Summary
Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.
Abstract
O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.
Introduction
O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer 6,7,8. Estudos retrospectivos recentes têm demonstrado associação inversa entre massa de MTD e/ou sua atividade metabólica com obesidade, hiperglicemia e saúde cardiometabólica em humanos 9,10,11.
Recentemente, a MTD tem sido proposta como um sumidouro metabólico responsável pela manutenção do NST, uma vez que requer quantidades substanciais de nutrientes circulantes como combustível termogênico 6,7. Além disso, as MTD podem gerar e liberar fatores bioativos, denominados adipocinas marrons ou BATokines, que atuam como sinais endócrinos e/ou parácrinos, indicando seu envolvimento ativo na homeostase metabólica em nível de sistemas 12,13,14,15. Portanto, a compreensão do metabolismo de nutrientes da MTD deve melhorar nossa compreensão de seu significado fisiopatológico em humanos, além de seu papel convencional como órgão termorregulador.
Estudos metabolômicos empregando traçadores de isótopos estáveis, em combinação com estudos clássicos de absorção de nutrientes usando radiotraçadores não metabolizáveis, melhoraram significativamente nossa compreensão de quais nutrientes são preferencialmente absorvidos pela MTD e como são utilizados 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por exemplo, estudos com traçadores radioativos demonstraram que a MTD ativada pelo frio absorve glicose, ácidos graxos ligados a lipoproteínas e aminoácidos de cadeia ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27 . O recente rastreamento isotópico combinado com estudos metabolômicos tem permitido medir o destino metabólico e o fluxo desses nutrientes dentro dos tecidos e células cultivadas 24,25,26,28,29,30. No entanto, essas análises se concentram principalmente na utilização individual de nutrientes, deixando-nos com conhecimento limitado dos papéis de nível de sistemas da MTD na troca de metabólitos de órgãos. As questões relativas às séries específicas de nutrientes circulantes consumidos pelas MTD e às suas contribuições quantitativas em termos de carbono e azoto permanecem indefinidas. Além disso, a exploração de se a MTD pode gerar e liberar BATokines derivadas de metabólitos (por exemplo, lipocinas) usando nutrientes está apenas começando 12,13,14,15,31,32.
A análise arteriovenosa do sangue é uma abordagem fisiológica clássica utilizada para avaliar a captação ou liberação específica de moléculas circulantes em órgãos/tecidos. Esta técnica já foi aplicada à MTD interescapular de ratos para medir oxigênio e vários metabólitos, estabelecendo a MTD como o principal sítio de termogênese adaptativa com seu potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recentemente, um estudo arteriovenoso utilizando MTD interescapular de ratos foi acoplado a uma abordagem trans-ômica, levando à identificação de BATokinas não descobertas liberadas por MTD estimulada termogenicamente38.
Avanços recentes em cromatografia gasosa de alta sensibilidade e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS) têm reacendido o interesse em estudos arteriovenosos para a análise quantitativa da troca de metabólitos órgão-específicos 39,40,41. Essas técnicas, com seu alto poder de resolução e precisão de massa, permitem a análise abrangente de uma ampla gama de metabólitos usando pequenas quantidades de amostra.
Em alinhamento com esses avanços, um estudo recente adaptou com sucesso a metabolômica arteriovenosa para o estudo da MTD em camundongos, possibilitando a análise quantitativa das atividades de troca de metabólitos nas MTD em diferentes condições42. Este artigo apresenta um protocolo de metabolômica arteriovenosa direcionado para MTD usando GC-MS em um modelo de camundongo C57BL/6J.
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Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cama e nidificação foram trocados semanalmente. Para este estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com idade de 12 semanas e peso entre 25 g e 30 g. Estes animais foram provenientes de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Modulação da atividade metabólica do tecido adiposo marrom através da aclimatação à temperatura e estimulação farmacológica
NOTA: A aclimatação da temperatura ao longo de vários dias a semanas ou a estimulação farmacológica usando agonistas dos receptores β-adrenérgicos são métodos comumente empregados para modular a atividade da MTD1. Portanto, uma visão geral concisa do método é fornecida abaixo para permitir que os leitores escolham a abordagem apropriada, conforme necessário. Para obter MTD metabolicamente inativa (menos termogênica), uma temperatura quente basal, conhecida como termoneutralidade (28-30 °C), é selecionada para camundongos C57BL/6J. Essa faixa garante que os camundongos não precisem gastar energia extra para manter uma temperatura corporal constante. Para obter MTD metabolicamente modesta ou altamente ativa (termogênica), temperaturas de frio leve (20-22 °C) ou frio severo (6 °C) podem ser escolhidas, respectivamente. Para os propósitos deste experimento, camundongos foram criados em condições padrão de alojamento a 22 °C, que, embora levemente frias para camundongos, não envolveram nenhum estímulo farmacológico.
