Summary
I denne protokollen er metoder som er relevante for BAT-optimaliserte arteriovenøse metabolomics ved bruk av GC-MS i en musemodell skissert. Disse metodene gjør det mulig å tilegne seg verdifull innsikt i BAT-mediert metabolittutveksling på organismenivå.
Abstract
Brunt fettvev (BAT) spiller en avgjørende rolle i å regulere metabolsk homeostase gjennom en unik energiforbruksprosess kjent som ikke-rystende termogenese. For å oppnå dette bruker BAT en variert meny av sirkulerende næringsstoffer for å støtte sin høye metabolske etterspørsel. I tillegg utskiller BAT metabolittavledede bioaktive faktorer som kan tjene som enten metabolske drivstoff eller signalmolekyler, noe som letter BAT-mediert intravev og / eller intervevskommunikasjon. Dette antyder at BAT aktivt deltar i systemisk metabolittutveksling, en interessant funksjon som begynner å bli utforsket. Her introduserer vi en protokoll for in vivo musenivå optimalisert BAT arteriovenøs metabolomikk. Protokollen fokuserer på relevante metoder for termogene stimuleringer og en arteriovenøs blodprøvetakingsteknikk ved bruk av Sulzers vene, som selektivt drenerer interskapulært BAT-avledet venøst blod og systemisk arterielt blod. Deretter demonstreres en gasskromatografibasert metabolomikkprotokoll ved bruk av disse blodprøvene. Bruken av denne teknikken bør utvide forståelsen av BAT-regulert metabolittutveksling på interorgannivå ved å måle netto opptak og frigjøring av metabolitter ved BAT.
Introduction
Brunt fettvev (BAT) har en unik energiforbruksegenskap kjent som ikke-rystende termogenese (NST), som involverer både mitokondrielt frakoblingsprotein 1 (UCP1) -avhengige og UCP1-uavhengige mekanismer 1,2,3,4,5. Disse karakteristiske egenskapene impliserer BAT i reguleringen av systemisk metabolisme og patogenesen av metabolske sykdommer, inkludert fedme, type 2 diabetes, kardiovaskulær sykdom og kreftkakeksi 6,7,8. Nylige retrospektive studier har vist en omvendt sammenheng mellom BAT-masse og/eller dens metabolske aktivitet med fedme, hyperglykemi og kardiometabolsk helse hos mennesker 9,10,11.
Nylig har BAT blitt foreslått som en metabolsk vask som er ansvarlig for å opprettholde NST, da det krever betydelige mengder sirkulerende næringsstoffer som termogent drivstoff 6,7. Videre kan BAT generere og frigjøre bioaktive faktorer, referert til som brune adipokiner eller BATokiner, som fungerer som endokrine og / eller parakrine signaler, noe som indikerer dets aktive involvering i systemnivå metabolsk homeostase 12,13,14,15. Derfor bør forståelse av BATs næringsmetabolisme forbedre vår forståelse av dens patofysiologiske betydning hos mennesker, utover dens konvensjonelle rolle som et termoregulerende organ.
Metabolomiske studier ved bruk av stabile isotopsporstoffer, i kombinasjon med klassiske studier av næringsopptak ved bruk av ikke-metaboliserbare radiotracere, har betydelig forbedret vår forståelse av hvilke næringsstoffer som fortrinnsvis tas opp av BAT og hvordan de utnyttes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. For eksempel har radioaktive tracerstudier vist at kaldaktivert BAT tar opp glukose, lipoproteinbundne fettsyrer og forgrenede aminosyrer 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Nyere isotopsporing kombinert med metabolomiske studier har gitt oss mulighet til å måle metabolsk skjebne og fluks av disse næringsstoffene i vev og dyrkede celler 24,25,26,28,29,30. Imidlertid fokuserer disse analysene primært på individuell utnyttelse av næringsstoffer, noe som gir oss begrenset kunnskap om BATs systemnivå roller i organmetabolittutveksling. Spørsmål angående den spesifikke serien av sirkulerende næringsstoffer som forbrukes av BAT og deres kvantitative bidrag når det gjelder karbon og nitrogen, er fortsatt unnvikende. I tillegg er utforskningen av om BAT kan generere og frigjøre metabolittavledede BATokiner (f.eks. lipokiner) ved hjelp av næringsstoffer, bare begynnelsen 12,13,14,15,31,32.
Arteriovenøs blodanalyse er en klassisk fysiologisk tilnærming som brukes til å vurdere spesifikt opptak eller frigjøring av sirkulerende molekyler i organer/vev. Denne teknikken har tidligere blitt brukt på interscapular BAT av rotter for å måle oksygen og flere metabolitter, og dermed etablere BAT som det viktigste stedet for adaptiv termogenese med sitt katabolske potensial 33,34,35,36,37. Nylig ble en arteriovenøs studie ved bruk av rotte interskapulær BAT kombinert med en trans-omics tilnærming, noe som førte til identifisering av uoppdagede BATokiner frigjort av termogent stimulert BAT38.
