Summary
In dit protocol worden methoden geschetst die relevant zijn voor BAT-geoptimaliseerde arterioveneuze metabolomics met behulp van GC-MS in een muismodel. Deze methoden maken het mogelijk om waardevolle inzichten te verwerven in de uitwisseling van BBT-gemedieerde metabolieten op organismaal niveau.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT) speelt een cruciale rol bij het reguleren van metabole homeostase door middel van een uniek energieverbruiksproces dat bekend staat als niet-rillende thermogenese. Om dit te bereiken, maakt BAT gebruik van een gevarieerd menu van circulerende voedingsstoffen om de hoge metabolische vraag te ondersteunen. Bovendien scheidt BAT van metabolieten afgeleide bioactieve factoren af die kunnen dienen als metabole brandstoffen of signaalmoleculen, waardoor BAT-gemedieerde communicatie tussen weefsels en/of tussen weefsels wordt vergemakkelijkt. Dit suggereert dat BAT actief deelneemt aan de uitwisseling van systemische metabolieten, een interessant kenmerk dat begint te worden onderzocht. Hier introduceren we een protocol voor in vivo geoptimaliseerde BAT-arterioveneuze metabolomics op muisniveau. Het protocol richt zich op relevante methoden voor thermogene stimulaties en een arterioveneuze bloedafnametechniek met behulp van de ader van Sulzer, die selectief interscapulier BAT-afgeleid veneus bloed en systemisch arterieel bloed afvoert. Vervolgens wordt een op gaschromatografie gebaseerd metabolomics-protocol gedemonstreerd met behulp van die bloedmonsters. Het gebruik van deze techniek zou het inzicht in de uitwisseling van BBT-gereguleerde metabolieten op het niveau tussen organen moeten vergroten door de netto-opname en afgifte van metabolieten door BBT te meten.
Introduction
Bruin vetweefsel (BAT) bezit een unieke eigenschap van energieverbruik die bekend staat als niet-rillende thermogenese (NST), waarbij zowel mitochondriale ontkoppelingsproteïne 1 (UCP1)-afhankelijke als UCP1-onafhankelijke mechanismenbetrokken zijn 1,2,3,4,5. Deze onderscheidende kenmerken impliceren BAT bij de regulatie van het systemische metabolisme en de pathogenese van stofwisselingsziekten, waaronder obesitas, diabetes type 2, hart- en vaatziekten en kankercachexie 6,7,8. Recente retrospectieve studies hebben een omgekeerd verband aangetoond tussen BAT-massa en/of de metabole activiteit ervan met obesitas, hyperglykemie en cardiometabole gezondheid bij mensen 9,10,11.
Onlangs is BBT voorgesteld als een metabolische put die verantwoordelijk is voor het in stand houden van NST, aangezien het aanzienlijke hoeveelheden circulerende voedingsstoffen vereist als thermogene brandstof 6,7. Bovendien kan BAT bioactieve factoren genereren en afgeven, bruine adipokines of BATokines genoemd, die fungeren als endocriene en/of paracriene signalen, wat wijst op zijn actieve betrokkenheid bij metabole homeostase op systeemniveau 12,13,14,15. Daarom zou het begrijpen van het nutriëntenmetabolisme van BBT ons begrip van de pathofysiologische betekenis ervan bij mensen moeten vergroten, naast zijn conventionele rol als thermoregulerend orgaan.
Metabolomische studies waarbij gebruik wordt gemaakt van stabiele isotopentracers, in combinatie met klassieke nutriëntenopnamestudies met niet-metaboliseerbare radiotracers, hebben ons begrip van welke nutriënten bij voorkeur door BBT worden opgenomen en hoe ze worden gebruikt aanzienlijk verbeterd 16,17,18,19,20,21,22,23,24,2526,27. Radioactieve tracerstudies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat koud geactiveerde BAT glucose, lipoproteïne-gebonden vetzuren en vertakte aminozuren opneemt 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recente isotopentracering in combinatie met metabolomische studies heeft ons in staat gesteld om het metabole lot en de flux van deze voedingsstoffen in weefsels en gekweekte cellen te meten 24,25,26,28,29,30. Deze analyses richten zich echter voornamelijk op het individuele gebruik van voedingsstoffen, waardoor we beperkte kennis hebben van de rol van BAT op systeemniveau bij de uitwisseling van orgaanmetabolieten. Vragen over de specifieke reeks circulerende nutriënten die door BBT worden geconsumeerd en hun kwantitatieve bijdragen in termen van koolstof en stikstof blijven ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek naar de vraag of BAT metaboliet-afgeleide BATokines (bijv. lipokines) kan genereren en vrijgeven met behulp van voedingsstoffen nog maar net begonnen 12,13,14,15,31,32.
Arterioveneuze bloedanalyse is een klassieke fysiologische benadering die wordt gebruikt om de specifieke opname of afgifte van circulerende moleculen in organen/weefsels te beoordelen. Deze techniek is eerder toegepast op de interscapulaire BAT van ratten om zuurstof en verschillende metabolieten te meten, waardoor BAT de belangrijkste plaats van adaptieve thermogenese is geworden met zijn katabole potentieel 33,34,35,36,37. Onlangs werd een arterioveneuze studie met behulp van interscapulaire BAT bij ratten gekoppeld aan een trans-omics-benadering, wat leidde tot de identificatie van onontdekte BATokines die vrijkomen door thermogeen gestimuleerde BAT38.
