiomarkörer35. För det andra är metoden för droppning av fritt fall för blodplasmaprovtagning som används för upprepade mätningar överlägsen alla andra uttagsmetoder eftersom den inte är terminal (icke-återhämtning), till skillnad från halshuggning, hjärtpunktion, buk-/bröstblodkärl eller retroorbital tillbakadragning och tillåter multipel blodprovstagning. Det är enklare än många svansvensblodvakuumuttagstekniker, eftersom det inte kräver slang28,37 och producerar hemolysfria plasmaprover av hög kvalitet för ytterligare sncRNA-analyser med fokus på att identifiera förmodade biomarkörer för epileptogenes38. Frånvaron av fritt hemoglobin i proverna, när man använde droppsamplingstekniken eller undvek svansmjölkning, bekräftades av låga absorbansresultat för plasmaproverna (tabell 2) i linje med tidigare publicerade procedurer som är lämpliga för utvärdering av sncRNA-plasmainnehåll39,40.

Tillämpningar och framtida inriktningar
De ovan beskrivna metoderna kan användas för att mäta lösliga molekyler av intresse i alla modeller av neurologiska sjukdomar. Ett specifikt exempel är provtagning av biologiska vätskor för identifiering av potentiella/förmodade biomarkörer för epilepsi. Det finns ett akut medicinskt behov av att upptäcka dessa biomarkörer för personer med epilepsi, särskilt prognostiska biomarkörer och känslighets-/riskbiomarkörer, eftersom de ännu inte existerar.

Sammanfattningsvis är det nuvarande protokollet genomförbart på råttor, inklusive epileptiska råttor, och är lätt att aktivera för tränade individer. Dessutom tillåter det flera högkvalitativa provtagningar i longitudinella studier i enlighet med principen om 3R (dvs. ersättning, minskning och förfining)41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av ett bidrag från Europeiska unionens arbetsprogram för Horisont 2020 (ansökningsomgång H2020-FETOPEN-2018-2020) inom ramen för bidragsavtal 964712 (PRIME; till M. Simonato).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).

Tags

Cerebrospinalvätska blodprovstagning lateral svansven råttor EEG-registreringar biomarkörer epilepsiforskning CSF-abstinens Cisterna Magna Video-EEG-övervakning diagnostiska biomarkörer prognostiska biomarkörer smärtfri provtagning minimal invasivitet minskad anestesitid
Provtagning av cerebrospinalvätska och blod från lateral svansven hos råttor under EEG-inspelningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soukupová, M., Guarino, A.,… More

Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter