Summary
I denne protokol skitseres metoder, der er relevante for BAT-optimeret arteriovenøs metabolomics ved anvendelse af GC-MS i en musemodel. Disse metoder giver mulighed for erhvervelse af værdifuld indsigt i BAT-medieret metabolitudveksling på organismeniveau.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT) spiller en afgørende rolle i reguleringen af metabolisk homeostase gennem en unik energiforbrugsproces kendt som ikke-rystende termogenese. For at opnå dette bruger BAT en varieret menu af cirkulerende næringsstoffer til at understøtte dets høje metaboliske efterspørgsel. Derudover udskiller BAT metabolitafledte bioaktive faktorer, der kan tjene som enten metaboliske brændstoffer eller signalmolekyler, hvilket letter BAT-medieret intravævs- og/eller intervævskommunikation. Dette tyder på, at BAT aktivt deltager i systemisk metabolitudveksling, en interessant funktion, der begynder at blive udforsket. Her introducerer vi en protokol til in vivo museniveau optimeret BAT arteriovenøs metabolomics. Protokollen fokuserer på relevante metoder til termogeniske stimuleringer og en arteriovenøs blodprøvetagningsteknik ved hjælp af Sulzers vene, som selektivt dræner interscapulært BAT-afledt venøst blod og systemisk arterielt blod. Dernæst demonstreres en gaskromatografibaseret metabolomics-protokol, der anvender disse blodprøver. Anvendelsen af denne teknik bør udvide forståelsen af BAT-reguleret metabolitudveksling på organniveau ved at måle BAT's nettooptagelse og frigivelse af metabolitter.
Introduction
Brunt fedtvæv (BAT) besidder en unik energiforbrugsegenskab kendt som ikke-rystende termogenese (NST), som involverer både mitokondriel afkoblingsprotein 1 (UCP1)-afhængige og UCP1-uafhængige mekanismer 1,2,3,4,5. Disse karakteristiske egenskaber implicerer BAT i reguleringen af systemisk metabolisme og patogenesen af metaboliske sygdomme, herunder fedme, type 2-diabetes, hjerte-kar-sygdomme og kræftkakeksi 6,7,8. Nylige retrospektive undersøgelser har vist en omvendt sammenhæng mellem BAT-masse og / eller dens metaboliske aktivitet med fedme, hyperglykæmi og kardiometabolisk sundhed hos mennesker 9,10,11.
For nylig er BAT blevet foreslået som et metabolisk dræn, der er ansvarligt for at opretholde NST, da det kræver betydelige mængder cirkulerende næringsstoffer som termogenisk brændstof 6,7. Desuden kan BAT generere og frigive bioaktive faktorer, kaldet brune adipokiner eller BATokines, der fungerer som endokrine og/eller parakrin signaler, hvilket indikerer dets aktive involvering i metabolisk homeostase på systemniveau 12,13,14,15. Derfor bør forståelsen af BAT's næringsstofmetabolisme øge vores forståelse af dens patofysiologiske betydning hos mennesker ud over dens konventionelle rolle som et termoregulerende organ.
Metabolomiske undersøgelser, der anvender stabile isotopsporere, i kombination med klassiske undersøgelser af næringsstofoptagelse ved hjælp af ikke-metaboliserbare radiosporstoffer, har signifikant forbedret vores forståelse af, hvilke næringsstoffer der fortrinsvis optages af BAT, og hvordan de udnyttes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For eksempel har radioaktive sporstofundersøgelser vist, at koldaktiveret BAT optager glukose, lipoproteinbundne fedtsyrer og forgrenede aminosyrer 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Nylig isotopsporing kombineret med metabolomiske undersøgelser har gjort det muligt for os at måle den metaboliske skæbne og flux af disse næringsstoffer i væv og dyrkede celler 24,25,26,28,29,30. Disse analyser fokuserer dog primært på den individuelle udnyttelse af næringsstoffer, hvilket efterlader os med begrænset viden om BAT's systemniveau roller i organmetabolitudveksling. Spørgsmål vedrørende den specifikke serie af cirkulerende næringsstoffer, der forbruges af BAT, og deres kvantitative bidrag i form af kulstof og kvælstof er fortsat uklare. Derudover er udforskningen af, om BAT kan generere og frigive metabolitafledte BATokiner (f.eks. lipokiner) ved hjælp af næringsstoffer, lige begyndt 12,13,14,15,31,32.
Arteriovenøs blodanalyse er en klassisk fysiologisk tilgang, der bruges til at vurdere den specifikke optagelse eller frigivelse af cirkulerende molekyler i organer / væv. Denne teknik er tidligere blevet anvendt på interscapular BAT hos rotter til måling af ilt og flere metabolitter, hvorved BAT blev etableret som det vigtigste sted for adaptiv termogenese med dets kataboliske potentiale 33,34,35,36,37. For nylig blev en arteriovenøs undersøgelse med rotteinterscapular BAT kombineret med en trans-omics tilgang, hvilket førte til identifikation af uopdagede BATokiner frigivet af termogent stimuleret BAT38.