- Aclimatação de temperatura
- Separe os ratos para abrigar 1 ou 2 camundongos por gaiola pelo menos 1 semana antes de iniciar a aclimatação da temperatura. Prepare incubadoras de roedores equipadas com ventilação de ar, temperatura e controle de umidade com as condições desejadas.
- Mover as gaiolas para suas respectivas incubadoras de roedores em dias apropriados para o tipo de aclimatação de temperatura escolhido.
- Certifique-se de que a distribuição do número de ratos seja uniforme em todos os grupos, com 1 ou 2 ratos por gaiola. A habitação individual é preferida por ser mais sensível às mudanças fisiológicas induzidas pela temperatura em comparação com a habitação de grupo43. Aqui estão as condições específicas de moradia para cada grupo:
- Grupo de termoneutralidade (30 °C): Manter os ratos deste grupo continuamente a uma temperatura de 30 °C durante até quatro semanas.
- Grupo de frio severo: Inicialmente, abrigar os camundongos deste grupo a 18 °C sem nenhum material de nidificação. Eles experimentarão uma diminuição semanal gradual da temperatura, chegando a 6 °C na quarta semana. A progressão da temperatura é a seguinte: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
- Grupo de frio moderado (20-22 °C): Alojar os ratos deste grupo em incubadoras de roedores nas mesmas condições de alojamento padrão mencionadas anteriormente.
- Desafios de frio agudo: Para desafios de frio agudo, coloque 1-2 camundongos por gaiola sem nenhum material de nidificação e os exponha a uma incubadora de roedores fixada a 6 °C por até 8 h.
NOTA: Estas condições de alojamento e variações de temperatura são essenciais para estudar os efeitos de diferentes ambientes de temperatura na atividade e metabolismo de MTD.
- Troque as gaiolas e reponha comida e água toda semana. Pré-aclimatar as gaiolas pelo menos 24 h antes da suplementação, em sua respectiva temperatura (incubadora de roedores).
NOTA: Para evitar a perturbação do estímulo de temperatura apropriado, é importante não fornecer enriquecimento de ratos que possam levar à construção de ninhos. Em resposta ao frio intenso, os ratos gastam mais energia para manter a temperatura corporal, resultando em aumento da ingestão de alimentos e maiores taxas de excreção. Portanto, é crucial verificar as gaiolas pelo menos duas a três vezes por semana (seguindo as diretrizes institucionais locais) para garantir que os camundongos tenham um suprimento adequado de comida e água, e que as gaiolas não estejam excessivamente úmidas. Esse monitoramento é essencial para manter o bem-estar e a saúde dos camundongos durante o estudo.
- Estimulação farmacológica1 utilizando o agonista dos receptores β3-adrenérgicos CL316,243
- Para maximizar o efeito estimulatório, pré-alojar os ratos em termoneutralidade (30 °C) por 2-4 semanas antes das injeções.
- Após o período de aclimatação, injetar por via intraperitoneal 1 mg/kg CL316,243.
NOTA: Para estimulação crônica com o agonista do receptor β3-adrenérgico (por exemplo, de 3 dias até semanas 1,44,45), injeções diárias são necessárias devido à estabilidade da droga. CL316,243 diluído deve ser preparado no dia da injeção devido à estabilidade.
2. Coleta de sangue arteriovenoso
NOTA: Camundongos com mais de 12-14 semanas são mais recomendados para amostragem de sangue arteriovenoso. Camundongos mais jovens podem não ter veias de Sulzer suficientemente dimensionadas, um vaso sanguíneo distinto que drena especificamente o sangue venoso da MTDinterescapular 46.
- Anestesiar suavemente com vaporizador calibrado com isoflurano a 3% para indução (em câmara de 205 x 265 x 200 mm) e isoflurano a 2% para manutenção (com máscara de anestesia gasosa).
