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Biochemistry

Metabolómica arteriovenosa para medir el intercambio de metabolitos in vivo en tejido adiposo marrón

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

En este protocolo, se describen los métodos relevantes para la metabolómica arteriovenosa optimizada para BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón. Estos métodos permiten la adquisición de información valiosa sobre el intercambio de metabolitos mediado por MTD a nivel de organismo.

Abstract

El tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la homeostasis metabólica a través de un proceso único de gasto de energía conocido como termogénesis sin escalofríos. Para lograr esto, BAT utiliza un menú diverso de nutrientes circulantes para respaldar su alta demanda metabólica. Además, las MTD secretan factores bioactivos derivados de metabolitos que pueden servir como combustibles metabólicos o moléculas de señalización, lo que facilita la comunicación intratisular y/o intertisular mediada por BAT. Esto sugiere que las MTD participan activamente en el intercambio sistémico de metabolitos, una característica interesante que está empezando a ser explorada. Aquí, presentamos un protocolo para la metabolómica arteriovenosa de MTD optimizada in vivo a nivel de ratón. El protocolo se centra en métodos relevantes para las estimulaciones termogénicas y una técnica de muestreo de sangre arteriovenosa utilizando la vena de Sulzer, que drena selectivamente la sangre venosa derivada de BAT interescapular y la sangre arterial sistémica. A continuación, se demuestra un protocolo metabolómico basado en cromatografía de gases utilizando esas muestras de sangre. El uso de esta técnica debería ampliar la comprensión del intercambio de metabolitos regulado por MTD a nivel interorgánico mediante la medición de la absorción y liberación neta de metabolitos por las MTD.

Introduction

El tejido adiposo marrón (BAT) posee una propiedad única de gasto energético conocida como termogénesis sin temblores (NST), que involucra mecanismos dependientes de la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1) e independientes de UCP1 1,2,3,4,5. Estas características distintivas implican a las MTD en la regulación del metabolismo sistémico y la patogénesis de las enfermedades metabólicas, como la obesidad, la diabetes tipo 2, las enfermedades cardiovasculares y la caquexia por cáncer 6,7,8. Estudios retrospectivos recientes han demostrado una asociación inversa entre la masa MTD y/o su actividad metabólica con la obesidad, la hiperglucemia y la salud cardiometabólica en humanos 9,10,11.

Recientemente, la MTD ha sido propuesta como un sumidero metabólico responsable del mantenimiento de la TSN, ya que requiere cantidades sustanciales de nutrientes circulantes como combustible termogénico 6,7. Además, la MTD puede generar y liberar factores bioactivos, denominados adipocinas marrones o BATokinas, que actúan como señales endocrinas y/o paracrinas, lo que indica su participación activa en la homeostasis metabólica a nivel de sistemas 12,13,14,15. Por lo tanto, comprender el metabolismo de los nutrientes de BAT debería mejorar nuestra comprensión de su importancia fisiopatológica en los seres humanos, más allá de su papel convencional como órgano termorregulador.

Los estudios metabolómicos en los que se emplean trazadores de isótopos estables, en combinación con los estudios clásicos de absorción de nutrientes en los que se utilizan radiotrazadores no metabolizables, han mejorado significativamente nuestra comprensión de qué nutrientes son absorbidos preferentemente por las MTD y cómo se utilizan 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por ejemplo, los estudios de trazadores radiactivos han demostrado que la MTD activada por frío absorbe glucosa, ácidos grasos unidos a lipoproteínas y aminoácidos de cadena ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27. El rastreo de isótopos reciente combinado con estudios metabolómicos nos ha permitido medir el destino metabólico y el flujo de estos nutrientes dentro de los tejidos y células cultivadas 24,25,26,28,29,30. Sin embargo, estos análisis se centran principalmente en la utilización individual de nutrientes, lo que nos deja con un conocimiento limitado de las funciones de los sistemas BAT en el intercambio de metabolitos de órganos. Las cuestiones relativas a la serie específica de nutrientes circulantes consumidos por las MTD y sus contribuciones cuantitativas en términos de carbono y nitrógeno siguen siendo difíciles de alcanzar. Además, la exploración de si las MTD pueden generar y liberar BATokines derivadas de metabolitos (por ejemplo, lipocinas) utilizando nutrientesapenas está comenzando 12,13,14,15,31,32.

El análisis de sangre arteriovenosa es un enfoque fisiológico clásico que se utiliza para evaluar la captación o liberación específica de moléculas circulantes en órganos/tejidos. Esta técnica se ha aplicado previamente a la MTD interescapular de ratas para medir el oxígeno y varios metabolitos, estableciendo así la MTD como el principal sitio de termogénesis adaptativa con su potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recientemente, un estudio arteriovenoso en el que se utilizaron MTD interescapulares de rata se combinó con un enfoque transómico, lo que condujo a la identificación de BATokines no descubiertos liberados por la MTD38 estimulada termogénicamente.