Nylige fremskridt inden for højfølsom gaskromatografi- og væskekromatografi-massespektrometri (GC-MS og LC-MS)-baserede metabolomics har genoplivet interessen for arteriovenøse undersøgelser til kvantitativ analyse af organspecifik metabolitudveksling 39,40,41. Disse teknikker, med deres høje opløsningsevne og massenøjagtighed, muliggør omfattende analyse af en bred vifte af metabolitter ved hjælp af små prøvemængder.
I overensstemmelse med disse fremskridt tilpassede en nylig undersøgelse med succes arteriovenøs metabolomics til undersøgelse af BAT på museniveau, hvilket muliggjorde kvantitativ analyse af metabolitudvekslingsaktiviteter i BAT under forskellige betingelser42. Denne artikel præsenterer en BAT-målrettet arteriovenøs metabolomics-protokol, der bruger GC-MS i en C57BL/6J-musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført med godkendelse af Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Mus blev anbragt i et IACUC-godkendt dyreanlæg beliggende i et renrum indstillet til 22 °C og 45% fugtighed efter en daglig 12 timers lys/mørk cyklus. De blev opbevaret i ventilerede stativer og havde adgang til en standard chow-diæt ad libitum (bestående af 60% kulhydrat, 16% protein og 3% fedt). Strøelse og redematerialer blev skiftet på ugentlig basis. Til denne undersøgelse blev der anvendt C57BL/6J-hanmus i alderen 12 uger og med en vægt på mellem 25 g og 30 g. Disse dyr blev indkøbt fra en kommerciel leverandør (se materialetabel).
1. Modulering af metabolisk aktivitet af det brune fedtvæv gennem temperaturakklimatisering og farmakologisk stimulering
BEMÆRK: Temperaturakklimatisering over flere dage til uger eller farmakologisk stimulering ved hjælp af β-adrenerge receptoragonister er almindeligt anvendte metoder til modulering af BAT-aktivitet1. Derfor gives der en kortfattet oversigt over metoden nedenfor, så læserne kan vælge den passende tilgang efter behov. For at opnå metabolisk inaktiv (mindre termogen) BAT vælges en baseline varm temperatur, kaldet termoneutralitet (28-30 °C), for C57BL/6J-mus. Dette sortiment sikrer, at musene ikke behøver at bruge ekstra energi for at opretholde en konstant kropstemperatur. For at opnå metabolisk beskeden eller højaktiv (termogen) BAT kan der vælges henholdsvis mild kulde (20-22 °C) eller svær kulde (6 °C). I forbindelse med dette forsøg blev mus opdrættet under standardopstaldningsforhold ved 22 °C, hvilket, selv om det var mildt koldt for mus, ikke involverede nogen farmakologisk stimulering.
- Temperaturakklimatisering
- Adskil musene for at huse 1 eller 2 mus pr. bur mindst 1 uge før aklimatisering af starttemperaturen. Forbered gnaverinkubatorer udstyret med luftventilation, temperatur og fugtighedsregulering med de ønskede forhold.
- Flyt burene til deres respektive gnaverinkubatorer på passende dage for den valgte type temperaturakklimatisering.
- Sørg for, at fordelingen af museantal er jævn på tværs af alle grupper med enten 1 eller 2 mus pr. bur. Enkelthus foretrækkes, da det er mere følsomt over for temperaturinducerede fysiologiske ændringer sammenlignet med gruppehus43. Her er de specifikke boligforhold for hver gruppe:
- Termoneutralitetsgruppe (30 °C): Hold musene i denne gruppe kontinuerligt ved en temperatur på 30 °C i op til fire uger.
- Alvorlig kuldegruppe: Opstald i første omgang musene i denne gruppe ved 18 °C uden redematerialer. De vil opleve et gradvist ugentligt temperaturfald og nå 6 °C i den fjerde uge. Temperaturprogressionen er som følger: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
- Let kuldegruppe (20-22 °C): Anbring musene i denne gruppe i gnaverkuvøser under samme betingelser som tidligere nævnte standardopstaldningsforhold.
- Akutte kuldeudfordringer: Ved akutte kuldeudfordringer anbringes 1-2 mus pr. bur uden redematerialer, og de udsættes for en gnaverinkubator indstillet til 6 °C i op til 8 timer.
BEMÆRK: Disse boligforhold og temperaturvariationer er afgørende for at studere virkningerne af forskellige temperaturmiljøer på BAT-aktivitet og metabolisme.
- Skift bur og genopfyld mad og vand hver uge. Forakklimatisere burene mindst 24 timer før tilskud ved deres respektive temperatur (gnaverinkubator).
