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Neuroscience

इन विट्रो परख और ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन के लिए वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया का अलगाव

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65893
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के अलगाव की रूपरेखा तैयार करता है, जिससे आरएनए विश्लेषण और सेल संस्कृति जैसे बाद के अनुप्रयोगों की सुविधा मिलती है। इसमें विस्तृत सेल पृथक्करण विधियों और प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है जो पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता और उपज दोनों को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Abstract

एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास, चोट प्रतिक्रियाओं और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये अत्यधिक गतिशील कोशिकाएं पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए तेजी से प्रतिक्रिया प्रदर्शित करती हैं और आकृति विज्ञान, ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल और कार्यों के संदर्भ में महत्वपूर्ण विविधता प्रदर्शित करती हैं। जबकि स्वास्थ्य और बीमारी में ग्लियल कोशिकाओं के कार्यों के बारे में हमारी समझ काफी हद तक उन्नत हो गई है, इन विट्रो की आवश्यकता बनी हुई है, अपमान या चोटों के संदर्भ में किए गए सेल-विशिष्ट विश्लेषण व्यापक रूप से अलग-अलग सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए। वयस्क माउस से कोशिकाओं को अलग करना सेल लाइनों या नवजात जानवरों पर कई फायदे प्रदान करता है, क्योंकि यह रोग स्थितियों के तहत और विशिष्ट समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी-विशिष्ट अलगाव पर ध्यान केंद्रित करना, मस्तिष्क की भागीदारी को छोड़कर, रीढ़ की हड्डी के विकृति में अनुसंधान को सक्षम बनाता है, जिसमें प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस, रीढ़ की हड्डी की चोट और एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है, कार्यात्मक, आणविक, या प्रोटिओमिक डाउनस्ट्रीम अध्ययनों में संभावित अनुप्रयोगों के साथ तत्काल या भविष्य के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।

Introduction

एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया बहुमुखी ग्लियाल कोशिकाएं हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जिसमें न्यूरोनल फ़ंक्शन को विनियमित करने, सीएनएस विकास में योगदान देने, रक्त-मस्तिष्क बाधा को बनाए रखने और अन्यमहत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में भाग लेने जैसी जिम्मेदारियां शामिल हैं 1,2,3,4 . होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में उनकी भूमिका के अलावा, ये ग्लियल कोशिकाएं चोट और मरम्मत तंत्र में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। माइक्रोग्लिया अपमान या चोटों 5,6,7 के बाद अपने फागोसाइटिक, भड़काऊ और प्रवासी क्षमताओं के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। रोग में एस्ट्रोसाइट प्रतिक्रियाएं समान रूप से विविध हैं, जिसमें सूजन में योगदान, ग्लियल निशान का गठन और रक्त-मस्तिष्क बाधा 8,9 का समझौता शामिल है। यद्यपि सीएनएस में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की हानिकारक और पुनरावर्ती भूमिकाओं की हमारी समझ बढ़ी है, उनकी संरचना और कार्य दोनों में अंतर्निहित विविधता को विभिन्न संदर्भों में उनका अध्ययन करने के लिए मजबूत उपकरणों की आवश्यकता होती है।

स्वास्थ्य और रोग में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की भूमिकाओं में और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इन विवो और इन विट्रो जांच में एक संयुक्त दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। विवो तकनीकों में सीएनएस के भीतर ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच जटिल क्रॉसस्टॉक का लाभ उठाते हैं, जबकि इन विट्रो कार्यप्रणाली विशिष्ट उत्तेजनाओं के तहत एकल-कोशिका कार्यों या प्रतिक्रियाओं का आकलन करते समय मूल्यवान साबित होती है। प्रत्येक विधि अद्वितीय लाभ प्रदान करती है; इन विट्रो अध्ययन पड़ोसी कोशिकाओं से प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष इनपुट के बिना इन सेल प्रकारों की विशिष्ट भूमिकाओं को समझने के लिए आवश्यक हैं। इसके अतिरिक्त, अमर सेल लाइनों का उपयोग करने वाले इन विट्रो परख कुछ लाभ प्रस्तुत करते हैं, जिसमें अनिश्चित काल तक प्रसार करने की क्षमता, लागत-दक्षता और रखरखाव में आसानी शामिल है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक कोशिकाएं सेल लाइनों की तुलना में सामान्य शारीरिक प्रतिक्रियाओं की अधिक बारीकी से नकल करती हैं। यह शारीरिक प्रासंगिकता कार्यात्मक परख और प्रतिलेख विश्लेषण में महत्वपूर्ण है।

