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Biochemistry

ब्राउन वसा ऊतक में विवो मेटाबोलाइट एक्सचेंज में मापने के लिए धमनीशिरापरक मेटाबोलॉमिक्स

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में, माउस मॉडल में जीसी-एमएस का उपयोग करके बैट-अनुकूलित धमनीशिरापरक मेटाबोलामिक्स के लिए प्रासंगिक तरीकों को रेखांकित किया गया है। ये विधियां जीव स्तर पर बैट-मध्यस्थता मेटाबोलाइट एक्सचेंज में मूल्यवान अंतर्दृष्टि के अधिग्रहण की अनुमति देती हैं।

Abstract

ब्राउन वसा ऊतक (बीएटी) एक अद्वितीय ऊर्जा व्यय प्रक्रिया के माध्यम से चयापचय होमियोस्टेसिस को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जिसे गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस के रूप में जाना जाता है। इसे प्राप्त करने के लिए, बैट अपनी उच्च चयापचय मांग का समर्थन करने के लिए पोषक तत्वों को प्रसारित करने के विविध मेनू का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, बैट मेटाबोलाइट-व्युत्पन्न बायोएक्टिव कारकों को गुप्त करता है जो चयापचय ईंधन या सिग्नलिंग अणुओं के रूप में काम कर सकते हैं, जिससे बैट-मध्यस्थता इंट्राटिश्यू और / या इंटरटिश्यू संचार की सुविधा मिलती है। इससे पता चलता है कि बैट सक्रिय रूप से प्रणालीगत मेटाबोलाइट एक्सचेंज में भाग लेता है, एक दिलचस्प विशेषता जिसे खोजा जाने लगा है। यहां, हम विवो माउस-स्तर अनुकूलित बैट धमनीशिरापरक मेटाबोलॉमिक्स के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल थर्मोजेनिक उत्तेजनाओं के लिए प्रासंगिक तरीकों और सुल्ज़र की नस का उपयोग करके एक धमनीशिरापरक रक्त नमूना तकनीक पर केंद्रित है, जो चुनिंदा रूप से इंटरस्कैपुलर बैट-व्युत्पन्न शिरापरक रक्त और प्रणालीगत धमनी रक्त को निकालता है। इसके बाद, उन रक्त नमूनों का उपयोग करके एक गैस क्रोमैटोग्राफी-आधारित मेटाबोलामिक्स प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है। इस तकनीक के उपयोग को बैट द्वारा मेटाबोलाइट्स के शुद्ध तेज और रिलीज को मापने के द्वारा अंतर-अंग स्तर पर बैट-विनियमित मेटाबोलाइट एक्सचेंज की समझ का विस्तार करना चाहिए।

Introduction

ब्राउन वसा ऊतक (बैट) में एक अद्वितीय ऊर्जा व्यय संपत्ति होती है जिसे गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस (एनएसटी) के रूप में जाना जाता है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) -निर्भर और यूसीपी1-स्वतंत्र तंत्र 1,2,3,4,5 दोनों शामिल हैं। इन विशिष्ट विशेषताओं प्रणालीगत चयापचय और मोटापा सहित चयापचय रोगों के रोगजनन के नियमन में बैट फंसाना, प्रकार 2 मधुमेह, हृदय रोग, और कैंसर cachexia 6,7,8. हाल के पूर्वव्यापी अध्ययनों ने बैट द्रव्यमान और / या मोटापे, हाइपरग्लाइसेमिया और मनुष्यों में कार्डियोमेटाबोलिक स्वास्थ्य के साथ इसकी चयापचय गतिविधि के बीच एक व्युत्क्रम संबंध दिखाया है 9,10,11.

हाल ही में, बैट को एनएसटी को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार चयापचय सिंक के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि इसे थर्मोजेनिक ईंधन 6,7 के रूप में परिसंचारी पोषक तत्वों की पर्याप्त मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, बैट बायोएक्टिव कारकों को उत्पन्न और जारी कर सकता है, जिन्हें ब्राउन एडिपोकिन्स या बैटकोकिन्स कहा जाता है, जो अंतःस्रावी और / या पैराक्राइन संकेतों के रूप में कार्य करते हैं, जो सिस्टम-स्तरीय चयापचय होमियोस्टेसिस 12,13,14,15में इसकी सक्रिय भागीदारी का संकेत देते हैं। इसलिए, बैट के पोषक तत्व चयापचय को समझने से मनुष्यों में इसके पैथोफिजियोलॉजिकल महत्व की हमारी समझ को बढ़ाना चाहिए, थर्मोरेगुलेटरी अंग के रूप में इसकी पारंपरिक भूमिका से परे।

गैर-चयापचय योग्य रेडियोट्रेसर्स का उपयोग करके क्लासिक पोषक तत्व तेज अध्ययनों के संयोजन में स्थिर आइसोटोप ट्रेसर को नियोजित करने वाले मेटाबोलोमिक अध्ययनों ने हमारी समझ में काफी सुधार किया है कि कौन से पोषक तत्व बैट द्वारा अधिमानतः लिए जाते हैं और उनका उपयोग कैसे किया जाता है 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. उदाहरण के लिए, रेडियोधर्मी अनुरेखक अध्ययनों से पता चला है कि शीत-सक्रिय बैट ग्लूकोज, लिपोप्रोटीन-बाउंड फैटी एसिड और ब्रांकेड-चेन अमीनो एसिड 16,17,18,19,20,21,22,23,27 लेता है. हाल ही में आइसोटोप अनुरेखण चयापचय अध्ययन के साथ संयुक्त हमें चयापचय भाग्य और ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं 24,25,26,28,29,30 के भीतर इन पोषक तत्वों के प्रवाह को मापने के लिए अनुमति दी है. हालांकि, ये विश्लेषण मुख्य रूप से पोषक तत्वों के व्यक्तिगत उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिससे हमें अंग मेटाबोलाइट एक्सचेंज में बीएटी की सिस्टम-स्तरीय भूमिकाओं के सीमित ज्ञान के साथ छोड़ दिया जाता है। बीएटी द्वारा खपत परिसंचारी पोषक तत्वों की विशिष्ट श्रृंखला और कार्बन और नाइट्रोजन के संदर्भ में उनके मात्रात्मक योगदान के बारे में प्रश्न मायावी रहते हैं। इसके अतिरिक्त, क्या बैट पोषक तत्वों का उपयोग करके मेटाबोलाइट-व्युत्पन्न BATokines (जैसे, लिपोकिन्स) उत्पन्न और जारी कर सकता है, इसकी खोज अभी 12,13,14,15,31,32 से शुरू हो रही है।