BEMÆRK: For at forhindre forstyrrelse af den passende temperaturstimulus er det vigtigt ikke at tilvejebringe museberigelser, der kan føre til redebygning. Som reaktion på alvorlig kulde bruger mus mere energi på at opretholde kropstemperaturen, hvilket resulterer i øget fødeindtagelse og højere udskillelseshastigheder. Derfor er det afgørende at kontrollere burene mindst to til tre gange om ugen (efter lokale institutionelle retningslinjer) for at sikre, at musene har en tilstrækkelig forsyning af mad og vand, og at burene ikke er for våde. Denne overvågning er afgørende for at opretholde musenes trivsel og sundhed under undersøgelsen.
- Farmakologisk stimulering1 ved anvendelse af β3-adrenerge receptoragonist CL316,243
- For at maksimere den stimulerende effekt skal musene huses ved termoneutralitet (30 °C) i 2-4 uger før injektioner.
- Efter akklimatiseringsperioden injiceres intraperitonealt 1 mg/kg CL316,243.
BEMÆRK: Til kronisk stimulering med β3-adrenerge receptoragonist (f.eks. fra 3 dage op til uge 1,44,45) kræves daglige injektioner på grund af lægemiddelstabilitet. Fortyndet CL316.243 skal klargøres på injektionsdagen på grund af stabilitet.
2. Arteriovenøs blodprøvetagning
BEMÆRK: Mus over 12-14 uger anbefales bedst til arteriovenøs blodprøvetagning. Yngre mus har muligvis ikke tilstrækkelig størrelse Sulzers vener, et særskilt blodkar, der specifikt dræner venøst blod fra den interscapulære BAT46.
- Bedøv forsigtigt med den kalibrerede fordamper med 3% isofluran til induktion (i et kammer på 205 x 265 x 200 mm) og 2% isofluran til vedligeholdelse (med en gasbedøvelsesmaske).
BEMÆRK: Hele arterielt blodprøvetagningsprocedure skal udføres straks efter anæstesi. En vandopvarmet opvarmningspude kan bruges under anæstesi for at opretholde kropstemperaturen.
FORSIGTIG: Isofluran er meget flygtigt og giftigt ved indånding. Derfor skal primærbedøvelse udføres under en damphætte. - Kontroller dyrets reflekser, såsom pote tilbagetrækning for at bekræfte, at bedøvelsen har nået en passende dybde.
- Indsamling af venøst blod fra Sulzers vene
- Placer musen for at udsætte dorsalhuden, bekræft dybden af anæstesi via en tåklemme lige før snittet. Fugt den dorsale hud med rigelig 70% ethanol for at forhindre hårløsrivelse, og lav et snit langs ryggen fra den nederste del af brystkassen helt op til nakken.
BEMÆRK: Den interscapulære BAT er placeret lige under huden og består af to fedtpuder dækket af tyndt hvidt fedtvæv. Det er vigtigt at sikre, at musen forbliver under anæstesi gennem gasbedøvelsesmasken. - Løft forsigtigt den interscapulære BAT med bøjede spidstang og skær forsigtigt det vedhæftede væv, hvoraf de fleste er muskler. Løft fedtpuden op mod hovedet, fortsæt med at skære de vedhæftede væv og åbn forsigtigt regionen, indtil Sulzers vene (en stor 'Y'-formet mørkerød beholder forbundet med begge fedtpuder af interscapular BAT) er blottet.
BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at skære kapillærkarrene i muskelvæv, der er forbundet med for- og sideregionen af interscapular BAT, da dette vil reducere mængden og kvaliteten af blod, der drænes fra sulzerens vene, betydeligt. - Sulzerens vene skæres forsigtigt over, og der opsamles ca. 40 μL blod ved hjælp af bundskårne 200 μL pipettespidser og en P100-pipette. Opbevar blodet i et blodopsamlingsrør og hold røret på is indtil serumopsamlingsprocessen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at indsamle blod fra lige under det Y-formede delingspunkt i Sulzers vene for at forhindre blodforurening fra den overlegne vena cava47. Indsamling af for meget blod vil mindske egenskaberne ved Sulzers vene. Sørg derfor for at indsamle den mindste mængde blod, der er nødvendig fra Sulzers vene til analyse. Vær omhyggelig, når du vælger blodopsamlingsrør, da serum og plasma giver forskellige metabolitprofiler 48,49,50. Til plasmaopsamling er det nødvendigt at anvende heparinbelagte rør. I dette eksperiment blev koagulationsaktivatorbelagte rør valgt for at opnå serum. Der må under ingen omstændigheder anvendes EDTA-belagte rør, da EDTA påvirker massespektrometrisignalerne51,52 betydeligt.
- Placer musen for at udsætte dorsalhuden, bekræft dybden af anæstesi via en tåklemme lige før snittet. Fugt den dorsale hud med rigelig 70% ethanol for at forhindre hårløsrivelse, og lav et snit langs ryggen fra den nederste del af brystkassen helt op til nakken.
