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Biochemistry

动静脉代谢组学测量棕色脂肪组织 中的体内 代谢物交换

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

在该方案中，概述了与在小鼠模型中使用GC-MS进行BAT优化的动静脉代谢组学相关的方法。这些方法允许在生物体水平上获得对BAT介导的代谢物交换的宝贵见解。

Abstract

棕色脂肪组织 （BAT） 通过一种称为非颤抖产热的独特能量消耗过程在调节代谢稳态中起着至关重要的作用。为了实现这一目标，英美烟草利用多样化的循环营养素菜单来支持其高代谢需求。此外，BAT 分泌代谢物衍生的生物活性因子，可作为代谢燃料或信号分子，促进 BAT 介导的组织内和/或组织间通讯。这表明BAT积极参与全身代谢物交换，这是一个有趣的特征，正在开始探索。在这里，我们介绍了一种 体内小鼠水平 优化的BAT动静脉代谢组学的方案。该方案侧重于产热刺激的相关方法和使用苏尔寿静脉的动静脉采血技术，该技术选择性地引流肩胛间 BAT 来源的静脉血和全身动脉血。接下来，演示了使用这些血液样本的基于气相色谱的代谢组学方案。该技术的使用应通过测量 BAT 对代谢物的净摄取和释放，在器官间水平上扩展对 BAT 调节的代谢物交换的理解。

Introduction

棕色脂肪组织 （BAT） 具有一种独特的能量消耗特性，称为非颤抖产热 （NST），它涉及线粒体解偶联蛋白 1 （UCP1） 依赖性和 UCP1 非依赖性机制1、2、3、4、5。这些显着特征使 BAT 参与全身代谢的调节和代谢疾病的发病机制，包括肥胖、2 型糖尿病、心血管疾病和癌症恶病质 6,7,8。最近的回顾性研究表明，BAT 质量和/或其代谢活性与人类肥胖、高血糖和心脏代谢健康呈负相关 9,10,11。

最近，BAT被提议作为负责维持NST的代谢汇，因为它需要大量的循环营养物质作为产热燃料6,7。此外，BAT可以产生和释放生物活性因子，称为棕色脂肪因子或BATokines，其充当内分泌和/或旁分泌信号，表明其积极参与系统水平的代谢稳态12,13,14,15。因此，了解BAT的营养代谢应该增强我们对它在人类中的病理生理学意义的理解，超越其作为体温调节器官的传统作用。

使用稳定同位素示踪剂的代谢组学研究，结合使用非代谢放射性示踪剂的经典营养素摄取研究，显著提高了我们对哪些营养素优先被 BAT 吸收以及如何利用的理解 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25，26,27.例如，放射性示踪剂研究表明，冷活化的 BAT 会吸收葡萄糖、脂蛋白结合的脂肪酸和支链氨基酸16、17、18、19、20、21、22、23、27.最近的同位素示踪与代谢组学研究相结合，使我们能够测量这些营养物质在组织和培养细胞内的代谢命运和通量24,25,26,28,29,30。然而，这些分析主要集中在营养物质的个体利用上，使我们对BAT在器官代谢物交换中的系统级作用的了解有限。关于英美烟草消耗的特定循环营养物质系列及其在碳和氮方面的定量贡献的问题仍然难以捉摸。此外，对 BAT 是否可以使用营养物质产生和释放代谢物衍生的 BATokines（例如脂因子）的探索才刚刚开始 12,13,14,15,31,32。

动静脉血液分析是一种经典的生理学方法，用于评估器官/组织中循环分子的特异性摄取或释放。该技术以前已应用于大鼠的肩胛间 BAT 以测量氧气和几种代谢物，从而将 BAT 确立为适应性产热的主要位点，具有分解代谢潜力33、34、35、36、37。最近，一项使用大鼠肩胛间 BAT 的动静脉研究与跨组学方法相结合，从而鉴定了由生热刺激的 BAT38 释放的未发现的 BATokines。

基于高灵敏度气相色谱和液相色谱质谱（GC-MS 和 LC-MS）的代谢组学的最新进展重新点燃了人们对动静脉研究的兴趣，该研究用于器官特异性代谢物交换的定量分析 39,40,41。这些技术具有高分辨能力和质量精度，能够使用少量样品对各种代谢物进行全面分析。