Nylige fremskritt innen høysensitiv gasskromatografi- og væskekromatografi-massespektrometri (GC-MS og LC-MS)-basert metabolomikk har gjenopplivet interessen for arteriovenøse studier for kvantitativ analyse av organspesifikk metabolittutveksling 39,40,41. Disse teknikkene, med sin høye oppløsningsevne og massenøyaktighet, muliggjør omfattende analyse av et bredt spekter av metabolitter ved hjelp av små prøvemengder.
I samsvar med disse fremskrittene tilpasset en nylig studie vellykket arteriovenøs metabolomikk for å studere BAT på musenivå, noe som muliggjorde kvantitativ analyse av metabolittutvekslingsaktiviteter i BAT under forskjellige forhold42. Denne artikkelen presenterer en BAT-målrettet arteriovenøs metabolomikkprotokoll ved bruk av GC-MS i en C57BL/6J musemodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført med godkjenning fra Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Mus ble plassert i et IACUC-godkjent dyreanlegg som ligger i et rent rom satt til 22 ° C og 45% fuktighet, etter en daglig 12 timers lys / mørk syklus. De ble holdt i ventilerte stativer og hadde tilgang til en standard chow diett ad libitum (bestående av 60% karbohydrat, 16% protein og 3% fett). Sengetøy og hekkematerialer ble skiftet på ukentlig basis. For denne studien ble mannlige C57BL / 6J-mus i alderen 12 uker og veier mellom 25 g og 30 g benyttet. Disse dyrene ble hentet fra en kommersiell leverandør (se materialfortegnelse).
1. Modulering av metabolsk aktivitet av det brune fettvevet gjennom temperaturakklimatisering og farmakologisk stimulering
MERK: Temperaturakklimatisering over flere dager til uker eller farmakologisk stimulering ved bruk av β-adrenerge reseptoragonister brukes ofte metoder for modulering av BAT-aktivitet1. Derfor er det gitt en kortfattet oversikt over metoden nedenfor for å gjøre det mulig for leserne å velge riktig tilnærming etter behov. For å oppnå metabolsk inaktiv (mindre termogen) BAT, velges en baseline varm temperatur, referert til som termonøytralitet (28-30 °C), for C57BL/6J-mus. Dette området sikrer at musene ikke trenger å bruke ekstra energi for å opprettholde en konstant kroppstemperatur. For å oppnå metabolsk beskjeden eller svært aktiv (termogen) flaggermus, kan man velge henholdsvis mild kulde (20-22 °C) eller streng kulde (6 °C). I dette forsøket ble mus oppdrettet under vanlige boligforhold ved 22 ° C, som, selv om det var mildt kaldt for mus, ikke involverte noen farmakologiske stimuleringer.
- Temperatur akklimatisering
- Separer musene for å huse 1 eller 2 mus per bur minst 1 uke før temperaturakklimatisering starter. Forbered gnagerinkubatorer utstyrt med luftventilasjon, temperatur og fuktighetskontroll under de ønskede forholdene.
- Flytt burene til deres respektive gnagerinkubatorer på passende dager for den valgte typen temperaturakklimatisering.
- Sørg for at fordelingen av antall mus er jevn på tvers av alle grupper, med enten 1 eller 2 mus per merd. Enkelthus foretrekkes da det er mer følsomt for temperaturinduserte fysiologiske endringer sammenlignet med gruppebolig43. Her er de spesifikke boforholdene for hver gruppe:
- Termonøytralitetsgruppen (30 °C): Hold musene i denne gruppen kontinuerlig ved en temperatur på 30 °C i opptil fire uker.
- Alvorlig kuldegruppe: I første omgang huser musene i denne gruppen ved 18 °C uten hekkematerialer. De vil oppleve en gradvis ukentlig temperaturreduksjon, og nå 6 ° C i den fjerde uken. Temperaturprogresjonen er som følger: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
- Mild kuldegruppe (20-22 °C): Oppbevar musene i denne gruppen i gnagerrugemaskiner under de samme forholdene som nevnt tidligere.
- Akutte kuldeutfordringer: For akutte kuldeutfordringer, plasser 1-2 mus per merd uten hekkematerialer og utsett dem for en gnagerinkubator satt til 6 °C i opptil 8 timer.
MERK: Disse boligforholdene og temperaturvariasjonene er avgjørende for å studere effekten av forskjellige temperaturmiljøer på BAT-aktivitet og metabolisme.
- Bytt bur og fyll på mat og vann hver uke. Pre-akklimatisere burene minst 24 timer før tilskudd, ved deres respektive temperatur (gnager inkubator).
