Summary
Denne protokol skitserer isoleringen af oprensede astrocytter og mikroglia fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter efterfølgende anvendelser såsom RNA-analyse og cellekultur. Det omfatter detaljerede celledissociationsmetoder og procedurer designet til at forbedre både kvaliteten og udbyttet af isolerede celler.
Abstract
Astrocytter og mikroglia spiller afgørende roller i udviklingen af centralnervesystemet, skaderesponser og neurodegenerative sygdomme. Disse meget dynamiske celler udviser hurtige reaktioner på miljøændringer og viser betydelig heterogenitet med hensyn til morfologi, transkriptionsprofiler og funktioner. Mens vores forståelse af gliacellernes funktioner i sundhed og sygdom er avanceret betydeligt, er der stadig behov for in vitro, cellespecifikke analyser udført i forbindelse med fornærmelser eller skader for omfattende at karakterisere forskellige cellepopulationer. Isolering af celler fra den voksne mus giver flere fordele i forhold til cellelinjer eller neonatale dyr, da det giver mulighed for analyse af celler under patologiske forhold og på bestemte tidspunkter. Desuden muliggør fokus på rygmarvsspecifik isolation, eksklusive hjerneinvolvering, forskning i rygmarvspatologier, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, rygmarvsskade og amyotrofisk lateral sklerose. Denne protokol præsenterer en effektiv metode til isolering af astrocytter og mikroglia fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter øjeblikkelig eller fremtidig analyse med potentielle anvendelser i funktionelle, molekylære eller proteomiske nedstrømsundersøgelser.
Introduction
Astrocytter og mikroglia er alsidige gliaceller, der spiller vitale roller i centralnervesystemet (CNS), der omfatter ansvar såsom regulering af neuronal funktion, bidrager til CNS-udvikling, opretholder blod-hjerne-barrieren og deltager i andre kritiske processer 1,2,3,4 . Udover deres rolle i at opretholde homeostase spiller disse gliaceller også en afgørende rolle i skade- og reparationsmekanismer. Microglia er kendt for deres fagocytiske, inflammatoriske og vandrende evner efter fornærmelser eller skader 5,6,7. Astrocytresponser i sygdom er lige så forskellige og omfatter bidrag til betændelse, dannelse af glia-ar og kompromiset mellem blod-hjerne-barrieren 8,9. Selvom vores forståelse af mikroglia og astrocytters skadelige og reparerende roller i CNS er vokset, kræver den iboende heterogenitet i både deres struktur og funktion robuste værktøjer til at studere dem i forskellige sammenhænge.
For at få yderligere indsigt i mikroglia og astrocytters rolle i sundhed og sygdom kræves en kombineret tilgang til in vivo - og in vitro-undersøgelser . In vivo-teknikker udnytter den indviklede krydstale mellem gliaceller og neuroner i CNS, mens in vitro-metoder viser sig værdifulde ved vurdering af enkeltcellefunktioner eller reaktioner under specifikke stimuli. Hver metode giver unikke fordele; In vitro-undersøgelser er afgørende for at forstå disse celletypers specifikke roller uden direkte eller indirekte input fra naboceller. Derudover giver in vitro-assays ved hjælp af udødelige cellelinjer visse fordele, herunder evnen til at sprede sig på ubestemt tid, omkostningseffektivitet og nem vedligeholdelse. Det er dog vigtigt at bemærke, at primære celler i højere grad efterligner normale fysiologiske reaktioner sammenlignet med cellelinjer. Denne fysiologiske relevans er afgørende i funktionelle assays og transkriptomiske analyser.
En af udfordringerne ved at opnå primære celler, især fra rygmarven hos voksne mus, ligger i mængden og levedygtigheden af prøverne. Den voksne rygmarv, der er mindre end hjernen og indeholder en betydelig mængde myelin, udgør unikke vanskeligheder. Mens der er flere offentliggjorte protokoller, der beskriver isoleringen af rene, levedygtige gliaceller fra neonatale dyr eller den voksne musehjerne 10,11,12,13, er disse metoder muligvis ikke egnede til at studere sygdomme og skader, der er specifikke for rygmarven. I denne protokol tilbyder vi en omfattende procedure til effektivt at isolere rene, levedygtige mikroglia og astrocytter fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter downstream-applikationer i cellekultur og transkriptomiske analyser. Denne protokol er med succes blevet anvendt til at isolere disse celler fra voksne mus i alderen 10 uger til 5 måneder, hvilket demonstrerer dens anvendelighed på tværs af forskellige sammenhænge, herunder undersøgelser, der involverer betingede knockout-mus, lægemiddelresponser, udviklingsforskning og aldersrelaterede modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrepleje- og eksperimentelle procedurer blev udført efter godkendelse fra Animal Care and Use Committee ved The George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, DC, USA; IACUC#2021-004). Undersøgelsen anvendte mandlige og kvindelige C57BL / 6J vildtypemus (WT) i alderen 10 uger til 5 måneder, som blev hentet fra en kommerciel leverandør (se tabel over materialer) og anbragt på The George Washington University. En oversigt over protokolarbejdsgangen er vist i figur 1.