Los avances recientes en la metabolómica basada en cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta sensibilidad basada en espectrometría de masas (GC-MS y LC-MS) han reavivado el interés en los estudios arteriovenosos para el análisis cuantitativo del intercambio de metabolitos específicos de órganos 39,40,41. Estas técnicas, con su alto poder de resolución y precisión de masa, permiten el análisis exhaustivo de una amplia gama de metabolitos utilizando pequeñas cantidades de muestra.

En consonancia con estos avances, un estudio reciente adaptó con éxito la metabolómica arteriovenosa para estudiar las MTD a nivel de ratón, lo que permitió el análisis cuantitativo de las actividades de intercambio de metabolitos en las MTD en diferentes condiciones42. En este artículo se presenta un protocolo de metabolómica arteriovenosa dirigido a BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón C57BL/6J.

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Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan. Los ratones se alojaron en una instalación de animales aprobada por la IACUC ubicada en una sala limpia a 22 °C y 45% de humedad, siguiendo un ciclo diario de luz/oscuridad de 12 h. Se mantuvieron en estantes ventilados y tuvieron acceso a una dieta estándar de comida ad libitum (que comprendía 60% de carbohidratos, 16% de proteínas y 3% de grasas). La ropa de cama y los materiales de anidación se cambiaron semanalmente. Para este estudio, se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 12 semanas de edad y con un peso de entre 25 g y 30 g. Estos animales se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Modulación de la actividad metabólica del tejido adiposo marrón a través de la aclimatación a la temperatura y la estimulación farmacológica

NOTA: La aclimatación a la temperatura durante varios días o semanas o la estimulación farmacológica con agonistas de los receptores β-adrenérgicos son métodos comúnmente empleados para modular la actividad MTD1. Por lo tanto, a continuación se proporciona una descripción general concisa del método para que los lectores puedan elegir el enfoque apropiado según sea necesario. Para obtener MTD metabólicamente inactiva (menos termogénica), se selecciona una temperatura cálida de referencia, denominada termoneutralidad (28-30 °C), para los ratones C57BL/6J. Este rango garantiza que los ratones no necesiten gastar energía adicional para mantener una temperatura corporal constante. Para obtener MTD metabólicamente modesta o altamente activa (termogénica), se pueden elegir temperaturas de frío suave (20-22 °C) o de frío severo (6 °C), respectivamente. Para los fines de este experimento, los ratones se criaron en condiciones de alojamiento estándar a 22 °C, que, aunque ligeramente frías para los ratones, no implicaron ninguna estimulación farmacológica.

  1. Aclimatación a la temperatura
    1. Separe los ratones para albergar 1 o 2 ratones por jaula al menos 1 semana antes de comenzar la aclimatación a la temperatura. Prepare incubadoras de roedores equipadas con ventilación de aire, control de temperatura y humedad con las condiciones deseadas.
    2. Mueva las jaulas a sus respectivas incubadoras de roedores en días apropiados para el tipo de aclimatación a la temperatura elegida.
    3. Asegúrese de que la distribución del número de ratones sea uniforme en todos los grupos, con 1 o 2 ratones por jaula. Se prefiere el alojamiento individual, ya que es más sensible a los cambios fisiológicos inducidos por la temperatura en comparación con el alojamiento grupal43. Estas son las condiciones específicas de alojamiento para cada grupo:
      1. Grupo de termoneutralidad (30 °C): Mantener a los ratones de este grupo de forma continua a una temperatura de 30 °C durante un máximo de cuatro semanas.
      2. Grupo frío severo: Inicialmente, aloje a los ratones de este grupo a 18 °C sin ningún material de anidación. Experimentarán un descenso gradual de la temperatura semanal, alcanzando los 6 °C en la cuarta semana. La progresión de la temperatura es la siguiente: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Grupo frío suave (20-22 °C): Aloje a los ratones de este grupo en incubadoras de roedores en las mismas condiciones que las condiciones de alojamiento estándar mencionadas anteriormente.
      4. Desafíos de frío agudo: Para desafíos de frío agudo, coloque 1-2 ratones por jaula sin ningún material de anidación y expóngalos a una incubadora de roedores configurada a 6 ° C durante un máximo de 8 h.
        NOTA: Estas condiciones de alojamiento y variaciones de temperatura son esenciales para estudiar los efectos de diferentes entornos de temperatura sobre la actividad y el metabolismo de las MTD.
    4. Cambie las jaulas y reponga la comida y el agua cada semana. Aclimatar previamente las jaulas al menos 24 h antes de la suplementación, a su temperatura respectiva (incubadora de roedores).
      NOTA: Para evitar la perturbación del estímulo de temperatura adecuado, es importante no proporcionar enriquecimiento de ratones que pueda conducir a la construcción de nidos. En respuesta al frío intenso, los ratones gastan más energía para mantener la temperatura corporal, lo que resulta en un aumento de la ingesta de alimentos y mayores tasas de excreción. Por lo tanto, es crucial revisar las jaulas al menos dos o tres veces por semana (siguiendo las pautas institucionales locales) para asegurarse de que los ratones tengan un suministro adecuado de comida y agua, y que las jaulas no estén excesivamente mojadas. Este seguimiento es esencial para mantener el bienestar y la salud de los ratones durante el estudio.
  2. Estimulación farmacológica1 con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL316,243
    1. Para maximizar el efecto estimulante, coloque previamente a los ratones en termoneutralidad (30 °C) durante 2-4 semanas antes de las inyecciones.
    2. Después del período de aclimatación, inyectar por vía intraperitoneal 1 mg/kg CL316,243.
      NOTA: Para la estimulación crónica con el agonista del receptor β3-adrenérgico (por ejemplo, desde los 3 días hasta las semanas 1,44,45), se requieren inyecciones diarias debido a la estabilidad del fármaco. El CL316,243 diluido debe prepararse el día de la inyección debido a la estabilidad.