与这些进展相一致，最近的一项研究成功地将动静脉代谢组学应用于小鼠水平的 BAT 研究，从而能够定量分析不同条件下 BAT 中的代谢物交换活动42。本文介绍了在 C57BL/6J 小鼠模型中使用 GC-MS 的 BAT 靶向动静脉代谢组学方案。

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Protocol

所有实验均在成均馆大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行。将小鼠饲养在IACUC批准的动物设施中，该设施位于22°C和45%湿度的洁净室中，每天进行12小时的光/暗循环。他们被放在通风的架子上，可以随意获得标准的食物饮食（包括 60% 的碳水化合物、16% 的蛋白质和 3% 的脂肪）。垫料和筑巢材料每周更换一次。在这项研究中，使用了12周龄且体重在25g至30g之间的雄性C57BL / 6J小鼠。这些动物来自商业供应商（见 材料表）。

1.通过温度驯化和药理刺激调节棕色脂肪组织的代谢活性

注意：数天至数周的温度适应或使用β-肾上腺素能受体激动剂的药理学刺激是调节 BAT 活性1 的常用方法。因此，下面提供了该方法的简明概述，以便读者能够根据需要选择适当的方法。为了获得代谢不活跃（产热性较低）的BAT，为C57BL / 6J小鼠选择称为热中性的基线温暖温度（28-30°C）。这个范围确保小鼠不需要消耗额外的能量来维持恒定的体温。为了获得代谢适度或高活性（产热）BAT，可以分别选择温和的寒冷（20-22°C）或严寒（6°C）温度。出于该实验的目的，在22°C的标准饲养条件下饲养小鼠，尽管对小鼠来说温和寒冷，但不涉及任何药理学刺激。

  1. 温度适应
    1. 在开始温度适应之前至少1周，将小鼠分开，每个笼子容纳1或2只小鼠。准备配备空气通风、温度和湿度控制的啮齿动物培养箱，并满足所需条件。
    2. 在适当的日子将笼子移至各自的啮齿动物培养箱中，以适应所选的温度。
    3. 确保小鼠数量在所有组中的分布均匀，每个笼子有 1 或 2 只小鼠。单体壳是首选，因为与组壳体相比，单体壳体对温度引起的生理变化更敏感43.以下是每个群体的具体住房条件：
      1. 热中性（30°C）组：将该组中的小鼠在30°C的温度下连续保存长达四个星期。
      2. 严寒组：最初，将该组中的小鼠饲养在18°C，没有任何筑巢材料。它们将经历每周逐渐下降的温度，到第四周达到 6 °C。温度变化如下：18°C→14°C→10°C→6°C。
      3. 轻度寒冷组（20-22°C）：在与前面提到的标准饲养条件相同的条件下，将该组中的小鼠饲养在啮齿动物培养箱中。
      4. 急性冷挑战：对于急性冷挑战，在没有任何筑巢材料的情况下，每个笼子放置1-2只小鼠，并将它们暴露在6°C的啮齿动物培养箱中长达8小时。
        注意：这些住房条件和温度变化对于研究不同温度环境对 BAT 活性和新陈代谢的影响至关重要。
    4. 每周更换笼子并补充食物和水。在补充前至少24小时，在各自的温度（啮齿动物培养箱）下预适应笼子。
      注意：为了防止适当温度刺激的干扰，重要的是不要提供可能导致筑巢的小鼠富集。为了应对严寒，小鼠会消耗更多的能量来维持体温，从而增加食物摄入量和排泄率。因此，每周至少检查笼子两到三次（遵循当地机构指南）至关重要，以确保小鼠有足够的食物和水供应，并且笼子不会过度潮湿。这种监测对于在研究期间维持小鼠的福祉和健康至关重要。
  2. 使用 β3-肾上腺素能受体激动剂 CL316,243 进行药理学刺激1
    1. 为了最大限度地提高刺激效果，在注射前将小鼠预置于热中性（30°C）下2-4周。
    2. 驯化期后，腹膜内注射1mg/kg CL316,243。
      注意：对于β3-肾上腺素能受体激动剂的慢性刺激（例如 从3天到第1,44,45周），由于药物稳定性，需要每天注射。稀释的CL316,243应在注射当天制备，因为稳定性。