1. Forberedelse af rygmarven
- Bedøv dyrene med Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribromethanol og 2,5% 2-methyl-2-butanol i sterilt vand) (se materialetabel). Bekræft fraværet af et svar på tå- og haleklemmer i musene.
- Udfør hjerteperfusion med kold 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) for at fjerne mononukleære celler i perifert blod.
- Placer dyret på en lav bakke og lav et lateralt snit for at udsætte pleurhulen. Indsæt en 23 G perfusionsnål forbundet til en peristaltisk pumpe (se materialetabellen) i venstre ventrikel og aktiver pumpen. Når kold DPBS strømmer gennem hjertet, skal du skabe et lille snit i højre atrium.
BEMÆRK: En hurtigere perfusionshastighed foretrækkes i dette trin for at forbedre cellelevedygtigheden. Blodet skal skylles ud på under 1 min. Rydning af leveren indikerer vellykket perfusion.
- Placer dyret på en lav bakke og lav et lateralt snit for at udsætte pleurhulen. Indsæt en 23 G perfusionsnål forbundet til en peristaltisk pumpe (se materialetabellen) i venstre ventrikel og aktiver pumpen. Når kold DPBS strømmer gennem hjertet, skal du skabe et lille snit i højre atrium.
- Halshug dyret ved hjælp af en stor saks og fjern rygsøjlen14. Nedsænk det i kold 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2% glukose i en petriskål på is til vævsskylning.
- Fra nu af skal du sikre dig, at alle trin udføres i et sterilt miljø. Brug hydraulisk ekstrudering14 til at isolere hele rygmarven. Brug en 18 G kanyle og en 10 ml sprøjte fyldt med kold 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2% glucose. Overfør rygmarven til en petriskål placeret på isposer, der indeholder tilstrækkelig kold 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2% glucose til at nedsænke hele vævet.
- Fjern forsigtigt hjernehinderne under et mikroskop i en laminær strømningshætte. Overfør rygmarven til en tom petriskål på isposer, og skær hele rygmarven i 2-3 mm sektioner ved hjælp af en kirurgisk skalpel nr. 10.
2. Enzymatisk celledissociation
- Tilføj enzymblanding 1 og enzymblanding 2 fra det kommercielt tilgængelige Adult Brain Dissociation Kit efter producentens protokol (se materialetabel). Enzymerne i skålen hvirvles flere gange for at sikre ensartet belægning af rygmarven, og inkuberes derefter ved 37 °C i 30 minutter. Hvert 5. minut hvirvles skålen forsigtigt for at forhindre vævsklumpning og lette jævn fordeling af reagenser.
- Fjern skålen fra inkubatoren og tilsæt 350 μL 0,46 mg/ml DNAse I i Minimal Essential Medium (MEM) (se materialetabel). Bland ved forsigtigt at hvirvle.
- Tilsæt 1 ml kold DMEM/0,5% føtalt bovin serum (FBS) og bland ved forsigtigt at hvirvle. Overfør straks hele indholdet til et 5 ml rør.
3. Dissociation af mekanisk celle
- Brug en P1000-pipette til forsigtigt at triturere vævet tre gange, og sørg for, at vævsstykker trækkes op hver gang for yderligere at adskille vævet. Brug derefter en tilsluttet 9" glaspasteurpipette til forsigtigt at triturere fem gange mere, så det sikres, at der ikke genereres bobler under processen.
- Placer 5 ml røret lodret og lad vævet sætte sig i bunden i 30 s. Når vævet har bundfældet sig, trækkes supernatanten op med en P1000-pipette og føres gennem et 30 μm filter ind i et 15 ml konisk rør.