धमनीशिरापरक रक्त विश्लेषण एक क्लासिक शारीरिक दृष्टिकोण है जिसका उपयोग अंगों/ऊतकों में परिसंचारी अणुओं के विशिष्ट तेज या रिहाई का आकलन करने के लिए किया जाता है। इस तकनीक को पहले ऑक्सीजन और कई चयापचयों को मापने के लिए चूहों के इंटरस्कैपुलर बैट पर लागू किया गया है, जिससे बैट को इसकी अपचय क्षमता 33,34,35,36,37 के साथ अनुकूली थर्मोजेनेसिस की प्रमुख साइट के रूप में स्थापित किया गया है। हाल ही में, चूहे इंटरस्कैपुलर बैट का उपयोग करके एक धमनीशिरापरक अध्ययन को ट्रांस-ओमिक्स दृष्टिकोण के साथ जोड़ा गया था, जिससे थर्मोजेनिक रूप से उत्तेजित बैट 38 द्वारा जारी अनदेखा बैट38 की पहचान की गई।

उच्च संवेदनशीलता गैस क्रोमैटोग्राफी में हाल ही में प्रगति- और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस और एलसी-एमएस) आधारित मेटाबोलॉमिक्स ने अंग-विशिष्ट मेटाबोलाइट एक्सचेंज39,40,41के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए धमनीशिरापरक अध्ययन में रुचि पैदा की है। ये तकनीकें, उनकी उच्च संकल्प शक्ति और द्रव्यमान सटीकता के साथ, छोटे नमूना मात्रा का उपयोग करके चयापचयों की एक विस्तृत श्रृंखला के व्यापक विश्लेषण को सक्षम करती हैं।

इन प्रगति के साथ संरेखण में, एक हाल के अध्ययन सफलतापूर्वक माउस स्तर पर बैट का अध्ययन करने के लिए धमनीशिरापरक चयापचयों अनुकूलित, विभिन्न परिस्थितियों में बैट में मेटाबोलाइट विनिमय गतिविधियों के मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम42. यह लेख C57BL/6J माउस मॉडल में GC-MS का उपयोग करके BAT-लक्षित धमनीशिरापरक मेटाबोलामिक्स प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों Sungkyunkwan विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ आयोजित किए गए (IACUC). चूहों एक दैनिक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के बाद, 22 डिग्री सेल्सियस और 45% आर्द्रता पर एक साफ कमरे सेट में स्थित एक IACUC अनुमोदित पशु सुविधा में रखे गए थे. उन्हें हवादार रैक में रखा गया था और एक मानक चाउ आहार एड लिबिटम (जिसमें 60% कार्बोहाइड्रेट, 16% प्रोटीन और 3% वसा शामिल था) तक पहुंच थी। बिस्तर और घोंसले के शिकार सामग्री को साप्ताहिक आधार पर बदल दिया गया था। इस अध्ययन के लिए, 12 सप्ताह की आयु के पुरुष C57BL/6J चूहों और 25 ग्राम और 30 ग्राम के बीच वजन का उपयोग किया गया था। इन जानवरों को एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)।

1. तापमान अनुकूलन और औषधीय उत्तेजना के माध्यम से भूरे रंग के वसा ऊतक की चयापचय गतिविधि का मॉड्यूलेशन

नोट: सप्ताह या औषधीय उत्तेजना β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट का उपयोग कर कई दिनों से अधिक तापमान अनुकूलन आमतौर पर बैट गतिविधि1 modulating के लिए तरीकों कार्यरत हैं. इसलिए, पाठकों को आवश्यकतानुसार उपयुक्त दृष्टिकोण चुनने में सक्षम बनाने के लिए विधि का एक संक्षिप्त अवलोकन नीचे दिया गया है। चयापचय रूप से निष्क्रिय (कम थर्मोजेनिक) बैट प्राप्त करने के लिए, एक आधारभूत गर्म तापमान, जिसे थर्मोन्यूट्रलिटी (28-30 डिग्री सेल्सियस) कहा जाता है, को C57BL/6J चूहों के लिए चुना जाता है। यह सीमा सुनिश्चित करती है कि चूहों को निरंतर शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त ऊर्जा खर्च करने की आवश्यकता नहीं है। चयापचय रूप से मामूली या अत्यधिक सक्रिय (थर्मोजेनिक) बैट प्राप्त करने के लिए, क्रमशः हल्के ठंडे (20-22 डिग्री सेल्सियस) या गंभीर ठंड (6 डिग्री सेल्सियस) तापमान को चुना जा सकता है। इस प्रयोग के प्रयोजनों के लिए, चूहों को 22 डिग्री सेल्सियस पर मानक आवास स्थितियों के तहत उठाया गया था, जो कि चूहों के लिए हल्के से ठंडा था, इसमें कोई औषधीय उत्तेजना शामिल नहीं थी।

  1. तापमान अनुकूलन
    1. तापमान अनुकूलन शुरू करने से कम से कम 1 सप्ताह पहले पिंजरे प्रति 1 या 2 चूहों के घर के लिए चूहों को अलग करें। वांछित परिस्थितियों के साथ वायु वेंटिलेशन, तापमान और आर्द्रता नियंत्रण से लैस कृंतक इनक्यूबेटर तैयार करें।
    2. चुने हुए प्रकार के तापमान अनुकूलन के लिए उपयुक्त दिनों में पिंजरों को उनके संबंधित कृंतक इन्क्यूबेटरों में ले जाएं।
    3. सुनिश्चित करें कि चूहों की संख्या का वितरण सभी समूहों में भी कर रहे हैं, या तो पिंजरे प्रति 1 या 2 चूहों के साथ. एकल आवास को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि यह समूह आवास43 की तुलना में तापमान-प्रेरित शारीरिक परिवर्तनों के प्रति अधिक संवेदनशील है। यहां प्रत्येक समूह के लिए विशिष्ट आवास स्थितियां दी गई हैं:
      1. थर्मोन्यूट्रलिटी (30 डिग्री सेल्सियस) समूह: इस समूह में चूहों को लगातार 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर चार सप्ताह तक रखें।
      2. गंभीर ठंड समूह: प्रारंभ में, किसी भी घोंसले के शिकार सामग्री के बिना 18 डिग्री सेल्सियस पर इस समूह में चूहों घर. वे धीरे-धीरे साप्ताहिक तापमान में कमी का अनुभव करेंगे, चौथे सप्ताह तक 6 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाएंगे। तापमान की प्रगति इस प्रकार है: 18 डिग्री सेल्सियस → 14 डिग्री सेल्सियस → 10 डिग्री सेल्सियस → 6 डिग्री सेल्सियस।
      3. हल्के ठंडे समूह (20-22 डिग्री सेल्सियस): इस समूह में चूहों को कृंतक इनक्यूबेटरों में पहले वर्णित मानक आवास स्थितियों के समान शर्तों के तहत रखें।
      4. तीव्र ठंड चुनौतियों: तीव्र ठंड चुनौतियों के लिए, किसी भी घोंसले के शिकार सामग्री के बिना पिंजरे प्रति 1-2 चूहों जगह और 8 घंटे के लिए 6 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक कृंतक इनक्यूबेटर के लिए उन्हें बेनकाब.
        नोट: ये आवास की स्थिति और तापमान भिन्नता बैट गतिविधि और चयापचय पर विभिन्न तापमान वातावरण के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं।
    4. पिंजरे बदलें और हर हफ्ते भोजन और पानी की भरपाई करें। पूरकता से कम से कम 24 घंटे पहले पिंजरों को उनके संबंधित तापमान (कृंतक इनक्यूबेटर) पर पूर्व-अनुकूल करें।
      नोट: उपयुक्त तापमान उत्तेजना की गड़बड़ी को रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि घोंसले के निर्माण के लिए नेतृत्व कर सकता है कि माउस संवर्धन प्रदान करने के लिए नहीं. गंभीर ठंड के जवाब में, चूहे शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए अधिक ऊर्जा खर्च करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भोजन का सेवन बढ़ जाता है और उच्च उत्सर्जन दर होती है। इसलिए, प्रति सप्ताह कम से कम दो से तीन बार (स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए) पिंजरों की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चूहों के पास भोजन और पानी की पर्याप्त आपूर्ति है, और पिंजरे अत्यधिक गीले नहीं हैं। अध्ययन के दौरान चूहों की भलाई और स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए यह निगरानी आवश्यक है।
  2. औषधीय उत्तेजना1 β3-adrenergic रिसेप्टर एगोनिस्ट CL316,243 का उपयोग कर
    1. उत्तेजक प्रभाव को अधिकतम करने के लिए, इंजेक्शन से पहले 2-4 सप्ताह के लिए थर्मोन्यूट्रलिटी (30 डिग्री सेल्सियस) पर चूहों को पूर्व-घर करें।
    2. अनुकूलन अवधि के बाद, इंट्रापेरिटोनली 1 मिलीग्राम/किग्रा CL316,243 इंजेक्ट करें।
      नोट: β3-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट (उदाहरण के लिए 3 दिनों सेसप्ताह 1,44,45 तक) के साथ पुरानी उत्तेजना के लिए, दवा स्थिरता के कारण दैनिक इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। पतला CL316,243 स्थिरता के कारण इंजेक्शन के दिन तैयार किया जाना चाहिए।