2. 动静脉采血

注意：最好建议12-14周以上的小鼠进行动静脉采血。年轻的小鼠可能没有足够大小的苏尔寿静脉，这是一种独特的血管，专门从肩胛间 BAT46 排出静脉血。

  1. 使用校准的汽化器轻轻麻醉，其中 3% 异氟醚用于诱导（在 205 x 265 x 200 毫米大小的腔室中）和 2% 异氟醚用于维护（使用气体麻醉面罩）。
    注意：整个动静脉采样程序应在麻醉后立即进行。麻醉期间可以使用水加热的加热垫来维持核心体温。
    注意：异氟醚吸入时具有高度挥发性和毒性。因此，一期麻醉必须在通风橱下进行。
  2. 验证动物的反应，例如爪子缩回，以确认麻醉已达到适当的深度。
  3. 从苏尔寿静脉采集静脉血
    1. 放置鼠标以暴露背部皮肤，在切口前通过脚趾捏合确认麻醉深度。用充足的 70% 乙醇润湿背部皮肤以防止毛发脱落，并沿着胸部下部一直切开一个切口，一直到颈部。
      注意：肩胛间 BAT 位于皮肤正下方，由两个脂肪垫组成，上面覆盖着薄薄的白色脂肪组织。重要的是要确保小鼠通过气体麻醉面罩保持麻醉状态。
    2. 用弯曲的尖端镊子轻轻提起肩胛间 BAT，小心地切割附着的组织，其中大部分是肌肉。将脂肪垫抬向头部，继续切割附着的组织并小心地打开该区域，直到苏尔寿静脉（连接到肩胛间 BAT 的两个脂肪垫的“Y”形深红色大血管）暴露出来。
      注意：注意不要切割与肩胛间 BAT 前部和侧面区域相连的肌肉组织的毛细血管，因为这样做会显着降低从苏尔寿静脉排出的血液量和质量。
    3. 小心地切开苏尔寿的静脉，并使用底部切口的 200 μL 移液器吸头和 P100 移液器收集约 40 μL 血液。将血液储存在采血管中，并将管子放在冰上，直到血清采集过程。
      注意：重要的是从苏尔寿静脉的 Y 形分割点正下方收集血液，以防止血液污染来自上腔静脉47。收集过多的血液会削弱苏尔寿静脉的特征。因此，请务必从苏尔寿静脉中收集所需的最低量血液进行分析。选择采血管时要深思熟虑，因为血清和血浆会产生不同的代谢物谱 48,49,50。对于血浆采集，有必要使用肝素包被的管。在该实验中，选择凝血活化剂包被的管子来获得血清。在任何情况下都不应使用EDTA涂层管，因为EDTA会显著影响质谱信号51,52。
  4. 从左心室采集动脉血
    1. 翻转鼠标而不失去与鼻锥的接触，露出腹侧皮肤。在切口之前通过脚趾捏确认麻醉深度。用足量的70%乙醇润湿腹侧皮肤，以防止毛发脱落，并用剪刀小心地打开胸腔，在不破坏任何内部结构的情况下露出心脏。
    2. 使用 1 mL 注射器和 29 G（1/2“）针头准确刺穿左心室的顶点区域。将三分之二的1/2英寸针插入心尖右侧水平3-5mm处（图1B），然后将注射器向后拉以从左心室收集血液（50-100μL）。左心室的血液是含氧动脉血，呈鲜红色。将血液储存在采血管中，并将管子放在冰上，直到血清采集过程。
      注意：应在胸腔内做一个最小的切口，以便进入心脏。切口过多可能导致局部出血，进而导致低血压。这可能会影响从左心室收集的动脉血的质量。避免旋转或翻转心脏，因为这会使确定左心室的精确位置变得困难。
    3. 执行安乐死，并按照当地机构的指导方针使用适当的方法确保安乐死。例如，安乐死可以通过颈椎脱位进行，并通过心跳停止来确认。
  5. 在4°C下以10,000× g 离心血液样品10分钟。 使用移液管小心收集上清液。上清液应含有血清或血浆，具体取决于所用采血管的类型。可以在这里停下来，将样品储存在-20°C下，直到血清处理以进行GC-MS分析。
    注意：如果观察到红色上清液，则可能发生溶血。为避免溶血，请在凝血完成前涡旋样品。一些富含红细胞的代谢物（包括谷氨酰胺和乳酸）可能导致数据误解，尽管大多数代谢物可能不会受到溶血的显着影响。建议在一周内分析血清/血浆。

