Summary
Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.
Abstract
Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.
Introduction
Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias após insultos ou lesões 5,6,7. As respostas astrocitárias na doença são igualmente diversas, englobando contribuições para a inflamação, a formação de cicatrizes gliais e o comprometimento da barreira hematoencefálica 8,9. Embora nossa compreensão dos papéis prejudiciais e reparadores da micróglia e dos astrócitos no SNC tenha crescido, a heterogeneidade inerente em sua estrutura e função requer ferramentas robustas para estudá-los em vários contextos.
Obter mais informações sobre os papéis da micróglia e dos astrócitos na saúde e na doença requer uma abordagem combinada de investigações in vivo e in vitro . Técnicas in vivo alavancam o intrincado crosstalk entre células gliais e neurônios dentro do SNC, enquanto metodologias in vitro mostram-se valiosas ao avaliar funções ou respostas unicelulares sob estímulos específicos. Cada método oferece vantagens únicas; Estudos in vitro são essenciais para a compreensão dos papéis específicos desses tipos celulares sem a entrada direta ou indireta de células vizinhas. Além disso, ensaios in vitro utilizando linhagens celulares imortais apresentam certos benefícios, incluindo a capacidade de proliferação indefinida, custo-benefício e facilidade de manutenção. No entanto, é importante notar que as células primárias imitam mais de perto as respostas fisiológicas normais em comparação com as linhagens celulares. Essa relevância fisiológica é crucial em ensaios funcionais e análises transcriptômicas.
Um dos desafios na obtenção de células primárias, particularmente da medula espinhal de camundongos adultos, está na quantidade e viabilidade das amostras. A medula espinhal adulta, sendo menor que o cérebro e contendo uma quantidade significativa de mielina, apresenta dificuldades únicas. Embora existam vários protocolos publicados detalhando o isolamento de células gliais puras e viáveis de animais neonatais ou do cérebro de camundongos adultos 10,11,12,13, essas metodologias podem não ser adequadas para o estudo de doenças e lesões específicas da medula espinhal. Neste protocolo, oferecemos um procedimento abrangente para isolar eficientemente a micróglia e os astrócitos puros e viáveis da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações a jusante em cultura de células e análises transcriptômicas. Este protocolo tem sido empregado com sucesso para isolar essas células de camundongos adultos com idade entre 10 semanas e 5 meses, demonstrando sua utilidade em vários contextos, incluindo estudos envolvendo camundongos knockout condicionais, respostas a drogas, pesquisa de desenvolvimento e modelos relacionados à idade.
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Protocol
Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de trabalho do protocolo é apresentada na Figura 1.
1. Preparação da medula espinhal
- Anestesiar os animais com Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-Tribromoetanol e 2,5% de 2-metil-2-butanol em água estéril) (ver Tabela de Materiais). Confirme a ausência de resposta aos beliscões dos dedos dos pés e da cauda nos ratos.
- Realizar perfusão cardíaca com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) 1x Dulbecco a frio para remover as células mononucleares do sangue periférico.
- Coloque o animal em uma bandeja rasa e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural. Insira uma agulha de perfusão 23 G conectada a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo e ative a bomba. Uma vez que a DPBS fria flui através do coração, crie uma pequena incisão no átrio direito.
NOTA: Uma taxa de perfusão mais rápida é preferida nesta etapa para aumentar a viabilidade celular. O sangue deve ser liberado em menos de 1 minuto. A limpeza do fígado indica perfusão bem-sucedida.
- Coloque o animal em uma bandeja rasa e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural. Insira uma agulha de perfusão 23 G conectada a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo e ative a bomba. Uma vez que a DPBS fria flui através do coração, crie uma pequena incisão no átrio direito.
- Decapitar o animal com uma tesoura grande e retirar a coluna vertebral14. Submergir em 1x DPBS frios com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose em uma placa de Petri sobre gelo para enxágue tecidual.
- A partir de agora, certifique-se de que todas as etapas sejam realizadas em um ambiente estéril. Use extrusão hidráulica14 para isolar toda a medula espinhal. Empregar uma agulha de 18 G e uma seringa de 10 mL preenchida com 1x DPBS frios com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri colocada em blocos de gelo contendo 1x DPBS frios suficientes com Ca2+/Mg2+/0,2% de glicose para submergir todo o tecido.
- Remova cuidadosamente as meninges sob um microscópio dentro de uma capela de fluxo laminar. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri vazia em bolsas de gelo e, usando um bisturi cirúrgico com lâmina nº 10, corte toda a medula espinhal em seções de 2-3 mm.
