Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.
Abstract
אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.
Introduction
אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות 5,6,7. תגובות אסטרוציטים במחלות מגוונות באותה מידה, וכוללות תרומות לדלקת, להיווצרות צלקות גלייה ולפשרה של מחסום הדם-מוח 8,9. למרות שהבנתנו את התפקידים המזיקים והמשניים של מיקרוגליה ואסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית גדלה, ההטרוגניות המובנית הן במבנה והן בתפקוד שלהם מחייבת כלים חזקים לחקור אותם בהקשרים שונים.
השגת תובנה נוספת לגבי תפקידם של מיקרוגליה ואסטרוציטים בבריאות ובמחלות דורשת גישה משולבת של חקירות in vivo ו - in vitro . טכניקות In vivo ממנפות את האינטראקציה המורכבת בין תאי גלייה ונוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית, בעוד שמתודולוגיות in vitro מוכיחות ערך בעת הערכת תפקודים או תגובות של תא בודד תחת גירויים ספציפיים. כל שיטה מציעה יתרונות ייחודיים; מחקרי מבחנה חיוניים להבנת התפקידים הספציפיים של סוגי תאים אלה ללא קלט ישיר או עקיף מתאים שכנים. בנוסף, בדיקות במבחנה המשתמשות בקווי תאים בני אלמוות מציגות יתרונות מסוימים, כולל היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן, יעילות כלכלית וקלות תחזוקה. עם זאת, חשוב לציין כי תאים ראשוניים מחקים באופן הדוק יותר תגובות פיזיולוגיות נורמליות בהשוואה לקווי תאים. רלוונטיות פיזיולוגית זו חיונית בבדיקות תפקודיות ובניתוחים תעתיקים.
אחד האתגרים בהשגת תאים ראשוניים, במיוחד מחוט השדרה של עכבר בוגר, טמון בכמות ובכדאיות הדגימות. חוט השדרה הבוגר, בהיותו קטן יותר מהמוח ומכיל כמות משמעותית של מיאלין, מציב קשיים ייחודיים. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו המפרטים את הבידוד של תאי גלייה טהורים וברי קיימא מבעלי חיים בילודים או ממוח העכבר הבוגר 10,11,12,13, מתודולוגיות אלה עשויות שלא להתאים לחקר מחלות ופציעות ספציפיות לחוט השדרה. בפרוטוקול זה, אנו מציעים הליך מקיף לבידוד יעיל של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, מה שמקל על יישומים במורד הזרם בתרביות תאים ובניתוחי שעתוק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבידוד תאים אלה מעכברים בוגרים בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, והדגים את יעילותו בהקשרים שונים, כולל מחקרים שכללו עכברי נוקאאוט מותנה, תגובות לתרופות, מחקר התפתחותי ומודלים הקשורים לגיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הטיפול בבעלי חיים והניסויים נערכו לאחר אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (וושינגטון הבירה, ארה"ב; IACUC #2021-004). המחקר כלל עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6J (WT) בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, שמקורם בספק מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. סקירה כללית של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הכנת חוט השדרה
- מרדימים את בעלי החיים באמצעות אברטין (12.5 מ"ג/מ"ל של 2,2,2-טריברומואתנול ו-2.5% 2-מתיל-2-בוטנול במים סטריליים) (ראו טבלת חומרים). אשר את היעדר התגובה לצביטות בבוהן ובזנב בעכברים.
- בצע זילוח לב עם מי מלח חוצצים פוספט (DPBS) קר 1x Dulbecco כדי להסיר תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם.
- מניחים את החיה על מגש רדוד ולבצע חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל pleural. הכנס מחט זילוח 23 G המחוברת למשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי והפעל את המשאבה. ברגע DPBS קר זורם דרך הלב, ליצור חתך קטן באטריום הימני.
הערה: קצב זילוח מהיר יותר עדיף בשלב זה כדי לשפר את כדאיות התא. יש לשטוף את הדם תוך פחות מדקה. ניקוי הכבד מצביע על זילוח מוצלח.