MERK: For å forhindre forstyrrelse av passende temperaturstimulans, er det viktig å ikke gi museberikelser som kan føre til reirbygging. Som svar på alvorlig kulde bruker mus mer energi for å opprettholde kroppstemperaturen, noe som resulterer i økt matinntak og høyere utskillelseshastigheter. Derfor er det viktig å sjekke burene minst to til tre ganger per uke (etter lokale institusjonelle retningslinjer) for å sikre at musene har tilstrekkelig tilførsel av mat og vann, og at burene ikke er for våte. Denne overvåkingen er viktig for å opprettholde musens velvære og helse under studien.
- Farmakologisk stimulering1 ved bruk av β3-adrenerg reseptoragonist CL316,243
- For å maksimere den stimulerende effekten, oppbevar musene på termonøytralitet (30 °C) i 2-4 uker før injeksjoner.
- Etter akklimatiseringsperioden injiseres 1 mg/kg CL316,243 intraperitonealt.
MERK: For kronisk stimulering med β3-adrenerge reseptoragonist (f.eks. fra 3 dager til uke 1,44,45), er det nødvendig med daglige injeksjoner på grunn av legemiddelstabilitet. Fortynnet CL316,243 bør tilberedes på injeksjonsdagen på grunn av stabilitet.
2. Arteriovenøs blodprøvetaking
MERK: Mus over 12-14 uker anbefales best for arteriovenøs blodprøvetaking. Yngre mus har kanskje ikke tilstrekkelig størrelse på Sulzers årer, et distinkt blodkar som spesifikt drenerer venøst blod fra den interskapulære BAT46.
- Bedøv forsiktig med den kalibrerte fordamperen med 3 % isofluran for induksjon (i et kammer på 205 x 265 x 200 mm) og 2 % isofluran for vedlikehold (med gassanestesimaske).
MERK: Hele arteriovenøs blodprøvetakingsprosedyre bør utføres umiddelbart etter anestesi. En vannoppvarmet oppvarmingspute kan brukes under anestesi for å opprettholde kjerne kroppstemperatur.
FORSIKTIG: Isofluran er svært flyktig og toksisk ved innånding. Derfor må primærbedøvelse utføres under en avtrekkshette. - Bekreft dyrets reflekser som pote tilbaketrekning for å bekrefte at bedøvelsen har nådd en passende dybde.
- Oppsamling av venøst blod fra Sulzer-venen
- Plasser musen for å eksponere den dorsale huden, bekreft dybden av anestesi via en tå-klemme rett før du gjør snittet. Fukt rygghuden med rikelig med 70% etanol for å hindre hårløsing, og gjør et snitt langs ryggen fra nedre del av thorax helt opp til halsen.
MERK: Den interskapulære BAT-en ligger rett under huden, bestående av to fettputer dekket av tynt hvitt fettvev. Det er viktig å sikre at musen forblir under anestesi gjennom gassbedøvelsesmasken. - Løft forsiktig den interscapulære BAT med bøyde spisstang og kutt forsiktig det vedlagte vevet, hvorav de fleste er muskler. Løft opp fettputen mot hodet, fortsett å kutte det vedlagte vevet og åpne området forsiktig til Sulzer-venen (et stort 'Y'-formet mørkerødt kar koblet til begge fettputene til interscapular BAT) er utsatt.
MERK: Vær forsiktig så du ikke kutter kapillærkarene i muskelvev som er forbundet med front- og sideregionen av interskapulær BAT, da dette vil redusere mengden og kvaliteten på blod som drenerer fra Sulzers vene betydelig. - Kutt forsiktig Sulzer-venen, og samle ca. 40 μl blod ved hjelp av bunnskårne 200 μL pipettespisser og en P100-pipette. Oppbevar blodet i et blodoppsamlingsrør og hold røret på is til serumoppsamlingsprosessen.
MERK: Det er viktig å samle blod fra like under det Y-formede delingspunktet i Sulzers vene, for å forhindre blodforurensning fra den overlegne vena cava47. Å samle for mye blod vil redusere egenskapene til Sulzers vene. Sørg derfor for å samle den minste mengden blod som trengs fra Sulzers vene for analyse. Vær nøye når du velger blodinnsamlingsrør, da serum og plasma gir forskjellige metabolittprofiler 48,49,50. For plasmaoppsamling er det nødvendig å bruke heparinbelagte rør. I dette forsøket ble koagulasjonsaktivatorbelagte rør valgt for å oppnå serum. Under ingen omstendigheter bør EDTA-belagte rør brukes, da EDTA påvirker massespektrometrisignalerbetydelig 51,52.
- Plasser musen for å eksponere den dorsale huden, bekreft dybden av anestesi via en tå-klemme rett før du gjør snittet. Fukt rygghuden med rikelig med 70% etanol for å hindre hårløsing, og gjør et snitt langs ryggen fra nedre del av thorax helt opp til halsen.
- Samle arterielt blod fra venstre ventrikel
- Vend musen uten å miste kontakten med nesekjeglen, for å eksponere ventral hud. Bekreft dybden av anestesi via en tå-klemme før du gjør snittet. Fukt den ventrale huden med rikelig mengde 70% etanol for å forhindre hårløsrivelse, og åpne thoraxhulen forsiktig med saks for å eksponere hjertet uten å skade noen indre struktur.