Recente ontwikkelingen op het gebied van hooggevoelige gaschromatografie en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (GC-MS en LC-MS) gebaseerde metabolomics hebben de belangstelling voor arterioveneuze studies voor de kwantitatieve analyse van orgaanspecifieke metabolietuitwisseling opnieuw aangewakkerd 39,40,41. Deze technieken, met hun hoge oplossend vermogen en massanauwkeurigheid, maken de uitgebreide analyse van een breed scala aan metabolieten mogelijk met behulp van kleine monsterhoeveelheden.
In overeenstemming met deze vooruitgang heeft een recente studie met succes arterioveneuze metabolomics aangepast voor het bestuderen van BAT op muisniveau, waardoor de kwantitatieve analyse van metabolietuitwisselingsactiviteiten in BBT onder verschillende omstandigheden mogelijk is42. Dit artikel presenteert een BAT-gericht arterioveneuze metabolomics-protocol met behulp van GC-MS in een C57BL/6J-muismodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De muizen werden gehuisvest in een door de IACUC goedgekeurde dierenfaciliteit in een cleanroom met een temperatuur van 22 °C en een luchtvochtigheid van 45%, volgens een dagelijkse licht/donkercyclus van 12 uur. Ze werden gehouden in geventileerde rekken en hadden toegang tot een standaard chow-dieet ad libitum (bestaande uit 60% koolhydraten, 16% eiwit en 3% vet). Strooisel en nestmateriaal werden wekelijks ververst. Voor deze studie werden mannelijke C57BL/6J-muizen van 12 weken oud met een gewicht tussen 25 g en 30 g gebruikt. Deze dieren waren afkomstig van een commerciële leverancier (zie Materiaaltabel).
1. Modulatie van de metabole activiteit van het bruine vetweefsel door temperatuuracclimatisatie en farmacologische stimulatie
OPMERKING: Temperatuuracclimatisatie gedurende enkele dagen tot weken of farmacologische stimulatie met behulp van β-adrenerge receptoragonisten zijn veelgebruikte methoden voor het moduleren van BBT-activiteit1. Daarom wordt hieronder een beknopt overzicht van de methode gegeven om lezers in staat te stellen de juiste aanpak te kiezen als dat nodig is. Om metabolisch inactieve (minder thermogene) BBT te verkrijgen, wordt voor C57BL/6J-muizen een basistemperatuur voor warme warmte (28-30 °C) gekozen, ook wel thermoneutraliteit genoemd. Dit bereik zorgt ervoor dat de muizen geen extra energie hoeven te verbruiken om een constante lichaamstemperatuur te behouden. Om metabolisch bescheiden of zeer actieve (thermogene) BBT te verkrijgen, kan respectievelijk worden gekozen voor milde koude (20-22 °C) of zeer koude (6 °C) temperaturen. Voor de doeleinden van dit experiment werden muizen grootgebracht onder standaard huisvestingsomstandigheden bij 22 °C, die, hoewel licht koud voor muizen, geen farmacologische stimulaties met zich meebrachten.
- Temperatuur acclimatisatie
- Scheid de muizen om 1 of 2 muizen per kooi te huisvesten, ten minste 1 week voorafgaand aan de start van de temperatuuracclimatisatie. Bereid knaagdierbroedmachines voor die zijn uitgerust met luchtventilatie, temperatuur- en vochtigheidsregeling met de gewenste omstandigheden.
- Verplaats de kooien naar hun respectievelijke knaagdierincubators op geschikte dagen voor het gekozen type temperatuuracclimatisatie.
- Zorg ervoor dat de verdeling van het aantal muizen gelijkmatig is over alle groepen, met 1 of 2 muizen per kooi. Eenpersoonshuisvesting heeft de voorkeur omdat deze gevoeliger is voor door temperatuur veroorzaakte fysiologische veranderingen in vergelijking met groepshuisvesting43. Dit zijn de specifieke huisvestingsvoorwaarden voor elke groep:
- Thermoneutraliteitsgroep (30 °C): Houd de muizen in deze groep gedurende maximaal vier weken continu op een temperatuur van 30 °C.
- Ernstige koudegroep: Huisvest de muizen in eerste instantie in deze groep bij 18 °C zonder nestmateriaal. Ze zullen een geleidelijke wekelijkse temperatuurdaling ervaren, die in de vierde week 6 °C bereikt. Het temperatuurverloop is als volgt: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
- Milde koude groep (20-22 °C): Huisvest de muizen in deze groep in broedmachines voor knaagdieren onder dezelfde omstandigheden als de eerder genoemde standaard huisvestingsomstandigheden.
- Acute koude-uitdagingen: Voor acute koude-uitdagingen, plaats 1-2 muizen per kooi zonder nestmateriaal en stel ze bloot aan een knaagdierincubator die is ingesteld op 6 °C gedurende maximaal 8 uur.
OPMERKING: Deze huisvestingsomstandigheden en temperatuurvariaties zijn essentieel voor het bestuderen van de effecten van verschillende temperatuuromgevingen op de BBT-activiteit en het metabolisme.
- Verander elke week van kooi en vul voedsel en water aan. Pre-acclimatiseer de kooien ten minste 24 uur voorafgaand aan de suppletie, op hun respectievelijke temperatuur (knaagdierincubator).