2. Toma de muestras de sangre arteriovenosa

NOTA: Los ratones de más de 12 a 14 semanas son los más recomendados para la toma de muestras de sangre arteriovenosa. Es posible que los ratones más jóvenes no tengan las venas de Sulzer de tamaño suficiente, un vaso sanguíneo distinto que drena específicamente la sangre venosa del BAT46 interescapular.

  1. Anestesiar suavemente con el vaporizador calibrado con un 3% de isoflurano para la inducción (en una cámara de 205 x 265 x 200 mm) y un 2% de isoflurano para el mantenimiento (con una máscara de anestesia de gas).
    NOTA: Todo el procedimiento de muestreo de sangre arteriovenosa debe realizarse de inmediato después de la anestesia. Se puede usar una almohadilla térmica calentada con agua durante la anestesia para mantener la temperatura corporal central.
    PRECAUCIÓN: El isoflurano es altamente volátil y tóxico cuando se inhala. Por lo tanto, la anestesia primaria debe realizarse bajo una campana extractora.
  2. Verifique los reflejos del animal, como la retracción de las patas, para confirmar que la anestesia ha alcanzado una profundidad adecuada.
  3. Extracción de sangre venosa de la vena del Sulzer
    1. Coloque el ratón para exponer la piel dorsal, confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie justo antes de realizar la incisión. Humedece la piel dorsal con una gran cantidad de etanol al 70% para evitar el desprendimiento del cabello y haz una incisión a lo largo de la espalda desde la parte inferior del tórax hasta el cuello.
      NOTA: La MTD interescapular se encuentra justo debajo de la piel, y consiste en dos almohadillas de grasa cubiertas por finos tejidos adiposos blancos. Es importante asegurarse de que el ratón permanezca bajo anestesia a través de la máscara de anestesia de gas.
    2. Levante suavemente la MTD interescapular con pinzas de punta doblada y corte con cuidado los tejidos adheridos, la mayoría de los cuales son músculos. Levante la almohadilla de grasa hacia la cabeza, continúe cortando los tejidos adheridos y abra con cuidado la región hasta que la vena de Sulzer (un gran vaso de color rojo oscuro en forma de "Y" conectado a ambas almohadillas de grasa del BAT interescapular) quede expuesta.
      NOTA: Tenga cuidado de no cortar los vasos capilares de los tejidos musculares que están conectados con la región frontal y lateral de la BAT interescapular, ya que al hacerlo se reducirá significativamente la cantidad y la calidad de la sangre que drena de la vena de Sulzer.
    3. Cortar con cuidado la vena de Sulzer y recoger aproximadamente 40 μl de sangre con puntas de pipeta de 200 μl y una pipeta P100. Guarde la sangre en un tubo de extracción de sangre y manténgalo en hielo hasta el proceso de recolección de suero.
      NOTA: Es importante recolectar sangre justo debajo del punto de división en forma de Y de la vena de Sulzer, para evitar la contaminación de la sangre de la vena cava superior47. Recolectar demasiada sangre disminuirá las características de la vena de Sulzer. Por lo tanto, asegúrese de recolectar la cantidad mínima de sangre necesaria de la vena de Sulzer para su análisis. Tenga cuidado al seleccionar los tubos de extracción de sangre, ya que el suero y el plasma producen diferentes perfiles de metabolitos 48,49,50. Para la recolección de plasma, es necesario utilizar tubos recubiertos de heparina. En este experimento, se eligieron tubos recubiertos de activadores de coagulación para obtener suero. Bajo ninguna circunstancia se deben utilizar tubos recubiertos de EDTA, ya que el EDTA afecta significativamente las señales de espectrometría de masas51,52.
  4. Extracción de sangre arterial del ventrículo izquierdo
    1. Voltee el mouse sin perder el contacto con el cono de la nariz, para exponer la piel ventral. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie antes de realizar la incisión. Humedecer la piel ventral con una gran cantidad de etanol al 70% para evitar el desprendimiento del cabello y abrir cuidadosamente la cavidad torácica con unas tijeras para exponer el corazón sin dañar ninguna estructura interna.
    2. Perforar con precisión el área del ápice del ventrículo izquierdo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 29 G (1/2"). Inserte dos tercios de una aguja de 1/2 pulgada a 3-5 mm de la horizontal derecha del ápice del corazón (Figura 1B) y tire de la jeringa hacia atrás para recoger sangre del ventrículo izquierdo (50-100 μL). La sangre del ventrículo izquierdo es sangre arterial oxigenada de color rojo brillante. Guarde la sangre en un tubo de extracción de sangre y manténgalo en hielo hasta el proceso de recolección de suero.
      NOTA: Se debe hacer una incisión mínima en la cavidad torácica para acceder al corazón. Una incisión excesiva podría provocar una hemorragia local, que posteriormente puede provocar una presión arterial baja. Esto podría afectar la calidad de la sangre arterial extraída del ventrículo izquierdo. Evite rotar o voltear el corazón, ya que dificultará la determinación de la posición precisa del ventrículo izquierdo.
    3. Realizar la eutanasia y asegurarla con un método adecuado siguiendo las directrices de las instituciones locales. Por ejemplo, la eutanasia puede realizarse a través de la luxación cervical y confirmarse mediante el cese de los latidos del corazón.
  5. Centrifugar muestras de sangre a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta. El sobrenadante debe contener suero o plasma, dependiendo del tipo de tubo de extracción de sangre utilizado. Se puede parar aquí y almacenar las muestras a -20 °C hasta el procesamiento del suero para el análisis de GC-MS.
    NOTA: Es posible que se haya producido hemólisis si se observa un sobrenadante de color rojo. Para evitar la hemólisis, haga un vórtice de la muestra antes de que se complete la coagulación. Algunos metabolitos enriquecidos con glóbulos rojos, como la glutamina y el lactato, podrían dar lugar a una interpretación errónea de los datos, aunque es posible que la mayoría de los metabolitos no se vean afectados significativamente por la hemólisis. Se recomienda analizar el suero/plasma en el plazo de una semana.