- Nøyaktig punktering av apex-området i venstre ventrikkel ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 29 G (1/2") nål. Sett inn to tredjedeler av en 1/2'' nål til 3-5 mm til høyre horisontalt for hjertets apex (figur 1B), og trekk sprøyten tilbake for å samle blod fra venstre ventrikkel (50-100 μL). Blod fra venstre ventrikkel er oksygenert arterielt blod som er lyse rødt. Oppbevar blodet i et blodoppsamlingsrør, og hold røret på is til serumoppsamlingsprosessen.
MERK: Et minimalt snitt bør gjøres i brysthulen for tilgang til hjertet. Kraftig snitt kan føre til lokal blødning, som senere kan resultere i lavt blodtrykk. Dette kan påvirke kvaliteten på arterielt blod samlet fra venstre ventrikkel. Unngå å rotere eller snu hjertet, da det vil gjøre det vanskelig å bestemme den nøyaktige posisjonen til venstre ventrikkel. - Utfør eutanasi og sørg for det med en passende metode i henhold til retningslinjene fra de lokale institusjonene. For eksempel kan eutanasi utføres gjennom cervikal dislokasjon og bekreftes ved opphør av hjerteslag.
- Sentrifuger blodprøver ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette. Supernatanten skal inneholde enten serum eller plasma, avhengig av hvilken type blodoppsamlingsslange som brukes. Man kan stoppe her og lagre prøvene ved -20 °C til serumbehandling for GC-MS-analyse.
MERK: Hemolyse kan potensielt ha oppstått hvis rødfarget supernatant observeres. For å unngå hemolyse, virvel prøven før koagulering er fullført. Noen røde blodcelleberikede metabolitter, inkludert glutamin og laktat, kan føre til feiltolkning av data, selv om de fleste metabolitter kanskje ikke påvirkes signifikant av hemolyse. Det anbefales å analysere serum/plasma innen en uke.
3. Metabolittekstraksjon fra serum og kjemisk derivatisering
- Forberedelse for utvinning
MERK: Alle metoder, inkludert metabolittekstraksjon, derivatisering og dataanalyse, er litt modifiserte versjoner av tidligere beskrevne metoder53,54.- Forbered ekstraksjonsbufferen ved å tilsette 100 μM-løsning av DL-norvalin, intern standard (se materialfortegnelse), til metanol av MS-kvalitet.
- Sørg for at alle eksperimentelle prosedyrer utføres på is.
- Overfør 10 μL musserum ekstrahert fra enten Sulzers vene eller venstre ventrikkel til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 40 μL ekstraksjonsbuffer.
- For å fjerne cellerester og protein, virv serumprøvene kort, etterfulgt av sentrifugeringen ved maksimal hastighet (18 000 x g) i 30 minutter ved 4 °C.
- Etter sentrifugering overføres 40 mikroliter supernatant forsiktig til et hetteglass etterfulgt av 3 timers tørking i en vakuumsentrifuge ved 4 °C.
MERK: En glassinnsats (se materialfortegnelse) anbefales i stedet for plastrør på grunn av plastreaktive kjemikalier som brukes gjennom hele det påfølgende derivatiseringstrinnet. - Utsett de tørkede prøvene for to påfølgende derivatiseringstrinn for GC-MS-analysen av serummetabolittene.
MERK: Følgende trinn bør utføres under en avtrekkshette på grunn av irritasjonsrisiko for løsemidlene.- Resuspender de tørkede serumekstraktene i 30 μL 10 mg/ml metoksyaminhydroklorid (se materialtabellen) oppløst i pyridin og inkuber det ved 37 °C i 30 minutter.
- Derivatiser prøver for silylering av metabolitter med 70 μL N-metyl-N-tert-butyldimetylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA, se materialtabell) ved 70 °C i 1 time.
MERK: Bruk av en glasssprøyte anbefales på nytt i stedet for en plastspiss i de følgende trinnene på grunn av derivatiseringsløsningsmidlene som reagerer med plast.
4. Metabolomics analyse ved bruk av GC-MS
MERK: Enkeltfiredobbel GC-MS (se materialfortegnelse) ble brukt til å måle de forskjellige serummetabolittene, inkludert karbohydrater, aminosyrer og TCA-syklusmellomprodukter i derivatiserte prøver fra Sulzers vene og venstre ventrikkel. Andre kolonner kan alternativt brukes, selv om de eksperimentelle innstillingene inkludert temperaturprogrammet kan variere avhengig av hvilke typer kolonner som brukes.
- Injiser 1 μL av den derivatiserte prøven inn i GC i delt modus ved 280 °C (innløpstemperatur), ved bruk av helium som bærergass med en strømningshastighet på 1,500 ml / min (settpunkt).