OPMERKING: Om verstoring van de juiste temperatuurprikkel te voorkomen, is het belangrijk om geen muizenverrijkingen te geven die tot nestbouw zouden kunnen leiden. Als reactie op ernstige verkoudheid verbruiken muizen meer energie om de lichaamstemperatuur op peil te houden, wat resulteert in een verhoogde voedselinname en hogere uitscheidingssnelheden. Daarom is het van cruciaal belang om de kooien minstens twee tot drie keer per week te controleren (volgens de lokale institutionele richtlijnen) om er zeker van te zijn dat de muizen voldoende voedsel en water hebben en dat de kooien niet te nat zijn. Deze monitoring is essentieel om het welzijn en de gezondheid van de muizen tijdens het onderzoek te behouden.
- Farmacologische stimulatie1 met behulp van de β3-adrenerge receptoragonist CL316,243
- Om het stimulerende effect te maximaliseren, moeten de muizen 2-4 weken vóór injecties in thermoneutraliteit (30 °C) worden gehuisvest.
- Injecteer na de acclimatisatieperiode intraperitoneaal 1 mg/kg CL316,243.
OPMERKING: Voor chronische stimulatie met de β3-adrenerge receptoragonist (bijv. van 3 dagen tot week 1,44,45) zijn dagelijkse injecties vereist vanwege de stabiliteit van het geneesmiddel. Verdund CL316,243 moet op de dag van injectie worden bereid vanwege de stabiliteit.
2. Arterioveneuze bloedafname
OPMERKING: Muizen ouder dan 12-14 weken worden het best aanbevolen voor arterioveneuze bloedafname. Jongere muizen hebben mogelijk niet voldoende grote Sulzer-aderen, een duidelijk bloedvat dat specifiek veneus bloed afvoert uit het interscapulaire BAT46.
- Verdoof voorzichtig met behulp van de gekalibreerde verdamper met 3% isofluraan voor inductie (in een kamer van 205 x 265 x 200 mm) en 2% isofluraan voor onderhoud (met een gasanesthesiemasker).
OPMERKING: De volledige arterioveneuze bloedafnameprocedure moet onmiddellijk na anesthesie worden uitgevoerd. Een met water verwarmd verwarmingskussen kan tijdens de anesthesie worden gebruikt om de kerntemperatuur van het lichaam op peil te houden.
LET OP: Isofluraan is zeer vluchtig en giftig bij inademing. Daarom moet primaire anesthetisatie worden uitgevoerd onder een zuurkast. - Controleer de reflexen van het dier, zoals het terugtrekken van de poten, om te bevestigen dat de verdoving de juiste diepte heeft bereikt.
- Het verzamelen van veneus bloed uit de ader van Sulzer
- Plaats de muis om de dorsale huid bloot te leggen, bevestig de diepte van de anesthesie via een teenknijp vlak voordat u de incisie maakt. Bevochtig de dorsale huid met voldoende 70% ethanol om loslating van het haar te voorkomen, en maak een incisie langs de rug van het onderste deel van de thorax helemaal tot aan de nek.
OPMERKING: De interscapulaire BAT bevindt zich direct onder de huid en bestaat uit twee vetkussentjes bedekt met dun wit vetweefsel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis onder narcose blijft door middel van het gasanesthesiemasker. - Til de interscapulaire BAT voorzichtig op met een pincet met gebogen punt en snijd voorzichtig de aangehechte weefsels, waarvan de meeste spieren zijn. Til het vetkussen op in de richting van het hoofd, blijf de aangehechte weefsels doorsnijden en open het gebied voorzichtig totdat de ader van Sulzer (een groot 'Y'-vormig donkerrood vat dat is verbonden met beide vetkussentjes van interscapulaire BAT) bloot komt te liggen.
OPMERKING: Pas op dat u de capillaire vaten van spierweefsels die verbonden zijn met het voor- en zijgebied van interscapulaire BAT niet doorsnijdt, omdat dit de hoeveelheid en kwaliteit van het bloed dat uit de ader van de Sulzer stroomt aanzienlijk zal verminderen. - Snijd voorzichtig de ader van Sulzer door en verzamel ongeveer 40 μl bloed met behulp van pipetpunten van 200 μl en een P100-pipet. Bewaar het bloed in een bloedafnamebuisje en bewaar het buisje op ijs tot het serumafnameproces.
OPMERKING: Het is belangrijk om bloed te verzamelen van net onder het Y-vormige scheidingspunt van de ader van Sulzer, om bloedbesmetting van de superieure vena cava47 te voorkomen. Het verzamelen van te veel bloed zal de kenmerken van de ader van Sulzer verminderen. Zorg er dus voor dat u de minimale hoeveelheid bloed verzamelt die nodig is uit de ader van Sulzer voor analyse. Wees bedachtzaam bij het selecteren van bloedafnamebuisjes, aangezien serum en plasma verschillende metabolietprofielen opleveren 48,49,50. Voor plasmaverzameling is het noodzakelijk om met heparine gecoate buisjes te gebruiken. In dit experiment werden stollingsactivator-gecoate buisjes gekozen om serum te verkrijgen. In geen geval mogen EDTA-gecoate buizen worden gebruikt, aangezien EDTA een aanzienlijke invloed heeft op massaspectrometriesignalen51,52.
