Summary
该方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞，促进了后续应用，如RNA分析和细胞培养。它包括详细的细胞解离方法和程序，旨在提高分离细胞的质量和产量。
Abstract
星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统发育、损伤反应和神经退行性疾病中起着关键作用。这些高度动态的细胞表现出对环境变化的快速反应，并在形态、转录谱和功能方面表现出显着的异质性。虽然我们对神经胶质细胞在健康和疾病中的功能的理解已经有了很大的进步，但仍然需要在损伤或损伤的背景下进行 体外细胞特异性分析，以全面表征不同的细胞群。与细胞系或新生动物相比，从成年小鼠中分离细胞具有多项优势，因为它允许在病理条件下和特定时间点分析细胞。此外，专注于脊髓特异性分离（不包括脑部受累）可以研究脊髓病理学，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症。该方案提供了一种从成年小鼠脊髓中分离星形胶质细胞和小胶质细胞的有效方法，有助于立即或将来的分析，并在功能，分子或蛋白质组学下游研究中具有潜在应用。
Introduction
星形胶质细胞和小胶质细胞是多功能神经胶质细胞，在中枢神经系统 （CNS） 中起着至关重要的作用，包括调节神经元功能、促进中枢神经系统发育、维持血脑屏障以及参与其他关键过程等职责 1,2,3,4.除了在维持体内平衡方面的作用外，这些神经胶质细胞在损伤和修复机制中也起着关键作用。小胶质细胞以其吞噬、炎症和损伤后的迁移能力而闻名 5,6,7。疾病中的星形胶质细胞反应同样多种多样，包括炎症、神经胶质瘢痕的形成和血脑屏障的损害 8,9。尽管我们对小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统中的有害和修复作用的理解有所增长，但它们的结构和功能固有的异质性需要强大的工具来研究它们在各种情况下。
进一步了解小胶质细胞和星形胶质细胞在健康和疾病中的作用需要 体内 和 体外 研究的综合方法。 体内 技术利用神经胶质细胞和中枢神经系统内神经元之间错综复杂的串扰，而 体外 方法在评估特定刺激下的单细胞功能或反应时被证明是有价值的。每种方法都有独特的优势; 体外 研究对于了解这些细胞类型的特定作用至关重要，而无需来自邻近细胞的直接或间接输入。此外，利用永生细胞系的 体外 检测具有某些好处，包括无限增殖的能力、成本效益和易于维护。然而，重要的是要注意，与细胞系相比，原代细胞更接近地模仿正常的生理反应。这种生理相关性在功能测定和转录组学分析中至关重要。
获得原代细胞，特别是从成年小鼠脊髓中获取原代细胞的挑战之一在于样本的数量和活力。成人脊髓比大脑小，含有大量的髓鞘，这带来了独特的困难。虽然有几种已发表的方案详细说明了从新生动物或成年小鼠大脑中分离纯、活的神经胶质细胞10,11,12,13，但这些方法可能不适合研究脊髓特异性的疾病和损伤。在该方案中，我们提供了一个全面的程序，可以有效地从成年小鼠脊髓中分离纯、活的小胶质细胞和星形胶质细胞，促进细胞培养和转录组学分析的下游应用。该方案已成功用于从10周至5个月的成年小鼠中分离这些细胞，证明了其在各种情况下的实用性，包括涉及条件敲除小鼠的研究，药物反应，发育研究和年龄相关模型。
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Protocol
所有动物护理和实验程序均在乔治华盛顿大学医学与健康科学学院（美国华盛顿特区;IACUC#2021-004）。该研究利用了10周至5个月的雄性和雌性C57BL / 6J野生型（WT）小鼠，这些小鼠来自商业供应商（见 材料表）并安置在乔治华盛顿大学。协议工作流程的概述如 图 1 所示。
1.脊髓的准备
- 使用Avertin（12.5mg / mL的2,2,2-三溴乙醇和2.5%2-甲基-2-丁醇在无菌水中）麻醉动物（见 材料表）。确认小鼠对脚趾和尾巴捏合没有反应。
- 用冷 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 进行心脏灌注，以去除外周血单核细胞。
- 将动物放在浅托盘上，并做一个侧切口以暴露胸膜腔。将连接到蠕动泵的 23 G 灌注针（参见 材料表）插入左心室并激活泵。一旦冷 DPBS 流经心脏，在右心房创建一个小切口。
注意：在此步骤中首选更快的灌注速率以增强细胞活力。血液应在 1 分钟内冲洗干净。清除肝脏提示灌注成功。