2. धमनीशिरापरक रक्त का नमूना

नोट: 12-14 सप्ताह से अधिक चूहों धमनीशिरापरक रक्त नमूना के लिए सबसे अच्छा सिफारिश कर रहे हैं. छोटे चूहों में पर्याप्त आकार के सुल्ज़र की नसें नहीं हो सकती हैं, एक अलग रक्त वाहिका जो विशेष रूप से इंटरस्कैपुलर बैट46 से शिरापरक रक्त को निकालती है।

  1. धीरे प्रेरण के लिए 3% isoflurane के साथ calibrated vaporizer का उपयोग anesthetize (एक 205 x 265 x 200 मिमी आकार के कक्ष में) और रखरखाव के लिए 2% isoflurane (एक गैस संज्ञाहरण मुखौटा के साथ).
    नोट: संज्ञाहरण के बाद संपूर्ण धमनीशिरापरक रक्त नमूना प्रक्रिया तुरंत की जानी चाहिए। कोर बॉडी तापमान को बनाए रखने के लिए एनेस्थीसिया के दौरान वाटर-हीटेड वार्मिंग पैड का उपयोग किया जा सकता है।
    चेतावनी: साँस लेने पर Isoflurane अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त होता है। इसलिए, प्राथमिक संवेदनाहारी एक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए।
  2. इस तरह के anesthetization एक उचित गहराई तक पहुँच गया है कि पुष्टि करने के लिए पंजा पीछे हटना के रूप में जानवर की सजगता की सजगता.
  3. Sulzer की नस से शिरापरक रक्त इकट्ठा करना
    1. पृष्ठीय त्वचा का पर्दाफाश करने के लिए माउस स्थिति, सही चीरा बनाने से पहले एक पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि. बालों की टुकड़ी को रोकने के लिए पर्याप्त 70% इथेनॉल के साथ पृष्ठीय त्वचा को गीला करें, और छाती के निचले हिस्से से गर्दन तक सभी तरह से पीठ के साथ एक चीरा बनाएं।
      नोट: इंटरस्कैपुलर बैट त्वचा के ठीक नीचे स्थित होता है, जिसमें पतले सफेद वसा ऊतकों द्वारा कवर किए गए दो वसा पैड होते हैं। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि माउस गैस संज्ञाहरण मुखौटा के माध्यम से संज्ञाहरण के तहत रहता है.
    2. धीरे तुला टिप संदंश के साथ interscapular बैट लिफ्ट और ध्यान से संलग्न ऊतकों, जिनमें से अधिकांश मांसपेशियों में कटौती की. सिर की ओर वसा पैड उठा, संलग्न ऊतकों को काटने के लिए जारी रखें और ध्यान से Sulzer नस (एक बड़े 'Y' आकार के गहरे लाल पोत इंटरस्कैपुलर बैट के दोनों वसा पैड से जुड़ा हुआ है) उजागर किया है जब तक क्षेत्र खुलासा.
      नोट: सावधान रहें कि मांसपेशियों के ऊतकों के केशिका वाहिकाओं को न काटें जो इंटरस्कैपुलर बैट के सामने और साइड-क्षेत्र से जुड़े होते हैं, क्योंकि ऐसा करने से सुल्ज़र की नस से रक्त निकलने की मात्रा और गुणवत्ता में काफी कमी आएगी।
    3. ध्यान से Sulzer नस में कटौती, और नीचे कटौती 200 माइक्रोन विंदुक युक्तियाँ और एक P100 विंदुक का उपयोग रक्त के लगभग 40 माइक्रोन इकट्ठा. रक्त को रक्त संग्रह ट्यूब में स्टोर करें और सीरम संग्रह प्रक्रिया तक ट्यूब को बर्फ पर रखें।
      नोट: बेहतर वेना कावा47 से रक्त संदूषण को रोकने के लिए, सुल्ज़र की नस के वाई-आकार के विभाजन बिंदु के नीचे से रक्त एकत्र करना महत्वपूर्ण है। बहुत अधिक रक्त एकत्र करने से सुल्ज़र की नस की विशेषताएं कम हो जाएंगी। इस प्रकार, विश्लेषण के लिए सुल्ज़र की नस से आवश्यक रक्त की न्यूनतम मात्रा एकत्र करना सुनिश्चित करें। रक्त संग्रह ट्यूबों का चयन करते समय विचारशील रहें, क्योंकि सीरम और प्लाज्मा अलग-अलग मेटाबोलाइट प्रोफाइल 48,49,50 उत्पन्न करते हैं। प्लाज्मा संग्रह के लिए, हेपरिन-लेपित ट्यूबों का उपयोग करना आवश्यक है। इस प्रयोग में, सीरम प्राप्त करने के लिए थक्के उत्प्रेरक-लेपित ट्यूबों को चुना गया था। किसी भी परिस्थिति में EDTA लेपित ट्यूबों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि EDTA बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री संकेतोंको महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है 51,52.
  4. बाएं वेंट्रिकल से धमनी रक्त एकत्र करना
    1. नाक शंकु से संपर्क खोने के बिना माउस फ्लिप, उदर त्वचा का पर्दाफाश करने के लिए. चीरा लगाने से पहले एक पैर की अंगुली-चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। बालों की टुकड़ी को रोकने के लिए 70% इथेनॉल की पर्याप्त मात्रा के साथ उदर त्वचा को गीला करें, और ध्यान से किसी भी आंतरिक संरचना को नुकसान पहुंचाए बिना दिल को बेनकाब करने के लिए कैंची के साथ वक्ष गुहा खोलें।
    2. सटीक रूप से एक 29 जी (1/2 ") सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर छोड़ दिया वेंट्रिकल के शीर्ष क्षेत्र पंचर. दिल के शीर्ष (चित्रा 1 बी) के दाहिने क्षैतिज के लिए 3-5 मिमी के लिए एक 1/2 '' सुई के दो-तिहाई डालें, और बाएं वेंट्रिकल (50-100 माइक्रोन) से रक्त इकट्ठा करने के लिए सिरिंज वापस खींचें। बाएं वेंट्रिकल से रक्त ऑक्सीजन युक्त धमनी रक्त है जो चमकदार लाल है। रक्त को रक्त संग्रह ट्यूब में स्टोर करें, और सीरम संग्रह प्रक्रिया तक ट्यूब को बर्फ पर रखें।
      नोट: दिल तक पहुंच के लिए छाती गुहा में एक न्यूनतम चीरा बनाया जाना चाहिए। अत्यधिक चीरा स्थानीय रक्तस्राव का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बाद में निम्न रक्तचाप हो सकता है। यह बाएं वेंट्रिकल से एकत्र धमनी रक्त की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। दिल को घुमाने या फ़्लिप करने से बचें, क्योंकि इससे बाएं वेंट्रिकल की सटीक स्थिति निर्धारित करना मुश्किल हो जाएगा।
    3. इच्छामृत्यु करें और स्थानीय संस्थानों के दिशा-निर्देशों का पालन करते हुए उचित विधि से इसे सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, इच्छामृत्यु गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से किया जा सकता है और दिल की धड़कन की समाप्ति द्वारा पुष्टि की जा सकती है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र रक्त के नमूने। ध्यान से एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. सतह पर तैरनेवाला या तो सीरम या प्लाज्मा इस्तेमाल किया रक्त संग्रह ट्यूब के प्रकार पर निर्भर होना चाहिए. एक यहाँ बंद करो और -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर कर सकते हैं जब तक जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए सीरम प्रसंस्करण.
    नोट: हेमोलिसिस संभावित रूप से हो सकता है यदि लाल रंग का सतह पर तैरनेवाला मनाया जाता है। हेमोलिसिस से बचने के लिए, थक्के पूरा होने से पहले नमूना भंवर। ग्लूटामाइन और लैक्टेट सहित कुछ लाल रक्त कोशिका-समृद्ध चयापचयों से डेटा गलत व्याख्या हो सकती है, हालांकि अधिकांश मेटाबोलाइट्स हेमोलिसिस से काफी प्रभावित नहीं हो सकते हैं। एक सप्ताह के भीतर सीरम/प्लाज्मा का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।