- Plaats de muis om de dorsale huid bloot te leggen, bevestig de diepte van de anesthesie via een teenknijp vlak voordat u de incisie maakt. Bevochtig de dorsale huid met voldoende 70% ethanol om loslating van het haar te voorkomen, en maak een incisie langs de rug van het onderste deel van de thorax helemaal tot aan de nek.
- Arterieel bloed verzamelen uit de linker hartkamer
- Draai de muis om zonder het contact met de neuskegel te verliezen, om de ventrale huid bloot te leggen. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen voordat u de incisie maakt. Bevochtig de ventrale huid met een ruime hoeveelheid 70% ethanol om loslating van het haar te voorkomen, en open de borstholte voorzichtig met een schaar om het hart bloot te leggen zonder de interne structuur te beschadigen.
- Prik nauwkeurig in het topgebied van de linker hartkamer met een spuit van 1 ml met een naald van 29 G (1/2"). Steek tweederde van een 1/2'' naald tot 3-5 mm rechts horizontaal van de top van het hart (Figuur 1B) en trek de spuit terug om bloed uit de linker hartkamer (50-100 μL) te verzamelen. Bloed uit de linker hartkamer is zuurstofrijk arterieel bloed dat helderrood is. Bewaar het bloed in een bloedafnamebuisje en bewaar het buisje op ijs tot het serumafnameproces.
OPMERKING: Er moet een minimale incisie in de borstholte worden gemaakt voor toegang tot het hart. Overmatige incisie kan leiden tot lokale bloedingen, wat vervolgens kan leiden tot lage bloeddruk. Dit kan van invloed zijn op de kwaliteit van het arteriële bloed dat uit de linker hartkamer wordt verzameld. Vermijd het draaien of omdraaien van het hart, omdat dit het moeilijk maakt om de precieze positie van de linker hartkamer te bepalen. - Voer euthanasie uit en zorg ervoor met een geschikte methode volgens de richtlijnen van de lokale instellingen. Euthanasie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van cervicale dislocatie en worden bevestigd door het stoppen van de hartslag.
- Centrifugeer bloedmonsters bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vang het supernatans voorzichtig op met behulp van een pipet. Het supernatans moet serum of plasma bevatten, afhankelijk van het type bloedafnamebuisje dat wordt gebruikt. Men kan hier stoppen en de monsters opslaan bij -20 °C tot serumverwerking voor GC-MS-analyse.
OPMERKING: Hemolyse kan mogelijk zijn opgetreden als roodgekleurd supernatans wordt waargenomen. Om hemolyse te voorkomen, moet u het monster vortex voordat de stolling is voltooid. Sommige met rode bloedcellen verrijkte metabolieten, waaronder glutamine en lactaat, kunnen leiden tot verkeerde interpretatie van gegevens, hoewel de meeste metabolieten mogelijk niet significant worden beïnvloed door hemolyse. Het wordt aanbevolen om het serum/plasma binnen een week te analyseren.
3. Metabolietextractie uit serum en chemische derivatisering
- Voorbereiding voor de extractie
OPMERKING: Alle methoden, inclusief metabolietextractie, derivatisering en gegevensanalyse, zijn licht gewijzigde versies van eerder beschreven methoden53,54.- Bereid de extractiebuffer voor door 100 μM-oplossing van DL-norvaline, interne standaard (zie materiaaltabel), toe te voegen aan methanol van MS-kwaliteit.
- Zorg ervoor dat alle experimentele procedures op ijs worden uitgevoerd.
- Breng 10 μL muizenserum geëxtraheerd uit de ader van Sulzer of de linker hartkamer over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 40 μL extractiebuffer.
- Om celresten en eiwitten te verwijderen, vortex u de serummonsters kort, gevolgd door centrifugeren op maximale snelheid (18.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Breng na het centrifugeren voorzichtig 40 μl supernatans over in een glazen injectieflacon, gevolgd door 3 uur drogen in een vacuümcentrifuge bij 4 °C.
NOTITIE: Een glazen inzetstuk (zie Materiaaltabel) wordt aanbevolen in plaats van plastic buizen vanwege plastic-reactieve chemicaliën die tijdens de volgende derivatisatiestap worden gebruikt. - Onderwerp de gedroogde monsters aan twee opeenvolgende derivatisatiestappen voor de GC-MS-analyse van de serummetabolieten.
NOTITIE: De volgende stappen moeten onder een zuurkast worden uitgevoerd vanwege irritatierisico's van de oplosmiddelen.- Resuspendeer de gedroogde serumextracten in 30 μl 10 mg/ml methoxyaminehydrochloride (zie materiaaltabel) opgelost in pyridine en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Derivatiseer monsters voor silylering van metabolieten met 70 μl N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamide (MTBSTFA, zie materiaaltabel) bij 70 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Het gebruik van een glazen spuit wordt aanbevolen in plaats van een plastic punt in de volgende stappen vanwege de derivatisatieoplosmiddelen die reageren met plastic.
4. Metabolomics-analyse met behulp van GC-MS
OPMERKING: Single quadruple GC-MS (zie Tabel met materialen) werd gebruikt om de verschillende serummetabolieten te meten, waaronder koolhydraten, aminozuren en TCA-cyclustussenproducten in afgeleide monsters van de Sulzer-ader en de linker hartkamer. Andere kolommen kunnen ook worden gebruikt, hoewel de experimentele instellingen, inclusief het temperatuurprogramma, kunnen variëren afhankelijk van het type kolommen dat wordt gebruikt.