NOTA: Todo o procedimento de coleta de sangue arteriovenoso deve ser prontamente realizado após a anestesia. Uma almofada de aquecimento aquecida por água pode ser usada durante a anestesia para manter a temperatura corporal central.
CUIDADO: O isoflurano é altamente volátil e tóxico quando inalado. Portanto, a anestesia primária deve ser realizada sob uma capela de fumaça. - Verifique os reflexos do animal, como a retração da pata, para confirmar se a anestesia atingiu uma profundidade adequada.
- Coleta de sangue venoso da veia da Sulzer
- Posicione o mouse para expor a pele dorsal, confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele dorsal com amplo etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelo e faça uma incisão ao longo das costas da parte inferior do tórax até o pescoço.
NOTA: A MTD interescapular está localizada logo abaixo da pele, consistindo de duas almofadas de gordura cobertas por finos tecidos adiposos brancos. É importante garantir que o rato permaneça sob anestesia através da máscara de anestesia gasosa. - Levante suavemente a MTD interescapular com pinças de ponta dobrada e corte cuidadosamente os tecidos anexados, a maioria dos quais são músculos. Levante o coxim gorduroso em direção à cabeça, continue a cortar os tecidos anexados e abra cuidadosamente a região até que a veia de Sulzer (um grande vaso vermelho escuro em forma de 'Y' conectado a ambos os coxins de gordura do morcego interescapular) seja exposta.
NOTA: Tenha cuidado para não cortar os vasos capilares dos tecidos musculares que estão conectados com a região frontal e lateral do BAT interescapular, pois isso reduzirá significativamente a quantidade e a qualidade do sangue que drena da veia de Sulzer. - Corte cuidadosamente a veia da Sulzer e colete aproximadamente 40 μL de sangue usando pontas de pipeta de 200 μL cortadas no fundo e uma pipeta P100. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro.
NOTA: É importante coletar sangue logo abaixo do ponto de divisão em forma de Y da veia de Sulzer, para evitar a contaminação do sangue da veia cava superior47. Coletar muito sangue diminuirá as características da veia de Sulzer. Assim, certifique-se de coletar a quantidade mínima de sangue necessária da veia da Sulzer para análise. Seja cuidadoso ao selecionar tubos de coleta de sangue, pois soro e plasma produzem diferentes perfis de metabólitos 48,49,50. Para a coleta de plasma, é necessário o uso de tubos revestidos com heparina. Neste experimento, tubos revestidos com ativador de coagulação foram escolhidos para obtenção de soro. Em nenhuma circunstância devem ser utilizados tubos revestidos com EDTA, pois o EDTA impacta significativamente os sinais de espectrometria de massa51,52.
- Posicione o mouse para expor a pele dorsal, confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele dorsal com amplo etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelo e faça uma incisão ao longo das costas da parte inferior do tórax até o pescoço.
- Coleta de sangue arterial do ventrículo esquerdo
- Vire o mouse sem perder o contato com o cone do nariz, para expor a pele ventral. Confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele ventral com ampla quantidade de etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelos e abra cuidadosamente a cavidade torácica com tesoura para expor o coração sem danificar nenhuma estrutura interna.
- Puncione com precisão a área do ápice do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 29 G (1/2"). Inserir dois terços de uma agulha de 1/2'' a 3-5 mm na horizontal direita do ápice do coração (Figura 1B) e puxar a seringa para trás para coletar sangue do ventrículo esquerdo (50-100 μL). O sangue do ventrículo esquerdo é sangue arterial oxigenado, que é vermelho vivo. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro.
NOTA: Uma incisão mínima deve ser feita na cavidade torácica para acesso ao coração. A incisão excessiva pode levar a sangramento local, que posteriormente pode resultar em pressão arterial baixa. Isso poderia afetar a qualidade do sangue arterial coletado do ventrículo esquerdo. Evite girar ou virar o coração, pois isso dificultará a determinação da posição precisa do ventrículo esquerdo. - Realizar a eutanásia e garanti-la com um método adequado seguindo as orientações das instituições locais. Por exemplo, a eutanásia pode ser realizada através do deslocamento cervical e confirmada pela cessação dos batimentos cardíacos.