- 将动物放在浅托盘上，并做一个侧切口以暴露胸膜腔。将连接到蠕动泵的 23 G 灌注针（参见 材料表）插入左心室并激活泵。一旦冷 DPBS 流经心脏，在右心房创建一个小切口。
- 用大剪刀将动物斩首并移除脊柱14.将其浸没在含有 Ca2+/Mg2+/0.2% 葡萄糖的冷 1x DPBS 中，放在冰上的培养皿中进行组织冲洗。
- 从现在开始，确保所有步骤都在无菌环境中进行。使用液压挤压14 隔离整个脊髓。使用一根 18 G 针头和一个 10 mL 注射器，注射器中装满含有 Ca2+/Mg2+/0.2% 葡萄糖的冷 1x DPBS。将脊髓转移到放置在冰袋上的培养皿中，冰袋中含有足够的冷 1x DPBS，含 Ca2+/Mg2+/0.2% 葡萄糖以淹没整个组织。
- 在层流罩内的显微镜下小心地去除脑膜。将脊髓转移到冰袋上的空培养皿中，并使用10号刀片手术刀将整个脊髓切成2-3毫米的部分。
2. 酶促细胞解离
- 按照制造商的方案，从市售的成人脑解离试剂盒中加入酶混合物 1 和酶混合物 2（参见 材料表）。将培养皿中的酶旋转数次以确保脊髓的均匀涂层，然后在37°C下孵育30分钟。每 5 分钟轻轻旋转培养皿，以防止组织结块并促进试剂均匀分布。
- 从培养箱中取出培养皿，在最小必需培养基（MEM）中加入350μL0.46mg/mL DNAse I（参见 材料表）。轻轻旋转混合。
- 加入 1 mL 冷 DMEM/0.5% 胎牛血清 （FBS），轻轻旋转混合。立即将全部内容物转移到 5 mL 试管中。
3.机械细胞解离
- 使用 P1000 移液管，轻轻研磨组织三次，确保每次都抽出组织碎片以进一步解离组织。然后，使用塞住的 9 英寸玻璃巴斯德移液管，再轻轻研磨五次，确保在此过程中不会产生气泡。
- 将 5 mL 试管直立放置，让组织在底部沉降 30 秒。组织沉降后，使用 P1000 移液管吸取上清液，并将其通过 30 μm 过滤器放入 15 mL 锥形管中。
- 在相同的 5 mL 试管中加入 1 mL 冷 DMEM/0.5% FBS。使用巴斯德移液管，轻轻研磨三次。
- 让组织在底部沉降 30 秒，然后将上清液通过 30 μm 过滤器并将其收集到与之前相同的 15 mL 管中。再次重复步骤 3.3 和步骤 3.4。
- 在室温（RT）下以300× g 离心过滤的细胞悬浮液10分钟。使用真空吸气器小心地除去并丢弃所得上清液。
4. 髓鞘去除
- 按照制造商的方案，使用成人脑解离试剂盒中提供的碎屑清除溶液 （DRS） 去除髓鞘。去除碎片后，向细胞沉淀中加入 5 mL 冷 DMEM/0.5% FBS，并轻轻倒置试管 3 次。在室温（RT）下以300× g 离心细胞悬液10分钟。
注意：如果细胞将用于 体外 研究并将保留在培养物中，则应使用预热的DMEM / 0.5%FBS。 - 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于 1 mL DPBS/0.5% FBS 中（冷用于 RNA 研究，温用于 体外 测定）。使用台盼蓝对细胞进行计数并评估活力。
注意：来自多种动物的细胞悬液可以组合以增加细胞浓度。 - 通过加入 DPBS/0.5% FBS 洗涤细胞，总体积高达 5 mL。在室温下以300× g 离心悬浮液10分钟，并用移液管弃去上清液。
5.小胶质细胞和星形胶质细胞分离
- 按照制造商的方案用抗CD11b或抗ACSA-2微珠标记细胞（参见 材料表）。
- 根据制造商的说明，使用MS色谱柱通过阳性选择对细胞进行排序（请参阅 材料表）。分选后，将分选的细胞以300× g 离心10分钟，并弃去上清液。
6. 用于 体外 检测的铺板细胞
注意：如果细胞不会被接种并立即用于RNA分析，请继续执行步骤8。
- 将细胞重悬于 1 mL 温热 DMEM/0.5% FBS 中。使用血细胞计数器对细胞进行计数并评估其活力（参见 材料表）。
- 将细胞浓度调节至每 50 μL 75,000 个细胞。 在 24 孔板中向每个 Poly-L-赖氨酸包被的盖玻片11 中加入 50 μL 细胞悬液。
- 在37°C孵育2小时，使细胞粘附在盖玻片上。
- 小心地向每个孔中加入 450 μL 温热的 DMEM/5% FBS/青霉素-链霉素（Pen-Strep，参见 材料表）。
- 3 天后，用 250 μL 温热的 DMEM/5% FBS/Pen-Strep 替换一半的培养基。为了进行维护，每 4-5 天用 500 μL 温热的 DMEM/5% FBS/Pen-Strep 完全更换培养基。
7. 免疫组化