3. Extracción de metabolitos a partir de suero y derivatización química

  1. Preparación para la extracción
    NOTA: Todos los métodos, incluida la extracción de metabolitos, la derivatización y el análisis de datos, son versiones ligeramente modificadas de los métodos descritos anteriormente53,54.
    1. Prepare el tampón de extracción añadiendo 100 μM de solución de DL-norvalina, patrón interno (véase la tabla de materiales), al metanol de grado MS.
    2. Asegúrese de que todos los procedimientos experimentales se lleven a cabo en hielo.
  2. Transfiera 10 μl de suero de ratón extraído de la vena de Sulzer o del ventrículo izquierdo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 40 μl de tampón de extracción.
  3. Para eliminar los restos celulares y las proteínas, se deben realizar un vórtice breve de las muestras de suero, seguido de la centrifugación a la velocidad máxima (18.000 x g) durante 30 minutos a 4 °C.
  4. Después de la centrifugación, transfiera cuidadosamente 40 μL de sobrenadante a un vial de vidrio seguido de 3 h de secado en una centrífuga al vacío a 4 °C.
    NOTA: Se recomienda un inserto de vidrio (consulte la Tabla de materiales) en lugar de tubos de plástico debido a los productos químicos reactivos al plástico utilizados durante el paso de derivatización posterior.
  5. Someter las muestras secas a dos pasos consecutivos de derivatización para el análisis GC-MS de los metabolitos séricos.
    NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo una campana extractora debido a los riesgos de irritación de los solventes.
    1. Resuspender los extractos séricos secos en 30 μL de clorhidrato de metoxiamina 10 mg/mL (ver Tabla de Materiales) disueltos en piridina e incubar a 37 °C durante 30 min.
    2. Derivatizar muestras para la sililación de metabolitos con 70 μL de N-metil-N-terc-butildimetilsililrifluoroacetamida (MTBSTFA, ver Tabla de Materiales) a 70 °C durante 1 h.
      NOTA: Se recomienda usar una jeringa de vidrio en lugar de una punta de plástico en los siguientes pasos debido a los solventes de derivatización que reaccionan con el plástico.

4. Análisis metabolómico mediante GC-MS

NOTA: Se empleó GC-MS cuádruple simple (ver Tabla de materiales) para medir los diversos metabolitos séricos, incluidos los carbohidratos, los aminoácidos y los intermedios del ciclo del TCA en muestras derivatizadas de la vena de Sulzer y el ventrículo izquierdo. Alternativamente, se pueden utilizar otras columnas, aunque los ajustes experimentales, incluido el programa de temperatura, pueden variar en función de los tipos de columnas utilizados.