3. सीरम और रासायनिक व्युत्पन्न से मेटाबोलाइट निष्कर्षण

  1. निष्कर्षण के लिए तैयारी
    नोट: मेटाबोलाइट निष्कर्षण, व्युत्पन्न, और डेटा विश्लेषण सहित सभी विधियां पहले वर्णित विधियों53,54 के थोड़ा संशोधित संस्करण हैं।
    1. एमएस-ग्रेड मेथनॉल में डीएल-नॉरवेलिन, आंतरिक मानक ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन समाधान जोड़कर निष्कर्षण बफर तैयार करें।
    2. सुनिश्चित करें कि सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं बर्फ पर आयोजित कर रहे हैं.
  2. Sulzer की नस या बाएं वेंट्रिकल से निकाले गए चूहों के सीरम के 10 माइक्रोन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें निष्कर्षण बफर के 40 माइक्रोन होते हैं।
  3. सेल मलबे और प्रोटीन को हटाने के लिए, संक्षेप में सीरम नमूनों भंवर, अधिकतम गति (18,000 x ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए.
  4. अपकेंद्रित्र के बाद, ध्यान से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सुखाने के 3 घंटे के बाद एक कांच की शीशी में सतह पर तैरनेवाला के 40 माइक्रोन हस्तांतरण.
    नोट: बाद के व्युत्पन्न चरण में उपयोग किए जाने वाले प्लास्टिक-प्रतिक्रियाशील रसायनों के कारण प्लास्टिक ट्यूबों के बजाय एक ग्लास डालने ( सामग्री की तालिकादेखें) की सिफारिश की जाती है।
  5. सीरम चयापचयों के जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए लगातार दो व्युत्पन्न चरणों के लिए सूखे नमूनों के अधीन.
    नोट: सॉल्वैंट्स के जलन जोखिम के कारण धूआं हुड के तहत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    1. पाइरीडिन में भंग 10 मिलीग्राम/एमएल मेथॉक्सीमाइन हाइड्रोक्लोराइड ( सामग्री की तालिकादेखें) के 30 माइक्रोन में सूखे सीरम अर्क को फिर से निलंबित करें और इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एन-मिथाइल-एन-टर्ट-ब्यूटाइल्डिमिथाइलसिलिसिलिरिफ्लोरोएसेटामाइड (एमटीबीएसटीएफए, सामग्री की तालिकादेखें) के 70 माइक्रोन के साथ चयापचयों के सिलीलेशन के लिए नमूनों को व्युत्पन्न करें।
      नोट: प्लास्टिक के साथ प्रतिक्रिया करने वाले व्युत्पन्न सॉल्वैंट्स के कारण निम्नलिखित चरणों में प्लास्टिक की नोक के बजाय एक ग्लास सिरिंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

4. जीसी-एमएस का उपयोग कर मेटाबोलामिक्स विश्लेषण

नोट: एकल चौगुनी जीसी-एमएस ( सामग्री की तालिकादेखें) कार्बोहाइड्रेट सहित विभिन्न सीरम चयापचयों को मापने के लिए नियोजित किया गया था, अमीनो एसिड, और टीसीए चक्र Sulzer नस और बाएं वेंट्रिकल से व्युत्पन्न नमूनों में मध्यवर्ती. अन्य कॉलम वैकल्पिक रूप से उपयोग किए जा सकते हैं, हालांकि तापमान कार्यक्रम सहित प्रयोगात्मक सेटिंग्स उपयोग किए गए कॉलम के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती हैं।