- Indsamling af arterielt blod fra venstre ventrikel
- Vend musen uden at miste kontakten til næsekeglen for at udsætte ventral hud. Bekræft dybden af anæstesi via en tåklemme, inden snittet foretages. Fugt den ventrale hud med rigelig mængde 70% ethanol for at forhindre hårløsrivelse, og åbn forsigtigt brysthulen med en saks for at udsætte hjertet uden at beskadige nogen indre struktur.
- Punktering nøjagtigt det øverste område af venstre ventrikel ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 29 G (1/2") nål. Indsæt to tredjedele af en 1/2'' nål til 3-5 mm til højre vandret for hjertets spids (figur 1B), og træk sprøjten tilbage for at opsamle blod fra venstre ventrikel (50-100 μL). Blod fra venstre ventrikel er iltet arterielt blod, som er lyse rødt. Opbevar blodet i et blodopsamlingsrør, og hold røret på is indtil serumopsamlingsprocessen.
BEMÆRK: Der skal foretages et minimalt snit i brysthulen for adgang til hjertet. Overdreven indsnit kan føre til lokal blødning, som efterfølgende kan resultere i lavt blodtryk. Dette kan påvirke kvaliteten af arterielt blod indsamlet fra venstre ventrikel. Undgå at rotere eller vende hjertet, da det vil gøre det vanskeligt at bestemme den præcise position af venstre ventrikel. - Udfør eutanasi og sørg for det med en passende metode efter retningslinjerne fra de lokale institutioner. For eksempel kan eutanasi udføres gennem cervikal dislokation og bekræftes ved ophør af hjerteslag.
- Blodprøver centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten opsamles forsigtigt med en pipette. Supernatanten skal indeholde enten serum eller plasma afhængigt af den anvendte type blodopsamlingsrør. Man kan stoppe her og opbevare prøverne ved -20 °C indtil serumbehandling til GC-MS-analyse.
BEMÆRK: Hæmolyse kan potentielt være forekommet, hvis der observeres rødfarvet supernatant. For at undgå hæmolyse er hvirvelprøven før koagulation afsluttet. Nogle røde blodlegemer-berigede metabolitter, herunder glutamin og lactat kan føre til data fejlfortolkning, selv om de fleste metabolitter ikke kan være signifikant påvirket af hæmolyse. Det anbefales at analysere serum/plasma inden for en uge.
3. Metabolitekstraktion fra serum og kemisk derivatisering
- Forberedelse til ekstraktionen
BEMÆRK: Alle metoder, herunder metabolitekstraktion, derivatisering og dataanalyse, er let modificerede versioner af tidligere beskrevne metoder53,54.- Ekstraktionsbufferen fremstilles ved at tilsætte 100 μM opløsning af DL-norvalin, intern standard (se materialetabel), til methanol af MS-kvalitet.
- Sørg for, at alle eksperimentelle procedurer udføres på is.
- Overfør 10 μL museserum ekstraheret fra enten Sulzers vene eller venstre ventrikel til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 40 μL ekstraktionsbuffer.
- For at fjerne cellerester og protein hvirvirvles serumprøverne kortvarigt efterfulgt af centrifugering ved maksimal hastighed (18.000 x g) i 30 minutter ved 4 °C.
- Efter centrifugering overføres forsigtigt 40 μl supernatant til et hætteglas af glas efterfulgt af 3 timers tørring i en vakuumcentrifuge ved 4 °C.
BEMÆRK: En glasindsats (se materialetabellen) anbefales i stedet for plastrør på grund af plastreaktive kemikalier, der anvendes i hele det efterfølgende derivatiseringstrin. - Udsæt de tørrede prøver for to på hinanden følgende derivatiseringstrin til GC-MS-analyse af serummetabolitterne.
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres under en stinkhætte på grund af irritationsrisici ved opløsningsmidlerne.- De tørrede serumekstrakter resuspenderes i 30 μl 10 mg/ml methoxyaminhydrochlorid (se materialetabellen) opløst i pyridin og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
- Prøver til silylering af metabolitter afledes med 70 μL N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA, se materialetabellen) ved 70 °C i 1 time.
BEMÆRK: Brug af en glassprøjte anbefales i stedet for en plastikspids i de følgende trin på grund af derivatiseringsopløsningsmidlerne, der reagerer med plast.
4. Metabolomics analyse ved hjælp af GC-MS
BEMÆRK: Enkelt firedobbelt GC-MS (se materialetabel) blev anvendt til at måle de forskellige serummetabolitter, herunder kulhydrater, aminosyrer og TCA-cyklusmellemprodukter i derivatiserede prøver fra Sulzers vene og venstre ventrikel. Andre kolonner kan alternativt bruges, selvom de eksperimentelle indstillinger, herunder temperaturprogrammet, kan variere afhængigt af de anvendte kolonnetyper.
- 1 μL af den derivatiserede prøve injiceres i GC i splitløs tilstand ved 280 °C (indgangstemperatur) ved hjælp af helium som bæregas med en strømningshastighed på 1,500 ml/min (sætpunkt).