3. 从血清中提取代谢物和化学衍生化

  1. 提取准备
    注：包括代谢物提取、衍生化和数据分析在内的所有方法都是先前描述的方法53,54 的略微修改版本。
    1. 通过向MS级甲醇中加入100μM的DL-正缬氨酸内标溶液（参见 材料表）来制备提取缓冲液。
    2. 确保所有实验程序都在冰上进行。
  2. 将从苏尔寿静脉或左心室提取的 10 μL 小鼠血清转移到含有 40 μL 提取缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 为了除去细胞碎片和蛋白质，短暂涡旋血清样品，然后在4°C下以最大速度（18,000× g）离心30分钟。
  4. 离心后，小心地将40μL上清液转移到玻璃小瓶中，然后在4°C的真空离心机中干燥3小时。
    注意：建议使用玻璃插件（参见 材料表）代替塑料管，因为在随后的衍生化步骤中使用了塑料反应性化学品。
  5. 将干燥的样品进行两个连续的衍生化步骤，以对血清代谢物进行GC-MS分析。
    注意： 由于溶剂的刺激风险，应在通风橱下执行以下步骤。
    1. 将干燥的血清提取物重悬于溶解在吡啶中的30μL10mg / mL甲氧胺盐酸盐（参见 材料表）中，并在37°C下孵育30分钟。
    2. 用70μLN-甲基-N-叔丁基二甲基硅基四氟乙酰胺（MTBSTFA，参见 材料表）在70°C下衍生用于代谢物硅烷化1小时的样品。
      注意：由于衍生化溶剂与塑料发生反应，因此建议在以下步骤中使用玻璃注射器而不是塑料尖端。

4. 使用GC-MS进行代谢组学分析

注：采用单联 GC-MS（见 材料表）测量苏尔寿静脉和左心室衍生样品中的各种血清代谢物，包括碳水化合物、氨基酸和 TCA 循环中间体。也可以使用其他色谱柱，尽管包括温度程序在内的实验设置可能会因所用色谱柱的类型而异。

  1. 在280°C（入口温度）下，使用氦气作为流速为1.500mL / min（设定点）的载气，以不分流模式将1μL衍生化样品注入GC中。
  2. 将四极杆设置为200°C，GC-MS接口设置为300°C。
    注意：所有代谢物分析的烘箱程序从60°C开始，保持1分钟，然后以10°C / min的速率增加，直到温度达到320°C。
  3. 通过设置为 70 eV 的电子电离 （EI） 收集数据，并在扫描模式 （50-550 m/z） 53 下获取样品数据。本研究中使用的所有代谢物均已通过标准品验证，以确认质谱和保留时间。
  4. 使用市售分析软件进行峰面积积分（参见 材料表）。
  5. 将化合物与每个TBMDS衍生物的子离子相匹配。然后，通过将碎片离子的 m/z 值积分到相应峰面积，得到提取离子色谱图（EIC），然后导出。碎片离子如 表1所示。
    注：每个样品中每种化合物的EIC均由DL-正缬氨酸归一化。数据由对数2 苏尔寿左心室静脉 （Log2（SV/LV）） 表示，使用每个归一化 EIC 值。

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Representative Results

图 1 显示了 BAT 优化房室代谢组学的实验方案。如协议部分所述，为了获得差异刺激的棕色脂肪组织，小鼠使用啮齿动物培养箱进行温度驯化或接受药理学给药，例如β-肾上腺素能受体激动剂。随后，麻醉小鼠，并收集血液样本进行代谢组学分析（图1A）。对于血液采样， 通过 苏尔寿静脉收集从肩胛间 BAT 特异性引流的静脉血，而直接从心脏左心室收集动脉血（图 1B）。

图2 表示使用GC-MS的血清代谢组学示意图（图2）。简而言之，将甲醇溶液添加到血清样品中，然后离心以除去血清蛋白。将含有代谢物的上清液在 SpeedVac 中干燥，并使用甲氧胺 （MOX） 和 MTBSTFA（N-叔丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺）对干燥的样品进行两步衍生化。衍生化步骤旨在用TBDMS酯取代代谢物的极性官能团，从而允许GC-MS检测作为TBDMS衍生物的代谢物。使用单四联GC-MS分析衍生化样品。代谢物根据其理化性质在色谱柱中分离。电子电离 （EI） 用于将代谢物分解成由质谱检测器检测到的独特碎片离子。化合物鉴定是通过检测化合物特异性碎片离子进行的。实验中化合物特异性碎片离子的m/z值和保留时间如表所示（表1）。提取的离子色谱图（EIC）用于将化合物特异性碎片离子的信号整合到代谢物的峰面积中，从而定义代谢物的丰度。