  1. 280 डिग्री सेल्सियस (इनलेट तापमान) पर स्प्लिटलेस मोड में जीसी में व्युत्पन्न नमूने के 1 माइक्रोन इंजेक्ट करें, हीलियम का उपयोग 1.500 एमएल / मिनट (सेट पॉइंट) की प्रवाह दर के साथ वाहक गैस के रूप में करें।
  2. 300 डिग्री सेल्सियस पर जीसी-एमएस इंटरफेस के साथ 200 डिग्री सेल्सियस पर चौगुनी सेट करें।
    नोट: सभी चयापचयों के विश्लेषण के लिए ओवन कार्यक्रम 60 डिग्री सेल्सियस से शुरू होता है, 1 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है, और फिर तापमान 320 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक 10 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से बढ़ाया जाता है।
  3. 70 eV पर सेट इलेक्ट्रॉन आयनीकरण (EI) द्वारा डेटा एकत्र करें और स्कैन मोड (50-550 m/z)53में नमूना डेटा प्राप्त करें। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी चयापचयों को पहले बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा और प्रतिधारण समय की पुष्टि करने के लिए मानकों के साथ मान्य किया गया था।
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पीक क्षेत्र एकीकरण करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. प्रत्येक TBMDS व्युत्पन्न के उत्पाद आयन के साथ यौगिकों का मिलान करें। फिर, संबंधित शिखर क्षेत्र में टुकड़े आयन के m/z मान को एकीकृत करके अर्क आयन क्रोमैटोग्राम (EIC) प्राप्त करें, और फिर इसे निर्यात करें। टुकड़ा आयनों तालिका 1 में दिखाया गया है.
    नोट: प्रत्येक यौगिक के ईआईसी को प्रत्येक नमूने में डीएल-नॉरवेलिन द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। डेटा को लॉग2 सुल्ज़र की नस द्वारा बाएं वेंट्रिकल (लॉग2 (एसवी/एलवी)) द्वारा प्रत्येक सामान्यीकृत ईआईसी मान का उपयोग करके दर्शाया जाता है।

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Representative Results

चित्रा 1 बैट अनुकूलित एवी मेटाबोलॉमिक्स की प्रयोगात्मक योजना दिखाता है। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, अलग-अलग उत्तेजित भूरे रंग के वसा ऊतकों को प्राप्त करने के लिए, चूहों कृंतक इनक्यूबेटरों का उपयोग करके तापमान अनुकूलन से गुजरते हैं या β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट जैसे औषधीय प्रशासन प्राप्त करते हैं। इसके बाद, चूहों को संवेदनाहारी किया जाता है, और चयापचय विश्लेषण(चित्रा 1ए)के लिए रक्त के नमूने एकत्र किए जाते हैं। रक्त के नमूने के लिए, विशेष रूप से इंटरस्कैपुलर बैट से निकलने वाले शिरापरक रक्त को सुल्ज़र की नस के माध्यम से एकत्र किया जाता है, जबकि धमनी रक्त सीधे हृदय के बाएं वेंट्रिकल(चित्रा 1बी)से एकत्र किया जाता है।

चित्रा 2 जीसी-एमएस (चित्रा 2) का उपयोग कर सीरम मेटाबोलामिक्स के स्कीमैटिक्स का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप में, सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सीरम नमूनों में मेथनॉल समाधान जोड़ा जाता है। चयापचयों युक्त सतह पर तैरनेवाला एक स्पीडवैक में सूख गया था और सूखे नमूनों methoxyamine (MOX) और MTBSTFA (एन tert-Butyldimethylsilyl-एन-methyltrifluoroacetamide) का उपयोग कर दो कदम व्युत्पन्न के अधीन थे. व्युत्पन्न कदम का उद्देश्य टीबीडीएमएस एस्टर के साथ चयापचयों के ध्रुवीय कार्यात्मक समूहों के प्रतिस्थापन के लिए है, जिससे टीबीडीएमएस डेरिवेटिव के रूप में चयापचयों का जीसी-एमएस पता लगाने की अनुमति मिलती है। व्युत्पन्न नमूनों का विश्लेषण एकल चौगुनी जीसी-एमएस का उपयोग करके किया गया था। मेटाबोलाइट्स को उनके भौतिक रासायनिक गुणों के अनुसार कॉलम में अलग किया जाता है। इलेक्ट्रॉन आयनीकरण (ईआई) को एक मास डिटेक्टर द्वारा पता लगाए गए अद्वितीय टुकड़े आयनों में चयापचयों को तोड़ने के लिए नियोजित किया जाता है। यौगिक पहचान यौगिक-विशिष्ट टुकड़े आयनों का पता लगाने के माध्यम से की जाती है। प्रयोग में यौगिक-विशिष्ट टुकड़ा आयनों के एम/जेड मूल्य और प्रतिधारण समय तालिका (तालिका 1) में दिखाए गए हैं। एक निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (ईआईसी) का उपयोग मेटाबोलाइट के चरम क्षेत्र में एक यौगिक-विशिष्ट टुकड़े आयन के संकेत को एकीकृत करने के लिए किया जाता है, जो चयापचयों की प्रचुरता को परिभाषित करता है।

बैट रिलीज या चयापचयों की एक श्रृंखला uptakes निर्धारित करने के लिए, Sulzer नस और बाएं वेंट्रिकल (लॉग2 (एसवी / एलवी)) के बीच आयन गिनती के लॉग2 अनुपात गणना की जा सकती है(चित्रा 3). यदि किसी विशेष मेटाबोलाइट के लिए लॉग2 (SV/LV) मान >0 है, तो यह इंगित करता है कि मेटाबोलाइट SV में LV की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में है, यह सुझाव देता है कि इंटरस्कैपुलर बैट नेट मेटाबोलाइट जारी करता है। इसके विपरीत, यदि एक निश्चित मेटाबोलाइट के लिए लॉग2 (SV/LV) मान <0 है, तो यह सुझाव देता है कि मेटाबोलाइट इंटरस्कैपुलर BAT द्वारा लिया जाता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि हल्के ठंड उत्तेजित बैट ग्लूकोज, लैक्टेट, 3-हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट (3-एचबी), बीसीएएएस, एस्पार्टेट, लाइसिन और ट्रिप्टोफैन का काफी उपभोग करता है, जबकि बैट काफी सक्सिनेट और पामिटेट (चित्रा 3ए)जारी करता है। इनमें से अधिकांश घटनाएं क्रोनिक कोल्ड बैट42 पर हमारे पिछले अध्ययनों में देखी गई थीं, यह सुझाव देते हुए कि हल्के ठंडे बैट चयापचय रूप से क्रोनिक कोल्ड बैट जैसा दिखता है, हालांकि कुछ हद तक। डेटा का एक त्वरित दृश्य अवलोकन प्रदान करने के लिए, लॉग2 (एसवी/एलवी) मान प्रदर्शित करने वाला एक हीट मैप दर्शाया गया है (चित्र 3बी)। सावधानी के साथ डेटा की व्याख्या करना आवश्यक है, क्योंकि हीटमैप समूह के भीतर जेड-स्कोर का प्रतिनिधित्व करता है।

