Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Артериовенозная метаболомика для измерения обмена метаболитов in vivo в бурой жировой ткани

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

В этом протоколе изложены методы, релевантные для BAT-оптимизированной артериовенозной метаболомики с использованием ГХ-МС на мышиной модели. Эти методы позволяют получить ценную информацию о BAT-опосредованном обмене метаболитов на уровне организма.

Abstract

Бурая жировая ткань (BAT) играет решающую роль в регулировании метаболического гомеостаза посредством уникального процесса расхода энергии, известного как термогенез без дрожания. Для достижения этой цели BAT использует разнообразное меню циркулирующих питательных веществ для поддержания своей высокой метаболической потребности. Кроме того, BAT выделяет биоактивные факторы, полученные из метаболитов, которые могут служить либо метаболическим топливом, либо сигнальными молекулами, облегчая BAT-опосредованную внутритканевую и/или межтканевую коммуникацию. Это говорит о том, что BAT активно участвует в системном обмене метаболитов, интересная особенность, которая начинает изучаться. Здесь мы представляем протокол для оптимизированного артериовенозного метаболомики БАТ на уровне мышей in vivo . Протокол фокусируется на соответствующих методах термогенной стимуляции и технике забора артериовенозной крови с использованием вены Зульцера, которая избирательно дренирует межлопаточную венозную кровь, полученную из BAT, и системную артериальную кровь. Затем демонстрируется протокол метаболомики на основе газовой хроматографии с использованием этих образцов крови. Использование этого метода должно расширить понимание метаболитов, регулируемого БАТ на межорганном уровне, путем измерения чистого поглощения и высвобождения метаболитов БАТ.

Introduction

Бурая жировая ткань (BAT) обладает уникальным свойством расхода энергии, известным как недрожащий термогенез (NST), который включает в себя как митохондриальный разъединяющий белок 1 (UCP1), так и UCP1-независимый механизмы 1,2,3,4,5. Эти отличительные характеристики указывают на то, что БАТ участвует в регуляции системного метаболизма и патогенезе метаболических заболеваний, включая ожирение, сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания и раковую кахексию 6,7,8. Недавние ретроспективные исследования показали обратную связь между массой БАТ и/или ее метаболической активностью с ожирением, гипергликемией и кардиометаболическим здоровьем у людей 9,10,11.

Недавно BAT был предложен в качестве метаболического поглотителя, ответственного за поддержание NST, поскольку он требует значительного количества циркулирующих питательных веществ в качестве термогенного топлива 6,7. Кроме того, BAT может генерировать и высвобождать биологически активные факторы, называемые коричневыми адипокинами или BATokines, которые действуют как эндокринные и/или паракринные сигналы, что указывает на его активное участие в метаболическом гомеостазе на системном уровне 12,13,14,15. Таким образом, понимание метаболизма питательных веществ БАТ должно улучшить наше понимание его патофизиологического значения для человека, выходящего за рамки его традиционной роли в качестве органа терморегуляции.

Метаболомные исследования с использованием стабильных изотопных индикаторов в сочетании с классическими исследованиями поглощения питательных веществ с использованием неметаболизируемых радиоиндикаторов значительно улучшили наше понимание того, какие питательные вещества предпочтительно поглощаются БАТ и как они используются 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Например, исследования радиоактивных индикаторов показали, что БАТ, активированный холодом, поглощает глюкозу, жирные кислоты, связанные с липопротеинами, и аминокислоты с разветвленной цепью 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Недавнее отслеживание изотопов в сочетании с метаболомными исследованиями позволило нам измерить метаболическую судьбу и поток этих питательных веществ в тканях и культивируемых клетках 24,25,26,28,29,30. Тем не менее, эти анализы в первую очередь сосредоточены на индивидуальном использовании питательных веществ, оставляя нам ограниченные знания о роли BAT на системном уровне в обмене метаболитов органов. Вопросы, касающиеся конкретных серий циркулирующих питательных веществ, потребляемых БАТ, и их количественного вклада в пересчете на углерод и азот, остаются неясными. Кроме того, изучение того, может ли BAT генерировать и высвобождать метаболиты BATokines (например, липокины) с использованием питательных веществ, только начинается 12,13,14,15,31,32.

Артериовенозный анализ крови является классическим физиологическим подходом, используемым для оценки специфического поглощения или высвобождения циркулирующих молекул в органах/тканях. Этот метод ранее применялся к межлопаточной БАТ крыс для измерения кислорода и нескольких метаболитов, тем самым установив БАТ в качестве основного места адаптивного термогенеза с его катаболическим потенциалом 33,34,35,36,37. Недавно артериовенозное исследование с использованием межлопаточного БАТ крыс было объединено с трансомиксным подходом, что привело к идентификации неоткрытых BATokins, высвобождаемых термогенно стимулированным BAT38.