为了确定 BAT 是否释放或摄取一系列代谢物，可以计算苏尔寿静脉和左心室之间离子计数的 Log2 比率 （Log2（SV/LV））（图 3）。如果特定代谢物的 Log2（SV/LV） 值为 >0，则表明代谢物在 SV 中比 LV 更丰富，表明肩胛间 BAT 网释放代谢物。相反，如果某种代谢物的 Log2（SV/LV） 值为 <0，则表明该代谢物被肩胛间 BAT 吸收。

使用这种方法，发现轻度冷刺激的 BAT 显着消耗葡萄糖、乳酸、3-羟基丁酸 （3-HB）、支链氨基酸、天冬氨酸、赖氨酸和色氨酸，而 BAT 显着释放琥珀酸盐和棕榈酸酯（图 3A）。这些现象中的大多数是在我们之前对慢性感冒 BAT42 的研究中观察到的，这表明轻度感冒 BAT 在代谢上类似于慢性感冒 BAT，尽管程度较小。为了提供数据的快速可视化概览，描绘了显示 Log2（SV/LV） 值的热图（图 3B）。必须谨慎解释数据，因为热图代表组内的 Z 分数。

Figure 1
图1：BAT优化动静脉（AV）代谢组学的实验方案。 （A） 显示房室代谢组学工作流程的图表。（1）为了诱导不同版本的代谢刺激棕色脂肪组织（BAT），小鼠适应不同的温度或接受药物注射。（2）随后，分别从小鼠的左心室和苏尔寿静脉收集动脉和静脉血样。（3）对所得血清样品进行代谢物提取，然后进行代谢组学分析。（B） 为采血程序提供指导的代表性图像。动脉血是从左心室收集的，而静脉血是从苏尔寿静脉中获取的，因为它专门从 BAT 中排出血液。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图2：基于GC/MS的靶向代谢组学。 基于GC/MS的靶向代谢组学实验方案。TBDMS：叔丁基二甲基硅烷基，EI：电子电离，EIC：提取离子色谱图。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3：代表性房室代谢组学数据。 （A） 最佳可得技术对选定的普遍和高活性循环燃料代谢物的吸收和随后释放，按其各自的类别分类。数据显示 Log2 苏尔寿静脉与左心室 （SV/LV） 的比率。表示平均 Log2 （SV/LV） <0 的代谢物的条形为红色，Log2 （SV/LV） >0 为蓝色。单个数据点代表每只鼠标;n = 11。数据是 SEM ±平均值。 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。支链氨基酸;支链氨基酸;监管局;必需氨基酸;国家能源局;非必需氨基酸。（B） 热图，说明苏尔寿静脉 （SV） 和左心室 （LV） 血之间代谢物丰度的差异。每列显示组内平均值的 Z 分数;n = 11。 请点击这里查看此图的较大版本.

复合 碎片离子的 m/z 保留时间 配方 TBDMS导数公式
丙酮 酸 174.1 8.72 分子式：C3H4O3 分子式：C15H33O3NSi2
天冬氨酸 418.2 18.45 C4H7NO4 分子式：C22H49NO4Si3
α-酮戊二酸 346.2 17.27 分子式：C5H6O5 分子式：C18H37NO5Si2
C16：0（棕榈酸酯） 313.3 19.72 C16H32O2 分子式：C22H46O2Si
授乳 261.2 11.66 分子式：C3H6O3 分子式：C15H34O3Si2
亮氨酸 200.2 14 C6H13NO2 分子式：C18H41NO2Si2
异亮氨酸 200.2 14.34 C6H13NO2 分子式：C18H41NO2Si2
缬氨酸 186.2 13.53 C5H11NO2 分子式：C17H39NO2Si2
丙氨酸 260.2 12.17 C3H7NO2 分子式：C15H35NO2Si2
丝氨酸 390.2 17.04 C3H7NO3 分子式：C21H49NO3Si3
甘氨酸 218.1 12.43 C2H5NO2 分子式：C14H33NO2Si2
赖氨酸 300.2 20.48 C6H14N2O2 分子式：C24H56N2O2Si3
琥珀酸 289.1 14.65 分子式：C4H6O4 分子式：C16H34O4Si2
脯氨酸 258.2 14.73 C5H9NO2 分子式：C17H37NO2Si2
苯丙氨酸 336.2 18 C9H11NO2 分子式：C21H39NO2Si2
蛋氨酸 320.2 16.84 C5H11NO2S 分子式：C17H39NO2SSi2
半胱氨酸 406.2 19 C3H7NO2S 分子式：C21H49NO2SSi3
天冬酰胺 417.2 19.86 C4H8N2O3 分子式：C22H50N2O3Si3
3-羟基丁酸酯（3HB） 275.2 12.81 分子式：C4H8O3 分子式：C16H36O3Si2
色氨酸 375.2 22.97 C11H12N2O2 分子式：C23H40N2O2Si2
苹果酸 419.2 18.19 分子式：C4H6O5 分子式：C22H48O5Si3
谷氨酸 432.3 19.59 C5H9NO4 分子式：C23H51NO4Si3
谷氨酰胺 431.3 20.85 C5H10N2O3 分子式：C23H52N2O3Si3
柠檬酸盐 459.2 22.38 分子式：C6H8O7 分子式：C30H64O7Si4
葡萄糖 476.3 22.7 C6H12O6 分子式：C30H68O6Si4