- Quadrupolen indstilles til 200 °C med GC-MS-interface ved 300 °C.
BEMÆRK: Ovnprogrammet for alle metabolitanalyser starter ved 60 °C, holdes i 1 min og øges derefter med en hastighed på 10 °C/min, indtil temperaturen når 320 °C. - Data indsamles ved elektronionisering (EI) indstillet til 70 eV, og prøvedataene indsamles i scanningstilstand (50-550 m/z)53. Alle metabolitter, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev tidligere valideret med standarder for at bekræfte massespektre og retentionstider.
- Udfør integration af spidsområder ved hjælp af en kommercielt tilgængelig analysesoftware (se materialetabel).
- Match forbindelserne med produktionen af hvert TBMDS-derivat. Derefter opnås ekstraktionkromatogrammet (EIC) ved at integrere m / z-værdien af fragmentionen i det tilsvarende topareal, og eksporter det derefter. Fragmentioner er vist i tabel 1.
BEMÆRK: EIC for hver forbindelse blev normaliseret med DL-norvalin i hver prøve. Dataene repræsenteres af Log2 Sulzers vene til venstre ventrikel (Log2 (SV / LV)) ved hjælp af hver normaliseret EIC-værdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer det eksperimentelle skema for BAT-optimeret AV-metabolomics. Som nævnt i protokolafsnittet gennemgår mus temperaturakklimatisering ved hjælp af gnaverinkubatorer eller modtager farmakologisk administration såsom β-adrenerge receptoragonister for at opnå differentielt stimuleret brunt fedtvæv. Derefter bedøves mus, og blodprøver indsamles til metabolomisk analyse (figur 1A). Til blodprøvetagning opsamles venøst blod, der specifikt drænes fra interscapular BAT, via Sulzers vene, mens arterielt blod opsamles direkte fra hjertets venstre ventrikel (figur 1B).
Figur 2 viser skemaerne over serummetabolomics ved anvendelse af GC-MS (figur 2). Kort fortalt tilsættes methanolopløsningen til serumprøver efterfulgt af centrifugering for at fjerne serumproteiner. Supernatanten indeholdende metabolitterne blev tørret i en SpeedVac, og de tørrede prøver blev underkastet totrinsderivatisering med methoxyamin (MOX) og MTBSTFA (N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid). Derivatiseringstrinnet sigter mod substitution af polære funktionelle grupper af metabolitterne med TBDMS-ester, hvilket muliggør GC-MS-påvisning af metabolitter som TBDMS-derivater. De derivatiserede prøver blev analyseret ved hjælp af enkelt firdobbelt GC-MS. Metabolitter adskilles i kolonnen i henhold til deres fysiokemiske egenskaber. Elektronionisering (EI) anvendes til at nedbryde metabolitterne i unikke fragmentioner detekteret af en massedetektor. Forbindelsesidentifikation udføres ved påvisning af forbindelsesspecifikke fragmentioner. M/z-værdien og retentionstiden for de stofspecifikke fragmentioner i eksperimentet er vist i tabellen (tabel 1). Et ekstraheret ionkromatogram (EIC) bruges til at integrere signalet fra en forbindelsesspecifik fragmention i metabolittens topområde, hvilket definerer forekomsten af metabolitter.
For at bestemme, om BAT frigiver eller optager en række metabolitter, kan Log2-forholdet mellem iontal mellem Sulzers vene og venstre ventrikel (log2(SV/LV)) beregnes (figur 3). Hvis Log2(SV/LV)-værdien for en bestemt metabolit er >0, indikerer det, at metabolitten er mere rigelig i SV end LV, hvilket tyder på, at interscapulært BAT-net frigiver metabolitten. Omvendt, hvis Log2 (SV / LV) -værdien for en bestemt metabolit er <0, antyder det, at metabolitten optages af den interscapulære BAT.
Ved hjælp af denne tilgang blev det konstateret, at mild koldstimuleret BAT signifikant forbruger glucose, lactat, 3-hydroxybutyrat (3-HB), BCAA'er, aspartat, lysin og tryptophan, mens BAT signifikant frigiver succinat og palmitat (figur 3A). De fleste af disse fænomener blev observeret i vores tidligere undersøgelser af kronisk forkølelse BAT42, hvilket tyder på, at mild kold BAT metabolisk ligner kronisk kold BAT, omend i mindre grad. For at give et hurtigt visuelt overblik over dataene er der afbildet et varmekort, der viser Log2 (SV / LV) værdier (figur 3B). Det er vigtigt at fortolke dataene med forsigtighed, da varmekortet repræsenterer Z-score inden for gruppen.