- Centrifugar amostras de sangue a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recolha cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta. O sobrenadante deve conter soro ou plasma, dependendo do tipo de tubo de coleta de sangue usado. Pode-se parar aqui e armazenar as amostras a -20 °C até o processamento do soro para análise de CG-EM.
NOTA: A hemólise pode potencialmente ter ocorrido se o sobrenadante de cor vermelha for observado. Para evitar hemólise, vórtice a amostra antes que a coagulação seja concluída. Alguns metabólitos enriquecidos com hemácias, incluindo glutamina e lactato, podem levar a erros de interpretação dos dados, embora a maioria dos metabólitos possa não ser significativamente afetada pela hemólise. Recomenda-se analisar o soro/plasma dentro de uma semana.
3. Extração de metabólitos do soro e derivatização química
- Preparação para a extração
NOTA: Todos os métodos, incluindo extração de metabólitos, derivatização e análise de dados, são versões ligeiramente modificadas dos métodos descritos anteriormente53,54.- Preparar o tampão de extracção adicionando 100 μM de solução de DL-norvalina, padrão interno (ver Tabela de Materiais), ao metanol de grau MS.
- Garantir que todos os procedimentos experimentais sejam conduzidos no gelo.
- Transfira 10 μL de soro de camundongos extraído da veia de Sulzer ou do ventrículo esquerdo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 40 μL de tampão de extração.
- Para remover restos celulares e proteínas, agite brevemente as amostras de soro, seguido da centrifugação à velocidade máxima (18.000 x g) por 30 min a 4 °C.
- Após centrifugação, transferir cuidadosamente 40 μL de sobrenadante para um frasco para injetáveis de vidro, seguido de 3 h de secagem numa centrífuga a vácuo a 4 °C.
NOTA: Recomenda-se uma pastilha de vidro (consulte a Tabela de Materiais) em vez de tubos de plástico devido a produtos químicos reativos de plástico usados durante toda a etapa de derivatização subsequente. - Submeter as amostras secas a duas etapas consecutivas de derivatização para a análise GC-MS dos metabólitos séricos.
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas sob um exaustor devido aos riscos de irritação dos solventes.- Ressuspender os extractos de soro secos em 30 μL de cloridrato de metoxiamina 10 mg/ml (ver Tabela de Materiais) dissolvido em piridina e incubá-lo a 37 °C durante 30 minutos.
- Derivatizar amostras para sililação de metabolitos com 70 μL de N-metil-N-terc-butildimetilsililifluoroacetamida (MTBSTFA, ver Tabela de Materiais) a 70 °C durante 1 h.
NOTA: O uso de uma seringa de vidro é recomendado em vez de uma ponta de plástico nas etapas a seguir devido aos solventes de derivatização que reagem com o plástico.
4. Análise metabolômica por CG-EM
NOTA: O GC-EM quádruplo único (ver Tabela de Materiais) foi empregado para medir os vários metabólitos séricos, incluindo carboidratos, aminoácidos e intermediários do ciclo do TCA em amostras derivatizadas da veia de Sulzer e do ventrículo esquerdo. Outras colunas podem ser usadas alternativamente, embora as configurações experimentais, incluindo o programa de temperatura, possam variar dependendo dos tipos de colunas usadas.
- Injetar 1 μL da amostra derivatizada no CG em modo splitless a 280 °C (temperatura de entrada), usando hélio como gás carreador com vazão de 1.500 mL/min (set point).
- Ajuste o quadrupolo a 200 °C com interface GC-MS a 300 °C.
NOTA: O programa do forno para todas as análises de metabólitos começa em 60 °C, é mantido por 1 minuto e, em seguida, é aumentado a uma taxa de 10 °C/min até que a temperatura atinja 320 °C. - Coletar dados por ionização de elétrons (EI) ajustada em 70 eV e adquirir os dados da amostra no modo de varredura (50-550 m/z)53. Todos os metabólitos utilizados neste estudo foram previamente validados com padrões para confirmar espectros de massa e tempos de retenção.
- Realizar a integração da área de pico usando um software de análise disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- Combine os compostos com o íon produto de cada derivado TBMDS. Em seguida, obtenha o cromatograma de íons de extração (EIC) integrando o valor m/z do íon fragmento na área do pico correspondente e, em seguida, exporte-o. Os íons fragmentados são mostrados na Tabela 1.