Последние достижения в области высокочувствительной газовой хроматографии и жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС и ЖХ-МС) на основе метаболомики возродили интерес к артериовенозным исследованиям для количественного анализа органоспецифического метаболитного обмена 39,40,41. Эти методы, обладающие высокой разрешающей способностью и точностью по массе, позволяют проводить всесторонний анализ широкого спектра метаболитов с использованием небольших количеств образцов.

В соответствии с этими достижениями недавнее исследование успешно адаптировало артериовенозную метаболомику для изучения БАТ на мышином уровне, что позволило провести количественный анализ активности обмена метаболитов в БАТ вразличных условиях. В данной статье представлен протокол артериовенозной метаболомики, нацеленный на BAT, с использованием ГХ-МС на мышиной модели C57BL/6J.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Сонгюнгван. Мыши были помещены в одобренное IACUC помещение для животных, расположенное в чистом помещении с температурой 22 °C и влажностью 45% в соответствии с ежедневным 12-часовым циклом света и темноты. Они содержались в вентилируемых стойках и имели доступ к стандартной диете чау-чау вволю (состоящей из 60% углеводов, 16% белков и 3% жиров). Подстилка и материалы для гнездования менялись еженедельно. Для этого исследования были использованы самцы мышей C57BL/6J в возрасте 12 недель и массой от 25 до 30 г. Эти животные были получены от коммерческого поставщика (см. Таблицу материалов).

1. Модуляция метаболической активности бурой жировой ткани посредством температурной акклиматизации и фармакологической стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Температурная акклиматизация в течение нескольких дней или недель или фармакологическая стимуляция с использованием агонистов β-адренорецепторов являются обычно используемыми методами для модуляции активности БАТ1. Поэтому ниже приводится краткий обзор метода, чтобы читатели могли выбрать подходящий подход по мере необходимости. Для получения метаболически неактивного (менее термогенного) БАТ для мышей C57BL/6J выбирается базовая теплая температура, называемая термонейтральностью (28-30 °C). Этот диапазон гарантирует, что мышам не нужно тратить дополнительную энергию на поддержание постоянной температуры тела. Для получения метаболически умеренно или высокоактивного (термогенного) БАТ можно выбрать соответственно умеренные холодные (20-22 °С) или сильные холодные (6 °С) температуры. Для целей этого эксперимента мышей выращивали в стандартных условиях содержания при температуре 22 °C, которые, хотя и были умеренно холодными для мышей, не включали никаких фармакологических стимулов.

  1. Температурная акклиматизация
    1. Разделите мышей на 1 или 2 мышей в клетку, по крайней мере, за 1 неделю до начала температурной акклиматизации. Подготовьте инкубаторы для грызунов, оснащенные вентиляцией воздуха, контролем температуры и влажности с нужными условиями.
    2. Переместите клетки в соответствующие инкубаторы для грызунов в соответствующие дни для выбранного типа температурной акклиматизации.
    3. Убедитесь, что количество мышей равномерно распределено по всем группам, по 1 или 2 мыши в клетке. Одноместное содержание предпочтительнее, так как оно более чувствительно к физиологическим изменениям, вызванным температурой, по сравнению с групповым содержанием43. Вот конкретные жилищные условия для каждой группы:
      1. Группа термонейтральности (30 °C): Держите мышей в этой группе постоянно при температуре 30 °C в течение четырех недель.
      2. Группа сильных холодов: Первоначально содержате мышей в этой группе при температуре 18 °C без каких-либо материалов для гнездования. У них будет наблюдаться постепенное еженедельное снижение температуры, достигающее 6 °C к четвертой неделе. Изменение температуры выглядит следующим образом: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Группа с умеренным холодом (20-22 °C): Содержание мышей этой группы в инкубаторах для грызунов в тех же условиях, что и стандартные условия содержания, упомянутые ранее.
      4. Острые проблемы холода: В случае острого холода поместите 1-2 мышей в клетку без каких-либо материалов для гнездования и поместите их в инкубатор для грызунов, установленный при температуре 6 °C, на срок до 8 часов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия содержания и колебания температуры имеют важное значение для изучения влияния различных температурных сред на активность и метаболизм летучих мышей.
    4. Меняйте клетки и пополняйте запасы корма и воды каждую неделю. Предварительно акклиматизируйте клетки не менее чем за 24 часа до внесения добавок при соответствующей температуре (инкубатор для грызунов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить нарушение соответствующего температурного стимула, важно не давать мышам обогащение, которое может привести к строительству гнезда. В ответ на сильный холод мыши тратят больше энергии на поддержание температуры тела, что приводит к увеличению потребления пищи и более высокой скорости выделения. Поэтому крайне важно проверять клетки не реже двух-трех раз в неделю (в соответствии с местными рекомендациями), чтобы убедиться, что у мышей есть достаточный запас пищи и воды, и что клетки не чрезмерно влажные. Этот мониторинг необходим для поддержания благополучия и здоровья мышей во время исследования.
  2. Фармакологическая стимуляция1 с использованием агониста β3-адренорецепторов CL316,243
    1. Для достижения максимального стимулирующего эффекта мышей предварительно содержат при термонейтральности (30 °C) в течение 2-4 недель перед инъекциями.
    2. После периода акклиматизации внутрибрюшинно вводят 1 мг/кг CL316,243.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При хронической стимуляции агонистом β3-адренорецепторов (например, от 3 дней до 1,44,45 недель) необходимы ежедневные инъекции из-за стабильности препарата. Разбавленный CL316,243 следует готовить в день инъекции из-за стабильности.