Figur 1: Eksperimentelt skema for BAT-optimeret arteriovenøs (AV) metabolomics. (A) Diagram, der viser arbejdsgangen for AV-metabolomics. (1) For at inducere forskellige versioner af metabolisk stimuleret brunt fedtvæv (BAT) akklimatiseres mus til forskellige temperaturer eller modtager farmakologiske lægemiddelinjektioner. (2) Derefter indsamles arteriel og venøs blodprøve fra henholdsvis venstre ventrikel og sulzerens vene hos musene. (3) De fremstillede serumprøver underkastes metabolitekstraktion efterfulgt af metabolomisk analyse. B) Repræsentative billeder, der giver vejledning i blodprøvetagningsprocedurer. Arterielt blod opsamles fra venstre ventrikel, mens venøst blod opnås fra Sulzers vene, da det specifikt dræner blod fra BAT. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: GC/MS-baseret målrettet metabolomics. Eksperimentel ordning af GC / MS-baseret målrettet metabolomics. TBDMS: tert-butyldimethylsilyl, EI: Elektronionisering, EIC: Ekstraktionskromatogram. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative AV-metabolomics-data. A) BAT optager og efterfølgende frigiver udvalgte udbredte og højaktive cirkulerende brændstofmetabolitter, klassificeret efter deres respektive grupper. Dataene viser Log2 Sulzers vene til venstre ventrikel (SV / LV) forhold. Søjler, der angiver metabolitter med gennemsnitlig Log2 (SV/LV) <0, er farvet røde, og Log2 (SV/LV) >0 er farvet blå. Individuelle datapunkter repræsenterer hver mus; n = 11. Data er gennemsnitlige ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; forgrenet aminosyre; LR; essentiel aminosyre; NEAA; ikke-essentiel aminosyre. (B) Et varmekort, der illustrerer den differentierede forekomst af metabolitter mellem Sulzers vene (SV) og blod i venstre ventrikel (LV). Hver kolonne viser en Z-score af gennemsnitsværdier inden for gruppen; n = 11. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | m/z af fragmentioner | Opbevaringstid | Formular | TBDMS afledt formular |
| Pyruvat | 174.1 | 8.72 | C3H4O3 | C15H33O3NSi2 |
| Aspartat | 418.2 | 18.45 | C4H7NO4 | C22H49NO4Si3 |
| α-ketoglutarat | 346.2 | 17.27 | C5H6O5 | C18H37NO5Si2 |
| C16:0(Palmitat) | 313.3 | 19.72 | C16H32O2 | C22H46O2Si |
| Laktat | 261.2 | 11.66 | C3H6O3 | C15H34O3Si2 |
| Leucin | 200.2 | 14 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Isoleucin | 200.2 | 14.34 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Valin | 186.2 | 13.53 | C5H11NO2 | C17H39NO2Si2 |
| Alanin | 260.2 | 12.17 | C3H7NO2 | C15H35NO2Si2 |
| Serin | 390.2 | 17.04 | C3H7NO3 | C21H49NO3Si3 |
| Glycin | 218.1 | 12.43 | C2H5NO2 | C14H33NO2Si2 |
| Lysin | 300.2 | 20.48 | C6H14N2O2 | C24H56N2O2Si3 |
| Succinat | 289.1 | 14.65 | C4H6O4 | C16H34O4Si2 |
| Prolin | 258.2 | 14.73 | C5H9NO2 | C17H37NO2Si2 |
| Fenylalanin | 336.2 | 18 | C9H11NO2 | C21H39NO2Si2 |
| Methionin | 320.2 | 16.84 | C5H11NO2S | C17H39NO2SSi2 |
| Cystein | 406.2 | 19 | C3H7NO2S | C21H49NO2SSi3 |
| Asparagin: | 417.2 | 19.86 | C4H8N2O3 | C22H50N2O3Si3 |
| 3-hydroxybutyrat (3HB) | 275.2 | 12.81 | C4H8O3 | C16H36O3Si2 |
| Tryptophan | 375.2 | 22.97 | C11H12N2O2 | C23H40N2O2Si2 |
| Malate | 419.2 | 18.19 | C4H6O5 | C22H48O5Si3 |
| Glutamat | 432.3 | 19.59 | C5H9NO4 | C23H51NO4Si3 |
| Glutamin | 431.3 | 20.85 | C5H10N2O3 | C23H52N2O3Si3 |
| Citrat | 459.2 | 22.38 | C6H8O7 | C30H64O7Si4 |
| Glukose | 476.3 | 22.7 | C6H12O6 | C30H68O6Si4 |
Tabel 1: GC/MS-sammensatte fragmentioner anvendt til integration. Denne tabel indeholder en liste over 25 serummetabolitter, der er identificeret i denne metode, med retentionstid og fragmentioner svarende til hver forbindelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skridt i forståelsen af BAT's metaboliske potentiale i hele kroppens energibalance er at definere, hvilke næringsstoffer det indtager, hvordan de metabolisk behandles, og hvilke metabolitter der frigives i kredsløbet. Denne protokol introducerer en specialiseret arteriovenøs prøveudtagningsteknik, der giver adgang til venøs vaskulatur af interscapular BAT og systemisk arteriel vaskulatur i C57BL/6J-mus, som for nylig blev udviklet og valideret af Park et al42. Nedenfor er nøglepunkter, du kritisk bør overveje, når du følger protokollen.