  1. Inyectar 1 μL de la muestra derivatizada en el GC en modo splitless a 280 °C (temperatura de entrada), utilizando helio como gas portador con un caudal de 1.500 mL/min (consigna).
  2. Ajuste el cuadrupolo a 200 °C con la interfaz GC-MS a 300 °C.
    NOTA: El programa de horno para todos los análisis de metabolitos comienza a 60 °C, se mantiene durante 1 minuto y luego se aumenta a una velocidad de 10 °C/min hasta que la temperatura alcanza los 320 °C.
  3. Recoger datos por ionización de electrones (EI) fijada en 70 eV y adquirir los datos de la muestra en modo de barrido (50-550 m/z)53. Todos los metabolitos utilizados en este estudio fueron previamente validados con estándares para confirmar espectros de masas y tiempos de retención.
  4. Lleve a cabo la integración del área de picos utilizando un software de análisis disponible en el mercado (ver Tabla de materiales).
  5. Haga coincidir los compuestos con el ion producto de cada derivado de TBMDS. A continuación, obtenga el cromatograma iónico de extracción (EIC) integrando el valor m/z del ion fragmento en el área de pico correspondiente y, a continuación, expórtelo. Los iones fragmentados se muestran en la Tabla 1.
    NOTA: El EIC de cada compuesto se normalizó por el de DL-norvalina en cada muestra. Los datos están representados por la vena de Sulzer Log2 al ventrículo izquierdo (Log2(SV/LV)) utilizando cada valor normalizado de EIC.

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Representative Results

La Figura 1 ilustra el esquema experimental de la metabolómica AV optimizada para BAT. Como se mencionó en la sección de Protocolo, para obtener tejidos adiposos marrones estimulados diferencialmente, los ratones se someten a aclimatación a la temperatura utilizando incubadoras de roedores o reciben administración farmacológica como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, los ratones son anestesiados y se recogen muestras de sangre para su análisis metabolómico (Figura 1A). Para la toma de muestras de sangre, la sangre venosa que drena específicamente de la MTD interescapular se recoge a través de la vena de Sulzer, mientras que la sangre arterial se recoge directamente del ventrículo izquierdo del corazón (Figura 1B).

La Figura 2 representa los esquemas de la metabolómica sérica utilizando GC-MS (Figura 2). Brevemente, la solución de metanol se agrega a las muestras de suero seguida de centrifugación para eliminar las proteínas séricas. El sobrenadante que contenía los metabolitos se secó en un SpeedVac y las muestras secas se sometieron a derivatización en dos pasos utilizando metoxiamina (MOX) y MTBSTFA (N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida). El paso de derivatización tiene como objetivo la sustitución de los grupos funcionales polares de los metabolitos con éster TBDMS, lo que permite la detección GC-MS de metabolitos como derivados TBDMS. Las muestras derivatizadas se analizaron mediante GC-MS cuádruple simple. Los metabolitos se separan en la columna según sus propiedades fisicoquímicas. La ionización de electrones (EI) se emplea para descomponer los metabolitos en iones de fragmentos únicos detectados por un detector de masas. La identificación de compuestos se lleva a cabo mediante la detección de iones de fragmentos específicos de compuestos. El valor m/z y el tiempo de retención de los iones de fragmentos específicos del compuesto en el experimento se muestran en la tabla (Tabla 1). Se utiliza un cromatograma iónico extraído (EIC) para integrar la señal de un ion fragmento específico de un compuesto en el área del pico del metabolito, que define la abundancia de metabolitos.

Para determinar si BAT libera o absorbe una serie de metabolitos, se pueden calcular las proporciones Log2 de los recuentos de iones entre la vena de Sulzer y el ventrículo izquierdo (Log2 (SV/LV)) (Figura 3). Si el valor de Log2(SV/LV) para un metabolito determinado es >0, indica que el metabolito es más abundante en el SV que en el LV, lo que sugiere que la red de MTD interescapular libera el metabolito. Por el contrario, si el valor de Log2(SV/LV) para un determinado metabolito es <0, sugiere que el metabolito es absorbido por el BAT interescapular.

Utilizando este enfoque, se encontró que la MTD estimulada por frío leve consume significativamente glucosa, lactato, 3-hidroxibutirato (3-HB), BCAA, aspartato, lisina y triptófano, mientras que la MTD libera significativamente succinato y palmitato (Figura 3A). La mayoría de estos fenómenos se observaron en nuestros estudios previos sobre la MTD42 del frío crónico, lo que sugiere que la MTD del resfriado leve se asemeja metabólicamente a la MTD del resfriado crónico, aunque en menor medida. Para proporcionar una visión general rápida de los datos, se muestra un mapa de calor que muestra los valores de Log2 (SV/LV) (Figura 3B). Es esencial interpretar los datos con precaución, ya que el mapa de calor representa las puntuaciones Z dentro del grupo.