प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने में चुनौतियों में से एक, विशेष रूप से वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से, मात्रा और नमूने की व्यवहार्यता में निहित है. वयस्क रीढ़ की हड्डी, मस्तिष्क से छोटी होने और माइलिन की एक महत्वपूर्ण मात्रा से युक्त, अद्वितीय कठिनाइयों का सामना करती है। जबकि नवजात जानवरों या वयस्क माउस मस्तिष्क10,11,12,13से शुद्ध, व्यवहार्य ग्लियल कोशिकाओं के अलगाव का विवरण देने वाले कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं, ये तरीके रीढ़ की हड्डी के लिए विशिष्ट बीमारियों और चोटों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम कुशलतापूर्वक वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध, व्यवहार्य माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रदान करते हैं, सेल संस्कृति और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण में डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को 10 सप्ताह से 5 महीने तक वयस्क चूहों से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है, जो सशर्त नॉकआउट चूहों, दवा प्रतिक्रियाओं, विकासात्मक अनुसंधान और उम्र से संबंधित मॉडल से जुड़े अध्ययनों सहित विभिन्न संदर्भों में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन करता है।

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Protocol

जॉर्ज वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड हेल्थ साइंसेज (वाशिंगटन, डीसी, यूएसए) में पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के बाद सभी पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं आयोजित की गईं; आईएसीयूसी # 2021-004)। अध्ययन में 10 सप्ताह से 5 महीने की आयु के पुरुष और महिला C57BL/6J जंगली-प्रकार (WT) चूहों का उपयोग किया गया, जिन्हें एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता ( सामग्री की तालिकादेखें) से प्राप्त किया गया था और जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में रखा गया था। प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का अवलोकन चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है।

1. रीढ़ की हड्डी की तैयारी

  1. एवर्टिन (बाँझ पानी में 2,2,2-ट्राइब्रोमोथेनॉल और 2.5% 2-मिथाइल-2-ब्यूटेनॉल के 12.5 मिलीग्राम/एमएल) ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके जानवरों को एनेस्थेटाइज करें। चूहों में पैर की अंगुली और पूंछ चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति की पुष्टि करें.
  2. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को हटाने के लिए ठंड 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS) के साथ कार्डियक परफ्यूजन करें।
    1. एक उथले ट्रे पर पशु प्लेस और फुफ्फुस गुहा बेनकाब करने के लिए एक पार्श्व चीरा बनाते हैं. बाएं वेंट्रिकल में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ( सामग्री की तालिकादेखें) से जुड़ा एक 23 जी छिड़काव सुई डालें और पंप को सक्रिय करें। एक बार ठंडा डीपीबीएस दिल से बहता है, दाहिने आलिंद में एक छोटा चीरा बनाएं।
      नोट: सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए इस चरण में एक तेज छिड़काव दर को प्राथमिकता दी जाती है। रक्त को 1 मिनट से कम समय में बाहर निकाल दिया जाना चाहिए। जिगर की समाशोधन सफल छिड़काव इंगित करता है.
  3. बड़े कैंची का उपयोग कर पशु सिर काटना और रीढ़ की हड्डी स्तंभ14 को हटा दें. ऊतक rinsing के लिए बर्फ पर एक पेट्री डिश में Ca2+/Mg2+/0.2% ग्लूकोज के साथ ठंड 1x DPBS में यह जलमग्न.
  4. अब शुरू, सुनिश्चित करें कि सभी कदम एक बाँझ वातावरण में आयोजित किए जाते हैं। हाइड्रोलिक एक्सट्रूज़नका उपयोग करें 14 पूरे रीढ़ की हड्डी को अलग करने के लिए. Ca2+/Mg2+/0.2% ग्लूकोज के साथ ठंडे 1x DPBS से भरा एक 18 ग्राम सुई और एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। रीढ़ की हड्डी को आइस पैक पर रखे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें पूरे ऊतक को जलमग्न करने के लिए सीए2+/एमजी2+/0.2% ग्लूकोज के साथ पर्याप्त ठंडा 1x डीपीबीएस हो।
  5. ध्यान से एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर एक खुर्दबीन के तहत meninges हटा दें. रीढ़ की हड्डी को आइस पैक पर एक खाली पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और नंबर 10 ब्लेड सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करके, पूरे रीढ़ की हड्डी को 2-3 मिमी वर्गों में काट लें।