- Injecteer 1 μL van het afgeleide monster in de GC in splitless modus bij 280 °C (inlaattemperatuur), waarbij helium wordt gebruikt als draaggas met een debiet van 1.500 ml/min (setpoint).
- Stel de quadrupool in op 200 °C met GC-MS interface op 300 °C.
OPMERKING: Het ovenprogramma voor alle metabolietenanalyses begint bij 60 °C, wordt gedurende 1 minuut aangehouden en wordt vervolgens verhoogd met een snelheid van 10 °C/min totdat de temperatuur 320 °C bereikt. - Verzamel gegevens door elektronenionisatie (EI) ingesteld op 70 eV en verkrijg de monstergegevens in scanmodus (50-550 m/z)53. Alle metabolieten die in deze studie werden gebruikt, werden eerder gevalideerd met standaarden om massaspectra en retentietijden te bevestigen.
- Piekgebiedsintegratie uitvoeren met behulp van in de handel verkrijgbare analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Stem de verbindingen af op het production van elk TBMDS-derivaat. Verkrijg vervolgens het extractie-ionenchromatogram (EIC) door de m/z-waarde van het fragmentionen in het overeenkomstige piekgebied te integreren en exporteer het vervolgens. Fragmentionen zijn weergegeven in tabel 1.
OPMERKING: De EIC van elke verbinding werd genormaliseerd door die van DL-norvaline in elk monster. De gegevens worden weergegeven door de ader van Log2 Sulzer naar de linker hartkamer (Log2(SV/LV)) met behulp van elke genormaliseerde EIC-waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert het experimentele schema van BAT-geoptimaliseerde AV-metabolomics. Zoals vermeld in de sectie Protocol, ondergaan muizen temperatuuracclimatisatie met behulp van knaagdierincubators om differentieel gestimuleerd bruin vetweefsel te verkrijgen of krijgen ze farmacologische toediening zoals β-adrenerge receptoragonisten. Vervolgens worden muizen verdoofd en worden bloedmonsters verzameld voor metabolomische analyse (Figuur 1A). Voor bloedafname wordt veneus bloed dat specifiek uit interscapulaire BAT wordt afgevoerd, verzameld via de ader van Sulzer, terwijl arterieel bloed rechtstreeks wordt verzameld uit de linker hartkamer (Figuur 1B).
Figuur 2 geeft de schema's weer van serummetabolomics met behulp van GC-MS (Figuur 2). In het kort wordt de methanoloplossing toegevoegd aan serummonsters, gevolgd door centrifugatie om serumeiwitten te verwijderen. Het supernatans dat de metabolieten bevatte, werd gedroogd in een SpeedVac en de gedroogde monsters werden onderworpen aan tweestapsderivatisering met behulp van methoxyamine (MOX) en MTBSTFA (N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamide). De derivatiseringsstap is gericht op de substitutie van polaire functionele groepen van de metabolieten door TBDMS-ester, waardoor GC-MS-detectie van metabolieten als TBDMS-derivaten mogelijk wordt. De afgeleide monsters werden geanalyseerd met behulp van enkelvoudige viervoudige GC-MS. Metabolieten worden in de kolom gescheiden op basis van hun fysiochemische eigenschappen. Elektronenionisatie (EI) wordt gebruikt om de metabolieten af te breken in unieke fragmentionen die door een massadetector worden gedetecteerd. Identificatie van verbindingen wordt uitgevoerd door de detectie van stofspecifieke fragmentionen. De m/z-waarde en de retentietijd van de stofspecifieke fragmentionen in het experiment zijn weergegeven in de tabel (tabel 1). Een geëxtraheerd ionenchromatogram (EIC) wordt gebruikt om het signaal van een stofspecifiek fragmention te integreren in het piekgebied van de metaboliet, dat de overvloed aan metabolieten definieert.
Om te bepalen of BAT een reeks metabolieten afgeeft of opneemt, kunnen Log2-verhoudingen van ionentellingen tussen de ader van Sulzer en de linkerventrikel (Log2(SV/LV)) worden berekend (Figuur 3). Als de Log2(SV/LV)-waarde voor een bepaalde metaboliet >0 is, geeft dit aan dat de metaboliet overvloediger aanwezig is in de SV dan LV, wat suggereert dat interscapulaire BAT netto de metaboliet vrijgeeft. Omgekeerd, als de Log2(SV/LV)-waarde voor een bepaalde metaboliet <0 is, suggereert dit dat de metaboliet wordt opgenomen door de interscapulaire BBT.
Met behulp van deze benadering werd vastgesteld dat milde koudegestimuleerde BAT significant glucose, lactaat, 3-hydroxybutyraat (3-HB), BCAA's, aspartaat, lysine en tryptofaan verbruikt, terwijl BAT significant succinaat en palmitaat afgeeft (Figuur 3A). De meeste van deze fenomenen werden waargenomen in onze eerdere studies over chronische koude BAT42, wat suggereert dat milde koude BAT metabolisch lijkt op chronische koude BAT, zij het in mindere mate. Om een snel visueel overzicht van de gegevens te geven, wordt een heatmap weergegeven met Log2(SV/LV)-waarden (Figuur 3B). Het is essentieel om de gegevens met de nodige voorzichtigheid te interpreteren, aangezien de heatmap de Z-scores binnen de groep weergeeft.