For termogeniske stimulering, en vigtig overvejelse er at vælge den mest passende type termogeniske stimulering til din eksperimentelle indstilling. For eksempel, når man bruger en eksperimentel gruppe (vs. kontrol) og sigter mod at observere forskelle i den metaboliske tilpasningskapacitet (afgørende for dets maksimale ikke-rystende termogene potentiale) af BAT, kronisk kuldeakklimatisering eller β-adrenerg receptorstimulering (varer mere end 3 dage til 4 uger) er egnet 1,45. Når BAT udsættes for akut kuldeeksponering (et par timer mindre end 24 timer), snarere end metabolisk tilpasning, metaboliserer BAT sine iboende lagrede brændstoffer og kommunikerer metabolisk med rystende muskler for optimal termogenese1. En β-adrenerg receptoragonist repræsenterer et neuronalt respons for at udløse BAT-termogenese 1,14, og der er andre endokrine faktorer, der forbedrer det termogene program 55,56,57,58,59,60. Når der udføres termogen stimulering som nævnt ovenfor, bør det være nyttigt at have en baseline-kontrol ved termoneutralitet (30 °C) for at bekræfte, om stimuleringen fungerede korrekt.
Som nævnt i protokolafsnittet er opnåelse af arteriovenøst blod af højeste kvalitet nøglen til at bestemme en vellykket etablering af eksperimentet. For at opnå dette er det vigtigt at forhindre hæmolyse (se trin 2.5) og indsamle en ensartet mængde blod for at undgå fortynding af de forskellige egenskaber ved venøst blod fra Sulzers vene (mindre end 40 μL fra Sulzers vene). Til dette formål anbefaler forfatterne under den indledende opsætning kraftigt at udføre et pilotforsøg til metabolitmåling ved hjælp af ikke kun blod fra Sulzers vene, men også blod fra ikke-BAT-drænende venøst blod (f.eks. ringere vena cava). Dette vil hjælpe med at bekræfte, om serumet i Sulzers vene afslører tydelig metabolitprofilering sammenlignet med de ikke-BAT venøse kar. Med hensyn til arteriel blodindsamling fra venstre ventrikel er det vigtigt konsekvent at punktere det samme område på venstre ventrikel for at minimere variationer i kardiokinniveauer61,62. Sådanne variationer kan give forvirrende resultater i arteriovenøs metabolomics eller -proteomics.
Kromatografi kombineret med massespektrometri er et af de mest kraftfulde værktøjer til metabolomics, en metode er GC-MS63. Faktisk blev måling af biologisk relevante metabolitter ved hjælp af GC-MS betragtet som udfordrende på grund af dækningsproblemet; GC-MS-anvendelse er normalt begrænset til analyse af metabolitter med meget flygtige og ikke-polære egenskaber i modsætning til de mange polære metabolitter i væv og biologiske væsker. Udviklingen af forskellige ekstraktions- og derivatiseringsmetoder sammen med fordelene ved GC-MS, herunder fremragende topopløsning, reproducerbarhed og omfattende massespektrale biblioteker, der muliggør praktisk topidentifikation, har imidlertid ført til en sådan platform som en attraktiv mulighed for at analysere biologisk relevante metabolitter64,65.
I denne protokol anvendes GC-MS-platformen til analyse af 25 metabolitter i serum indsamlet ved hjælp af ovennævnte teknik. Til dette formål blev metabolitekstraktion udført under anvendelse af 80% methanolopløsning. Bemærk, at i løbet af dette trin anbefales det at bruge visse typer rør, herunder Eppendorf-rør, for at opnå de laveste niveauer af organisk stofforurening i prøverne. Omhyggelig adskillelse af supernatant fra pellets efter ekstraktion er også nødvendig for at fjerne proteinrester fra serumet, hvilket er afgørende for opretholdelsen af MS-ion-kildens ydeevne.
Derivatiseringstrinnet kan diversificeres baseret på typerne af derivatiseringer, herunder arylderivater, silylering og acylering66. Forfatterne anvendte totrinsderivatisering med N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA) til metabolitsialylering, som er en almindeligt anvendt metode med fordelen ved stabil påvisning af biologisk relevante polære metabolitter, herunder sukkerarter, men med en ulempe med hensyn til lejlighedsvis tab af N-trimethylsilylgruppen af aminer og aminosyrer under analysetrin64. Bemærk, at prøver skal tørres fuldstændigt inden derivatiseringstrinnet på grund af reagensernes og derivaternes fugtfølsomhed.