2. Забор артериовенозной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам старше 12-14 недель лучше всего рекомендовать для забора артериовенозной крови. У молодых мышей может не быть достаточно больших вен Зульцера, отдельного кровеносного сосуда, который специфически дренирует венозную кровь из межлопаточного BAT46.

  1. Осторожно обезболивайте с помощью откалиброванного испарителя с 3% изофлураном для индукции (в камере размером 205 x 265 x 200 мм) и 2% изофлураном для поддержания (с помощью маски для газовой анестезии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура забора артериовенозной крови должна быть выполнена сразу после анестезии. Во время анестезии можно использовать грелку с водяным подогревом для поддержания температуры тела.
    ВНИМАНИЕ: Изофлуран очень летуч и токсичен при вдыхании. Поэтому первичная анестезия должна проводиться под вытяжным шкафом.
  2. Проверьте рефлексы животного, такие как втягивание лапы, чтобы убедиться, что анестезия достигла соответствующей глубины.
  3. Забор венозной крови из вены Зульцера
    1. Расположите мышь так, чтобы обнажить спинную кожу, подтвердите глубину анестезии с помощью щипкового пальца ноги прямо перед тем, как сделать разрез. Смочите спинную кожу достаточным количеством 70% этанола, чтобы предотвратить отслоение волос, и сделайте разрез вдоль спины от нижней части грудной клетки до шеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Межлопаточная летучая мышь расположена прямо под кожей и состоит из двух жировых пакетов, покрытых тонкими белыми жировыми тканями. Важно следить за тем, чтобы мышь оставалась под наркозом через маску газовой анестезии.
    2. Осторожно приподнимите межлопаточную БАТ щипцами с загнутым кончиком и осторожно обрежьте прикрепленные ткани, большинство из которых являются мышцами. Поднимите жировую подушку вверх по направлению к голове, продолжайте разрезать прикрепленные ткани и осторожно вскрывайте область до тех пор, пока не обнажится вена Зульцера (большой Y-образный темно-красный сосуд, соединенный с обоими жировыми пакетами межлопаточного BAT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не перерезайте капиллярные сосуды мышечных тканей, которые связаны с передней и боковой областью межлопаточного БАТ, так как это значительно уменьшит количество и качество крови, стекающей из вены Зульцера.
    3. Осторожно перережьте вену Зульцера и соберите примерно 40 мкл крови с помощью наконечников дозатора 200 мкл и пипетки P100. Храните кровь в пробирке для забора крови и держите пробирку на льду до начала процесса сбора сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно собирать кровь чуть ниже Y-образной точки деления вены Зульцера, чтобы предотвратить загрязнение крови из верхней полой вены47. Забор слишком большого количества крови ухудшит характеристики вены Зульцера. Таким образом, обязательно возьмите минимальное количество крови из вены Зульцера для анализа. Будьте внимательны при выборе пробирок для забора крови, так как сыворотка и плазма дают различные профили метаболитов 48,49,50. Для забора плазмы необходимо использовать пробирки с гепариновым покрытием. В этом эксперименте для получения сыворотки были выбраны пробирки, покрытые активатором свертывания крови. Ни в коем случае нельзя использовать пробирки с покрытием ЭДТА, так как ЭДТА существенно влияет на сигналы масс-спектрометрии51,52.
  4. Забор артериальной крови из левого желудочка
    1. Переверните мышь, не теряя контакта с носовым обтекателем, чтобы обнажить вентральную кожу. Перед выполнением разреза подтвердите глубину анестезии с помощью щипкового пальца ноги. Смочите вентральную кожу достаточным количеством 70% этанола, чтобы предотвратить отслоение волос, и осторожно вскрывайте грудную полость ножницами, чтобы обнажить сердце, не повреждая внутреннюю структуру.
    2. Точно проколите область верхушки левого желудочка с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 29 G (1/2 дюйма). Введите две трети иглы диаметром 1/2 дюйма на 3-5 мм вправо от вершины сердца (рис. 1B) и потяните шприц назад, чтобы собрать кровь из левого желудочка (50-100 мкл). Кровь из левого желудочка представляет собой насыщенную кислородом артериальную кровь, ярко-красного цвета. Храните кровь в пробирке для забора крови и держите пробирку на льду до начала процесса сбора сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В грудной полости должен быть сделан минимальный разрез для доступа к сердцу. Чрезмерный разрез может привести к местному кровотечению, которое впоследствии может привести к низкому кровяному давлению. Это может повлиять на качество артериальной крови, собранной из левого желудочка. Избегайте вращения или переворачивания сердца, так как это затруднит определение точного положения левого желудочка.
    3. Проводите эвтаназию и обеспечьте ее надлежащим методом, следуя рекомендациям местных учреждений. Например, эвтаназия может быть проведена при вывихе шейки матки и подтверждена прекращением сердцебиения.
  5. Центрифугетируют образцы крови при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Аккуратно соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Надосадочная жидкость должна содержать либо сыворотку, либо плазму в зависимости от типа используемой пробирки для забора крови. Здесь можно остановиться и хранить образцы при температуре -20 °C до обработки сыворотки для анализа ГХ-МС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гемолиз потенциально мог возникнуть, если наблюдается надосадочная жидкость красного цвета. Чтобы избежать гемолиза, встряхните образец до завершения свертывания крови. Некоторые метаболиты, обогащенные эритроцитами, включая глютамин и лактат, могут привести к неверной интерпретации данных, хотя на большинство метаболитов гемолиз может существенно не влиять. Рекомендуется анализ сыворотки/плазмы в течение недели.