- Sett kvadrupolen på 200 °C med GC-MS-grensesnitt ved 300 °C.
MERK: Ovnsprogrammet for alle metabolittanalyser starter ved 60 °C, holdes i 1 minutt og økes deretter med en hastighet på 10 °C/min til temperaturen når 320 °C. - Samle inn data ved elektronionisering (EI) satt til 70 eV og hent prøvedataene i skannemodus (50-550 m / z) 53. Alle metabolitter brukt i denne studien ble tidligere validert med standarder for å bekrefte massespektra og retensjonstider.
- Utfør toppområdeintegrasjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig analyseprogram (se Materialfortegnelse).
- Match forbindelsene med produktionet til hvert TBMDS-derivat. Deretter får du ekstraksjonsionkromatogrammet (EIC) ved å integrere m / z-verdien av fragmentionet i det tilsvarende toppområdet, og eksporter det deretter. Fragmentioner er vist i tabell 1.
MERK: EIC for hver forbindelse ble normalisert av DL-norvaline i hver prøve. Dataene er representert av logg2 Sulzers vene til venstre ventrikkel (logg2(SV/LV)) ved bruk av hver normaliserte EIC-verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer det eksperimentelle skjemaet for BAT-optimalisert AV-metabolomikk. Som nevnt i protokollseksjonen, for å oppnå differensielt stimulert brunt fettvev, gjennomgår mus temperaturakklimatisering ved hjelp av gnagerinkubatorer eller mottar farmakologisk administrasjon som β-adrenerge reseptoragonister. Deretter bedøves mus, og blodprøver samles for metabolomisk analyse (figur 1A). For blodprøvetaking samles venøst blod spesifikt drenering fra interskapulær BAT via Sulzers vene, mens arterielt blod hentes direkte fra hjertets venstre ventrikkel (figur 1B).
Figur 2 representerer skjemaet for serummetabolomikk ved bruk av GC-MS (figur 2). Kort fortalt tilsettes metanoloppløsningen til serumprøver etterfulgt av sentrifugering for å fjerne serumproteiner. Supernatanten som inneholdt metabolittene ble tørket i en SpeedVac og de tørkede prøvene ble utsatt for totrinns derivatisering ved bruk av metoksyamin (MOX) og MTBSTFA (N-tert-Butyldimetylsilyl-N-metyltrifluoracetamid). Derivatiseringstrinnet tar sikte på substitusjon av polare funksjonelle grupper av metabolittene med TBDMS-ester, noe som muliggjør GC-MS-deteksjon av metabolitter som TBDMS-derivater. De derivatiserte prøvene ble analysert ved hjelp av enkelt firedobbelt GC-MS. Metabolitter separeres i kolonnen i henhold til deres fysiokjemiske egenskaper. Elektronionisering (EI) brukes til å bryte metabolittene ned i unike fragmentioner oppdaget av en massedetektor. Identifikasjon av forbindelser utføres ved påvisning av forbindelsesspesifikke fragmentioner. M/z-verdien og retensjonstiden til de forbindelsesspesifikke fragmentionene i forsøket er vist i tabellen (tabell 1). Et ekstrahert ionkromatogram (EIC) brukes til å integrere signalet fra et forbindelsesspesifikt fragmention i toppområdet av metabolitten, som definerer overflod av metabolitter.
For å avgjøre om BAT frigjør eller tar opp en serie metabolitter, kan logg2-forhold mellom ionantall mellom Sulzers vene og venstre ventrikkel (logg2(SV/LV)) beregnes (figur 3). Hvis Log2(SV/LV)-verdien for en bestemt metabolitt er >0, indikerer det at metabolitten er mer tallrik i SV enn LV, noe som tyder på at interskapulær BAT-nettofrigjøring av metabolitten. Omvendt, hvis log2(SV/LV)-verdien for en bestemt metabolitt er <0, antyder det at metabolitten tas opp av den interskapulære BAT.
Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det funnet at mild kuldestimulert BAT signifikant forbruker glukose, laktat, 3-hydroksybutyrat (3-HB), BCAA, aspartat, lysin og tryptofan, mens BAT frigjør succinat og palmitat betydelig (figur 3A). De fleste av disse fenomenene ble observert i våre tidligere studier på kronisk kald BAT42, noe som tyder på at mild kald BAT metabolsk ligner kronisk kald BAT, om enn i mindre grad. For å gi en rask visuell oversikt over dataene, vises et varmekart som viser logg2 (SV / LV) verdier (figur 3B). Det er viktig å tolke dataene med forsiktighet, da varmekartet representerer Z-score i gruppen.