Figure 1
चित्रा 1: बैट-अनुकूलित धमनीशिरापरक (एवी) मेटाबोलॉमिक्स की प्रायोगिक योजना। (ए) एवी मेटाबोलॉमिक्स के वर्कफ़्लो को दिखाने वाला आरेख। (1) चयापचय रूप से उत्तेजित भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) के विभिन्न संस्करणों को प्रेरित करने के लिए, चूहों को विभिन्न तापमानों के लिए अभ्यस्त किया जाता है या औषधीय दवा इंजेक्शन प्राप्त होते हैं। (2) इसके बाद, धमनी और शिरापरक रक्त के नमूने क्रमशः बाएं वेंट्रिकल और चूहों की सुल्ज़र नस से एकत्र किए जाते हैं। (3) प्राप्त सीरम नमूने मेटाबोलाइट निष्कर्षण के अधीन हैं, इसके बाद मेटाबोलिक विश्लेषण किया जाता है। (बी) रक्त नमूना प्रक्रियाओं के लिए मार्गदर्शन प्रदान करने वाली प्रतिनिधि छवियां। धमनी रक्त बाएं वेंट्रिकल से एकत्र किया जाता है, जबकि शिरापरक रक्त सुल्ज़र की नस से प्राप्त किया जाता है क्योंकि यह विशेष रूप से बैट से रक्त निकालता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जीसी/एमएस-आधारित लक्षित मेटाबोलॉमिक्स। "जीसी/एमएस-आधारित लक्षित मेटाबोलॉमिक्स की प्रायोगिक योजना"। टीबीडीएमएस: टर्ट-ब्यूटाइलडिमिथाइलसिलिल, ईआई: इलेक्ट्रॉन आयनीकरण, ईआईसी: आयन क्रोमैटोग्राम निकालें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि एवी मेटाबोलामिक्स डेटा। (ए) बीएटी द्वारा चयनित प्रचलित और अत्यधिक सक्रिय परिसंचारी ईंधन चयापचयों का तेज और बाद में रिहाई, उनके संबंधित समूहों के अनुसार वर्गीकृत। डेटा लॉग2 सुल्ज़र की नस को बाएं वेंट्रिकल (एसवी / एलवी) अनुपात दिखाता है। माध्य लॉग2 (SV/LV) <0 वाले मेटाबोलाइट्स को इंगित करने वाले बार्स को लाल रंग से रंगा जाता है, और लॉग2 (SV/LV) >0 को नीले रंग से रंगा जाता है। व्यक्तिगत डेटा बिंदु प्रत्येक माउस का प्रतिनिधित्व करते हैं; n = 11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 का ±मतलब है। बीसीएए; ब्रांकेड-चेन एमिनो एसिड; ईएए; आवश्यक अमीनो एसिड; एनईएए; गैर-आवश्यक अमीनो एसिड। (बी) एक गर्मी का नक्शा जो सुल्ज़र की नस (एसवी) और बाएं वेंट्रिकल (एलवी) रक्त के बीच चयापचयों के अंतर बहुतायत को दर्शाता है। प्रत्येक कॉलम समूह के भीतर औसत मूल्यों का जेड-स्कोर दिखाता है; n = 11. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यौगिक टुकड़ा आयनों का m/z अवधारण समय सूत्रधार TBDMS व्युत्पन्न सूत्र
पाइरूवेट 174.1 8.72 सी 3 एच 4 ओ 3 सी15एच33हे3एनएसआई2
एस्पार्टेट 418.2 18.45 C4H7NO4 सी22एच49नहीं4एसआई3
α-केटोग्लूटारेट 346.2 17.27 सी 5 एच 6 ओ 5 सी18एच37नहीं5एसआई2
C16:0(पामिटेट) 313.3 19.72 C16H32O2 सी22एच46हे2सी
स्तनपान कराना 261.2 11.66 सी 3 एच 6 ओ 3 सी15एच34हे3एसआई2
ल्यूसीन 200.2 14 C6H13NO2 सी18एच41नहीं2एसआई2
आइसोलेकिन 200.2 14.34 C6H13NO2 सी18एच41नहीं2एसआई2
वेलिन 186.2 13.53 C5H11NO2 सी17एच39नहीं2एसआई2
एलानिन 260.2 12.17 C3H7NO2 सी15एच35नहीं2एसआई2
सेरीन 390.2 17.04 C3H7NO3 सी21एच49नहीं3एसआई3
ग्लाइसिन 218.1 12.43 C2H5NO2 सी 14 एच 33 नहीं2 एसआई2
लाइसिन 300.2 20.48 C6H14N2O2 सी24एच56एन2ओ2एसआई3
सक्सिनेट 289.1 14.65 सी4एच6हे4 सी16एच34हे4एसआई2
प्रोलाइन 258.2 14.73 C5H9NO2 सी17एच37नहीं2एसआई2
फेनिलएलनिन 336.2 18 C9H11NO2 सी21एच39नहीं2एसआई2
मेथियोनीन 320.2 16.84 C5H11NO2S सी17एच39नहीं2एसएसआई2
सिस्टीन 406.2 19 C3H7NO2S सी21एच49NO2SSi3
शतावरी 417.2 19.86 C4H8N2O3 सी22एच50एन2ओ3एसआई3
3-हाइड्रोक्सीब्यूटाइरेट (3HB) 275.2 12.81 सी 4 एच 8 ओ 3 सी16एच36हे3एसआई2
ट्रिप्टोफैन 375.2 22.97 C11H12N2O2 सी23एच40एन2हे2एसआई2
मालेट 419.2 18.19 सी 4 एच 6 ओ 5 सी22एच48हे5एसआई3
ग्लूटामेट 432.3 19.59 C5H9NO4 सी23एच51नहीं4एसआई3
ग्लूटामाइन 431.3 20.85 C5H10N2O3 सी23एच52एन2हे3एसआई3
साइट्रेट 459.2 22.38 सी 6 एच 8 ओ 7 सी 30 एच 64 ओ 7 एसआई 4
ग्‍लूकोज़ 476.3 22.7 C6H12O6 सी 30 एच 68 ओ 6 एसआई 4

तालिका 1: एकीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले जीसी/एमएस यौगिक खंड आयन। इस तालिका में वर्तमान विधि में पहचाने गए 25 सीरम मेटाबोलाइट्स की एक सूची है, जिसमें प्रत्येक यौगिक के अनुरूप प्रतिधारण समय और टुकड़े आयन हैं।