3. Извлечение метаболитов из сыворотки крови и химическая дериватизация

  1. Подготовка к экстракции
    Примечание: Все методы, включая экстракцию метаболитов, дериватизацию и анализ данных, являются слегка модифицированными версиями ранее описанных методов53,54.
    1. Приготовьте буфер для экстракции, добавив 100 мкМ раствора DL-норвалина, внутреннего стандарта (см. таблицу материалов), к метанолу MS-класса.
    2. Следите за тем, чтобы все экспериментальные процедуры проводились на льду.
  2. Переложите 10 мкл сыворотки мышей, извлеченной из вены Зульцера или левого желудочка, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 40 мкл буфера для экстракции.
  3. Чтобы удалить клеточный мусор и белок, кратковременно вихрят образцы сыворотки, а затем центрифугируют на максимальной скорости (18 000 x g) в течение 30 мин при 4 °C.
  4. После центрифугирования осторожно перелейте 40 мкл надосадочной жидкости в стеклянный флакон с последующей сушкой в течение 3 ч в вакуумной центрифуге при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо пластиковых трубок рекомендуется использовать стеклянную вставку (см. Таблицу материалов) из-за химически активных веществ, используемых на последующем этапе дериватизации.
  5. Высушенные образцы подвергают двум последовательным стадиям дериватизации для анализа метаболитов сыворотки сыворотки методом ГХ-МС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять под вытяжным шкафом из-за риска раздражения растворителей.
    1. Высушенные сывороточные экстракты ресуспендируют в 30 мкл 10 мг/мл метоксиамина гидрохлорида (см. таблицу материалов), растворенных в пиридине, и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
    2. Дериватизируют образцы для силилирования метаболитов 70 мкл N-метил-N-трет-бутилдиметилсилилрифторацетамида (MTBSTFA, см. таблицу материалов) при 70 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать стеклянный шприц, а не пластиковый наконечник на следующих этапах из-за дериватизации растворителей, которые вступают в реакцию с пластиком.

4. Метаболомный анализ с использованием ГХ-МС

ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения различных метаболитов сыворотки, включая углеводы, аминокислоты и промежуточные продукты цикла ТСА, в дериватизированных образцах из вены Зульцера и левого желудочка был использован однократный четырехкратный ГХ-МС (см. таблицу материалов). В качестве альтернативы можно использовать другие колонки, хотя экспериментальные настройки, включая температурную программу, могут варьироваться в зависимости от типа используемых колонок.