- מניחים את החיה על מגש רדוד ולבצע חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל pleural. הכנס מחט זילוח 23 G המחוברת למשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי והפעל את המשאבה. ברגע DPBS קר זורם דרך הלב, ליצור חתך קטן באטריום הימני.
- ערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות מספריים גדולים והסירו את עמוד השדרה14. טבלו אותו ב-DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז בצלחת פטרי על קרח לשטיפת רקמות.
- החל מעכשיו, ודא שכל השלבים מתבצעים בסביבה סטרילית. השתמש בשחול הידראולי14 כדי לבודד את חוט השדרה כולו. השתמש במחט 18 גרם ומזרק 10 מ"ל מלא DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז. העבירו את חוט השדרה לצלוחית פטרי המונחת על שקיות קרח המכילות מספיק DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז כדי לטבול את הרקמה כולה.
- בזהירות להסיר את קרומי המוח תחת מיקרוסקופ בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. מעבירים את חוט השדרה לצלחת פטרי ריקה על חבילות קרח, ובאמצעות אזמל כירורגי מס '10 להב, חותכים את חוט השדרה כולו למקטעים של 2-3 מ"מ.
2. דיסוציאציה אנזימטית של תאים
- הוסף תערובת אנזימים 1 ותערובת אנזימים 2 מערכת הדיסוציאציה המוחית למבוגרים הזמינה באופן מסחרי בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). מערבלים את האנזימים בצלחת מספר פעמים כדי להבטיח ציפוי אחיד של חוט השדרה, ואז דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. כל 5 דקות, מערבלים בעדינות את המנה כדי למנוע גושי רקמות ולהקל על הפצה אחידה של ריאגנטים.
- מוציאים את הצלוחית מהאינקובטור ומוסיפים 350 μL של 0.46 מ"ג/מ"ל DNAse I ב-Minimal Essential Medium (MEM) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.
- יש להוסיף 1 מ"ל של DMEM קר/סרום בקר עוברי 0.5% (FBS) ולערבב בעדינות. מיד להעביר את התוכן כולו לצינור 5 מ"ל.
3. דיסוציאציה מכנית של תאים
- באמצעות פיפטה P1000, Triturate בעדינות את הרקמה שלוש פעמים, להבטיח כי חתיכות רקמה נמשכים בכל פעם כדי לנתק עוד יותר את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית 9 אינץ' מחוברת, טרטור בעדינות חמש פעמים נוספות, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות במהלך התהליך.
- מניחים את הצינור 5 מ"ל זקוף ומאפשרים לרקמה להתיישב בתחתית במשך 30 שניות. לאחר שהרקמה התיישבה, ציירו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 והעבירו אותו דרך מסנן של 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
- לאותו צינור 5 מ"ל עם הרקמה הנותרת, הוסף 1 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS. בעזרת פיפטה של פסטר, טריטורט בעדינות שלוש פעמים.
- תנו לרקמה לשקוע בתחתית למשך 30 שניות, ואז העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 30 מיקרומטר ואספו אותו לאותו צינור של 15 מ"ל כמו קודם. חזור על שלב 3.3 ושלב 3.4 פעם נוספת.
- צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant שנוצר באמצעות שואב ואקום.
4. הסרת מיאלין
- הסר את המיאלין באמצעות הפתרון להסרת פסולת (DRS) המסופק בערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הסרת הפסולת, הוסף 5 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS לגלולת התא והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: אם התאים ישמשו למחקרי מבחנה ויישארו בתרבית, יש להשתמש במקום זאת ב- DMEM / 0.5% FBS שחומם מראש. - יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של DPBS/0.5% FBS (קר למחקרי RNA וחם לבדיקות במבחנה ). ספרו את התאים והעריכו את הכדאיות באמצעות Trypan Blue.
הערה: ניתן לשלב תרחיפים של תאים מבעלי חיים מרובים כדי להגדיל את ריכוז התאים. - שטף את התאים על-ידי הוספת DPBS/0.5% FBS עד לנפח כולל של 5 מ"ל. צנטריפוגו את המתלים ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.