2. एंजाइमी सेल पृथक्करण

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट से एंजाइम मिक्स 1 और एंजाइम मिक्स 2 जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। रीढ़ की हड्डी की समान कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए डिश में एंजाइमों को कई बार घुमाएं, फिर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट, धीरे ऊतक clumping को रोकने के लिए पकवान भंवर और भी अभिकर्मकों के वितरण की सुविधा.
  2. इनक्यूबेटर से डिश निकालें और न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) में 0.46 मिलीग्राम/एमएल डीएनए I के 350 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। धीरे से घूमकर मिलाएं।
  3. 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 1 एमएल जोड़ें और धीरे घूमता द्वारा मिश्रण करें। तुरंत एक 5 एमएल ट्यूब के लिए पूरी सामग्री हस्तांतरण.

3. यांत्रिक सेल पृथक्करण

  1. एक P1000 विंदुक का प्रयोग, धीरे ऊतक तीन बार triturate, सुनिश्चित करना है कि ऊतक टुकड़े आगे ऊतक अलग करने के लिए हर बार तैयार कर रहे हैं कि. फिर, एक प्लग 9 का उपयोग कर" ग्लास पाश्चर विंदुक, धीरे से पांच बार triturate सुनिश्चित करने के लिए कोई बुलबुले प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं.
  2. 5 एमएल ट्यूब को सीधा रखें और ऊतक को 30 एस के लिए नीचे व्यवस्थित करने की अनुमति दें। एक बार ऊतक बस गया है, एक P1000 विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला आकर्षित और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 30 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से यह पास.
  3. शेष ऊतक के साथ एक ही 5 एमएल ट्यूब के लिए, ठंड डीएमईएम / 0.5% एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें। एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे तीन बार triturate.
  4. ऊतक को 30 एस के लिए तल पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें, फिर 30 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पास करें और इसे पहले की तरह ही 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। दोहराएँ कदम 3.3 और कदम 3.4 एक बार और.
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर फ़िल्टर्ड सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। ध्यान से हटाने और एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग कर परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला त्यागें.

4. माइलिन हटाने

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट में प्रदान किए गए मलबे हटाने के समाधान (डीआरएस) का उपयोग करके माइलिन निकालें। मलबे को हटाने के बाद, सेल गोली में ठंड DMEM/0.5% FBS के 5 एमएल जोड़ें और धीरे ट्यूब तीन बार पलटना. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    नोट: यदि कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो अध्ययन के लिए किया जाएगा और संस्कृति में रहेगा, तो इसके बजाय पूर्व-गर्म डीएमईएम / 0.5% एफबीएस का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DPBS/0.5% FBS (शाही सेना अध्ययन के लिए ठंड और इन विट्रो assays में के लिए गर्म) के 1 एमएल में सेल गोली resuspended . कोशिकाओं की गणना करें और Trypan ब्लू का उपयोग व्यवहार्यता का आकलन.
    नोट: सेल एकाग्रता बढ़ाने के लिए कई जानवरों से सेल निलंबन को जोड़ा जा सकता है।
  3. 5 एमएल की कुल मात्रा तक डीपीबीएस/0.5% एफबीएस जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र और एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.

5. माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट अलगाव

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एंटी-सीडी 11 बी या एंटी-एसीएसए -2 माइक्रोबीड्स के साथ कोशिकाओं को लेबल करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एमएस कॉलम का उपयोग करके सकारात्मक चयन द्वारा कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। छँटाई के बाद, 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.