  1. Введите 1 мкл дериватизированного образца в ГХ в бесщепленном режиме при температуре 280 °C (температура на входе), используя гелий в качестве газа-носителя с расходом 1.500 мл/мин (заданное значение).
  2. Установите квадруполь на 200 °C, а интерфейс GC-MS на 300 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа печи для всех анализов метаболитов начинается с 60 °C, выдерживается в течение 1 минуты, а затем увеличивается со скоростью 10 °C/мин до тех пор, пока температура не достигнет 320 °C.
  3. Сбор данных методом электронной ионизации (ЭИ), установленной на 70 эВ, и получение данных образца в режиме сканирования (50-550 м/з)53. Все метаболиты, использованные в этом исследовании, были предварительно проверены стандартами для подтверждения масс-спектров и времени удержания.
  4. Выполните интегрирование пиковых площадей с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалов).
  5. Сопоставьте соединения с произведением иона каждого производного TBMDS. Затем получают ионную хроматограмму экстракта (EIC) путем интегрирования значения m/z фрагментного иона в соответствующей пиковой области, а затем экспортируют ее. Фрагменты ионов приведены в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭИК каждого соединения нормировали по ЭИК DL-норвалина в каждом образце. Данные представлены в виде Log2 вены Зульцера к левому желудочку (Log2(SV/LV)) с использованием каждого нормализованного значения EIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показана экспериментальная схема BAT-оптимизированной AV-метаболомики. Как упоминалось в разделе «Протокол», для получения дифференциально стимулированной бурой жировой ткани мыши проходят температурную акклиматизацию с помощью инкубаторов грызунов или получают фармакологическое введение в виде агонистов β-адренорецепторов. Затем мышей обезболивают, а образцы крови отбирают для метаболомного анализа (рис. 1А). Для забора крови венозная кровь, специфически стекающая из межлопаточного БАТ, собирается через вену Зульцера, в то время как артериальная кровь собирается непосредственно из левого желудочка сердца (рис. 1B).

На рисунке 2 представлена схема метаболомики сыворотки крови с использованием ГХ-МС (рис. 2). Вкратце, раствор метанола добавляют в образцы сыворотки с последующим центрифугированием для удаления сывороточных белков. Надосадочную жидкость, содержащую метаболиты, сушили в SpeedVac, а высушенные образцы подвергали двухступенчатой дериватизации с использованием метоксиамина (МОКС) и MTBSTFA (N-трет-бутилдиметилсилил-N-метилтрифторацетамида). Стадия дериватизации направлена на замещение полярных функциональных групп метаболитов эфиром TBDMS, что позволяет ГХ-МС детектировать метаболиты как производные TBDMS. Дериватизированные образцы анализировали с помощью одиночного четырехкратного ГХ-МС. Метаболиты разделяются в колонке в соответствии с их физико-химическими свойствами. Электронная ионизация (EI) используется для расщепления метаболитов на уникальные фрагменты ионов, обнаруженные масс-детектором. Идентификация соединений осуществляется путем детектирования соединений-специфических фрагмент-ионов. Величина m/z и время удержания соединений-специфичных фрагмент-ионов в эксперименте приведены в таблице (табл. 1). Экстрагированная ионная хроматограмма (ЭИК) используется для интегрирования сигнала соединения-специфического фрагмента иона в пиковой области метаболита, которая определяет обилие метаболитов.

Чтобы определить, высвобождает ли или поглощает БАТ ряд метаболитов, можно рассчитать логарифмическоеотношение количества ионов между веной Зульцера и левым желудочком (Log2(SV/LV)) (рисунок 3). Если значение Log2 (SV/LV) для конкретного метаболита равно >0, это указывает на то, что метаболита в SV больше, чем в LV, что позволяет предположить, что межлопаточная сетка BAT высвобождает метаболит. И наоборот, если значение Log2 (SV/LV) для определенного метаболита равно <0, это означает, что метаболит поглощается межлопаточной BAT.