5. בידוד מיקרוגליה ואסטרוציטים
- תייג את התאים עם מיקרו-כדוריות אנטי-CD11b או אנטי-ACSA-2 בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
- מיין את התאים לפי בחירה חיובית באמצעות עמודות MS בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר המיון, צנטריפוגו את התאים הממוינים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.
6. ציפוי תאים לבדיקות חוץ גופיות
הערה: אם התאים לא יהיו מצופים וישמשו באופן מיידי לניתוח RNA, המשך לשלב 8.
- להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של DMEM חם / 0.5% FBS. ספרו את התאים והעריכו את יכולת הקיום שלהם באמצעות המציטומטר (ראו טבלת חומרים).
- כוונן את ריכוז התא ל- 75,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל כיסוי מצופה פולי-L-ליזין11 בצלחת של 24 בארות.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.
- יש להוסיף בזהירות 450 μL של DMEM חם/5% FBS/פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep, ראו טבלת חומרים) לכל באר.
- לאחר 3 ימים, החלף מחצית מהמדיה ב- 250 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep. לתחזוקה, החלף לחלוטין את המדיה עם 500 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep כל 4-5 ימים.
7. אימונוהיסטוכימיה
הערה: עדיף לבצע ניתוחים אימונוהיסטוכימיים לאחר 3 ימים לפחות כאשר המדיה הוחלפה לפחות פעם אחת. זה מבטיח שהפסולת הוסרה והתאים נדבקו לחלוטין לכיסוי.
- הסר את המדיה ותייג את התאים עם mAb O4 נגד עכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים) בסרום DMEM חם/5% FBS/10% רגיל של עזים (NGS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או ב-37°C.
הערה: דלג על שלב זה והמשך לשלב 7.3 אם התאים לא יסומנו ב- O4. - שטפו בעדינות את הכיסויים על ידי טבילתם ב-DMEM/5% FBS חם שלוש פעמים. הוסף עז נגד עכבר 594 IgM (1: 300) (ראה רשימת חומרים) ב- DMEM חם / 5% FBS / 10% NGS ודגור ב- RT במשך 15 דקות בחושך. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים ב-DMEM חם/FBS 5%.
- תקן את התאים עם 5% חומצה אצטית / מתנול קר במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתייג עם הנוגדן המתאים: GFAP נגד ארנבים (1: 500), GFAP נגד עכבר (1: 500), או נגד ארנב Iba1 (1: 500) ב 1% Triton-X100/10% NGS ב 1x DPBS (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
הערה: יש לשמור את הכיסויים בחושך אם הם כבר הוכתמו ב-O4. - יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. תווית עם הנוגדן המשני המתאים: נגד עכבר 594 IgG (1: 500), נגד ארנב 488 IgG (1: 500) (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.
- יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. כתם נגדי עם DAPI (1:1000) למשך דקה אחת ב-RT. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) ולהרכיב כיסויים על שקופיות.
8. מיצוי RNA
הערה: באופן אידיאלי, צריכים להיות לפחות 100,000 תאים כדי לחלץ מספיק RNA לניתוח. במידת הצורך, ניתן לשלב תאים מ 2-3 חוטי שדרה.
- חלץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור כל שלב שטיפה עם חיץ הכביסה RW1 המסופק בערכה, השאירו את התאים במאגר הכביסה למשך 2 דקות נוספות.
- הסר את כל הדנ"א הגנומי שנותר באמצעות DNase I בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). יש לדגור עם DNase ב-RT למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם חיץ RW1.
- כדי להגדיל את תפוקת הרנ"א, לפני ההדבקה, יש לדגור על הדגימות במים נטולי RNAse ב-RT למשך 10 דקות. להעריך את שלמות הרנ"א ואת כמותו, באמצעות ביואנלייזר15 (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בידוד של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקלות על יישומים שונים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות או היסטולוגיות במבחנה וניתוח RNA.