Figuur 1: Experimenteel schema van voor BBT geoptimaliseerde arterioveneuze (AV) metabolomics. (A) Diagram met de workflow van AV-metabolomics. (1) Om verschillende versies van metabolisch gestimuleerd bruin vetweefsel (BAT) te induceren, worden muizen geacclimatiseerd aan verschillende temperaturen of krijgen ze farmacologische medicijninjecties. (2) Vervolgens worden de arteriële en veneuze bloedmonsters verzameld uit respectievelijk de linker hartkamer en de Sulzer-ader van de muizen. (3) De verkregen serummonsters worden onderworpen aan metabolietextractie, gevolgd door metabolomische analyse. (B) Representatieve beelden die als leidraad dienen voor bloedafnameprocedures. Artereel bloed wordt verzameld uit de linker hartkamer, terwijl veneus bloed wordt verkregen uit de ader van Sulzer, omdat het specifiek bloed uit BAT afvoert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: GC/MS-gebaseerde gerichte metabolomics. Experimenteel schema van GC/MS-gebaseerde gerichte metabolomics. TBDMS: tert-butyldimethylsilyl, EI: elektronenionisatie, EIC: extractie-ionenchromatogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve AV-metabolomicsgegevens. (A) De opname en daaropvolgende afgifte van geselecteerde prevalente en zeer actieve circulerende brandstofmetabolieten door middel van BBT, ingedeeld naar hun respectieve groepen. De gegevens tonen Log2 Sulzer's ader tot linker ventrikel (SV/LV) verhoudingen. Balken die metabolieten met een gemiddelde Log2 (SV/LV) <0 aangeven, zijn rood gekleurd en Log2 (SV/LV) >0 zijn blauw gekleurd. Individuele datapunten vertegenwoordigen elke muis; n = 11. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; aminozuur met vertakte keten; EAA; essentieel aminozuur; NEAA; niet-essentieel aminozuur. (B) Een heatmap die de differentiële overvloed aan metabolieten tussen Sulzer's ader (SV) en linkerventrikel (LV) bloed illustreert. Elke kolom toont een Z-score van gemiddelde waarden binnen de groep; n = 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Verbinding | m/z van fragmentionen | Bewaartermijn | Formular | Formular voor TBDMS-derivaten |
| Pyruvaat | 174.1 | 8.72 | C3H4O3 | C15H33O3NSi2 |
| Aspartaat | 418.2 | 18.45 | C4H7NO4 | C22H49NO4Si3 |
| α-ketoglutaraat | 346.2 | 17.27 | C5H6O5 | C18H37NO5Si2 |
| C16:0 (Palmitaat) | 313.3 | 19.72 | C16H32O2 | C22H46O2Si |
| Lactaat | 261.2 | 11.66 | C3H6O3 | C15H34O3Si2 |
| Leucine | 200.2 | 14 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Isoleucine | 200.2 | 14.34 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2 |
| Valine | 186.2 | 13.53 | C5H11NO2 | C17H39NO2Si2 |
| Alanine | 260.2 | 12.17 | C3H7NO2 | C15H35NO2Si2 |
| Serine | 390.2 | 17.04 | C3H7NO3 | C21H49NO3Si3 |
| Glycine | 218.1 | 12.43 | C2H5NO2 | C14H33NO2Si2 |
| Lysine | 300.2 | 20.48 | C6H14N2O2 | C24H56N2O2Si3 |
| Succinaat | 289.1 | 14.65 | C4H6O4 | C16H34O4Si2 |
| Proline | 258.2 | 14.73 | C5H9NO2 | C17H37NO2Si2 |
| Fenylalanine | 336.2 | 18 | C9H11NO2 | C21H39NO2Si2 |
| Methionine | 320.2 | 16.84 | C5H11NO2S | C17H39NO2SSi2 |
| Cysteïne | 406.2 | 19 | C3H7NO2S | C21H49NO2SSi3 |
| Asparagine | 417.2 | 19.86 | C4H8N2O3 | C22H50N2O3Si3 |
| 3-hydroxybutyraat (3HB) | 275.2 | 12.81 | C4H8O3 | C16H36O3Si2 |
| Tryptofaan | 375.2 | 22.97 | C11H12N2O2 | C23H40N2O2Si2 |
| Malaat | 419.2 | 18.19 | C4H6O5 | C22H48O5Si3 |
| Glutamaat | 432.3 | 19.59 | C5H9NO4 | C23H51NO4Si3 |
| Glutamine | 431.3 | 20.85 | C5H10N2O3 | C23H52N2O3Si3 |
| Citraat | 459.2 | 22.38 | C6H8O7 | C30H64O7Si4 |
| Glucose | 476.3 | 22.7 | C6H12O6 | C30H68O6Si4 |
Tabel 1: GC/MS-fragmentionen die voor integratie worden gebruikt. Deze tabel bevat een lijst van 25 serummetabolieten die in de huidige methode zijn geïdentificeerd, waarbij de retentietijd en fragmentionen overeenkomen met elke verbinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap in het begrijpen van het metabolische potentieel van BAT in de energiebalans van het hele lichaam is om te bepalen welke voedingsstoffen het verbruikt, hoe ze metabolisch worden verwerkt en welke metabolieten in de bloedsomloop vrijkomen. Dit protocol introduceert een gespecialiseerde arterioveneuze bemonsteringstechniek die toegang geeft tot het veneuze vaatstelsel van interscapulaire BAT en systemische arteriële vasculatuur in C57BL/6J-muizen, die onlangs is ontwikkeld en gevalideerd door Park et al42. Hieronder staan de belangrijkste punten waarmee u kritisch rekening moet houden bij het volgen van het protocol.