NOTA: A CEI de cada composto foi normalizada pela DL-norvalina em cada amostra. Os dados são representados pela veia Log2 de Sulzer para o ventrículo esquerdo (Log2(SV/LV)) usando cada valor normalizado de EIC.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra o esquema experimental da metabolômica AV otimizada para BAT. Como mencionado na seção Protocolo, para obter tecido adiposo marrom diferencialmente estimulado, camundongos são submetidos à aclimatação à temperatura em incubadoras de roedores ou recebem administração farmacológica, como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, camundongos são anestesiados e amostras de sangue são coletadas para análise metabolômica (Figura 1A). Para a coleta de sangue, o sangue venoso que drena especificamente da MTD interescapular é coletado pela veia de Sulzer, enquanto o sangue arterial é coletado diretamente do ventrículo esquerdo do coração (Figura 1B).
A Figura 2 representa os esquemas da metabolômica sérica utilizando CG-EM (Figura 2). Resumidamente, a solução de metanol é adicionada às amostras de soro seguida de centrifugação para remover as proteínas séricas. O sobrenadante contendo os metabólitos foi seco em SpeedVac e as amostras secas foram submetidas à derivatização em duas etapas usando metoxiamina (MOX) e MTBSTFA (N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida). A etapa de derivatização visa a substituição de grupos funcionais polares dos metabólitos por éster de TBDMS, permitindo a detecção de metabólitos por CG-EM como derivados de TBDMS. As amostras derivatizadas foram analisadas utilizando-se CG-EM quádruplo simples. Os metabólitos são separados na coluna de acordo com suas propriedades físico-químicas. A ionização eletrônica (EI) é empregada para quebrar os metabólitos em íons fragmentos únicos detectados por um detector de massa. A identificação do composto é realizada através da detecção de íons fragmentos específicos do composto. O valor de m/z e o tempo de retenção dos íons fragmentos compostos específicos no experimento são mostrados na tabela (Tabela 1). Um cromatograma de íons extraído (EIC) é usado para integrar o sinal de um íon fragmento específico composto na área do pico do metabólito, que define a abundância de metabólitos.
Para determinar se a MTD libera ou absorve uma série de metabólitos, as razões Log2 da contagem de íons entre a veia de Sulzer e o ventrículo esquerdo (Log2(SV/LV)) podem ser calculadas (Figura 3). Se o valor de Log2 (SV/LV) para um determinado metabólito for >0, isso indica que o metabólito é mais abundante no VS do que no VE, sugerindo que a rede BAT interescapular libera o metabólito. Por outro lado, se o valor de Log2 (SV/LV) para um determinado metabólito for <0, isso sugere que o metabólito é absorvido pelo morcego interescapular.
Usando essa abordagem, verificou-se que a MTD leve estimulada pelo frio consome significativamente glicose, lactato, 3-hidroxibutirato (3-HB), BCAAs, aspartato, lisina e triptofano, enquanto a MTD libera significativamente succinato e palmitato (Figura 3A). A maioria desses fenômenos foi observada em nossos estudos anteriores sobre MTD de frio crônico42, sugerindo que a MTD de frio leve se assemelha metabolicamente à MTD de frio crônico, embora em menor grau. Para fornecer uma visão geral rápida dos dados, um mapa de calor exibindo os valores de Log2 (SV/LV) é representado (Figura 3B). É essencial interpretar os dados com cautela, pois o mapa de calor representa os escores Z dentro do grupo.