6. इन विट्रो परख के लिए चढ़ाना कोशिकाओं

नोट: यदि कोशिकाओं चढ़ाया नहीं जाएगा और शाही सेना विश्लेषण के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जाएगा, 8 कदम के लिए आगे बढ़ें.

  1. 0.5% एफबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और हेमासाइटोमीटर का उपयोग करके उनकी व्यवहार्यता का आकलन करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. सेल एकाग्रता को 50 माइक्रोन प्रति 75,000 कोशिकाओं में समायोजित करें। एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक पाली एल लाइसिन लेपित coverslip11 करने के लिए सेल निलंबन के 50 माइक्रोन जोड़ें.
  3. कोशिकाओं coverslip का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. ध्यान से गर्म DMEM/5% FBS/पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप, सामग्री की तालिकादेखें) के 450 माइक्रोन को प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
  5. 3 दिनों के बाद, आधे मीडिया को 250 माइक्रोन गर्म डीएमईएम/5% एफबीएस/पेन-स्ट्रेप से बदलें। रखरखाव के लिए, मीडिया को हर 500-4 दिनों में 500 माइक्रोन गर्म डीएमईएम/5% एफबीएस/पेन-स्ट्रेप से पूरी तरह से बदलें।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: कम से कम 3 दिनों के बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण करना सबसे अच्छा है जब मीडिया को कम से कम एक बार बदल दिया गया हो। यह सुनिश्चित करता है कि मलबे को हटा दिया गया है और कोशिकाओं ने पूरी तरह से कवरस्लिप का पालन किया है।

  1. मीडिया निकालें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए या 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म DMEM/5% FBS/10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) में एंटी-माउस mAb O4 (1:100) ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोशिकाओं को लेबल करें।
    नोट: इस चरण को छोड़ दें और चरण 7.3 पर आगे बढ़ें यदि कोशिकाओं को O4 के साथ लेबल नहीं किया जाएगा।
  2. धीरे उन्हें गर्म DMEM/5% FBS में डुबाया द्वारा coverslips तीन बार कुल्ला. गर्म DMEM/5% FBS/10% NGS में बकरी विरोधी माउस 594 IgM (1: 300) ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और अंधेरे में 15 मिनट के लिए RT पर सेते हैं. 5% FBS में धीरे से तीन बार कुल्ला।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ठंड 5% एसिटिक एसिड / मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, फिर उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ लेबल करें: एंटी-खरगोश GFAP (1: 500), एंटी-माउस GFAP (1: 500), या एंटी-खरगोश Iba1 (1: 500) 1% ट्राइटन-X100/10% NGS में 1x DPBS में ( सामग्री की तालिकादेखें)। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    नोट: अंधेरे में coverslips रखें अगर वे पहले से ही O4 के साथ दाग दिया गया है.
  4. धीरे पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल: एंटी-माउस 594 आईजीजी (1: 500), एंटी-खरगोश 488 आईजीजी (1: 500) ( सामग्री की तालिकादेखें)। अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. धीरे पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. आरटी पर 1 मिनट के लिए DAPI (1: 1000) के साथ काउंटरस्टेन पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला, बढ़ते माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें, और स्लाइड पर कवरस्लिप माउंट करें।

8. आरएनए निष्कर्षण

नोट: आदर्श रूप से, विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए निकालने के लिए कम से कम 100,000 कोशिकाएं होनी चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो 2-3 रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है।

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अलगाव किट का उपयोग करके आरएनए निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें)। किट में प्रदान की RW1 धोने बफर के साथ प्रत्येक धोने कदम के लिए, एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए धोने बफर में कोशिकाओं को छोड़ दें.
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार DNase I का उपयोग करके किसी भी शेष जीनोमिक डीएनए को हटा दें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 15 मिनट के लिए आरटी पर DNase के साथ सेते हैं, तो RW1 बफर के साथ धो लें.
  3. आरएनए उपज बढ़ाने के लिए, क्षालन से पहले, 10 मिनट के लिए आरटी पर आरएनए मुक्त पानी में नमूनों को सेते हैं। एक bioanalyzer15 का उपयोग कर शाही सेना अखंडता और मात्रा का आकलन ( सामग्री की तालिकादेखें).