Voor thermogene stimulatie is het kiezen van het meest geschikte type thermogene stimulatie voor uw experimentele setting een belangrijke overweging. Bijvoorbeeld, bij gebruik van een experimentele groep (vs. controlegroep) en gericht op het waarnemen van verschillen in het metabole aanpassingsvermogen (cruciaal voor het maximale niet-rillende thermogene potentieel) van BAT, is chronische koude-acclimatisatie of β-adrenerge receptorstimulatie (die langer dan 3 dagen tot 4 weken duurt) geschikt 1,45. Wanneer BBT wordt blootgesteld aan acute blootstelling aan koude (enkele uren minder dan 24 uur), metaboliseert BBT zijn intrinsiek opgeslagen brandstoffen in plaats van zich metabolisch aan te passen en communiceert het metabolisch met rillende spieren voor een optimale thermogenese1. Een β-adrenerge receptoragonist vertegenwoordigt een neuronale respons om BAT-thermogenese 1,14 te activeren, en er zijn andere endocriene factoren die het thermogene programma 55,56,57,58,59,60 versterken. Bij het uitvoeren van thermogene stimulatie zoals hierboven vermeld, zou een basiscontrole bij thermoneutraliteit (30 °C) nuttig moeten zijn om te bevestigen of de stimulatie naar behoren werkte.
Zoals vermeld in het protocolgedeelte, is het verkrijgen van arteriovenus bloed van de hoogste kwaliteit de sleutel tot het bepalen van een succesvolle opzet van het experiment. Om dit te bereiken, is het essentieel om hemolyse te voorkomen (zie stap 2.5) en een consistente hoeveelheid bloed te verzamelen om verdunning van de verschillende kenmerken van veneus bloed uit de ader van Sulzer (minder dan 40 μL uit de ader van Sulzer) te voorkomen. Daartoe bevelen de auteurs ten zeerste aan om tijdens de eerste opzet een pilootexperiment uit te voeren voor metabolietmeting met niet alleen bloed uit de ader van Sulzer, maar ook bloed uit niet-BBT-drainerend veneus bloed (bijv. inferieure vena cava). Dit zal helpen bevestigen of het serum van de ader van Sulzer een duidelijke metabolietprofilering vertoont in vergelijking met de niet-BAT veneuze vaten. Met betrekking tot arteriële bloedafname uit de linker hartkamer, is het belangrijk om consequent hetzelfde gebied op de linker hartkamer te doorboren om variaties in cardiokineniveaus te minimaliseren 61,62. Dergelijke variaties kunnen verwarrende resultaten opleveren in arterioveneuze metabolomics of -proteomics.
Chromatografie in combinatie met massaspectrometrie is een van de krachtigste instrumenten voor metabolomics, een methode is GC-MS63. De meting van biologisch relevante metabolieten met behulp van GC-MS werd inderdaad als een uitdaging beschouwd vanwege het dekkingsprobleem; De toepassing van GC-MS is meestal beperkt tot de analyse van metabolieten met zeer vluchtige en niet-polaire eigenschappen, in tegenstelling tot de talrijke polaire metabolieten in weefsels en biologische vloeistoffen. De ontwikkeling van verschillende extractie- en derivatiseringsmethoden, samen met de voordelen van GC-MS, waaronder een uitstekende piekresolutie, reproduceerbaarheid en uitgebreide massaspectrale bibliotheken die een handige piekidentificatie mogelijk maken, heeft echter geleid tot een dergelijk platform als een aantrekkelijke optie voor het analyseren van biologisch relevante metabolieten 64,65.
In dit protocol wordt het GC-MS-platform gebruikt voor de analyse van 25 metabolieten in serum dat is verzameld met behulp van de bovengenoemde techniek. Daartoe werd metabolietextractie uitgevoerd met behulp van 80% methanoloplossing. Houd er rekening mee dat tijdens deze stap het gebruik van bepaalde soorten buizen, waaronder Eppendorf-buizen, wordt aanbevolen om de laagste niveaus van verontreiniging met organische stoffen in de monsters te bereiken. Zorgvuldige scheiding van supernatans van pellets na extractie is ook nodig om eiwitresten uit het serum te verwijderen, wat van cruciaal belang is voor het behoud van de prestaties van MS-ionenbronnen.
De derivatiseringsstap kan worden gediversifieerd op basis van de soorten derivatisaties, waaronder arylderivaten, silylering en acylering66. De auteurs gebruikten tweestapsderivatisatie met N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoroacetamide (MTBSTFA) voor metabolietsialylering, een veelgebruikte methode met het voordeel van stabiele detectie van biologisch relevante polaire metabolieten, waaronder suikers, maar met een nadeel met betrekking tot het incidentele verlies van de N-trimethylsilylgroep van aminen en aminozuren tijdens de analysestap64. Merk op dat monsters vóór de derivatisatiestap volledig moeten worden gedroogd, vanwege de vochtgevoeligheid van de reagentia en derivaten.