Figura 1: Esquema experimental da metabolômica arteriovenosa (AV) otimizada para BAT. (A) Diagrama mostrando o fluxo de trabalho da metabolômica AV. (1) Para induzir diferentes versões do tecido adiposo marrom (BAT) metabolicamente estimulado, camundongos são aclimatados a diferentes temperaturas ou recebem injeções farmacológicas de drogas. (2) Posteriormente, as amostras de sangue arterial e venoso são coletadas do ventrículo esquerdo e da veia de Sulzer dos camundongos, respectivamente. (3) As amostras de soro obtidas são submetidas à extração de metabólitos, seguida de análise metabolômica. (B) Imagens representativas que orientem os procedimentos de coleta de sangue. O sangue arterial é coletado do ventrículo esquerdo, enquanto o sangue venoso é obtido da veia de Sulzer, pois drena especificamente o sangue da BAT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Metabolômica direcionada baseada em GC/MS. Esquema experimental de metabolômica direcionada baseada em CG/MS. TBDMS: terc-butildimetilsilil, EI: ionização de elétrons, EIC: Cromatograma de íons de extração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados representativos da metabolômica AV. (A) A absorção e subsequente liberação de metabólitos de combustível circulantes prevalentes e altamente ativos selecionados por MTD, classificados de acordo com seus respectivos grupos. Os dados mostram a relação veia/ventrículo esquerdo (VS/VE) de Log2 Sulzer. As barras que indicam metabólitos com Log2 médio (SV/LV) <0 são coloridas de vermelho e Log2 (SV/LV) >0 são coloridas de azul. Pontos de dados individuais representam cada mouse; n = 11. Os dados são médios ± MEV.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; aminoácidos de cadeia ramificada; CEA; aminoácidos essenciais; NEAA; aminoácidos não essenciais. (B) Um mapa de calor ilustrando a abundância diferencial de metabólitos entre o sangue da veia de Sulzer (VS) e do ventrículo esquerdo (VE). Cada coluna mostra um escore Z de valores médios dentro do grupo; n = 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto | m/z de íons fragmentados | Tempo de retenção | Formular | Formular derivado TBDMS |
| Piruvato | 174.1 | 8.72 | C3H4O3 | C15H33O3NSi2 |
| Aspartato | 418.2 | 18.45 | C4H7NO4 | C22H49NO4Si3 |
| α-Cetoglutarato | 346.2 | 17.27 | C5H6O5 | C18H37NO5Si2 |
| C16:0 (Palmitato) | 313.3 | 19.72 | C16H32O2 | C22H46O2Si |
| Lactato | 261.2 | 11.66 | C3H6O3 | C15H34O3Si2 |
| Leucina | 200.2 | 14 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Isoleucina | 200.2 | 14.34 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Valina | 186.2 | 13.53 | C5H11NO2 | C17H39NO2Si2 |
| Alanina | 260.2 | 12.17 | C3H7NO2 | C15H35NO2Si2 |
| Serina | 390.2 | 17.04 | C3H7NO3 | C21H49NO3Si3 |
| Glicina | 218.1 | 12.43 | C2H5NO2 | C14H33NO2Si2 |
| Lisina | 300.2 | 20.48 | C6H14N2O2 | C24H56N2O2Si3 |
| Succinato | 289.1 | 14.65 | C4H6O4 | C16H34O4Si2 |
| Prolina | 258.2 | 14.73 | C5H9NO2 | C17H37NO2Si2 |
| Fenilalanina | 336.2 | 18 | C9H11NO2 | C21H39NO2Si2 |
| Metionina | 320.2 | 16.84 | C5H11NO2S | C17H39NO2SSi2 |
| Cisteína | 406.2 | 19 | C3H7NO2S | C21H49NO2SSi3 |
| Asparagina | 417.2 | 19.86 | C4H8N2O3 | C22H50N2O3Si3 |
| 3-hidroxibutirato (3HB) | 275.2 | 12.81 | C4H8O3 | C16H36O3Si2 |
| Triptofano | 375.2 | 22.97 | C11H12N2O2 | C23H40N2O2Si2 |
| Malato | 419.2 | 18.19 | C4H6O5 | C22H48O5Si3 |
| Glutamato | 432.3 | 19.59 | C5H9NO4 | C23H51NO4Si3 |
| Glutamina | 431.3 | 20.85 | C5H10N2O3 | C23H52N2O3Si3 |
| Citrato | 459.2 | 22.38 | C6H8O7 | C30H64O7Si4 |
| Glicose | 476.3 | 22.7 | C6H12O6 | C30H68O6Si4 |
Tabela 1: Íons de fragmentos compostos GC/MS usados para integração. Esta tabela contém uma lista de 25 metabólitos séricos identificados no presente método, com o tempo de retenção e os íons fragmentos correspondentes a cada composto.
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Discussion
Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park ecols.42. Abaixo estão os principais pontos que você deve considerar criticamente ao seguir o protocolo.