注意：最好在至少 3 天后至少更换一次培养基后进行免疫组化分析。这确保了碎片已被清除，细胞已完全粘附在盖玻片上。
- 在室温（RT）或37°C下取出培养基，并用抗小鼠单克隆抗体O4（1：100）（参见 材料表）在温热的DMEM / 5% FBS / 10%正常山羊血清（NGS）中标记细胞15分钟。
注意：如果细胞不会用O4标记，请跳过此步骤并继续执行步骤7.3。 - 将盖玻片浸入温热的DMEM / 5%FBS中三次，轻轻冲洗盖玻片。在温热的DMEM / 5% FBS / 10%NGS中加入山羊抗小鼠594IgM（1：300）（参见 材料表），并在室温下在黑暗中孵育15分钟。用温热的 DMEM/5% FBS 轻轻冲洗 3 次。
- 用冷的5%乙酸/甲醇在4°C下固定细胞15分钟。 用 1x PBS 洗涤 3 次，然后用适当的抗体标记：抗兔 GFAP （1：500）、抗小鼠 GFAP （1：500） 或抗兔 Iba1 （1：500） 在 1% Triton-X100/10% NGS 的 1x DPBS 中（见 材料表）。在室温下孵育1小时。
注意： 如果盖玻片已经被 O4 染色，请将其放在黑暗中。 - 用 PBS 轻轻冲洗 3 次。用适当的二抗标记：抗小鼠594 IgG（1：500），抗兔488 IgG（1：500）（参见 材料表）。在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
- 用 PBS 轻轻冲洗 3 次。用DAPI（1：1000）在室温下复染1分钟。 用PBS冲洗三次，加入封固剂（参见 材料表），并将盖玻片安装到载玻片上。
8. RNA提取
注意：理想情况下，至少应该有 100,000 个细胞来提取足够的 RNA 进行分析。如有必要，可以合并来自2-3个脊髓的细胞。
- 按照制造商的方案使用市售的RNA分离试剂盒提取RNA（参见 材料表）。对于使用试剂盒中提供的RW1洗涤缓冲液的每个洗涤步骤，将细胞留在洗涤缓冲液中再放置2分钟。
- 根据制造商的说明，使用DNase I去除任何剩余的基因组DNA（参见 材料表）。在室温下与DNase孵育15分钟，然后用RW1缓冲液洗涤。
- 为了提高RNA产量，在洗脱之前，将样品在室温下在无RNA酶的水中孵育10分钟。使用生物分析仪15 评估RNA的完整性和数量（参见 材料表）。
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Representative Results
该协议中概述的方法能够从成年小鼠脊髓中分离纯和活的小胶质细胞和星形胶质细胞，促进各种下游应用，包括 体外 功能或组织学测定和RNA分析。
体 外 研究的成功分离将导致数天的细胞连续增殖。与从新生动物中分离的细胞相比，成体细胞的增殖速度较慢，并且在最初几天可能存在一些碎片。到 体外 4 天 （DIV） 时，细胞应基本清除碎片，大多数细胞粘附在烧瓶底部。星形胶质细胞将开始形成更长的突起，而小胶质细胞将呈现椭圆形和较短的纺锤体（图2）。到7 DIV时，星形胶质细胞应形成连接的汇合层，小胶质细胞应显示更少和更短的过程（图3）。
纯度可以通过用 GFAP 和 O4 双标记 ACSA2 分选的细胞来评估星形胶质细胞培养物中的少突胶质细胞污染，以及用 Iba1 和 GFAP 对 CD11b 分选的细胞来评估小胶质细胞培养物中的星形胶质细胞污染（表 1）。
成功的方案还将产生具有最小降解和足够数量的高质量RNA（图4A）。从分离细胞中提取的RNA电泳图应表现出突出的18S和28S峰。细胞过度解离或灌注和细胞分选之间的时间延长可导致RNA降解（图4B）。酶和/或机械解离不足或髓鞘去除不足可导致细胞产量和RNA降低（图4C）。可以对分离的星形胶质细胞进行测序以识别炎症标志物。将健康的星形胶质细胞与炎症激活的星形胶质细胞（例如，来自实验性自身免疫性脑脊髓炎动物）进行比较，将揭示健康与炎性星形胶质细胞中炎症通路的相对抑制（图4D）。