Een van de belangrijkste beperkingen van de GC-analyse in het algemeen komt nog steeds neer op het bereik van detecteerbare metabolieten, ondanks de bovengenoemde derivatisatiestappen die de GC-MS-capaciteit met betrekking tot de detectie van polaire metabolieten verbeteren, vooral in vergelijking met op LC-MS gebaseerde analyse. Kwantitatieve metabolomics met behulp van LC-MS kan een grote bijdrage leveren aan het verkrijgen van een beter inzicht in het metabole spectrum van BBT's met betrekking tot systemische metabolietenuitwisseling24,42.
Hoewel de berekening die wordt gebruikt bij de protocolmeting van de metabolietconcentratiegradiënt tussen de arteriële vs. veneus bloed; Log2(SV/LV)-kwantificeert fractionele absorptie en afgifteverandering door BAT, voorzichtigheid is geboden bij de interpretatie van gegevens. Met name voor metabolieten waarvan de fractionele netto uitwisselingswaarde "0" is (bv. citraat, αKG, malaat, methionine, alanine, glutamine) kan het resultaat worden toegeschreven aan ofwel geen opname/afgifte, ofwel aan even actief katabolisme en synthese (waarbij zowel de opname als de afgifte hoog zijn). Om na te gaan welke van de twee mogelijkheden juist is, zijn aanvullende metabole fluxexperimenten nodig waarbij isotopentracering in vivo wordt gebruikt met de opgenomen metaboliet en/of het substraatervan 39.
De beperking van de fractionele berekening is dat het niet het kwantitatieve landschap van de opname en afgifte voor die metabolieten oplevert 42,67. Hoewel de Log2(SV/LV)-waarde bijvoorbeeld een vergelijkbare relatieve netto-opname tussen glucose en 3-hydroxybutyraat (3HB) aangeeft, zou de werkelijke bijdrage van glucose aan de koolstofbronnen veel hoger moeten zijn dan 3-HB vanwege het feit dat de bloedconcentratie van glucose veel hoger is dan die van 3HB, en omdat glucose vier koolstofatomen meer bevat (glucose heeft zes koolstofatomen; 3HB heeft twee koolstofatomen). Indien nodig moet een uitgebreide analyse met aanvullende parameters, zoals de bloedstroomsnelheid, de werkelijke bloedconcentraties van elke metaboliet en hun chemische vergelijkingen, ons informeren over de kwantitatieve bijdragen van de opgenomen/vrijgekomen metabolieten en hun bijdragen aan de totale koolstof- of stikstofflux42,67.
Een groot voordeel van deze geminiaturiseerde methodologie voor arterioveneuze bloedafname en metabolomische analyse op muisniveau is de synergetische combinatie met verschillende genetische modellen om het metabolisme en de fysiologie van bruin vetweefsel te bestuderen (bijv. UCP1-KO, UCP1-Cre-gestuurde BAT-specifieke modellen voor functieverlies, transgene modellen). Recente metabolomische analyses, waarbij slechts sporen van serum nodig zijn voor metabolomische profilering, maken deze aanpak beter haalbaar met kleinere organismen (zie protocol 3)39. Proteomische analyse, die betere inzichten kan opleveren wanneer ze samen met metabolomics worden beschouwd, kan echter grotere hoeveelheden monsters vereisen. In dit opzicht kan conventionele arterioveneuze bemonstering met ratten geschikter zijn. We verwijzen de lezers naar het meest recente protocol voor arterioveneuze bloedafname voor BBT bij ratten, geschreven door Mestres-Arenas en collega's47.
Hoewel het huidige protocol de anesthesieprocedure met isofluraan gebruikt, zoals beschreven in Park et al.42, kan deze benadering een negatieve invloed hebben op het thermogene metabolisme van bruine vetcellen en/of bruin vetweefsel in vivo 68,69,70,71. Daarom rechtvaardigen toekomstige arterioveneuze metabolomics met behulp van pentobarbital onderzoek.
Samengevat biedt dit protocol een fundamentele methodologie voor het meten van BBT-specifieke netto metabole activiteit (consumptie vs. productie) bij verschillende thermogene stimulaties. Dit zou ons waardevolle inzichten moeten geven in de rol van BBT als systemische nutriëntenput en als leverancier door een kwantitatieve inventarisatie te maken van de belangrijkste metabole brandstoffen en uitgescheiden metabolieten. Bovendien kan dit ook nuttig zijn voor het identificeren van voorheen niet bestudeerde metaboliet-afgeleide bruine adipokines, vooral wanneer ze worden bediend met op ontdekking gebaseerde metabolomische platforms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten te melden hebben.
Acknowledgments
We danken alle leden van de laboratoria van Choi en Jung voor de methodologische discussie. Wij danken C. Jang en D. Guertin voor hun advies en feedback. We danken M.S. Choi voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NRF-2022R1C1C1012034 aan S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 aan D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 aan S.M.J. en D.W.C. Dit werk werd ondersteund door Chungnam National University voor W.T.K. Figuur 1 en Figuur 2 zijn gemaakt met behulp van BioRender (http://biorender.com/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
| 1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
| Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
| Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
- Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
- Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
- Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
- Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z.
- Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
- Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
- Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
- Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
- Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
- Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
- Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
- Hui, S., et al.
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
- Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
- Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
- Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
- Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
- Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
- Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
- Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
- Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
- Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
- Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
- Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D.
- Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
- Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
- Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
- Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
- Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
- Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
- Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
- Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
- Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
- Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
- Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
- Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
- Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
- Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
- Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
- Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
- Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
- Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
- Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
- Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
- Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D.
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
- Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
- Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
- Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
- Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
- Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
- Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
- Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).