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Discussion

पूरे शरीर के ऊर्जा संतुलन में बैट की चयापचय क्षमता को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम यह परिभाषित करना है कि यह किन पोषक तत्वों का उपभोग करता है, वे चयापचय रूप से कैसे संसाधित होते हैं, और कौन से चयापचयों को परिसंचरण में छोड़ा जाता है। यह प्रोटोकॉल एक विशेष धमनीशिरापरक नमूना तकनीक का परिचय देता है जो C57BL/6J चूहों में इंटरस्कैपुलर बैट और प्रणालीगत धमनी वास्कुलचर के शिरापरक वास्कुलचर तक पहुंच को सक्षम बनाता है, जिसे हाल ही में पार्क एट अल42 द्वारा विकसित और मान्य किया गया था। नीचे प्रमुख बिंदु दिए गए हैं जिन्हें आपको प्रोटोकॉल का पालन करते समय गंभीर रूप से विचार करना चाहिए।

thermogenic उत्तेजना के लिए, एक महत्वपूर्ण विचार अपने प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए thermogenic उत्तेजना का सबसे उपयुक्त प्रकार का चयन कर रहा है. उदाहरण के लिए, जब एक प्रयोगात्मक समूह (बनाम नियंत्रण) का उपयोग कर और चयापचय अनुकूलन क्षमता (इसकी अधिकतम गैर कंपकंपी thermogenic क्षमता के लिए महत्वपूर्ण) बैट, पुरानी ठंड acclimation, या β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर उत्तेजना (अधिक से अधिक समय तक चलने के लिए 4 सप्ताह) उपयुक्त 1,45 उपयुक्त है. जब बैट तीव्र ठंड जोखिम (24 घंटे से कम कुछ घंटे) के संपर्क में है, बजाय चयापचय अनुकूलन से, बैट अपने आंतरिक संग्रहीत ईंधन metabolizes और इष्टतम thermogenesis1 के लिए कंपकंपी मांसपेशियों के साथ चयापचय संचार. एक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट बैट थर्मोजेनेसिस 1,14 को ट्रिगर करने के लिए एक न्यूरोनल प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, और अन्य अंतःस्रावी कारक हैं जो थर्मोजेनिक प्रोग्राम55,56,57,58,59,60 को बढ़ाते हैं। जब भी ऊपर वर्णित thermogenic उत्तेजना प्रदर्शन, thermoneutrality (30 डिग्री सेल्सियस) पर एक आधारभूत नियंत्रण होने उत्तेजना उचित काम किया है कि क्या पुष्टि करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, उच्चतम गुणवत्ता के धमनीशिरापरक रक्त प्राप्त करना प्रयोग की सफल स्थापना का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसे प्राप्त करने के लिए, हेमोलिसिस को रोकने के लिए आवश्यक है (चरण 2.5 देखें) और सुल्ज़र की नस (सुल्ज़र की नस से 40 माइक्रोन से कम) से शिरापरक रक्त की विशिष्ट विशेषताओं के कमजोर पड़ने से बचने के लिए रक्त की एक सुसंगत मात्रा एकत्र करें। यह अंत करने के लिए, प्रारंभिक सेट-अप के दौरान, लेखक दृढ़ता से न केवल सुल्ज़र की नस से रक्त का उपयोग करके मेटाबोलाइट माप के लिए एक पायलट प्रयोग करने की सलाह देते हैं, बल्कि गैर-बैट से रक्त निकालने वाले शिरापरक रक्त (जैसे अवर वेना कावा) से भी रक्त करते हैं। इससे यह पुष्टि करने में मदद मिलेगी कि क्या सुल्ज़र की नस का सीरम गैर-बैट शिरापरक वाहिकाओं की तुलना में अलग-अलग मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग का खुलासा करता है। बाएं वेंट्रिकल से धमनी रक्त संग्रह के बारे में, कार्डियोकाइन के स्तर61,62 में भिन्नता को कम करने के लिए बाएं वेंट्रिकल पर एक ही क्षेत्र को लगातार पंचर करना महत्वपूर्ण है। इस तरह की विविधताएं धमनीशिरापरक-मेटाबोलामिक्स या -प्रोटिओमिक्स में भ्रामक परिणाम दे सकती हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर क्रोमैटोग्राफी मेटाबोलॉमिक्स के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक है, एक विधि जीसी-एमएस63 है। दरअसल, जीसी-एमएस का उपयोग करके जैविक रूप से प्रासंगिक चयापचयों के माप को कवरेज मुद्दे के कारण चुनौतीपूर्ण माना जाता था; जीसी-एमएस आवेदन आमतौर पर ऊतकों और जैविक तरल पदार्थों में कई ध्रुवीय चयापचयों के विपरीत अत्यधिक अस्थिर और गैर-ध्रुवीय गुणों वाले चयापचयों के विश्लेषण तक सीमित होता है। हालांकि, विभिन्न निष्कर्षण और व्युत्पन्न विधियों के विकास, उत्कृष्ट शिखर संकल्प, प्रजनन क्षमता, और व्यापक जन वर्णक्रमीय पुस्तकालयों सहित जीसी-एमएस के अपसाइड्स के साथ मिलकर आसान शिखर पहचान के लिए अनुमति देता है, जैविक रूप से प्रासंगिक चयापचयों64,65 का विश्लेषण करने के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में इस तरह के एक मंच का नेतृत्व किया है।

इस प्रोटोकॉल में, जीसी-एमएस प्लेटफॉर्म को उपरोक्त तकनीक का उपयोग करके एकत्र किए गए सीरम में 25 चयापचयों के विश्लेषण के लिए नियोजित किया जाता है। यह अंत करने के लिए, metabolite निष्कर्षण 80% मेथनॉल समाधान का उपयोग किया गया था. ध्यान दें, इस चरण के दौरान, एपेंडॉर्फ ट्यूबों सहित कुछ प्रकार के ट्यूबों का उपयोग करके नमूनों में कार्बनिक पदार्थ संदूषण के निम्नतम स्तर को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। निष्कर्षण के बाद छर्रों से सतह पर तैरनेवाला की सावधान जुदाई भी सीरम से प्रोटीन मलबे को हटाने के लिए आवश्यक है, जो एमएस-आयन स्रोत प्रदर्शन के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है.