图 1：脊髓制备、组织解离和细胞分选概述。 该图概述了脊髓制备过程，包括组织解离和细胞分选。脊髓清扫后，组织发生酶解和机械解离。去除髓磷脂，用抗ACSA2或抗CD11b抗体标记细胞，以靶向星形胶质细胞和小胶质细胞。然后，分选的细胞可用于细胞培养和RNA分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2： 体外 4 天 （4DIV） 时星形胶质细胞和小胶质细胞的相差图像。 （A） 描述了具有扩展过程的 ACSA2+ 分选细胞的代表性示例。（B） CD11b+ 细胞呈椭圆形细胞体和短突。比例尺 = 50 μm。该图改编自Ahn， J. J. et al.16。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3： 体外 8 天 （8DIV） 时星形胶质细胞和小胶质细胞的荧光图像。 （A） 用 GFAP（绿色）和 O4（红色）标记的 ACSA2+ 细胞表现出最小的 O4 染色并形成相连的星形胶质细胞汇合层。（B） 用 Iba1（绿色）和 GFAP（红色）标记的 CD11b+ 细胞显示 GFAP 的存在极少。比例尺 = 50 μm。该图改编自Ahn， J. J. et al.16。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：RNA样品的代表性电泳图。 （A） 成功分离细胞后，有望获得高产量、高质量的 RNA。（B） 低产量、低质量 RNA 或 （C） 在细胞死亡、解离不充分或碎片清除不充分的情况下，可能会出现低产量、高质量的 RNA。（D） 对健康星形胶质细胞与炎性星形胶质细胞中选定的炎症途径的 RNA 测序分析显示，与炎性星形胶质细胞相比，分选的健康星形胶质细胞对炎症的相对抑制。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 细胞类型 | 细胞总数 | 排序单元格 | 已排序/总计百分比 | 平均存活率百分比 |
| ACSA2型 | 约6.3×105 | 1.7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b型 | 约6.3×105 | 约8.0×104 | 12.7 | 93 |
表 1：ACSA-2 和 CD11b 细胞分选后的细胞产量、纯度和活力。 此表改编自 Ahn， J. J. et al.16。
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Discussion
分离纯活的原代细胞对于研究特定细胞类型的结构和功能至关重要。在成年小鼠中，特别是在脊髓中，这项任务带来了重大挑战，因为现有的方案通常不是针对成年脊髓量身定制的10,17。该方案提供了一种高效且具有成本效益的方法，适用于各种下游应用，包括细胞培养、流式细胞术、组织学和转录组学研究。
脊髓制备的速度在确保最佳细胞活力和产量方面起着至关重要的作用。虽然在心脏灌注过程中必须有效清除红细胞，但根据心脏灌注和酶解离之间经过的时间，分离的细胞数量可能会有很大差异。我们观察到，在心脏灌注后 10 分钟以上开始组织解离会导致细胞活力降低。此外，酶解离持续时间小于 30 分钟被证明是无效的，留下未消化的组织片段并降低细胞产量。
虽然完全消除机械解离（如研磨或切碎）不会影响细胞活力，但由于存在未消化的组织碎片，它确实导致分离的细胞减少。机械方法与酶解离的结合被证明是细胞分离的最有效方法。然而，值得注意的是，在组织解离过程中不可避免地会发生一定程度的细胞应激，这可能会影响转录组学研究18。这是中枢神经系统组织解离程序的常见挑战19。然而，温和的研磨方法已被证明可以最大限度地减少细胞死亡、外来转录激活和不需要的蛋白水解16。此外，虽然可以通过完全消除机械解离来获得活细胞，但这可能需要使用额外的动物。为了提高可重复性，建议通过轻柔的切碎和研磨来补充酶解离，以最大限度地提高每条脊髓的细胞产量。然而，如果他们的研究靶标对细胞应激高度敏感并且需要最小的解离，研究人员可以选择通过消除研磨或切碎来修改方案。
总之，温和的解离步骤和快速组织制备的整合确保了最佳的细胞产量和活力。通过选择用温培养基代替冷培养基来维持培养细胞，增强了实验方案的灵活性。该方法已针对 10 周龄至至少 5 个月大的动物模型（包括疾病模型）的应用进行了优化。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
我们感谢乔治华盛顿大学基因组学核心的 Castle Raley 进行 RNA 分析，并感谢 Q2 Lab Solutions 的 RNA 测序分析。这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所[资助号F31NS117085]和Vivian Gill研究基金会对Robert H. Miller博士的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
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