Figur 1: Eksperimentelt skjema for BAT-optimalisert arteriovenøs (AV) metabolomikk. (A) Diagram som viser arbeidsflyten til AV-metabolomikk. (1) For å indusere forskjellige versjoner av metabolsk stimulert brunt fettvev (BAT), blir mus akklimatisert til forskjellige temperaturer eller mottar farmakologiske legemiddelinjeksjoner. (2) Deretter samles arterielle og venøse blodprøver fra henholdsvis venstre ventrikkel og Sulzers vene hos musene. (3) De oppnådde serumprøvene blir utsatt for metabolittekstraksjon, etterfulgt av metabolomisk analyse. (B) Representative bilder som gir veiledning for blodprøvetakingsprosedyrer. Arterielt blod samles fra venstre ventrikkel, mens venøst blod oppnås fra Sulzers vene da det spesifikt drenerer blod fra BAT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: GC/MS-basert målrettet metabolomikk. Eksperimentelt skjema for GC / MS-basert målrettet metabolomikk. TBDMS: tert-butyldimetylsilyl, EI: Elektronionisering, EIC: Ekstraksjonsionkromatogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative data om AV-metabolomikk. (A) Opptak og påfølgende frigjøring av utvalgte prevalente og svært aktive sirkulerende drivstoffmetabolitter ved BAT, klassifisert i henhold til deres respektive grupper. Dataene viser Log2 Sulzers vene til venstre ventrikkel (SV / LV) forhold. Søyler som indikerer metabolitter med gjennomsnittlig log2 (SV/LV) <0 er farget rødt, og logg2 (SV/LV) >0 er farget blå. Individuelle datapunkter representerer hver mus; n = 11. Data er gjennomsnittlige ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; forgrenet aminosyre; EAA; essensiell aminosyre; NEAA; ikke-essensiell aminosyre. (B) Et varmekart som illustrerer differensialforekomsten av metabolitter mellom Sulzers vene (SV) og venstre ventrikkel (LV) blod. Hver kolonne viser en Z-score for gjennomsnittsverdier i gruppen; n = 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sammensatt | m/z av fragmentioner | Tid for oppbevaring av data | Formular | TBDMS derivat formular |
| Pyruvat | 174.1 | 8.72 | C3H4O3 | C15H33O3NSi2 |
| Aspartat | 418.2 | 18.45 | C4H7NO4 | C22H49NO4Si3 |
| α-ketoglutarat | 346.2 | 17.27 | C5H6O5 | C18H37NO5Si2 |
| C16:0(Palmitat) | 313.3 | 19.72 | C16H32O2 | C22H46O2Si |
| Laktat | 261.2 | 11.66 | C3H6O3 | C15H34O3Si2 |
| Leucine | 200.2 | 14 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Isoleucin | 200.2 | 14.34 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Valine | 186.2 | 13.53 | C5H11NO2 | C17H39NO2Si2 |
| Alanin | 260.2 | 12.17 | C3H7NO2 | C15H35NO2Si2 |
| Serine | 390.2 | 17.04 | C3H7NO3 | C21H49NO3Si3 |
| Glysin | 218.1 | 12.43 | C2H5NO2 | C14H33NO2Si2 |
| Lysin | 300.2 | 20.48 | C6H14N2O2 | C24H56N2O2Si3 |
| Succinate | 289.1 | 14.65 | C4H6O4 | C16H34O4Si2 |
| Proline | 258.2 | 14.73 | C5H9NO2 | C17H37NO2Si2 |
| Fenylalanin | 336.2 | 18 | C9H11NO2 | C21H39NO2Si2 |
| Metionin | 320.2 | 16.84 | C5H11NO2S | C17H39NO2SSi2 |
| Cystein | 406.2 | 19 | C3H7NO2S | C21H49NO2SSi3 |
| Asparagin | 417.2 | 19.86 | C4H8N2O3 | C22H50N2O3Si3 |
| 3-hydroksybutyrat (3HB) | 275.2 | 12.81 | C4H8O3 | C16H36O3Si2 |
| Tryptofan | 375.2 | 22.97 | C11H12N2O2 | C23H40N2O2Si2 |
| Malate | 419.2 | 18.19 | C4H6O5 | C22H48O5Si3 |
| Glutamat | 432.3 | 19.59 | C5H9NO4 | C23H51NO4Si3 |
| Glutamin | 431.3 | 20.85 | C5H10N2O3 | C23H52N2O3Si3 |
| Citrate | 459.2 | 22.38 | C6H8O7 | C30H64O7Si4 |
| Glukose | 476.3 | 22.7 | C6H12O6 | C30H68O6Si4 |
Tabell 1: GC/MS-sammensatte fragmentioner brukt til integrering. Denne tabellen inneholder en liste over 25 serummetabolitter identifisert i foreliggende metode, med retensjonstid og fragmentioner tilsvarende hver forbindelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk skritt for å forstå det metabolske potensialet til BAT i energibalansen i hele kroppen er å definere hvilke næringsstoffer det forbruker, hvordan de metabolsk behandles, og hvilke metabolitter som slippes ut i sirkulasjonen. Denne protokollen introduserer en spesialisert arteriovenøs prøvetakingsteknikk som gir tilgang til venøs vaskulatur av interskapulær BAT og systemisk arteriell vaskulatur i C57BL/6J-mus, som nylig ble utviklet og validert av Park et al42. Nedenfor er viktige punkter du bør vurdere kritisk når du følger protokollen.