व्युत्पन्न कदम को एरिल डेरिवेटिव, सिलीलेशन और एसाइलेशन66 सहित व्युत्पन्न के प्रकारों के आधार पर विविध किया जा सकता है। लेखकों ने मेटाबोलाइट सियालिलेशन के लिए एन-मिथाइल-एन-टर्ट-ब्यूटाइलडिमिथाइलसिलिलिरिफ्लोरोएसेटामाइड (एमटीबीएसटीएफए) के साथ दो-चरणीय व्युत्पन्न को नियोजित किया, जो शर्करा सहित जैविक रूप से प्रासंगिक ध्रुवीय चयापचयों के स्थिर पता लगाने के लाभ के साथ आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, लेकिन विश्लेषण चरण64 के दौरान एमाइन और अमीनो एसिड के एन-ट्राइमेथिलसिलिल समूह के सामयिक नुकसान के बारे में एक खामी के साथ. ध्यान दें, अभिकर्मकों और डेरिवेटिव की नमी संवेदनशीलता के कारण, व्युत्पन्न चरण से पहले नमूने पूरी तरह से सूख जाने चाहिए।

जीसी विश्लेषण की मुख्य सीमाओं में से एक, सामान्य रूप से, अभी भी उपरोक्त व्युत्पन्न चरणों के बावजूद पता लगाने योग्य चयापचयों की सीमा के लिए नीचे आता है जो ध्रुवीय मेटाबोलाइट पहचान के संबंध में जीसी-एमएस क्षमता में सुधार करते हैं, विशेष रूप से एलसी-एमएस-आधारित विश्लेषण की तुलना में। एलसी-एमएस का उपयोग मात्रात्मक मेटाबोलामिक्स प्रणालीगत मेटाबोलाइट एक्सचेंज 24,42के संबंध में बैट के चयापचय स्पेक्ट्रम में बेहतर अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में बहुत मदद कर सकता है।

हालांकि धमनी बनाम के बीच मेटाबोलाइट एकाग्रता ढाल के प्रोटोकॉल-माप में उपयोग की जाने वाली गणना। शिरापरक रक्त; लॉग2 (एसवी / एलवी) -बीएटी द्वारा आंशिक अवशोषण और रिलीज परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करता है, डेटा व्याख्या के लिए सावधानी की आवश्यकता है। विशेष रूप से, उन चयापचयों के लिए जिनके भिन्नात्मक शुद्ध विनिमय मूल्य '0' (जैसे साइट्रेट, αकेजी, मालेट, मेथियोनीन, एलेनिन, ग्लूटामाइन) है, परिणाम को या तो कोई तेज / रिलीज या समान रूप से सक्रिय अपचय और संश्लेषण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (जहां तेज और रिलीज दोनों उच्च हैं)। सत्यापित करने के लिए जो दो संभावनाओं में से सही है, अतिरिक्त चयापचय प्रवाह प्रयोगों लिया मेटाबोलाइट और / या इसके सब्सट्रेट के साथ विवो में आइसोटोप अनुरेखण का उपयोग39 आवश्यक हैं.

भिन्नात्मक गणना की सीमा यह है कि यह उन चयापचयों42,67 के लिए तेज और रिलीज के मात्रात्मक परिदृश्य प्रदान नहीं करता है. उदाहरण के लिए, हालांकि लॉग2 (एसवी / एलवी) मान ग्लूकोज और 3-हाइड्रॉक्सीब्यूटाइरेट (3 एचबी) के बीच एक तुलनीय सापेक्ष शुद्ध तेज इंगित करता है, कार्बन स्रोतों में ग्लूकोज का वास्तविक योगदान 3-एचबी से बहुत अधिक होना चाहिए क्योंकि ग्लूकोज की रक्त एकाग्रता 3 एचबी की तुलना में बहुत अधिक है, और क्योंकि ग्लूकोज में चार और कार्बन होते हैं (ग्लूकोज में छह कार्बन होते हैं; 3 एचबी में दो कार्बन होते हैं)। यदि आवश्यक हो, इस तरह के रक्त प्रवाह दर, प्रत्येक metabolite के वास्तविक रक्त सांद्रता, और उनके रासायनिक समीकरणों के रूप में अतिरिक्त मापदंडों, शामिल एक व्यापक विश्लेषण हमें चयापचयों के मात्रात्मक योगदान और कुल कार्बन या नाइट्रोजन प्रवाह42,67 में उनके योगदान के बारे में सूचित करना चाहिए.

माउस स्तर पर धमनीशिरापरक रक्त नमूनाकरण और चयापचय विश्लेषण के लिए इस लघु पद्धति का एक बड़ा लाभ भूरे रंग के वसा ऊतक चयापचय और शरीर विज्ञान (जैसे UCP1-KO, UCP1-Cre संचालित BAT-विशिष्ट हानि-समारोह मॉडल, ट्रांसजेनिक मॉडल) का अध्ययन करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक मॉडल के साथ इसका सहक्रियात्मक संयोजन है। हाल ही में मेटाबोलॉमिक विश्लेषण जिसके लिए केवल मेटाबोलोमिक प्रोफाइलिंग के लिए सीरम की मात्रा का पता लगाने की आवश्यकता होती है, इस दृष्टिकोण को छोटे जीवों के साथ अधिक व्यवहार्य बनाता है (प्रोटोकॉल 3 देखें)39। हालांकि, प्रोटिओमिक विश्लेषण, जो मेटाबोलॉमिक्स के साथ मिलकर विचार करने पर बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, के लिए बड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता हो सकती है। इस संबंध में, चूहों का उपयोग करके पारंपरिक धमनीशिरापरक नमूना अधिक उपयुक्त हो सकता है। हम पाठकों को चूहों में बैट के लिए धमनीशिरापरक रक्त नमूने के लिए सबसे हालिया प्रोटोकॉल का उल्लेख करते हैं, जो मेस्ट्रेस-एरेनास और सहयोगियों द्वारा लिखित47.

हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल पार्क एट अल.42 में वर्णित आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण प्रक्रिया को अपनाता है, यह दृष्टिकोण विवो 68,69,70,71 में भूरे रंग के एडिपोसाइट्स और/या भूरे रंग के वसा ऊतक के थर्मोजेनिक चयापचय को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। इसलिए, भविष्य के धमनीशिरापरक मेटाबोलामिक्स पेंटोबार्बिटल वारंट जांच का उपयोग करते हैं।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल विभिन्न thermogenic उत्तेजनाओं पर बैट विशिष्ट शुद्ध चयापचय गतिविधि (खपत बनाम उत्पादन) को मापने के लिए एक मूलभूत पद्धति प्रदान करता है. यह हमें एक प्रणालीगत पोषक तत्व सिंक के रूप में बैट की भूमिका में मूल्यवान अंतर्दृष्टि देना चाहिए और साथ ही प्रमुख चयापचय ईंधन के साथ-साथ स्रावित चयापचयों को मात्रात्मक रूप से सूचीबद्ध करके प्रदाता भी देना चाहिए। इसके अलावा, यह पहले से अप्रयुक्त मेटाबोलाइट-व्युत्पन्न ब्राउन एडिपोकिन्स की पहचान करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है, खासकर जब खोज-आधारित मेटाबोलिक प्लेटफार्मों के साथ संचालित किया जाता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पद्धतिगत चर्चा के लिए चोई और जंग प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम सलाह और प्रतिक्रिया के लिए सी जंग और डी गुएर्टिन को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के आलोचनात्मक पठन के लिए एमएस चोई को धन्यवाद देते हैं। इस काम को NRF-2022R1C1C1012034 द्वारा SMJ को वित्त पोषित किया गया था; NRF-2022R1C1C1007023 से DWC; एनआरएफ-2022आर1ए4ए3024551 से एसएमजे और डीडब्ल्यूसी यह काम W.T.K. चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender (http://biorender.com/) का उपयोग कर बनाया गया के लिए Chungnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

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References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

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