表1：用于积分的GC/MS化合物碎片离子。 该表包含在本方法中鉴定的25种血清代谢物的列表，以及每种化合物对应的保留时间和碎片离子。

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Discussion

了解 BAT 在全身能量平衡中的代谢潜力的一个关键步骤是确定它消耗了哪些营养物质，它们是如何代谢处理的，以及哪些代谢物被释放到循环中。该协议引入了一种专门的动静脉取样技术，该技术能够进入 C57BL/6J 小鼠肩胛间 BAT 和全身动脉脉管系统的静脉脉管系统，该技术最近由 Park 等人42 开发和验证。以下是您在遵循协议时应认真考虑的关键点。

对于生热刺激，一个关键的考虑因素是为您的实验环境选择最合适的生热刺激类型。例如，当使用实验组（与对照组）并旨在观察 BAT 的代谢适应能力（对其最大非颤抖生热潜力至关重要）的差异时，慢性冷适应或β肾上腺素能受体刺激（持续超过 3 天至 4 周）是合适的 1,45.当 BAT 暴露于急性冷暴露（少于 24 小时）时，BAT 不会进行代谢适应，而是代谢其内在储存的燃料并与颤抖的肌肉进行代谢交流以获得最佳产热1。β肾上腺素能受体激动剂代表触发BAT产热的神经元反应1,14，并且还有其他内分泌因子增强产热程序55,56,57,58,59,60。每当进行上述产热刺激时，在热中性（30°C）下进行基线控制应该有助于确认刺激是否正确有效。

如协议部分所述，获得最高质量的动静脉血是确定实验成功建立的关键。为此，必须防止溶血（参见步骤 2.5）并收集一致量的血液，以避免从苏尔寿静脉稀释静脉血的独特特征（苏尔寿静脉的静脉血少于 40 μL）。为此，在初始设置期间，作者强烈建议进行代谢物测量的试点实验，不仅使用苏尔寿静脉的血液，还使用非 BAT 引流静脉血（例如下腔静脉）的血液。这将有助于确认与非 BAT 静脉血管相比，苏尔寿静脉的血清是否显示出不同的代谢物谱。关于从左心室采集动脉血，重要的是始终如一地穿刺左心室的同一区域，以尽量减少心因子水平的变化 61,62。这种变异可能会在动静脉代谢组学或蛋白质组学中产生令人困惑的结果。

色谱与质谱联用是代谢组学最强大的工具之一，其中一种方法是GC-MS63。事实上，由于覆盖率问题，使用GC-MS测量生物学相关代谢物被认为具有挑战性;GC-MS的应用通常仅限于分析具有高度挥发性和非极性特性的代谢物，而不是组织和生物体液中的众多极性代谢物。然而，各种萃取和衍生化方法的发展，以及GC-MS的优点，包括出色的峰分辨率、重现性和广泛的质谱库，允许方便的峰鉴定，使这样的平台成为分析生物相关代谢物的有吸引力的选择64,65。

在该方案中，GC-MS平台用于分析使用上述技术收集的血清中的25种代谢物。为此，使用80%甲醇溶液进行代谢物提取。值得注意的是，在此步骤中，建议使用某些类型的试管，包括 Eppendorf 试管，以达到样品中最低的有机物质污染水平。提取后还需要仔细分离沉淀中的上清液，以去除血清中的蛋白质碎片，这对于维持MS离子源的性能至关重要。