Figure 1
Figura 1: Esquema experimental de la metabolómica arteriovenosa (AV) optimizada para BAT. (A) Diagrama que muestra el flujo de trabajo de la metabolómica AV. (1) Para inducir diferentes versiones de tejido adiposo marrón (BAT) estimulado metabólicamente, los ratones se aclimatan a diferentes temperaturas o reciben inyecciones de fármacos farmacológicos. (2) Posteriormente, se recogen las muestras de sangre arterial y venosa del ventrículo izquierdo y de la vena de Sulzer de los ratones, respectivamente. (3) Las muestras de suero obtenidas se someten a una extracción de metabolitos, seguida de un análisis metabolómico. (B) Imágenes representativas que sirvan de guía para los procedimientos de toma de muestras de sangre. La sangre arterial se extrae del ventrículo izquierdo, mientras que la sangre venosa se obtiene de la vena de Sulzer, ya que drena específicamente la sangre del BAT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Metabolómica dirigida basada en GC/MS. Esquema experimental de metabolómica dirigida basada en GC/MS. TBDMS: terc-butildimetilsililo, EI: Ionización de electrones, EIC: Cromatograma iónico de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Datos metabolómicos representativos de AV. (A) La absorción y posterior liberación de metabolitos de combustible circulantes prevalentes y altamente activos seleccionados por las MTD, clasificados según sus respectivos grupos. Los datos muestran la relación entre la venade Sulzer y el ventrículo izquierdo (SV/VI). Las barras que indican metabolitos con Log2 (SV/LV) <0 medio son de color rojo y Log2 (SV/LV) >0 son de color azul. Los puntos de datos individuales representan cada mouse; n = 11. Los datos son medias ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; aminoácido de cadena ramificada; EAA; aminoácido esencial; NEAA; Aminoácido no esencial. (B) Un mapa de calor que ilustra la abundancia diferencial de metabolitos entre la sangre de la vena de Sulzer (SV) y la del ventrículo izquierdo (VI). Cada columna muestra una puntuación Z de valores promedio dentro del grupo; n = 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto m/z de iones fragmentados Tiempo de retención Formular Formulador de derivados TBDMS
Piruvato 174.1 8.72 C3H4O3 C15H33O3NSi2
Aspartato 418.2 18.45 C4H7NO4 C22H49NO4Si3
α-cetoglutarato 346.2 17.27 C5H6O5 C18H37NO5Si2
C16:0 (Palmito) 313.3 19.72 C16H32O2 C22H46O2Si
Lactato 261.2 11.66 C3H6O3 C15H34O3Si2
Leucina 200.2 14 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Isoleucina 200.2 14.34 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Valina 186.2 13.53 C5H11NO2 C17H39NO2Si2
Alanina 260.2 12.17 C3H7NO2 C15H35NO2Si2
Serina 390.2 17.04 C3H7NO3 C21H49NO3Si3
Glicina 218.1 12.43 C2H5NO2 C14H33NO2Si2
Lisina 300.2 20.48 C6H14N2O2 C24H56N2O2Si3
Succinato 289.1 14.65 C4H6O4 C16H34O4Si2
Prolina 258.2 14.73 C5H9NO2 C17H37NO2Si2
Fenilalanina 336.2 18 C9H11NO2 C21H39NO2Si2
Metionina 320.2 16.84 C5H11NO2S C17H39NO2SSi2
Cisteína 406.2 19 C3H7NO2S C21H49NO2SSi3
Asparagina 417.2 19.86 C4H8N2O3 C22H50N2O3Si3
3-hidroxibutirato (3HB) 275.2 12.81 C4H8O3 C16H36O3Si2
Triptófano 375.2 22.97 C11H12N2O2 C23H40N2O2Si2
Malato 419.2 18.19 C4H6O5 C22H48O5Si3
Glutamato 432.3 19.59 C5H9NO4 C23H51NO4Si3
Glutamina 431.3 20.85 C5H10N2O3 C23H52N2O3Si3
Citrato 459.2 22.38 C6H8O7 C30H64O7Si4
Glucosa 476.3 22.7 C6H12O6 C30H68O6Si4

Tabla 1: Iones de fragmentos compuestos GC/MS utilizados para la integración. Esta tabla contiene una lista de 25 metabolitos séricos identificados en el presente método, con el tiempo de retención y los iones fragmentarios correspondientes a cada compuesto.