Para a estimulação termogênica, uma consideração fundamental é escolher o tipo mais apropriado de estimulação termogênica para o seu ambiente experimental. Por exemplo, ao utilizar um grupo experimental (vs. controle) e com o objetivo de observar diferenças na capacidade de adaptação metabólica (crucial para seu potencial termogênico máximo não trêmulo) da BAT, a aclimatação crônica ao frio ou a estimulação dos receptores β-adrenérgicos (com duração superior a 3 dias a 4 semanas)é adequada 1,45. Quando a MTD é exposta à exposição aguda ao frio (algumas horas a menos de 24 h), em vez de se adaptar metabolicamente, a MTD metaboliza seus combustíveis intrínsecos armazenados e se comunica metabolicamente com os músculos que tremem para obter a termogênese ideal1. Um agonista dos receptores β-adrenérgicos representa uma resposta neuronal para desencadear a termogênese de MTD 1,14, e existem outros fatores endócrinos que potencializam o programa termogênico 55,56,57,58,59,60. Ao realizar a estimulação termogênica como mencionado acima, ter um controle basal na termoneutralidade (30 °C) deve ser útil para confirmar se a estimulação funcionou adequadamente.
Como mencionado na seção de protocolo, a obtenção de sangue arteriovenoso da mais alta qualidade é fundamental para determinar o sucesso do estabelecimento do experimento. Para tal, é essencial prevenir a hemólise (ver passo 2.5) e recolher uma quantidade consistente de sangue para evitar a diluição das características distintas do sangue venoso da veia da Sulzer (menos de 40 μL da veia da Sulzer). Para esse fim, durante a configuração inicial, os autores recomendam fortemente a realização de um experimento piloto para medição de metabólitos usando não apenas sangue da veia de Sulzer, mas também sangue de sangue venoso não BAT drenando (por exemplo, veia cava inferior). Isso ajudará a confirmar se o soro da veia de Sulzer revela perfil de metabólito distinto em comparação com os vasos venosos não-BAT. Em relação à coleta de sangue arterial do ventrículo esquerdo, é importante puncionar consistentemente a mesma área no ventrículo esquerdo para minimizar as variações nos níveis de cardiocinas61,62. Tais variações poderiam produzir resultados confusos em metabolômica arteriovenosa ou proteômica.
A cromatografia acoplada à espectrometria de massas é uma das ferramentas mais poderosas para metabolômica, sendo um método o GC-MS63. De fato, a medição de metabólitos biologicamente relevantes usando GC-MS foi considerada desafiadora devido à questão da cobertura; A aplicação de GC-MS é geralmente limitada à análise de metabólitos com propriedades altamente voláteis e apolares, em oposição aos numerosos metabólitos polares em tecidos e fluidos biológicos. No entanto, o desenvolvimento de vários métodos de extração e derivatização, juntamente com as vantagens do GC-MS, incluindo excelente resolução de pico, reprodutibilidade e extensas bibliotecas espectrais de massa, permitindo a identificação prática de picos, levou a tal plataforma como uma opção atraente para analisar metabólitos biologicamente relevantes64,65.
Neste protocolo, a plataforma GC-MS é empregada para a análise de 25 metabólitos em soro coletado pela técnica supracitada. Para tanto, a extração dos metabólitos foi realizada com solução de metanol a 80%. É importante notar que, durante esta etapa, o uso de certos tipos de tubos, incluindo tubos Eppendorf, é recomendado para atingir os níveis mais baixos de contaminação por substâncias orgânicas nas amostras. A separação cuidadosa do sobrenadante dos pellets após a extração também é necessária para remover restos de proteína do soro, o que é crítico para a manutenção do desempenho da fonte de íons MS.
A etapa de derivatização pode ser diversificada com base nos tipos de derivatizações, incluindo derivados de arila, sililação e acilação66. Os autores empregaram a derivatização em duas etapas com N-metil-N-terc-butildimetilsililrifluoroacetamida (MTBSTFA) para a sialilação de metabólitos, que é um método comumente usado com a vantagem de detecção estável de metabólitos polares biologicamente relevantes, incluindo açúcares, mas com uma desvantagem em relação à perda ocasional do grupo N-trimetilsilil de aminas e aminoácidos durante a etapa de análise64. Vale ressaltar que as amostras devem ser completamente secas antes da etapa de derivatização, devido à sensibilidade à umidade dos reagentes e derivados.