衍生化步骤可以根据衍生化类型（包括芳基衍生物、硅烷化和酰化66）进行多样化。作者采用N-甲基-N-叔丁基二甲基硅基六氟乙酰胺（MTBSTFA）的两步衍生化进行代谢物唾液酸化，这是一种常用的方法，具有稳定检测生物相关极性代谢物（包括糖）的优点，但缺点是在分析步骤64中偶尔会损失N-三甲基硅基的胺和氨基酸.值得注意的是，由于试剂和衍生物的水分敏感性，样品应在衍生化步骤之前完全干燥。

一般来说，GC分析的主要局限性之一仍然归结为可检测代谢物的范围，尽管上述衍生化步骤提高了GC-MS在极性代谢物检测方面的能力，特别是与基于LC-MS的分析相比。使用LC-MS的定量代谢组学可以极大地帮助更好地了解BATs在全身代谢物交换方面的代谢谱24,42。

虽然在协议中使用的计算 - 测量动脉与动脉之间的代谢物浓度梯 度。静脉血;Log2（SV/LV）-量化BAT的吸收和释放分数变化，数据解释需要谨慎。特别是，对于那些分数净交换值为“0”的代谢物（例如柠檬酸盐、 αKG、苹果酸、蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺），结果可归因于无摄取/释放或同样活跃的分解代谢和合成（摄取和释放都很高）。为了验证这两种可能性中的哪一种是正确的，有必要在 体内 使用同位素示踪对吸收的代谢物和/或其底物进行额外的代谢通量实验39。

分数计算的局限性在于它不能提供这些代谢物的摄取和释放的定量景观42,67。例如，虽然Log2（SV/LV）值表明葡萄糖和3-羟基丁酸酯（3HB）之间的相对净摄取相当，但由于葡萄糖的血液浓度远高于3HB，并且葡萄糖含有4个碳（葡萄糖有6个碳，3HB有两个碳），因此葡萄糖对碳源的实际贡献应该远高于3-HB。如果需要，综合分析包括其他参数，例如血流速率、每种代谢物的实际血液浓度及其化学方程式，应告知我们吸收/释放的代谢物的定量贡献及其对总碳或氮通量的贡献 42,67。

这种用于小鼠水平动静脉采样和代谢组学分析的小型化方法的一个主要优点是它与各种遗传模型的协同组合，以研究棕色脂肪组织代谢和生理学（例如UCP1-KO，UCP1-Cre驱动的BAT特异性功能丧失模型，转基因模型）。最近的代谢组学分析只需要微量的血清进行代谢组学分析，这使得这种方法在较小的生物体上更加可行（见方案3）39。然而，蛋白质组学分析在与代谢组学一起考虑时可以提供更好的见解，可能需要更多的样品。在这方面，使用大鼠进行常规动静脉取样可能更合适。我们向读者推荐了由Mestres-Arenas及其同事撰写的最新大鼠BAT动静脉血液采样方案47。

尽管目前的方案采用Park等人42中描述的使用异氟醚的麻醉程序，但这种方法可能会对体内棕色脂肪细胞和/或棕色脂肪组织的产热代谢产生负面影响68,69,70,71。因此，未来利用戊巴比妥的动静脉代谢组学值得研究。

总之，该协议提供了一种基本方法，用于测量各种产热刺激下BAT特异性的净代谢活性（消耗 与生产）。这应该通过定量列出关键的代谢燃料和分泌的代谢物，为我们提供有关 BAT 作为系统营养汇和提供者的作用的宝贵见解。此外，这也可用于识别以前未研究的代谢物衍生的棕色脂肪因子，特别是当使用基于发现的代谢组学平台操作时。

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Disclosures

作者声明他们没有利益冲突需要报告。

Acknowledgments

我们感谢Choi和Jung实验室的所有成员进行的方法论讨论。我们感谢 C. Jang 和 D. Guertin 提供的建议和反馈。我们感谢 M.S. Choi 对手稿的批判性阅读。这项工作由 NRF-2022R1C1C1012034 资助给 S.M.J.;NRF-2022R1C1C1007023 至 D.W.C;NRF-2022R1A4A3024551 至 S.M.J. 和 D.W.C.这项工作得到了忠南国立大学对WTK的支持，图1和图2是使用BioRender（http://biorender.com/）创建的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

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