En af de største begrænsninger ved GC-analysen kommer generelt stadig ned på rækkevidden af detekterbare metabolitter på trods af de førnævnte derivatiseringstrin, der forbedrer GC-MS-kapaciteten med hensyn til polar metabolitdetektion, især sammenlignet med LC-MS-baseret analyse. Kvantitativ metabolomics ved hjælp af LC-MS kan i høj grad hjælpe med at få bedre indsigt i det metaboliske spektrum af BAT'er med hensyn til systemisk metabolitudveksling24,42.
Selvom beregningen anvendt i protokolmålingen af metabolitkoncentrationsgradienten mellem arteriel vs. venøst blod; Log2(SV/LV)-kvantificerer fraktioneret absorption og frigivelsesændring ved hjælp af BAT, forsigtighed er nødvendig for datafortolkning. Navnlig for de metabolitter, hvis fraktionelle nettobytteværdi er »0« (f.eks. citrat, αKG, malat, methionin, alanin og glutamin), kan resultatet tilskrives enten ingen optagelse/frigivelse eller lige så aktiv katabolisme og syntese (hvor både optagelse og frigivelse er høj). For at kontrollere, hvilken af de to muligheder der er korrekt, er det nødvendigt med yderligere metaboliske fluxforsøg med isotopsporing in vivo med den optagne metabolit og/eller dens substrat39.
Begrænsningen ved brøkberegningen er, at den ikke giver det kvantitative landskab for optagelse og frigivelse for disse metabolitter42,67. For eksempel, selvom Log2 (SV / LV) -værdien indikerer en sammenlignelig relativ nettooptagelse mellem glucose og 3-hydroxybutyrat (3HB), bør glukoses faktiske bidrag til kulstofkilderne være meget højere end 3-HB på grund af det faktum, at blodkoncentrationen af glucose er meget højere end 3HB, og fordi glucose indeholder fire flere carbonatomer (glucose har seks carbonatomer; 3HB har to carbonatomer). Om nødvendigt bør en omfattende analyse, der omfatter yderligere parametre, såsom blodgennemstrømningshastighed, faktiske blodkoncentrationer af hver metabolit og deres kemiske ligninger, informere os om de kvantitative bidrag fra metabolitterne, der optages/frigives, og deres bidrag i total kulstof- eller nitrogenflux42,67.
En stor fordel ved denne miniaturiserede metode til arteriovenøs blodprøvetagning og metabolomisk analyse på museniveau er dens synergistiske kombination med forskellige genetiske modeller til undersøgelse af brunt fedtvævsmetabolisme og fysiologi (f.eks. UCP1-KO, UCP1-Cre-drevne BAT-specifikke tab-af-funktionsmodeller, transgene modeller). Nylig metabolomisk analyse, som kun kræver spormængder af serum til metabolomisk profilering, gør denne fremgangsmåde mere gennemførlig med mindre organismer (se protokol 3)39. Imidlertid kan proteomisk analyse, som kan give bedre indsigt, når den betragtes sammen med metabolomics, kræve større mængder prøver. I denne henseende kan konventionel arteriovenøs prøveudtagning med rotter være mere egnet. Vi henviser læserne til den seneste protokol for arteriovenøs blodprøvetagning for BAT hos rotter, skrevet af Mestres-Arenas og kolleger47.
Selv om den nuværende protokol anvender anæstesiproceduren ved hjælp af isofluran som beskrevet i Park et al.42, kan denne fremgangsmåde have en negativ indvirkning på den termogene metabolisme af brune adipocytter og/eller brunt fedtvæv in vivo 68,69,70,71. Derfor berettiger fremtidig arteriovenøs metabolomics ved hjælp af pentobarbital undersøgelse.
Sammenfattende giver denne protokol en grundlæggende metode til måling af BAT-specifik netto metabolisk aktivitet (forbrug vs. produktion) ved forskellige termogene stimuleringer. Dette bør give os værdifuld indsigt i BAT's rolle som et systemisk næringsstofdræn såvel som leverandør ved kvantitativt at opføre vigtige metaboliske brændstoffer såvel som udskillede metabolitter. Desuden kan dette også være nyttigt til at identificere tidligere uundersøgte metabolitafledte brune adipokiner, især når de drives med opdagelsesbaserede metabolomiske platforme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af Choi og Jung laboratorierne for metodologisk diskussion. Vi takker C. Jang og D. Guertin for råd og feedback. Vi takker M.S. Choi for den kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af NRF-2022R1C1C1012034 til S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 til D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 til S.M.J. og D.W.C. Dette arbejde blev støttet af Chungnam National University for W.T.K. Figur 1 og figur 2 blev oprettet ved hjælp af BioRender (http://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
| 1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
| Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
| Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
- Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
- Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
- Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
- Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z.
- Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
- Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
- Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
- Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
- Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
- Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
- Hui, S., et al.
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
- Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
- Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
- Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
- Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
- Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
- Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
- Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
- Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
- Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
- Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
- Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
- Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
- Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
- Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
- Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
- Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
- Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
- Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
- Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
- Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
- Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
- Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
- Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
- Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
- Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
- Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
- Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
- Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
- Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D.
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
- Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
- Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
- Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
- Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
- Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
- Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
- Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).