Используя этот подход, было обнаружено, что мягкая БАТ, стимулированная холодом, значительно потребляет глюкозу, лактат, 3-гидроксибутират (3-HB), BCAA, аспартат, лизин и триптофан, в то время как БАТ значительно высвобождает сукцинат и пальмитат (рис. 3A). Большинство из этих явлений наблюдалось в наших предыдущих исследованиях хронической простуды BAT42, предполагая, что мягкий холодный BAT метаболически напоминает хронический холодный BAT, хотя и в меньшей степени. Для быстрого визуального обзора данных изображена тепловая карта, отображающая значения Log2 (SV/LV) (рис. 3B). Важно интерпретировать данные с осторожностью, так как тепловая карта представляет Z-оценки внутри группы.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная схема BAT-оптимизированной артериовенозной (AV) метаболомики. (A) Диаграмма, показывающая рабочий процесс AV-метаболомики. (1) Чтобы индуцировать различные версии метаболически стимулированной бурой жировой ткани (BAT), мышей акклиматизируют к различным температурам или делают инъекции фармакологических препаратов. (2) Затем образцы артериальной и венозной крови берутся из левого желудочка и вены Зульцера мышей соответственно. (3) Полученные образцы сыворотки подвергают экстракции метаболитов с последующим метаболомным анализом. (B) Репрезентативные изображения, содержащие рекомендации по процедурам отбора проб крови. Артериальная кровь собирается из левого желудочка, в то время как венозная кровь берется из вены Зульцера, поскольку она специфически дренирует кровь из БАТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Таргетная метаболомика на основе ГХ/МС. Экспериментальная схема таргетной метаболомики на основе ГХ/МС. TBDMS: трет-бутилдиметилсилил, EI: электронная ионизация, EIC: ионная хроматограмма экстракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные данные AV-метаболомики. (А) Поглощение и последующее высвобождение отобранных распространенных и высокоактивных циркулирующих топливных метаболитов НДТ, классифицированных в соответствии с их соответствующими группами. Данные показывают соотношение вен Зульцера к левому желудочку (SV/LV) Log2 . Столбцы, обозначающие метаболиты со средним Log2 (SV/LV) <0, окрашены в красный цвет, а Log2 (SV/LV) >0 окрашены в синий цвет. Каждая мышь представлена отдельными точками данных; n = 11. Данные являются средними ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Аминокислоты с разветвленной цепью ( аминокислота с разветвленной цепью; ЕАА; незаменимая аминокислота; НИАА; заменимая аминокислота. (B) Тепловая карта, иллюстрирующая дифференциальное содержание метаболитов в крови вены (SV) и левого желудочка (LV) компании Sulzer. В каждом столбце отображается Z-оценка средних значений в группе; n = 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Соединение м/з ионов фрагментов Срок хранения Формуляр Формула производной TBDMS
Пируват 174.1 8.72 К3Н4О3 К15Х33О3НСи2
Аспартат 418.2 18.45 C4H7NO4 К22Х49НО4Си3
α-кетоглутарат 346.2 17.27 К5Н6О5 К18Х37НО5Си2
C16:0 (пальмитат) 313.3 19.72 C16H32O2 К22Х46О2Си
Лактат 261.2 11.66 К3Н6О3 К15Х34О3Си2
Лейцин 200.2 14 C6H13NO2 К18Х41НО2Си2
Изолейцин 200.2 14.34 C6H13NO2 К18Х41НО2Си2
Валин 186.2 13.53 C5H11NO2 К17Х39НО2Си2
Аланин 260.2 12.17 C3H7NO2 К15Х35НО2Си2
Серин 390.2 17.04 C3H7NO3 К21Х49НО3Си3
Глицин 218.1 12.43 C2H5NO2 К14Х33НО2Си2
Лизин 300.2 20.48 C6H14N2O2 К24Х56Н2О2Си3
Сукцинат 289.1 14.65 С4Н6О4 К16Х34О4Си2
Пролин 258.2 14.73 C5H9NO2 К17Х37НО2Си2
Фенилаланин 336.2 18 C9H11NO2 К21Х39НО2Си2
Метионин 320.2 16.84 C5H11NO2S К17Х39НО2ССи2
Цистеин 406.2 19 C3H7NO2S К21Х49НО2ССи3
Аспарагин 417.2 19.86 C4H8N2O3 К22Х50Н2О3Си3
3-гидроксибутират (3HB) 275.2 12.81 К4Н8О3 К16Х36О3Си2
Триптофан 375.2 22.97 C11H12N2O2 К23Х40Н2О2Си2
Малат 419.2 18.19 К4Н6О5 К22Х48О5Си3
Глутамат 432.3 19.59 C5H9NO4 К23Х51НО4Си3
Глутамин 431.3 20.85 C5H10N2O3 К23Х52Н2О3Си3
Соль лимонной кислоты 459.2 22.38 К6Н8О7 К30Х64О7Си4
Глюкоза 476.3 22.7 C6H12O6 К30Х68О6Си4

Таблица 1: Ионы соединений GC/MS, используемые для интеграции. Эта таблица содержит список из 25 сывороточных метаболитов, идентифицированных данным методом, с временем удержания и ионами фрагментов, соответствующими каждому соединению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важным шагом в понимании метаболического потенциала БАТ в энергетическом балансе всего организма является определение того, какие питательные вещества он потребляет, как они метаболически перерабатываются и какие метаболиты высвобождаются в кровоток. Этот протокол представляет собой специализированную технику артериовенозного отбора проб, которая обеспечивает доступ к венозным сосудам межлопаточного БАТ и системной артериальной сосудистой сети у мышей C57BL/6J, которая была недавно разработана и подтверждена Park et al42. Ниже приведены ключевые моменты, которые вы должны критически учитывать при следовании протоколу.