- Til det samme 5 ml rør med det resterende væv tilsættes 1 ml kold DMEM / 0,5% FBS. Brug en Pasteur-pipette til forsigtigt at triturere tre gange.
- Lad vævet bundfælde sig i bunden i 30 sekunder, før derefter supernatanten gennem et 30 μm filter og opsaml det i det samme 15 ml glas som før. Gentag trin 3.3 og trin 3.4 igen.
- Den filtrerede cellesuspension centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT). Den resulterende supernatant fjernes forsigtigt og kasseres ved hjælp af en vakuumaspirator.
4. Myelin fjernelse
- Fjern myelin ved hjælp af opløsningen til fjernelse af affald (DRS), der findes i Adult Brain Dissociation Kit efter producentens protokol. Efter fjernelse af snavs tilsættes 5 ml kold DMEM / 0,5% FBS til cellepillen og vender forsigtigt røret tre gange. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Hvis cellerne skal bruges til in vitro-undersøgelser og forblive i kultur, skal der anvendes forvarmet DMEM / 0,5% FBS i stedet. - Supernatanten kasseres, og cellepelleten resuspenderes i 1 ml DPBS/0,5 % FBS (kold til RNA-undersøgelser og varm til in vitro-assays ). Tæl cellerne og vurder levedygtigheden ved hjælp af Trypan Blue.
BEMÆRK: Cellesuspensioner fra flere dyr kan kombineres for at øge cellekoncentrationen. - Vask cellerne ved at tilføje DPBS/0,5% FBS op til et samlet volumen på 5 ml. Opslæmningen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres med en pipette.
5. Isolering af mikroglia og astrocyt
- Mærk cellerne med anti-CD11b eller anti-ACSA-2 mikroperler i henhold til producentens protokol (se materialetabel).
- Sorter cellerne efter positiv markering ved hjælp af MS-kolonnerne i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel). Efter sortering centrifugeres de sorterede celler ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten kasseres.
6. Plating celler til in vitro assays
BEMÆRK: Hvis celler ikke vil blive belagt og straks vil blive brugt til RNA-analyse, skal du fortsætte til trin 8.
- Resuspender cellerne i 1 ml varm DMEM / 0,5% FBS. Tæl cellerne og vurder deres levedygtighed ved hjælp af et hæmacytometer (se materialetabel).
- Cellekoncentrationen justeres til 75.000 celler pr. 50 μL. Der tilsættes 50 μL af cellesuspensionen til hvert Poly-L-lysinbelagt dæksel11 i en plade med 24 huller.
- Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer, så cellerne kan klæbe til dæksedlen.
- Der tilsættes forsigtigt 450 μL varm DMEM/5% FBS/Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep, se materialetabel) til hvert hul.
- Efter 3 dage udskiftes halvdelen af mediet med 250 μL varm DMEM/5% FBS/Pen-Strep. Til vedligeholdelse skal mediet udskiftes helt med 500 μL varm DMEM / 5% FBS / Pen-Strep hver 4-5 dage.
7. Immunhistokemi
BEMÆRK: Det er bedst at udføre immunhistokemiske analyser efter mindst 3 dage, når mediet er blevet udskiftet mindst én gang. Dette sikrer, at snavs er fjernet, og celler har klæbet helt til dæksedlen.
- Fjern mediet og mærk cellerne med anti-mus mAb O4 (1:100) (se materialetabel) i varmt DMEM/5% FBS/10% normalt gedeserum (NGS) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) eller ved 37 °C.
BEMÆRK: Spring dette trin over, og fortsæt til trin 7.3, hvis cellerne ikke skal mærkes med O4. - Skyl forsigtigt dækslerne ved at dyppe dem i varm DMEM/5% FBS tre gange. Tilføj ged anti-mus 594 IgM (1: 300) (se tabel over materialer) i varm DMEM / 5% FBS / 10% NGS og inkuber ved RT i 15 minutter i mørke. Skyl forsigtigt tre gange i varm DMEM/5% FBS.
- Fastgør cellerne med kold 5% eddikesyre/methanol i 15 minutter ved 4 °C. Vask tre gange med 1x PBS, og mærk derefter med det relevante antistof: anti-kanin GFAP (1: 500), anti-mus GFAP (1: 500) eller anti-kanin Iba1 (1: 500) i 1% Triton-X100/10% NGS i 1x DPBS (se materialetabel). Inkuber i 1 time ved RT.