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Discussion

Un paso crítico para comprender el potencial metabólico de las MTD en el equilibrio energético de todo el cuerpo es definir qué nutrientes consume, cómo se procesan metabólicamente y qué metabolitos se liberan en la circulación. Este protocolo introduce una técnica especializada de muestreo arteriovenoso que permite el acceso a la vasculatura venosa de la MTD interescapular y a la vasculatura arterial sistémica en ratones C57BL/6J, que fue desarrollada y validada recientemente por Park et al42. A continuación se presentan los puntos clave que debe considerar críticamente al seguir el protocolo.

En el caso de la estimulación termogénica, una consideración clave es elegir el tipo de estimulación termogénica más adecuado para su entorno experimental. Por ejemplo, cuando se utiliza un grupo experimental (frente a control) y se pretenden observar diferencias en la capacidad de adaptación metabólica (crucial para su máximo potencial termogénico sin escalofríos) de la MTD, es adecuada la aclimatación crónica al frío o la estimulación del receptor β-adrenérgico (que dura más de 3 días a 4 semanas) 1,45. Cuando BAT se expone a una exposición aguda al frío (unas pocas horas menos de 24 h), en lugar de adaptarse metabólicamente, BAT metaboliza sus combustibles almacenados intrínsecos y se comunica metabólicamente con los músculos temblorosos para una termogénesis óptima1. Un agonista del receptor β-adrenérgico representa una respuesta neuronal para desencadenar la termogénesis BAT 1,14, y existen otros factores endocrinos que potencian el programa termogénico 55,56,57,58,59,60. Siempre que se realice la estimulación termogénica como se mencionó anteriormente, tener un control de referencia a la termoneutralidad (30 °C) debería ser útil para confirmar si la estimulación funcionó adecuadamente.

Como se mencionó en la sección de protocolo, la obtención de sangre arteriovenosa de la más alta calidad es clave para determinar el establecimiento exitoso del experimento. Para lograr esto, es esencial prevenir la hemólisis (ver paso 2.5) y recolectar una cantidad constante de sangre para evitar la dilución de las características distintivas de la sangre venosa de la vena de Sulzer (menos de 40 μL de la vena de Sulzer). Con este fin, durante la configuración inicial, los autores recomiendan encarecidamente realizar un experimento piloto para la medición de metabolitos utilizando no solo sangre de la vena de Sulzer, sino también sangre de sangre venosa que drena sin MTD (por ejemplo, vena cava inferior). Esto ayudará a confirmar si el suero de la vena de Sulzer revela un perfil de metabolitos distinto en comparación con los vasos venosos sin BAT. En cuanto a la extracción de sangre arterial del ventrículo izquierdo, es importante la punción consistente de la misma área del ventrículo izquierdo para minimizar las variaciones en los niveles de cardiocina61,62. Tales variaciones podrían arrojar resultados confusos en la metabolómica arteriovenosa o proteómica.

La cromatografía junto con la espectrometría de masas es una de las herramientas más poderosas para la metabolómica, uno de los métodos es GC-MS63. De hecho, la medición de metabolitos biológicamente relevantes mediante GC-MS se consideró un reto debido a la cuestión de la cobertura; La aplicación de GC-MS generalmente se limita al análisis de metabolitos con propiedades altamente volátiles y no polares, a diferencia de los numerosos metabolitos polares en tejidos y fluidos biológicos. Sin embargo, el desarrollo de varios métodos de extracción y derivatización, junto con las ventajas de la GC-MS, incluida la excelente resolución de picos, la reproducibilidad y las extensas bibliotecas de espectros de masas que permiten una identificación práctica de los picos, ha llevado a una plataforma de este tipo como una opción atractiva para analizar metabolitos biológicamente relevantes64,65.

En este protocolo, se emplea la plataforma GC-MS para el análisis de 25 metabolitos en suero recolectados mediante la técnica antes mencionada. Para ello, la extracción de metabolitos se llevó a cabo utilizando una solución de metanol al 80%. Cabe destacar que, durante este paso, se recomienda el uso de ciertos tipos de tubos, incluidos los tubos Eppendorf, para lograr los niveles más bajos de contaminación por sustancias orgánicas en las muestras. También es necesaria una separación cuidadosa del sobrenadante de los gránulos después de la extracción para eliminar los restos de proteínas del suero, lo cual es fundamental para el mantenimiento del rendimiento de la fuente de iones MS.

El paso de derivatización se puede diversificar en función de los tipos de derivatización, incluidos los derivados de arilo, la sililación y la acilación66. Los autores emplearon la derivatización en dos pasos con N-metil-N-terc-butildimetilsililrifluoroacetamida (MTBSTFA) para la sialilación de metabolitos, que es un método comúnmente utilizado con la ventaja de la detección estable de metabolitos polares biológicamente relevantes, incluidos los azúcares, pero con un inconveniente relacionado con la pérdida ocasional del grupo N-trimetilsilil de aminas y aminoácidos durante el paso64 del análisis. Cabe destacar que las muestras deben secarse completamente antes de la etapa de derivatización, debido a la sensibilidad a la humedad de los reactivos y derivados.