Для термогенной стимуляции ключевым моментом является выбор наиболее подходящего типа термогенной стимуляции для ваших экспериментальных условий. Например, при использовании экспериментальной группы (по сравнению с контрольной группой) и с целью наблюдения различий в метаболической адаптационной способности (решающей для ее максимального недрожащего термогенного потенциала) БАТ подходит хроническая акклиматизация к холоду или стимуляция β-адренорецепторов (продолжительностью от 3 дней до 4 недель) 1,45. Когда BAT подвергается воздействию острого холода (несколько часов менее 24 часов), вместо того, чтобы метаболически адаптироваться, BAT метаболизирует присущее ей топливо и метаболически взаимодействует с дрожащими мышцами для оптимального термогенеза1. Агонист β-адренорецепторов представляет собой нейронный ответ для запуска термогенеза BAT 1,14, и существуют другие эндокринные факторы, которые усиливают термогенную программу 55,56,57,58,59,60. При выполнении термогенной стимуляции, как упоминалось выше, наличие базового контроля при термонейтральности (30 °C) должно быть полезно для подтверждения того, что стимуляция сработала должным образом.

Как упоминалось в разделе протокола, получение артериовенозной крови самого высокого качества является ключом к успешному проведению эксперимента. Для этого необходимо предотвратить гемолиз (см. шаг 2.5) и собрать постоянное количество крови, чтобы избежать разбавления различных характеристик венозной крови из вены Зульцера (менее 40 мкл из вены Зульцера). С этой целью, во время первоначальной установки, авторы настоятельно рекомендуют провести пилотный эксперимент по измерению метаболитов с использованием не только крови из вены Зульцера, но и крови из венозной крови, не дренируемой БАТ (например, нижней полой вены). Это поможет подтвердить, имеет ли сыворотка вены Зульцера отчетливое профилирование метаболитов по сравнению с венозными сосудами, не содержащими BAT. Что касается забора артериальной крови из левого желудочка, важно последовательно проводить пункцию одной и той же области левого желудочка, чтобы свести к минимуму колебания уровня кардиокинов61,62. Такие вариации могут привести к сбивающим с толку результатам в артериовенозной метаболомике или -протеомике.

Хроматография в сочетании с масс-спектрометрией является одним из самых мощных инструментов для метаболомики, одним из методов является GC-MS63. Действительно, измерение биологически значимых метаболитов с помощью ГХ-МС считалось сложным из-за проблемы охвата; Применение ГХ-МС обычно ограничивается анализом метаболитов с высоколетучими и неполярными свойствами, в отличие от многочисленных полярных метаболитов в тканях и биологических жидкостях. Тем не менее, разработка различных методов экстракции и дериватизации, наряду с преимуществами ГХ-МС, включая превосходное пиковое разрешение, воспроизводимость и обширные масс-спектральные библиотеки, позволяющие удобно идентифицировать пики, привели к появлению такой платформы в качестве привлекательного варианта для анализа биологически значимых метаболитов64,65.

В этом протоколе платформа ГХ-МС используется для анализа 25 метаболитов в сыворотке крови, собранных с помощью вышеупомянутой методики. С этой целью была проведена экстракция метаболитов с использованием 80% раствора метанола. Следует отметить, что на этом этапе рекомендуется использовать определенные типы пробирок, включая пробирки Eppendorf, для достижения минимальных уровней загрязнения образцов органическими веществами. Тщательное отделение надосадочной жидкости от гранул после экстракции также необходимо для удаления белковых остатков из сыворотки, что имеет решающее значение для поддержания работоспособности источника ионов MS.

Стадия дериватизации может быть диверсифицирована в зависимости от типов дериватизации, включая арилпроизводные, силилирование и ацилирование66. Авторы использовали двухстадийную дериватизацию N-метил-N-трет-бутилдиметилсилилрифторацетамидом (MTBSTFA) для сиалирования метаболитов, который является широко используемым методом, преимущество которого заключается в стабильном обнаружении биологически значимых полярных метаболитов, включая сахара, но с недостатком, касающимся случайной потери N-триметилсилильной группы аминов и аминокислот во время этапаанализа 64. Следует отметить, что образцы должны быть полностью высушены перед стадией дериватизации из-за чувствительности реагентов и производных к влаге.

Одним из основных ограничений ГХ-анализа, в целом, по-прежнему остается диапазон обнаруживаемых метаболитов, несмотря на вышеупомянутые этапы дериватизации, которые улучшают способность ГХ-МС в отношении обнаружения полярных метаболитов, особенно по сравнению с анализом на основе ЖХ-МС. Количественная метаболомика с использованием ЖХ-МС может значительно помочь получить лучшее представление о метаболическом спектре БАТ в отношении системного метаболитного обмена24,42.