Uma das principais limitações da análise por CG, em geral, ainda se resume à gama de metabólitos detectáveis, apesar das etapas de derivatização mencionadas acima, que melhoram a capacidade de CG-EM em relação à detecção de metabólitos polares, especialmente em comparação com a análise baseada em LC-MS. Metabolômica quantitativa usando LC-MS pode ajudar muito a obter uma melhor compreensão do espectro metabólico dos BATs com relação à troca sistêmica de metabólitos24,42.
Embora o cálculo utilizado no protocolo-medida do gradiente de concentração do metabólito entre o arterial vs. sangue venoso; Log2(SV/LV)-quantifica a absorção fracionada e a mudança de liberação por BAT, é necessário cuidado para a interpretação dos dados. Em particular, para os metabolitos cujo valor de troca líquido fracionário é «0» (por exemplo, citrato, αKG, malato, metionina, alanina, glutamina), o resultado pode ser atribuído à ausência de captação/libertação ou ao catabolismo e síntese igualmente activos (em que tanto a absorção como a libertação são elevadas). Para verificar qual das duas possibilidades está correta, são necessários experimentos adicionais de fluxo metabólico utilizando o traçado isotópico in vivo com o metabólito captado e/ou seu substrato39.
A limitação do cálculo fracionário é que ele não fornece o panorama quantitativo da captação e liberação desses metabólitos42,67. Por exemplo, embora o valor de Log2 (SV/LV) indique uma captação líquida relativa comparável entre glicose e 3-hidroxibutirato (3HB), a contribuição real da glicose para as fontes de carbono deve ser muito maior do que a de 3-HB devido ao fato de que a concentração sanguínea de glicose é muito maior do que a de 3HB, e porque a glicose contém quatro carbonos a mais (glicose tem seis carbonos; 3HB tem dois carbonos). Se necessário, uma análise abrangente incorporando parâmetros adicionais, como a taxa de fluxo sanguíneo, as concentrações sanguíneas reais de cada metabólito e suas equações químicas, deve nos informar sobre as contribuições quantitativas dos metabólitos absorvidos/liberados e suas contribuições no fluxo total de carbono ou nitrogênio42,67.
Uma grande vantagem desta metodologia miniaturizada para amostragem arteriovenosa de sangue e análise metabolômica em camundongos é sua combinação sinérgica com vários modelos genéticos para estudar o metabolismo e a fisiologia do tecido adiposo marrom (por exemplo, UCP1-KO, UCP1-Cre conduzido por modelos de perda de função específicos para BAT, modelos transgênicos). A análise metabolômica recente, que requer apenas traços de soro para o perfil metabolômico, torna essa abordagem mais viável com organismos menores (ver protocolo 3)39. No entanto, a análise proteômica, que pode fornecer melhores insights quando considerada em conjunto com a metabolômica, pode exigir maiores quantidades de amostras. Nesse sentido, a amostragem arteriovenosa convencional em ratos pode ser mais adequada. Remetemos os leitores ao mais recente protocolo de coleta de sangue arteriovenoso para MTD em ratos, de autoria de Mestres-Arenas e colaboradores47.
Embora o protocolo atual adote o procedimento anestésico com isoflurano, conforme descrito em Park et al.42, essa abordagem pode impactar negativamente o metabolismo termogênico de adipócitos marrons e/ou tecido adiposo marrom in vivo 68,69,70,71. Portanto, futuras metabolômicas arteriovenosas utilizando pentobarbital justificam a investigação.
Em resumo, este protocolo fornece uma metodologia fundamental para medir a atividade metabólica líquida específica do MTD (consumo vs. produção) sobre vários estímulos termogênicos. Isso deve nos dar informações valiosas sobre o papel da MTD como um sumidouro sistêmico de nutrientes, bem como fornecedor, listando quantitativamente os principais combustíveis metabólicos, bem como metabólitos secretados. Além disso, isso também pode ser útil para identificar adipocinas marrons derivadas de metabólitos não estudadas anteriormente, especialmente quando operadas com plataformas metabolômicas baseadas em descoberta.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros dos laboratórios Choi e Jung pela discussão metodológica. Agradecemos a C. Jang e D. Guertin pelos conselhos e feedback. Agradecemos a M.S. Choi pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por NRF-2022R1C1C1012034 para S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 para D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 para S.M.J. e D.W.C. Este trabalho foi apoiado pela Chungnam National University for W.T.K. A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas usando BioRender (http://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
| 1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
| Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
| Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
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