בידוד מוצלח למחקרי מבחנה יביא להתרבות תאים רציפה במשך מספר ימים. תאים בוגרים מציגים קצב התרבות איטי יותר בהשוואה לתאים שבודדו מבעלי חיים בילודים, וחלק מהפסולת עשויה להיות נוכחת בימים הראשונים. לאחר 4 ימים במבחנה (DIV), התאים צריכים להיות נקיים במידה רבה מפסולת, כאשר רוב התאים נצמדים לתחתית הבקבוק. אסטרוציטים יתחילו ליצור תהליכים ארוכים יותר, בעוד שתאי מיקרוגליה יקבלו צורה אליפסה עם צירים קצרים יותר (איור 2). עד 7 DIV, אסטרוציטים אמורים ליצור שכבה קונפלואנטית מחוברת, ותאי מיקרוגליה אמורים להציג פחות תהליכים קצרים יותר ויותר (איור 3).
ניתן לאשר טוהר על ידי תיוג כפול של תאים ממוינים ACSA2 עם GFAP ו-O4 כדי להעריך זיהום אוליגודנדרוציטים בתרביות אסטרוציטים ותאים ממוינים CD11b עם Iba1 ו-GFAP כדי להעריך זיהום אסטרוציטים בתרביות מיקרוגליה (טבלה 1).
פרוטוקול מוצלח גם יניב רנ"א באיכות גבוהה עם פירוק מינימלי וכמות מספקת (איור 4A). אלקטרופרוגרמות של RNA המופקות מתאים מבודדים צריכות להציג פסגות בולטות של 18S ו-28S. דיסוציאציה מוגזמת של תאים או זמן ממושך בין זילוח למיון תאים יכולים להוביל לפירוק רנ"א (איור 4B). דיסוציאציה אנזימטית ו/או מכנית לא מספקת או הסרת מיאלין לא מספקת יכולים לגרום לירידה בתפוקת התאים וברנ"א (איור 4C). ניתן לרצף אסטרוציטים מבודדים כדי לזהות סמנים דלקתיים. השוואת אסטרוציטים בריאים לאסטרוציטים המופעלים על ידי דלקת (למשל, מחיה אוטואימונית ניסיונית של אנצפלומיאליטיס) תחשוף עכבות יחסיות של מסלולים דלקתיים באסטרוציטים בריאים לעומת דלקתיים (איור 4D).
איור 1: סקירה כללית של הכנת חוט השדרה, דיסוציאציה של רקמות ומיון תאים. האיור מספק סקירה כללית של תהליך הכנת חוט השדרה, כולל דיסוציאציה של רקמות ומיון תאים. לאחר דיסקציה של חוט השדרה, רקמות עוברות דיסוציאציה אנזימטית ומכנית. המיאלין מוסר, והתאים מסומנים בנוגדנים נגד ACSA2 או CD11b כדי להתמקד באסטרוציטים ובמיקרוגליה. לאחר מכן ניתן להשתמש בתאים הממוינים לתרבית תאים ולניתוח רנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות ניגודיות פאזה של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה במבחנה של 4 ימים (4DIV). (A) מציג דוגמה מייצגת של תאים ממוינים ACSA2+ עם תהליכים מורחבים. (B) תאי CD11b+ מציגים גופי תאים בצורת אליפסה ותהליכים קצרים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה נלקח מ Ahn, J. J. et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות פלואורסצנטיות של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה לאחר 8 ימים במבחנה (8DIV). (A) תאי ACSA2+ המסומנים ב-GFAP (ירוק) ו-O4 (אדום) מציגים צביעת O4 מינימלית ויוצרים שכבה מחוברת של אסטרוציטים. (B) תאי CD11b+ המסומנים ב-Iba1 (ירוק) וב-GFAP (אדום) מראים נוכחות מינימלית של GFAP. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה נלקח מ Ahn, J. J. et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אלקטרופרוגרמות מייצגות של דגימות רנ"א. (A) RNA איכותי בעל תפוקה גבוהה צפוי לאחר בידוד תאים מוצלח. (B) RNA באיכות נמוכה או (C) בעל תפוקה נמוכה, RNA באיכות גבוהה עשוי להיות צפוי במקרים של מוות תאי, דיסוציאציה לא מספקת, או פינוי פסולת לא מספק. (D) ניתוח ריצוף RNA של מסלולים דלקתיים נבחרים באסטרוציטים בריאים לעומת אסטרוציטים דלקתיים מגלה עיכוב יחסי של דלקת באסטרוציטים בריאים ממוינים בהשוואה לאסטרוציטים דלקתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| סוג תא | ספירת תאים כוללת | תאים ממוינים | % ממוין/סה"כ | כדאיות ממוצעת באחוזים |
| ACSA2 | 6.3 x 105 | 1.7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6.3 x 105 | 8.0 x 104 | 12.7 | 93 |
טבלה 1: תפוקת תאים, טוהר וכדאיות לאחר מיון עבור תאי ACSA-2 ו- CD11b. טבלה זו לקוחה מתוך Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר10,17. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה וחסכונית הישימה ליישומים שונים במורד הזרם, כולל תרבית תאים, ציטומטריית זרימה, היסטולוגיה ומחקרי שעתוק.