For termogen stimulering er en viktig faktor å velge den mest passende typen termogen stimulering for eksperimentell innstilling. For eksempel, når du bruker en eksperimentell gruppe (vs. kontroll) og tar sikte på å observere forskjeller i metabolsk tilpasningskapasitet (avgjørende for det maksimale, ikke-rystende termogene potensialet) av BAT, er kronisk kaldakklimatisering eller β-adrenerg reseptorstimulering (som varer mer enn 3 dager til 4 uker) egnet 1,45. Når BAT utsettes for akutt kuldeeksponering (noen timer mindre enn 24 timer), i stedet for metabolsk tilpasning, metaboliserer BAT sitt iboende lagrede drivstoff og kommuniserer metabolsk med rystende muskler for optimal termogenese1. En β-adrenerg reseptoragonist representerer en nevronrespons for å utløse BAT-termogenese 1,14, og det er andre endokrine faktorer som forbedrer det termogene programmet 55,56,57,58,59,60. Når termogen stimulering utføres som nevnt ovenfor, bør det være nyttig å ha en baselinekontroll ved termonøytralitet (30 °C) for å bekrefte om stimuleringen fungerte som den skulle.
Som nevnt i protokollseksjonen er oppnåelse av arteriovenøst blod av høyeste kvalitet nøkkelen til å bestemme vellykket etablering av forsøket. For å oppnå dette er det viktig å forhindre hemolyse (se trinn 2.5) og samle en konsistent mengde blod for å unngå fortynning av de distinkte egenskapene til venøst blod fra Sulzers vene (mindre enn 40 μL fra Sulzer-venen). For dette formål, under det første oppsettet, anbefaler forfatterne sterkt å utføre et piloteksperiment for metabolittmåling ved bruk av ikke bare blod fra Sulzers vene, men også blod fra ikke-BAT-drenerende venøst blod (f.eks. dårligere vena cava). Dette vil bidra til å bekrefte om serumet i Sulzer-venen avslører distinkt metabolittprofilering sammenlignet med ikke-BAT-venekar. Når det gjelder arteriell blodsamling fra venstre ventrikkel, er det viktig å konsekvent punktere det samme området på venstre ventrikkel for å minimere variasjoner i kardiokinnivåer61,62. Slike variasjoner kan gi forvirrende resultater i arteriovenøs-metabolomics eller -proteomics.
Kromatografi kombinert med massespektrometri er et av de kraftigste verktøyene for metabolomikk, en metode er GC-MS63. Faktisk ble måling av biologisk relevante metabolitter ved bruk av GC-MS ansett som utfordrende på grunn av dekningsproblemet; GC-MS-applikasjonen er vanligvis begrenset til analyse av metabolitter med svært flyktige og ikke-polare egenskaper i motsetning til de mange polare metabolittene i vev og biologiske væsker. Imidlertid har utviklingen av ulike ekstraksjons- og derivatiseringsmetoder, sammen med oppsidene til GC-MS, inkludert utmerket toppoppløsning, reproduserbarhet og omfattende massespektralbiblioteker som muliggjør praktisk toppidentifikasjon, ført til en slik plattform som et attraktivt alternativ for å analysere biologisk relevante metabolitter64,65.
I denne protokollen brukes GC-MS-plattformen til analyse av 25 metabolitter i serum samlet ved hjelp av den nevnte teknikken. Til dette formål ble metabolittekstraksjon utført ved bruk av 80% metanoloppløsning. Merk at i løpet av dette trinnet anbefales det å bruke visse typer rør, inkludert Eppendorf-rør, for å oppnå de laveste nivåene av organisk stoffforurensning i prøvene. Forsiktig separasjon av supernatant fra pellets etter ekstraksjon er også nødvendig for å fjerne proteinrester fra serumet, noe som er avgjørende for vedlikehold av MS-ion-kildeytelsen.
Derivatiseringstrinnet kan diversifiseres basert på typer derivatiseringer, inkludert arylderivater, silylering og acylering66. Forfatterne benyttet totrinnsderivatisering med N-metyl-N-tert-butyldimetylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA) for metabolittsialylering, som er en vanlig metode med fordelen av stabil påvisning av biologisk relevante polare metabolitter, inkludert sukkerarter, men med en ulempe med hensyn til sporadisk tap av N-trimetylsilylgruppen av aminer og aminosyrer under analysetrinn64. Merk at prøvene bør tørkes helt før derivatiseringstrinnet, på grunn av fuktighetsfølsomheten til reagensene og derivatene.