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरीके वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध और व्यवहार्य माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव को सक्षम करते हैं, जिससे इन विट्रो कार्यात्मक या हिस्टोलॉजिकल परख और आरएनए विश्लेषण सहित विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा मिलती है।

इन विट्रो अध्ययन में के लिए एक सफल अलगाव कई दिनों में निरंतर सेल प्रसार में परिणाम होगा. वयस्क कोशिकाएं नवजात जानवरों से अलग कोशिकाओं की तुलना में धीमी प्रसार दर प्रदर्शित करती हैं, और कुछ मलबे पहले कुछ दिनों में मौजूद हो सकते हैं। इन विट्रो (डीआईवी) में 4 दिनों तक, कोशिकाओं को काफी हद तक मलबे से साफ होना चाहिए, जिसमें अधिकांश कोशिकाएं फ्लास्क तल का पालन करती हैं। एस्ट्रोसाइट्स लंबी प्रक्रियाओं का निर्माण करना शुरू कर देंगे, जबकि माइक्रोग्लिया छोटे स्पिंडल (चित्रा 2) के साथ एक अंडाकार आकार ग्रहण करेगा। 7 डीआईवी द्वारा, एस्ट्रोसाइट्स को एक जुड़ी हुई संगम परत बनानी चाहिए, और माइक्रोग्लिया को कम और छोटी प्रक्रियाओं (चित्रा 3) को प्रदर्शित करना चाहिए।

माइक्रोग्लिया संस्कृतियों (तालिका 1) में एस्ट्रोसाइट संदूषण का मूल्यांकन करने के लिए एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों और आईबीए 1 और जीएफएपी के साथ सीडी 11 बी-सॉर्टेड कोशिकाओं में ऑलिगोडेंड्रोसाइट संदूषण का आकलन करने के लिए जीएफएपी और ओ 4 के साथ एसीएसए 2-सॉर्टेड कोशिकाओं को डबल लेबलिंग करके शुद्धता की पुष्टि की जा सकती है।

एक सफल प्रोटोकॉल भी न्यूनतम गिरावट और पर्याप्त मात्रा (चित्रा 4 ए) के साथ उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना उपज जाएगा. पृथक कोशिकाओं से निकाले गए आरएनए के इलेक्ट्रोफेरोग्राम को प्रमुख 18S और 28S चोटियों का प्रदर्शन करना चाहिए। छिड़काव और सेल छँटाई के बीच कोशिकाओं या लंबे समय तक समय के overdissociation आरएनए गिरावट(चित्रा 4B)के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अपर्याप्त एंजाइमेटिक और/या यांत्रिक पृथक्करण या अपर्याप्त माइलिन हटाने के परिणामस्वरूप सेल उपज और आरएनए(चित्रा 4सी)कम हो सकती है। भड़काऊ मार्करों की पहचान करने के लिए पृथक एस्ट्रोसाइट्स को अनुक्रमित किया जा सकता है। स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स की तुलना सूजन-सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स (उदाहरण के लिए, एक प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस जानवर से) से स्वस्थ बनाम भड़काऊ एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 4डी)में भड़काऊ मार्गों के सापेक्ष अवरोधों को प्रकट करेगा।