Una de las principales limitaciones del análisis de GC, en general, sigue siendo el rango de metabolitos detectables a pesar de los pasos de derivatización antes mencionados, que mejoran la capacidad de GC-MS con respecto a la detección de metabolitos polares, especialmente en comparación con el análisis basado en LC-MS. La metabolómica cuantitativa mediante LC-MS puede ayudar en gran medida a comprender mejor el espectro metabólico de las MTD con respecto al intercambio de metabolitos sistémicos24,42.

A pesar de que el cálculo utilizado en el protocolo de medición del gradiente de concentración de metabolitos entre la sangre venosa; Log2(SV/LV): cuantifica la absorción fraccional y el cambio de liberación por MTD, se necesita precaución para la interpretación de los datos. En particular, en el caso de los metabolitos cuyo valor de intercambio neto fraccionario es «0» (por ejemplo, citrato, αKG, malato, metionina, alanina, glutamina), el resultado podría atribuirse a la ausencia de absorción/liberación o al catabolismo y la síntesis igualmente activos (cuando tanto la absorción como la liberación son elevadas). Para verificar cuál de las dos posibilidades es correcta, son necesarios experimentos adicionales de flujo metabólico utilizando el rastreo de isótopos in vivo con el metabolito absorbido y/o su sustrato39.

La limitación del cálculo fraccionario es que no proporciona el panorama cuantitativo de la absorción y liberación de esos metabolitos42,67. Por ejemplo, aunque el valor de Log2(SV/LV) indica una absorción neta relativa comparable entre la glucosa y el 3-hidroxibutirato (3HB), la contribución real de la glucosa a las fuentes de carbono debería ser mucho mayor que la del 3-HB debido al hecho de que la concentración de glucosa en sangre es mucho mayor que la del 3HB, y porque la glucosa contiene cuatro carbonos más (la glucosa tiene seis carbonos; el 3HB tiene dos carbonos). Si es necesario, un análisis exhaustivo que incorpore parámetros adicionales, como la tasa de flujo sanguíneo, las concentraciones reales en sangre de cada metabolito y sus ecuaciones químicas, debería informarnos de las contribuciones cuantitativas de los metabolitos absorbidos/liberados y sus contribuciones en el flujo total de carbono o nitrógeno42,67.

Una de las principales ventajas de esta metodología miniaturizada para la toma de muestras de sangre arteriovenosa y el análisis metabolómico a nivel de ratón es su combinación sinérgica con varios modelos genéticos para estudiar el metabolismo y la fisiología del tejido adiposo marrón (por ejemplo, UCP1-KO, modelos de pérdida de función específicos de BAT impulsados por UCP1-Cre, modelos transgénicos). Los análisis metabolómicos recientes, que solo requieren trazas de suero para el perfil metabolómico, hacen que este enfoque sea más factible con organismos más pequeños (ver protocolo 3)39. Sin embargo, el análisis proteómico, que puede proporcionar una mejor comprensión cuando se considera junto con la metabolómica, puede requerir mayores cantidades de muestras. En este sentido, la toma de muestras arteriovenosas convencionales con ratas puede ser más adecuada. Remitimos a los lectores al protocolo más reciente para la toma de muestras de sangre arteriovenosa para MTD en ratas, escrito por Mestres-Arenas y colaboradores47.

A pesar de que el protocolo actual adopta el procedimiento anestésico con isoflurano descrito en Park et al.42, este abordaje puede tener un impacto negativo en el metabolismo termogénico de los adipocitos marrones y/o del tejido adiposo marrón in vivo 68,69,70,71. Por lo tanto, la futura metabolómica arteriovenosa que utiliza pentobarbital justifica la investigación.

En resumen, este protocolo proporciona una metodología fundamental para medir la actividad metabólica neta específica de las MTD (consumo frente a producción) tras diversas estimulaciones termogénicas. Esto debería proporcionarnos información valiosa sobre el papel de las MTD como sumidero y proveedor sistémico de nutrientes, al enumerar cuantitativamente los principales combustibles metabólicos, así como los metabolitos secretados. Además, esto también puede ser útil para identificar adipoquinas marrones derivadas de metabolitos no estudiadas anteriormente, especialmente cuando se opera con plataformas metabolómicas basadas en el descubrimiento.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que denunciar.

Acknowledgments

Agradecemos a todos los miembros de los laboratorios Choi y Jung por la discusión metodológica. Agradecemos a C. Jang y D. Guertin por sus consejos y comentarios. Agradecemos a M.S. Choi por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por NRF-2022R1C1C1012034 a S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 a D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 a S.M.J. y D.W.C. Este trabajo fue apoyado por la Universidad Nacional de Chungnam para W.T.K. La Figura 1 y la Figura 2 se crearon utilizando BioRender (http://biorender.com/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

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