En av hovedbegrensningene i GC-analysen kommer generelt fortsatt ned til rekkevidden av detekterbare metabolitter til tross for de nevnte derivatiseringstrinnene som forbedrer GC-MS-kapasiteten med hensyn til påvisning av polare metabolitter, spesielt sammenlignet med LC-MS-basert analyse. Kvantitativ metabolomikk ved bruk av LC-MS kan i stor grad bidra til å få bedre innsikt i det metabolske spekteret av BATs med hensyn til systemisk metabolittutveksling24,42.
Selv om beregningen som ble brukt i protokollmålingen av metabolittkonsentrasjonsgradienten mellom arteriell vs. venøst blod; Logg2(SV/LV)-kvantifiserer fraksjonell absorpsjon og frigjøringsendring ved BAT, forsiktighet er nødvendig for datatolkning. Spesielt for de metabolittene hvis fraksjonelle netto bytteverdi er '0' (f.eks. citrat, αKG, malat, metionin, alanin, glutamin), kan resultatet tilskrives enten ingen opptak/frigjøring eller like aktiv katabolisme og syntese (hvor både opptak og frigjøring er høy). For å verifisere hvilken av de to mulighetene som er riktig, er det nødvendig med ytterligere metabolske flukseksperimenter ved bruk av isotopsporing in vivo med den opptatte metabolitten og/eller dens substrat39.
Begrensningen av brøkberegningen er at den ikke gir det kvantitative landskapet for opptak og frigjøring for disse metabolittene42,67. For eksempel, selv om Log2 (SV / LV) -verdien indikerer et sammenlignbart relativt nettoopptak mellom glukose og 3-hydroksybutyrat (3HB), bør det faktiske bidraget av glukose til karbonkildene være mye høyere enn 3-HB på grunn av at blodkonsentrasjonen av glukose er mye høyere enn 3HB, og fordi glukose inneholder fire flere karboner (glukose har seks karbonatomer, 3HB har to karbonatomer). Om nødvendig bør en omfattende analyse som omfatter tilleggsparametere, for eksempel blodstrømningshastighet, faktiske blodkonsentrasjoner av hver metabolitt og deres kjemiske ligninger, informere oss om de kvantitative bidragene fra metabolittene som tas opp / frigjøres og deres bidrag i total karbon- eller nitrogenfluks42,67.
En stor fordel med denne miniatyriserte metoden for arteriovenøs blodprøvetaking og metabolomisk analyse på musenivå er dens synergistiske kombinasjon med ulike genetiske modeller for å studere brun fettvevsmetabolisme og fysiologi (f.eks. UCP1-KO, UCP1-Cre-drevne BAT-spesifikke tap av funksjonsmodeller, transgene modeller). Nyere metabolomisk analyse som bare krever spormengder av serum for metabolomisk profilering, gjør denne tilnærmingen mer gjennomførbar med mindre organismer (se protokoll 3) 39. Proteomisk analyse, som kan gi bedre innsikt når den vurderes sammen med metabolomikk, kan imidlertid kreve større mengder prøver. I denne forbindelse kan konvensjonell arteriovenøs prøvetaking med rotter være mer egnet. Vi henviser leserne til den nyeste protokollen for arteriovenøs blodprøvetaking for BAT hos rotter, skrevet av Mestres-Arenas og kolleger47.
Selv om den nåværende protokollen vedtar anestesiprosedyren ved bruk av isofluran som beskrevet i Park et al.42, kan denne tilnærmingen negativt påvirke den termogene metabolismen av brune adipocytter og / eller brunt fettvev in vivo 68,69,70,71. Derfor er fremtidige arteriovenøse metabolomika ved bruk av pentobarbital berettiget undersøkelse.
Oppsummert gir denne protokollen en grunnleggende metodikk for å måle BAT-spesifikk netto metabolsk aktivitet (forbruk vs. produksjon) ved forskjellige termogene stimuleringer. Dette bør gi oss verdifull innsikt i rollen til BAT som en systemisk næringsvask samt leverandør ved kvantitativt å liste viktige metabolske drivstoff samt utskilte metabolitter. Videre kan dette også være nyttig for å identifisere tidligere ustuderte metabolittavledede brune adipokiner, spesielt når de opereres med oppdagelsesbaserte metabolomiske plattformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av Choi- og Jung-laboratoriene for metodologisk diskusjon. Vi takker C. Jang og D. Guertin for råd og tilbakemeldinger. Vi takker M.S. Choi for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NRF-2022R1C1C1012034 til S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 til D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 til S.M.J. og D.W.C. Dette arbeidet ble støttet av Chungnam National University for WTK Figur 1 og figur 2 ble opprettet ved hjelp av BioRender (http://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
| 1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
| Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
| Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
- Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
- Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
- Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
- Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z.
- Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
- Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
- Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
- Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
- Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
- Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
- Hui, S., et al.
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
- Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
- Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
- Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
- Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
- Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
- Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
- Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
- Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
- Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
- Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
- Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
- Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
- Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
- Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
- Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
- Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
- Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
- Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
- Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
- Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
- Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
- Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
- Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
- Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
- Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
- Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
- Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
- Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
- Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D.
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
- Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
- Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
- Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
- Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
- Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
- Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
- Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).