Несмотря на то, что расчет, используемый в протоколе-измерении градиента концентрации метаболитов между артериальным и артериальным венозная кровь; Log2 (SV/LV) - количественно определяет изменение фракционного поглощения и высвобождения с помощью BAT, необходимо соблюдать осторожность при интерпретации данных. В частности, для тех метаболитов, чья дробная чистая обменная стоимость равна «0» (например, цитрат, αкг, малат, метионин, аланин, глутамин), результат может быть связан либо с отсутствием поглощения/высвобождения, либо с одинаково активным катаболизмом и синтезом (где и поглощение, и высвобождение являются высокими). Чтобы проверить, какая из двух возможностей верна, необходимы дополнительные эксперименты по метаболическим потокам с использованием отслеживания изотопов in vivo с захваченным метаболитом и/или его субстратом39.

Ограничением дробного расчета является то, что он не дает количественного ландшафта поглощения и высвобождения этих метаболитов 42,67. Например, несмотря на то, что значение Log2 (SV/LV) указывает на сопоставимое относительное чистое поглощение глюкозы и 3-гидроксибутиратом (3HB), фактический вклад глюкозы в источники углерода должен быть намного выше, чем 3-HB, из-за того, что концентрация глюкозы в крови намного выше, чем у 3HB, а также потому, что глюкоза содержит на четыре атома углерода больше (глюкоза имеет шесть атомов углерода; 3HB имеет два атома углерода). При необходимости комплексный анализ, включающий дополнительные параметры, такие как скорость кровотока, фактические концентрации каждого метаболита в крови и их химические уравнения, должен дать нам информацию о количественном вкладе поглощенных/высвобожденных метаболитов и их вкладе в общий поток углерода или азота42,67.

Основным преимуществом этой миниатюрной методики для забора артериовенозной крови и метаболомного анализа на мышином уровне является ее синергетическая комбинация с различными генетическими моделями для изучения метаболизма и физиологии бурой жировой ткани (например, UCP1-KO, UCP1-Cre-специфичные модели потери функции BAT, трансгенные модели). Недавний метаболомный анализ, требующий только следовых количеств сыворотки крови для метаболомного профилирования, делает этот подход более осуществимым для более мелких организмов (см. протокол 3)39. Тем не менее, протеомный анализ, который может дать лучшее понимание при рассмотрении вместе с метаболомикой, может потребовать большего количества образцов. В связи с этим более подходящим может быть обычный артериовенозный забор с использованием крыс. Мы отсылаем читателей к последнему протоколу забора артериовенозной крови на БАТ у крыс, написанному Местрес-Аренасом и коллегами47.

Несмотря на то, что в текущем протоколе используется процедура анестезии с использованием изофлурана, описанная в Park et al.42, этот подход может негативно повлиять на термогенный метаболизм бурых адипоцитов и/или бурой жировой ткани in vivo 68,69,70,71. Таким образом, будущая артериовенозная метаболомика с использованием пентобарбитала требует изучения.

Таким образом, этот протокол представляет собой основополагающую методологию для измерения чистой метаболической активности БАТ (потребление и производство) при различных термогенных стимуляциях. Это должно дать нам ценную информацию о роли НДТ в качестве системного поглотителя питательных веществ, а также поставщика, путем количественного перечисления ключевых метаболических видов топлива, а также секретируемых метаболитов. Кроме того, это также может быть полезно для идентификации ранее не изученных коричневых адипокинов, полученных из метаболитов, особенно при работе с метаболомными платформами, основанными на открытиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, о котором они могли бы сообщить.

Acknowledgments

Благодарим всех сотрудников лабораторий Чхве и Юнга за методологическую дискуссию. Благодарим К. Янга и Д. Гертина за советы и отзывы. Благодарим М.С. Чой за критическое прочтение рукописи. Эта работа была профинансирована NRF-2022R1C1C1012034 S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 в D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 в S.M.J. и D.W.C. Эта работа была поддержана Чхуннамским национальным университетом для W.T.K. Рисунки 1 и 2 были созданы с помощью BioRender (http://biorender.com/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 200 Бурая жировая ткань BAT термогенез без дрожания метаболический гомеостаз циркулирующие питательные вещества процесс расхода энергии биологически активные факторы метаболическое топливо сигнальные молекулы внутритканевая коммуникация межтканевая коммуникация оптимизированная артериовенозная метаболомика БАТ на мышином уровне термогенная стимуляция метод забора артериальной крови вена Зульцера протокол метаболомики на основе газовой хроматографии обмен метаболитов на межорганном уровне
Артериовенозная метаболомика для измерения обмена метаболитов <em>in vivo</em> в бурой жировой ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H.,… More

Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter