Summary
Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.
Abstract
Astrocyten en microglia spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, letselreacties en neurodegeneratieve ziekten. Deze zeer dynamische cellen vertonen snelle reacties op veranderingen in de omgeving en vertonen een aanzienlijke heterogeniteit in termen van morfologie, transcriptieprofielen en functies. Hoewel ons begrip van de functies van gliacellen bij gezondheid en ziekte aanzienlijk is verbeterd, blijft er behoefte aan in vitro, celspecifieke analyses die worden uitgevoerd in de context van beledigingen of verwondingen om verschillende celpopulaties volledig te karakteriseren. Het isoleren van cellen van de volwassen muis biedt verschillende voordelen ten opzichte van cellijnen of neonatale dieren, omdat het de analyse van cellen onder pathologische omstandigheden en op specifieke tijdstippen mogelijk maakt. Bovendien maakt de focus op ruggenmergspecifieke isolatie, met uitzondering van betrokkenheid van de hersenen, onderzoek mogelijk naar ruggenmergpathologieën, waaronder experimentele auto-immuunencefalomyelitis, ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het isoleren van astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor onmiddellijke of toekomstige analyse wordt vergemakkelijkt met mogelijke toepassingen in functionele, moleculaire of proteomische stroomafwaartse studies.
Introduction
Astrocyten en microglia zijn veelzijdige gliacellen die een vitale rol spelen in het centrale zenuwstelsel (CZS), met verantwoordelijkheden zoals het reguleren van de neuronale functie, het bijdragen aan de ontwikkeling van het CZS, het onderhouden van de bloed-hersenbarrière en het deelnemen aan andere kritieke processen 1,2,3,4 . Naast hun rol bij het handhaven van de homeostase, spelen deze gliacellen ook een cruciale rol bij letsel- en herstelmechanismen. Microglia staan bekend om hun fagocytische, inflammatoire en migrerende eigenschappen na beledigingen of verwondingen 5,6,7. Astrocytenreacties bij ziekte zijn even divers en omvatten bijdragen aan ontstekingen, de vorming van glialittekens en het aantasten van de bloed-hersenbarrière 8,9. Hoewel ons begrip van de schadelijke en herstellende rol van microglia en astrocyten in het CZS is gegroeid, vereist de inherente heterogeniteit in zowel hun structuur als functie robuuste instrumenten om ze in verschillende contexten te bestuderen.
Om meer inzicht te krijgen in de rol van microglia en astrocyten in gezondheid en ziekte, is een gecombineerde aanpak van in vivo en in vitro onderzoek nodig. In vivo technieken maken gebruik van de ingewikkelde overspraak tussen gliacellen en neuronen in het CZS, terwijl in vitro methodologieën waardevol blijken te zijn bij het beoordelen van eencellige functies of reacties onder specifieke stimuli. Elke methode biedt unieke voordelen; In vitro studies zijn essentieel voor het begrijpen van de specifieke rollen van deze celtypen zonder directe of indirecte input van naburige cellen. Bovendien bieden in-vitrotests die gebruik maken van onsterfelijke cellijnen bepaalde voordelen, waaronder het vermogen om zich voor onbepaalde tijd te vermenigvuldigen, kostenefficiëntie en onderhoudsgemak. Het is echter belangrijk op te merken dat primaire cellen normale fysiologische reacties beter nabootsen in vergelijking met cellijnen. Deze fysiologische relevantie is cruciaal in functionele assays en transcriptomische analyses.
Een van de uitdagingen bij het verkrijgen van primaire cellen, met name uit het ruggenmerg van volwassen muizen, ligt in de hoeveelheid en levensvatbaarheid van de monsters. Het volwassen ruggenmerg, dat kleiner is dan de hersenen en een aanzienlijke hoeveelheid myeline bevat, vormt unieke moeilijkheden. Hoewel er verschillende gepubliceerde protocollen zijn die de isolatie van zuivere, levensvatbare gliacellen van neonatale dieren of de hersenen van volwassen muizen beschrijven 10,11,12,13, zijn deze methodologieën mogelijk niet geschikt voor het bestuderen van ziekten en verwondingen die specifiek zijn voor het ruggenmerg. In dit protocol bieden we een uitgebreide procedure om zuivere, levensvatbare microglia en astrocyten efficiënt te isoleren uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor stroomafwaartse toepassingen in celkweek en transcriptomische analyses worden vergemakkelijkt. Dit protocol is met succes gebruikt om deze cellen te isoleren van volwassen muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, wat het nut ervan in verschillende contexten aantoont, waaronder onderzoeken met voorwaardelijke knock-outmuizen, geneesmiddelreacties, ontwikkelingsonderzoek en leeftijdsgerelateerde modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierverzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd na goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, DC, VS; IACUC#2021-004). De studie maakte gebruik van mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J wild-type (WT) muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, die afkomstig waren van een commerciële leverancier (zie Tabel met materialen) en gehuisvest waren aan de George Washington University. Een overzicht van de protocolworkflow wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het ruggenmerg
- Verdoof de dieren met Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribroomethanol en 2,5% 2-methyl-2-butanol in steriel water) (zie materiaaltabel). Bevestig de afwezigheid van een reactie op teen- en staartknijpen bij de muizen.
- Voer hartperfusie uit met koude 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om perifere mononucleaire bloedcellen te verwijderen.
- Leg het dier op een ondiepe bak en maak een zijdelingse incisie om de pleuraholte bloot te leggen. Steek een perfusienaald van 23 G die is aangesloten op een peristaltische pomp (zie Materiaaltabel) in de linker hartkamer en activeer de pomp. Zodra koude DPBS door het hart stroomt, maakt u een kleine incisie in het rechter atrium.
OPMERKING: In deze stap wordt de voorkeur gegeven aan een snellere perfusiesnelheid om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren. Het bloed moet in minder dan 1 minuut worden weggespoeld. Het opruimen van de lever duidt op een succesvolle perfusie.
- Leg het dier op een ondiepe bak en maak een zijdelingse incisie om de pleuraholte bloot te leggen. Steek een perfusienaald van 23 G die is aangesloten op een peristaltische pomp (zie Materiaaltabel) in de linker hartkamer en activeer de pomp. Zodra koude DPBS door het hart stroomt, maakt u een kleine incisie in het rechter atrium.
- Onthoofd het dier met een grote schaar en verwijder de wervelkolom14. Dompel het onder in koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose in een petrischaal op ijs voor weefselspoeling.
- Zorg er vanaf nu voor dat alle stappen in een steriele omgeving worden uitgevoerd. Gebruik hydraulische extrusie14 om het hele ruggenmerg te isoleren. Gebruik een naald van 18 G en een spuit van 10 ml gevuld met koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose. Breng het ruggenmerg over naar een petrischaal die op ijspakken is geplaatst en voldoende koude 1x DPBS met Ca2+/Mg2+/0,2% glucose bevat om het hele weefsel onder te dompelen.
- Verwijder de hersenvliezen voorzichtig onder een microscoop in een laminaire stroomkap. Breng het ruggenmerg over naar een lege petrischaal op ijspakken en snijd met een chirurgisch scalpel nr. 10 het hele ruggenmerg in secties van 2-3 mm.
2. Enzymatische celdissociatie
- Voeg enzymmix 1 en enzymmix 2 toe uit de in de handel verkrijgbare Adult Brain Dissociation Kit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Draai de enzymen meerdere keren in de schaal om een gelijkmatige coating van het ruggenmerg te garanderen en incubeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C. Draai de schaal elke 5 minuten voorzichtig rond om klontering van het weefsel te voorkomen en een gelijkmatige verdeling van de reagentia te vergemakkelijken.
- Haal de schaal uit de incubator en voeg 350 μL 0,46 mg/ml DNAse I in Minimal Essential Medium (MEM) toe (zie Tabel met materialen). Meng door zachtjes te draaien.
- Voeg 1 ml koude DMEM/0,5% Fetal Bovine Serum (FBS) toe en meng door zachtjes rond te draaien. Breng de volledige inhoud onmiddellijk over in een tube van 5 ml.
3. Mechanische celdissociatie
- Gebruik een P1000-pipet om het weefsel drie keer voorzichtig te trituleren en zorg ervoor dat er elke keer stukjes weefsel worden opgezogen om het weefsel verder te dissociëren. Gebruik vervolgens een verstopte 9" glazen pasteurpipet en trituer nog vijf keer voorzichtig, zodat er tijdens het proces geen luchtbellen ontstaan.
- Zet de tube van 5 ml rechtop en laat het weefsel 30 seconden op de bodem bezinken. Zodra het weefsel is neergedaald, zuigt u het supernatans op met behulp van een P1000-pipet en voert u het door een filter van 30 μm in een conische buis van 15 ml.
- Voeg aan hetzelfde buisje van 5 ml met het resterende weefsel 1 ml koude DMEM/0,5% FBS toe. Gebruik een pasteurpipet om driemaal voorzichtig te tritugeren.
- Laat het weefsel 30 s op de bodem bezinken, haal het supernatans vervolgens door een filter van 30 μm en vang het op in hetzelfde buisje van 15 ml als voorheen. Herhaal stap 3.3 en stap 3.4 nog een keer.
- Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het resulterende supernatans voorzichtig en gooi het weg met behulp van een vacuümaspirator.
4. Myeline verwijdering
- Verwijder myeline met behulp van de puinverwijderingsoplossing (DRS) die wordt meegeleverd in de Adult Brain Dissociation Kit volgens het protocol van de fabrikant. Voeg na het verwijderen van het vuil 5 ml koude DMEM/0,5% FBS toe aan de celpellet en keer de buis voorzichtig drie keer om. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Als de cellen worden gebruikt voor in-vitro-onderzoeken en in kweek blijven, moet in plaats daarvan voorverwarmde DMEM/0,5% FBS worden gebruikt. - Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 1 ml DPBS/0,5% FBS (koud voor RNA-onderzoek en warm voor in-vitrotesten ). Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met behulp van Trypan Blue.
OPMERKING: Celsuspensies van meerdere dieren kunnen worden gecombineerd om de celconcentratie te verhogen. - Was de cellen door DPBS/0,5% FBS toe te voegen tot een totaal volume van 5 ml. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatans weg met een pipet.
5. Isolatie van microglia en astrocyten
- Label de cellen met anti-CD11b- of anti-ACSA-2-microbeads volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Sorteer de cellen op positieve selectie met behulp van de MS-kolommen volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen). Centrifugeer na het sorteren de gesorteerde cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g en gooi het supernatant weg.
6. Plateren van cellen voor in-vitrotests
OPMERKING: Als cellen niet worden geplateerd en onmiddellijk worden gebruikt voor RNA-analyse, gaat u verder met stap 8.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml warme DMEM/0,5% FBS. Tel de cellen en beoordeel hun levensvatbaarheid met behulp van een hemacytometer (zie Tabel met materialen).
- Pas de celconcentratie aan tot 75.000 cellen per 50 μL. Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan elk met Poly-L-lysine gecoat dekglaasje11 in een plaat met 24 putjes.
- Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C zodat de cellen zich aan het dekglaasje kunnen hechten.
- Voeg voorzichtig 450 μL warme DMEM/5% FBS/Penicilline-Streptomycine (Pen-Streptomycine, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje.
- Vervang na 3 dagen de helft van het medium door 250 μL warme DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken. Vervang voor onderhoud de media om de 4-5 dagen volledig door 500 μL warme DMEM/5% FBS/Pen-Streptokokken.
7. Immunohistochemie
OPMERKING: Het is het beste om immunohistochemische analyses uit te voeren na ten minste 3 dagen wanneer de media ten minste één keer zijn vervangen. Dit zorgt ervoor dat vuil is verwijderd en dat de cellen zich volledig aan het dekglaasje hebben gehecht.
- Verwijder de media en label de cellen met anti-muis mAb O4 (1:100) (zie materiaaltabel) in warm DMEM/5% FBS/10% normaal geitenserum (NGS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) of bij 37 °C.
OPMERKING: Sla deze stap over en ga verder met stap 7.3 als de cellen niet worden gelabeld met O4. - Spoel de dekglaasjes voorzichtig af door ze driemaal in warme DMEM/5% FBS te dompelen. Voeg geit anti-muis 594 IgM (1: 300) (zie Materiaaltabel) toe in warme DMEM/5% FBS/10% NGS en incubeer bij RT gedurende 15 minuten in het donker. Spoel driemaal voorzichtig af met warme DMEM/5% FBS.
- Fixeer de cellen met koud 5% azijnzuur/methanol gedurende 15 minuten bij 4 °C. Was driemaal met 1x PBS en label vervolgens met het juiste antilichaam: anti-konijn GFAP (1: 500), anti-muis GFAP (1: 500) of anti-konijn Iba1 (1: 500) in 1% Triton-X100/10% NGS in 1x DPBS (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
OPMERKING: Bewaar dekglaasjes in het donker als ze al met O4 zijn bevlekt. - Spoel drie keer voorzichtig met PBS. Etiket met het juiste secundaire antilichaam: anti-muis 594 IgG (1: 500), anti-konijn 488 IgG (1: 500) (zie materiaaltabel). Incubeer 30 minuten bij RT in het donker.
- Spoel drie keer voorzichtig met PBS. Tegenbeitsen met DAPI (1: 1000) gedurende 1 min bij RT. Spoel driemaal met PBS, voeg montagemedium toe (zie Materiaaltabel) en monteer dekglaasjes op de objectglaasjes.
8. RNA-extractie
OPMERKING: Idealiter zouden er ten minste 100.000 cellen moeten zijn om voldoende RNA te extraheren voor analyse. Indien nodig kunnen cellen van 2-3 ruggenmerg worden gecombineerd.
- Extraheer RNA met behulp van een in de handel verkrijgbare RNA-isolatiekit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Laat voor elke wasstap met de RW1-wasbuffer die in de set zit, de cellen nog 2 minuten in de wasbuffer staan.
- Verwijder eventueel achtergebleven genoom-DNA met behulp van DNase I volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Incubeer met DNase bij RT gedurende 15 minuten en was daarna met RW1-buffer.
- Om de RNA-opbrengst te verhogen, incubeert u de monsters voorafgaand aan de elutie gedurende 10 minuten in RNAse-vrij water bij RT. Beoordeel de integriteit en hoeveelheid van RNA met behulp van een bioanalysator15 (zie Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methoden die in dit protocol worden beschreven, maken het mogelijk om zuivere en levensvatbare microglia en astrocyten uit het ruggenmerg van volwassen muizen te isoleren, waardoor verschillende stroomafwaartse toepassingen mogelijk worden, waaronder in vitro functionele of histologische assays en RNA-analyse.
Een succesvolle isolatie voor in vitro studies zal resulteren in continue celproliferatie gedurende meerdere dagen. Volwassen cellen vertonen een langzamere proliferatiesnelheid in vergelijking met cellen geïsoleerd uit neonatale dieren, en er kan in de eerste paar dagen wat puin aanwezig zijn. Tegen 4 dagen in vitro (DIV) moeten de cellen grotendeels vrij zijn van vuil, waarbij de meeste cellen zich aan de bodem van de kolf hechten. Astrocyten zullen langere processen beginnen te vormen, terwijl microglia een ovale vorm zullen aannemen met kortere spoelen (Figuur 2). Bij 7 DIV zouden astrocyten een verbonden confluente laag moeten vormen en zouden microglia minder en kortere processen moeten vertonen (Figuur 3).
Zuiverheid kan worden bevestigd door ACSA2-gesorteerde cellen dubbel te labelen met GFAP en O4 om de besmetting met oligodendrocyten in astrocytenculturen te beoordelen en CD11b-gesorteerde cellen met Iba1 en GFAP om de besmetting met astrocyten in microgliaculturen te evalueren (tabel 1).
Een succesvol protocol levert ook RNA van hoge kwaliteit op met minimale afbraak en voldoende kwantiteit (Figuur 4A). Elektroferogrammen van RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde cellen moeten prominente 18S- en 28S-pieken vertonen. Overdissociatie van cellen of langere tijd tussen perfusie en celsortering kan leiden tot afbraak van RNA (Figuur 4B). Onvoldoende enzymatische en/of mechanische dissociatie of onvoldoende verwijdering van myeline kan leiden tot verminderde celopbrengst en RNA (Figuur 4C). Geïsoleerde astrocyten kunnen worden gesequenced om ontstekingsmarkers te identificeren. Het vergelijken van gezonde astrocyten met door ontsteking geactiveerde astrocyten (bijv. van een experimenteel auto-immuun encefalomyelitis-dier) zal relatieve remmingen van ontstekingsroutes in gezonde versus inflammatoire astrocyten aan het licht brengen (Figuur 4D).
Figuur 1: Overzicht van de voorbereiding van het ruggenmerg, weefseldissociatie en celsortering. De figuur geeft een overzicht van het voorbereidingsproces van het ruggenmerg, inclusief weefseldissociatie en celsortering. Na dissectie van het ruggenmerg ondergaan weefsels enzymatische en mechanische dissociatie. Myeline wordt verwijderd en cellen worden gelabeld met anti-ACSA2- of anti-CD11b-antilichamen om astrocyten en microglia aan te pakken. De gesorteerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor celkweek en RNA-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fasecontrastbeelden van astrocyten en microglia op 4 dagen in vitro (4DIV). (A) Toont een representatief voorbeeld van ACSA2+ gesorteerde cellen met uitgebreide processen. (B) CD11b+-cellen vertonen ovaalvormige cellichamen en korte processen. Schaalbalk = 50 μm. Deze figuur is een bewerking van Ahn, J. J. et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescerende beelden van astrocyten en microglia op 8 dagen in vitro (8DIV). (A) ACSA2+-cellen gelabeld met GFAP (groen) en O4 (rood) vertonen minimale O4-kleuring en vormen een verbonden confluente laag astrocyten. (B) CD11b+-cellen gelabeld met Iba1 (groen) en GFAP (rood) vertonen minimale aanwezigheid van GFAP. Schaalbalk = 50 μm. Deze figuur is een bewerking van Ahn, J. J. et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve elektroferogrammen van RNA-monsters. (A) RNA met een hoge opbrengst en hoge kwaliteit wordt verwacht na een succesvolle celisolatie. (B) RNA met een lage opbrengst van lage kwaliteit of (C) RNA van lage kwaliteit met een lage opbrengst kan worden verwacht in gevallen van celdood, onvoldoende dissociatie of onvoldoende verwijdering van puin. (D) RNA-sequencinganalyse van geselecteerde ontstekingsroutes in gezonde astrocyten versus inflammatoire astrocyten onthult relatieve remming van ontsteking in gesorteerde gezonde astrocyten in vergelijking met inflammatoire astrocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celtype | Totaal aantal cellen | Gesorteerde cellen | % gesorteerd/totaal | Gemiddelde % levensvatbaarheid |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabel 1: Celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid na sortering voor ACSA-2- en CD11b-cellen. Deze tabel is een bewerking van Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het isoleren van zuivere, levensvatbare primaire cellen is van het grootste belang voor het onderzoeken van de structuur en functie van specifieke celtypen. Bij de volwassen muis, met name in het ruggenmerg, brengt deze taak aanzienlijke uitdagingen met zich mee, omdat bestaande protocollen vaak niet zijn afgestemd op het volwassen ruggenmerg10,17. Dit protocol biedt een efficiënte en kosteneffectieve methode die van toepassing is op verschillende stroomafwaartse toepassingen, waaronder celkweek, flowcytometrie, histologie en transcriptomische onderzoeken.
De snelheid van de voorbereiding van het ruggenmerg speelt een cruciale rol bij het garanderen van een optimale cellevensvatbaarheid en opbrengst. Hoewel het absoluut noodzakelijk is om een effectieve klaring van rode bloedcellen tijdens hartperfusie te bereiken, kan het aantal geïsoleerde cellen sterk variëren op basis van de tijd die is verstreken tussen hartperfusie en enzymatische dissociatie. We zagen dat het initiëren van weefseldissociatie meer dan 10 minuten na hartperfusie leidde tot verminderde cellevensvatbaarheid. Bovendien bleek enzymatische dissociatieduur van minder dan 30 minuten niet effectief, waardoor onverteerde weefselfragmenten achterbleven en de celopbrengst afnam.
Hoewel volledige eliminatie van mechanische dissociatie (zoals tritureren of hakken) geen invloed had op de levensvatbaarheid van de cellen, resulteerde het wel in minder geïsoleerde cellen vanwege de aanwezigheid van onverteerde weefselfragmenten. Een combinatie van mechanische methoden met enzymatische dissociatie bleek de meest effectieve aanpak voor celisolatie. Het is echter vermeldenswaard dat een zekere mate van cellulaire stress onvermijdelijk optreedt tijdens weefseldissociatie, wat mogelijk van invloed is op transcriptomische studies18. Dit is een veel voorkomende uitdaging bij procedures voor dissociatie van het CZS-weefsel19. Desalniettemin is aangetoond dat zachte trituratiemethoden celdood, externe transcriptactivering en ongewenste proteolyse minimaliseren16. Bovendien, hoewel levensvatbare cellen kunnen worden verkregen door mechanische dissociatie volledig te elimineren, kan dit het gebruik van extra dieren noodzakelijk maken. Omwille van de reproduceerbaarheid wordt aanbevolen om enzymatische dissociatie aan te vullen met zacht hakken en tritureren om de celopbrengst per ruggenmerg te maximaliseren. Onderzoekers kunnen er echter voor kiezen om het protocol aan te passen door trituratie of hakken te elimineren als de doelen van hun studie zeer gevoelig zijn voor cellulaire stress en minimale dissociatie vereisen.
Samenvattend zorgt de integratie van zachte dissociatiestappen en snelle weefselvoorbereiding voor een optimale celopbrengst en levensvatbaarheid. De flexibiliteit van het protocol wordt vergroot door de optie om koude media te vervangen door warme media om cellen in kweek te houden. Deze methodologie is geoptimaliseerd voor toepassing in diermodellen variërend van 10 weken tot ten minste 5 maanden oud, inclusief ziektemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
We danken Castle Raley van de George Washington University Genomics Core voor RNA-analyses en Q2 Lab Solutions voor RNA-sequencing-analyses. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke [subsidienummer F31NS117085] en de Vivian Gill Research Endowment aan Dr. Robert H. Miller. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