BEMÆRK: Opbevar dæksedler i mørke, hvis de allerede er blevet farvet med O4. - Skyl forsigtigt tre gange med PBS. Etiket med det relevante sekundære antistof: anti-mus 594 IgG (1: 500), anti-kanin 488 IgG (1: 500) (se materialetabel). Inkuber i 30 minutter ved RT i mørke.
- Skyl forsigtigt tre gange med PBS. Modbejdse med DAPI (1: 1000) i 1 min ved RT. Skyl tre gange med PBS, tilsæt monteringsmedium (se materialetabel), og monter dæksler på dias.
8. RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Ideelt set bør der være mindst 100.000 celler til at ekstrahere tilstrækkeligt RNA til analyse. Om nødvendigt kan celler fra 2-3 rygmarv kombineres.
- Uddrag RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-isolationssæt efter producentens protokol (se materialetabel). For hvert vasketrin med den RW1-vaskebuffer, der følger med sættet, skal cellerne stå i vaskebufferen i yderligere 2 minutter.
- Fjern eventuelt resterende genomisk DNA ved hjælp af DNase I i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel). Inkuber med DNase ved RT i 15 minutter, vask derefter med RW1-buffer.
- For at øge RNA-udbyttet, før eluering, inkuberes prøverne i RNAse-frit vand ved RT i 10 min. Vurder RNA-integritet og -mængde ved hjælp af en bioanalysator15 (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder, der er skitseret i denne protokol, muliggør isolering af rene og levedygtige mikroglia og astrocytter fra rygmarven hos voksne mus, hvilket letter forskellige downstream-applikationer, herunder in vitro-funktionelle eller histologiske assays og RNA-analyse.
En vellykket isolering for in vitro-undersøgelser vil resultere i kontinuerlig celleproliferation over flere dage. Voksne celler udviser en langsommere spredningshastighed sammenlignet med celler isoleret fra neonatale dyr, og nogle rester kan være til stede i de første par dage. Ved 4 dage in vitro (DIV) skal cellerne stort set være fri for snavs, hvor de fleste celler klæber til kolbebunden. Astrocytter vil begynde at danne længere processer, mens microglia vil antage en oval form med kortere spindler (figur 2). Ved 7 DIV skal astrocytter danne et forbundet sammenflydende lag, og mikroglia skal vise færre og kortere processer (figur 3).
Renhed kan bekræftes ved dobbeltmærkning ACSA2-sorterede celler med GFAP og O4 for at vurdere oligodendrocytforurening i astrocytkulturer og CD11b-sorterede celler med Iba1 og GFAP for at evaluere astrocytforurening i mikrogliakulturer (tabel 1).
En vellykket protokol vil også give RNA af høj kvalitet med minimal nedbrydning og tilstrækkelig mængde (figur 4A). Elektroferogrammer af RNA ekstraheret fra isolerede celler bør udvise fremtrædende 18S og 28S toppe. Overdissociation af celler eller længere tid mellem perfusion og cellesortering kan føre til RNA-nedbrydning (figur 4B). Utilstrækkelig enzymatisk og/eller mekanisk dissociation eller utilstrækkelig myelinfjernelse kan resultere i reduceret celleudbytte og RNA (figur 4C). Isolerede astrocytter kan sekventeres for at identificere inflammatoriske markører. Sammenligning af sunde astrocytter med inflammationsaktiverede astrocytter (fx fra et eksperimentelt autoimmun encephalomyelitisdyr) vil afsløre relative hæmninger af inflammatoriske veje i sunde versus inflammatoriske astrocytter (figur 4D).
Figur 1: Oversigt over rygmarvsforberedelse, vævsdissociation og cellesortering. Figuren giver et overblik over rygmarvsforberedelsesprocessen, herunder vævsdissociation og cellesortering. Efter rygmarvsdissektion gennemgår væv enzymatisk og mekanisk dissociation. Myelin fjernes, og celler mærkes med anti-ACSA2 eller anti-CD11b antistoffer til at målrette astrocytter og microglia. De sorterede celler kan derefter bruges til cellekultur og RNA-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fasekontrastbilleder af astrocytter og mikroglia ved 4 dage in vitro (4DIV). (A) Viser et repræsentativt eksempel på ACSA2+ sorterede celler med udvidede processer. (B) CD11b + celler viser ovale formede cellelegemer og korte processer. Skalabjælke = 50 μm. Denne figur er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fluorescerende billeder af astrocytter og mikroglia ved 8 dage in vitro (8DIV). (A) ACSA2+ celler mærket med GFAP (grøn) og O4 (rød) udviser minimal O4-farvning og danner et forbundet sammenflydende lag af astrocytter. (B) CD11b + celler mærket med Iba1 (grøn) og GFAP (rød) viser minimal tilstedeværelse af GFAP. Skalabjælke = 50 μm. Denne figur er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative elektroferogrammer af RNA-prøver. (A) Højt udbytte og RNA af høj kvalitet forventes efter en vellykket celleisolering. (B) Lavt udbytte, lav kvalitet RNA eller (C) lavt udbytte, høj kvalitet RNA kan forventes i tilfælde af celledød, utilstrækkelig dissociation eller utilstrækkelig fjernelse af affald. (D) RNA-sekventeringsanalyse af udvalgte inflammatoriske veje i raske astrocytter versus inflammatoriske astrocytter afslører relativ hæmning af inflammation i sorterede sunde astrocytter sammenlignet med inflammatoriske astrocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Celletype | Samlet antal celler | Sorterede celler | % sorteret/i alt | Gennemsnitlig levedygtighed i % |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabel 1: Celleudbytte, renhed og levedygtighed efter sortering for ACSA-2- og CD11b-celler. Denne tabel er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering af rene, levedygtige primære celler er altafgørende for at undersøge strukturen og funktionen af specifikke celletyper. Hos den voksne mus, især i rygmarven, giver denne opgave betydelige udfordringer, da eksisterende protokoller ofte ikke er skræddersyet til den voksne rygmarv10,17. Denne protokol præsenterer en effektiv og omkostningseffektiv metode, der kan anvendes til forskellige downstream-applikationer, herunder cellekultur, flowcytometri, histologi og transkriptomiske undersøgelser.
Hastigheden af rygmarvsforberedelsen spiller en afgørende rolle for at sikre optimal cellelevedygtighed og udbytte. Selvom det er bydende nødvendigt at opnå effektiv clearance af røde blodlegemer under hjerteperfusion, kan antallet af isolerede celler variere meget baseret på den tid, der er gået mellem hjerteperfusion og enzymatisk dissociation. Vi observerede, at initiering af vævsdissociation mere end 10 minutter efter hjerteperfusion førte til nedsat cellelevedygtighed. Derudover viste enzymatiske dissociationsvarigheder på mindre end 30 minutter sig ineffektive, hvilket efterlod ufordøjede vævsfragmenter og reducerede celleudbyttet.
Selvom fuldstændig eliminering af mekanisk dissociation (såsom triturering eller hakning) ikke påvirkede cellelevedygtigheden, resulterede det i færre isolerede celler på grund af tilstedeværelsen af ufordøjede vævsfragmenter. En kombination af mekaniske metoder med enzymatisk dissociation viste sig at være den mest effektive tilgang til celleisolering. Det er dog værd at bemærke, at et vist niveau af cellulær stress uundgåeligt opstår under vævsdissociation, hvilket potentielt påvirker transkriptomiske undersøgelser18. Dette er en almindelig udfordring med CNS-vævsdissociationsprocedurer19. Ikke desto mindre har blide tritureringsmetoder vist sig at minimere celledød, fremmed transkriptaktivering og uønsket proteolyse16. Selv om levedygtige celler kan opnås ved helt at eliminere mekanisk dissociation, kan dette desuden nødvendiggøre anvendelse af yderligere dyr. Af hensyn til reproducerbarheden anbefales det at supplere enzymatisk dissociation med skånsom hakning og trituration for at maksimere celleudbyttet pr. rygmarv. Forskere kan dog vælge at ændre protokollen ved at eliminere trituration eller hakning, hvis deres undersøgelses mål er meget følsomme over for cellulær stress og kræver minimal dissociation.
Sammenfattende sikrer integrationen af blide dissociationstrin og hurtig vævsforberedelse optimalt celleudbytte og levedygtighed. Protokolfleksibiliteten forbedres af muligheden for at erstatte kolde medier med varme medier til opretholdelse af celler i kultur. Denne metode er optimeret til anvendelse i dyremodeller, der spænder fra 10 uger til mindst 5 måneder gamle, herunder sygdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi takker Castle Raley ved George Washington University Genomics Core for RNA-analyser og Q2 Lab Solutions for RNA-sekventeringsanalyser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bevillingsnummer F31NS117085] og Vivian Gill Research Endowment til Dr. Robert H. Miller. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