Figure 1
चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी की तैयारी, ऊतक पृथक्करण, और सेल छँटाई का अवलोकन। यह आंकड़ा रीढ़ की हड्डी की तैयारी प्रक्रिया का अवलोकन प्रदान करता है, जिसमें ऊतक पृथक्करण और सेल सॉर्टिंग शामिल है। रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन के बाद, ऊतक एंजाइमेटिक और यांत्रिक पृथक्करण से गुजरते हैं। माइलिन को हटा दिया जाता है, और कोशिकाओं को एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को लक्षित करने के लिए एंटी-एसीएसए 2 या एंटी-सीडी 11 बी एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। क्रमबद्ध कोशिकाओं तो सेल संस्कृति और शाही सेना विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो (4DIV) में 4 दिनों में एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की चरण विपरीत छवियां। (ए) विस्तारित प्रक्रियाओं के साथ एसीएसए 2 + सॉर्ट की गई कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि उदाहरण दर्शाता है। (बी) सीडी 11 बी + कोशिकाएं अंडाकार आकार के सेल निकायों और छोटी प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा अहन, जेजे एट अल 16 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो (8DIV) में 8 दिनों में एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की फ्लोरोसेंट छवियां। (ए) एसीएसए 2+ जीएफएपी (हरा) और ओ 4 (लाल) के साथ लेबल वाली कोशिकाएं न्यूनतम ओ 4 धुंधला प्रदर्शित करती हैं और एस्ट्रोसाइट्स की एक जुड़ी हुई संगम परत बनाती हैं। (बी) Iba1 (हरा) और GFAP (लाल) के साथ लेबल वाली CD11b+ कोशिकाएं GFAP की न्यूनतम उपस्थिति दिखाती हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा अहन, जेजे एट अल 16 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आरएनए नमूनों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम। (ए) उच्च उपज, उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए एक सफल सेल अलगाव के बाद की उम्मीद है। (बी) कम उपज, कम गुणवत्ता वाले आरएनए या (सी) कम उपज, उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की उम्मीद कोशिका मृत्यु, अपर्याप्त पृथक्करण, या अपर्याप्त मलबे को हटाने के मामलों में की जा सकती है। (डी) स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स बनाम भड़काऊ एस्ट्रोसाइट्स में चुनिंदा भड़काऊ मार्गों के आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण से भड़काऊ एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में सॉर्ट किए गए स्वस्थ एस्ट्रोसाइट्स में सूजन के सापेक्ष निषेध का पता चलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल प्रकार कुल सेल गिनती सॉर्ट किए गए कक्ष % क्रमबद्ध/कुल औसत% व्यवहार्यता
एसीएसए2 6.3 एक्स 105 1.7 एक्स 105 27 92
सीडी11बी 6.3 एक्स 105 8.0 एक्स 104 12.7 93

तालिका 1: एसीएसए -2 और सीडी 11 बी कोशिकाओं के लिए छँटाई के बाद सेल उपज, शुद्धता और व्यवहार्यता। यह तालिका Ahn, J. J. et al.16 से अनुकूलित है।

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Discussion

शुद्ध, व्यवहार्य प्राथमिक कोशिकाओं का अलगाव विशिष्ट सेल प्रकारों की संरचना और कार्य की जांच के लिए सर्वोपरि है। वयस्क माउस में, विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी में, इस कार्य महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करता है, के रूप में मौजूदा प्रोटोकॉल अक्सर वयस्क रीढ़ की हड्डी10,17 के अनुरूप नहीं हैं. यह प्रोटोकॉल सेल संस्कृति, प्रवाह साइटोमेट्री, ऊतक विज्ञान, और प्रतिलेख अध्ययन सहित विभिन्न बहाव अनुप्रयोगों के लिए लागू एक कुशल और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत करता है।

रीढ़ की हड्डी की तैयारी की गति इष्टतम सेल व्यवहार्यता और उपज सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि कार्डियक परफ्यूजन के दौरान लाल रक्त कोशिकाओं की प्रभावी निकासी प्राप्त करना अनिवार्य है, लेकिन पृथक कोशिकाओं की संख्या कार्डियक परफ्यूजन और एंजाइमेटिक पृथक्करण के बीच बीतने वाले समय के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न हो सकती है। हमने देखा कि कार्डियक परफ्यूजन के बाद 10 मिनट से अधिक ऊतक पृथक्करण शुरू करने से सेल व्यवहार्यता कम हो गई। इसके अतिरिक्त, 30 मिनट से कम की एंजाइमेटिक पृथक्करण अवधि अप्रभावी साबित हुई, जिससे अपचित ऊतक के टुकड़े निकल गए और सेल उपज कम हो गई।