מהירות הכנת חוט השדרה ממלאת תפקיד מכריע בהבטחת כדאיות תאים אופטימלית ותפוקה. אמנם הכרחי להשיג פינוי יעיל של תאי דם אדומים במהלך זילוח לב, אך מספר התאים המבודדים יכול להשתנות במידה רבה בהתבסס על הזמן שחלף בין זילוח הלב לדיסוציאציה אנזימטית. ראינו כי התחלת דיסוציאציה של רקמות יותר מ-10 דקות לאחר זילוח הלב הובילה לירידה בכדאיות התאים. בנוסף, משך דיסוציאציה אנזימטית של פחות מ-30 דקות הוכח כלא יעיל, הותיר שברי רקמות לא מעוכלות והפחית את תפוקת התאים.
אף על פי שחיסול מוחלט של דיסוציאציה מכנית (כגון טריטוציה או קיצוץ) לא השפיע על יכולת הקיום של התא, הוא הביא לפחות תאים שבודדו בשל נוכחותם של שברי רקמות לא מעוכלים. שילוב של שיטות מכניות עם דיסוציאציה אנזימטית הוכיח את עצמו כגישה היעילה ביותר לבידוד תאים. עם זאת, ראוי לציין כי רמה מסוימת של מתח תאי מתרחשת באופן בלתי נמנע במהלך דיסוציאציה של רקמות, מה שעלול להשפיע על מחקרי שעתוק18. זהו אתגר נפוץ עם הליכי דיסוציאציה של רקמת CNS19. אף על פי כן, שיטות טריטורציה עדינות הוכחו כממזערות מוות תאי, הפעלת תעתיק חיצוני ופרוטאוליזה לא רצויה16. יתר על כן, למרות שניתן להשיג תאים בני קיימא על ידי ביטול הדיסוציאציה המכנית לחלוטין, הדבר עשוי לדרוש שימוש בבעלי חיים נוספים. למען יכולת השחזור, מומלץ להשלים דיסוציאציה אנזימטית עם קיצוץ וטריטורציה עדינים כדי למקסם את תפוקת התאים לכל חוט שדרה. עם זאת, חוקרים עשויים לבחור לשנות את הפרוטוקול על ידי ביטול טריטורציה או קיצוץ אם מטרות המחקר שלהם רגישות מאוד לעקה תאית ודורשות דיסוציאציה מינימלית.
לסיכום, שילוב של שלבי דיסוציאציה עדינים והכנת רקמות מהירה מבטיח תפוקת תאים אופטימלית וכדאיות. גמישות הפרוטוקול משופרת על ידי האפשרות להחליף מדיה קרה במדיה חמה לשמירה על תאים בתרבית. מתודולוגיה זו הותאמה ליישום במודלים של בעלי חיים החל מגיל 10 שבועות ועד גיל 5 חודשים לפחות, כולל מודלים של מחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
אנו מודים לקאסל ראלי ב-George Washington University Genomics Core עבור ניתוחי RNA ול-Q2 Lab Solutions עבור ניתוחי ריצוף RNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי [מענק מספר F31NS117085] וקרן המחקר ע"ש ויויאן גיל לד"ר רוברט ה. מילר. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