हालांकि यांत्रिक पृथक्करण (जैसे ट्रिट्यूरेटिंग या चॉपिंग) का पूर्ण उन्मूलन सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता था, इसके परिणामस्वरूप अवांछित ऊतक टुकड़ों की उपस्थिति के कारण कम कोशिकाओं को अलग किया जाता था। एंजाइमी पृथक्करण के साथ यांत्रिक तरीकों का एक संयोजन सेल अलगाव के लिए सबसे प्रभावी दृष्टिकोण साबित हुआ। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि सेलुलर तनाव के कुछ स्तर अनिवार्य रूप से ऊतक पृथक्करण के दौरान होता है, संभावित रूप से ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन18 को प्रभावित करता है। यह सीएनएस ऊतक पृथक्करण प्रक्रियाओं19 के साथ एक आम चुनौती है. फिर भी, कोमल विचूर्णन तरीकों कोशिका मृत्यु, बाहरी प्रतिलेख सक्रियण, और अवांछित प्रोटियोलिसिस16 को कम करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, हालांकि व्यवहार्य कोशिकाओं को पूरी तरह से यांत्रिक पृथक्करण को समाप्त करके प्राप्त किया जा सकता है, इससे अतिरिक्त जानवरों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। प्रजनन क्षमता के लिए, रीढ़ की हड्डी प्रति सेल उपज को अधिकतम करने के लिए कोमल चॉपिंग और विचूर्णन के साथ एंजाइमेटिक पृथक्करण को पूरक करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, शोधकर्ता विचूर्णन या चॉपिंग को समाप्त करके प्रोटोकॉल को संशोधित करना चुन सकते हैं यदि उनके अध्ययन के लक्ष्य सेलुलर तनाव के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं और न्यूनतम पृथक्करण की आवश्यकता होती है।

सारांश में, कोमल पृथक्करण चरणों और शीघ्र ऊतक तैयारी का एकीकरण इष्टतम सेल उपज और व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है। प्रोटोकॉल लचीलापन संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए गर्म मीडिया के साथ ठंड मीडिया को बदलने के विकल्प द्वारा बढ़ाया जाता है. इस पद्धति को रोग मॉडल सहित 10 सप्ताह से लेकर कम से कम 5 महीने पुराने पशु मॉडल में आवेदन के लिए अनुकूलित किया गया है।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

हम आरएनए विश्लेषण के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय जीनोमिक्स कोर में कैसल रैले और आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए क्यू 2 लैब समाधान का धन्यवाद करते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक [अनुदान संख्या F31NS117085] और विवियन गिल रिसर्च एंडोमेंट द्वारा डॉ रॉबर्ट एच मिलर को समर्थित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol Sigma Aldrich T48402
24 well tissue culture plate Avantor 10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98% Thermo Fisher A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride Invitrogen D1306 1:1000
45% glucose solution Corning 25-037-CI
5 mL capped tubes Eppendorf 30122305
Acetic acid Sigma-Adlrich A6283
Adult Brain Dissociation Kit Miltenyi 103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit Miltenyi 130-097-679
Anti-Iba1 Wako 019-1974
Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice  Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads Miltenyi 130-093-634
Celltrics 30 µm filter Sysmex Partec 04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer) Hausser Scientific Co 3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich D4527-40KU
Distilled water TMO 15230001
DMEM/F12 Thermo Fisher 11320074
DNase for RNA purification Qiagen 79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline Thermo Fisher 14040117
Fetal bovine serum Thermo Fisher A5209401
GFAP antibody (mouse) Santa Cruz sc-33673 1:500
GFAP antibody (rabbit) Dako Z0334 1:500
Goat anti-mouse 594 IgG Invitrogen a11032 1:500
Goat anti-mouse 594 IgM Invitrogen a21044 1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG Invitrogen a11008 1:500
Iba1 antibody (rabbit) Wako 019-1974 1:500
MACS Separator Miltenyi 130-042-303
Masterflex C/L Pump System Thermo Fisher 77122-22
MEM Corning 15-015-CV
Methanol Sigma-Adlrich 439193
Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
MS Columns Miltenyi 130-042-401
O4 Antibody R&D MAB1326
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette VWR 14672-412
RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 Fisher scientific 22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm Kawasumi D3K2-23G

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References

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Ahn, J. J., Miller, R. H., Islam, Y. Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies. J. Vis. Exp. (200), e65893, doi:10.3791/65893 (2023).

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