2. Dissociação enzimática celular
- Adicione a mistura de enzimas 1 e a mistura de enzimas 2 do Kit de dissociação cerebral para adultos disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Agite as enzimas no prato várias vezes para garantir um revestimento uniforme da medula espinhal e, em seguida, incube a 37 °C durante 30 minutos. A cada 5 minutos, gire suavemente o prato para evitar aglomeração de tecidos e facilitar a distribuição uniforme de reagentes.
- Retire a placa da incubadora e adicione 350 μL de 0,46 mg/mL de DNAse I em Meio Essencial Mínimo (MEM) (ver Tabela de Materiais). Misture girando suavemente.
- Adicione 1 mL de DMEM frio/0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB) e misture girando suavemente. Transfira imediatamente todo o conteúdo para um tubo de 5 mL.
3. Dissociação mecânica celular
- Usando uma pipeta P1000, triture suavemente o tecido três vezes, garantindo que pedaços de tecido sejam retirados cada vez para dissociar ainda mais o tecido. Em seguida, usando uma pipeta de vidro Pasteur plugada de 9", triture suavemente mais cinco vezes, garantindo que nenhuma bolha seja gerada durante o processo.
- Coloque o tubo de 5 mL na vertical e deixe o tecido se acomodar no fundo por 30 s. Uma vez que o tecido tenha se acomodado, extrair o sobrenadante usando uma pipeta P1000 e passá-lo através de um filtro de 30 μm para um tubo cônico de 15 mL.
- Ao mesmo tubo de 5 mL com o tecido restante, adicionar 1 mL de DMEM frio/SFB a 0,5%. Usando uma pipeta Pasteur, triture suavemente três vezes.
- Deixe o tecido assentar no fundo por 30 s, depois passe o sobrenadante através de um filtro de 30 μm e colete-o no mesmo tubo de 15 mL de antes. Repita as etapas 3.3 e 3.4 mais uma vez.
- Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR). Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante resultante usando um aspirador a vácuo.
4. Remoção da mielina
- Remova a mielina usando a solução de remoção de detritos (DRS) fornecida no Kit de Dissociação Cerebral para Adultos seguindo o protocolo do fabricante. Após a remoção dos detritos, adicionar 5 mL de DMEM frio/FBS a 0,5% ao pellet de células e inverter suavemente o tubo três vezes. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR).
NOTA: Se as células serão usadas para estudos in vitro e permanecerão em cultura, deve-se usar DMEM/FBS pré-aquecido a 0,5%. - Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de DPBS/FBS a 0,5% (frio para estudos de RNA e quente para ensaios in vitro ). Conte as células e avalie a viabilidade usando Trypan Blue.
NOTA: Suspensões celulares de vários animais podem ser combinadas para aumentar a concentração celular. - Lave as células adicionando DPBS/FBS a 0,5% até um volume total de 5 mL. Centrifugar a suspensão a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
5. Isolamento de micróglias e astrócitos
- Rotule as células com microesferas anti-CD11b ou anti-ACSA-2 seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
- Classifique as células por seleção positiva usando as colunas MS de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Após a triagem, centrifugar as células classificadas a 300 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
6. Plating de células para ensaios in vitro
NOTA: Se as células não forem plaqueadas e forem usadas imediatamente para análise de RNA, prossiga para a etapa 8.
- Ressuspender as células em 1 mL de DMEM quente/SFB a 0,5%. Conte as células e avalie sua viabilidade usando um hemacitômetro (ver Tabela de Materiais).
- Ajustar a concentração celular para 75.000 células por 50 μL. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada lamínula revestida de poli-L-lisina11 em uma placa de 24 poços.
- Incubar a 37 °C durante 2 h para permitir que as células adiram à lamínula.
- Adicione cuidadosamente 450 μL de DMEM quente/5% FBS/Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep, ver Tabela de Materiais) a cada poço.
- Após 3 dias, substituir metade do meio por 250 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep. Para manutenção, substitua completamente o meio por 500 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep a cada 4-5 dias.
7. Imuno-histoquímica
NOTA: É melhor realizar análises imunohistoquímicas após pelo menos 3 dias quando o meio tiver sido substituído pelo menos uma vez. Isso garante que os detritos tenham sido removidos e que as células tenham aderido completamente à lamínula.
- Remover o meio e rotular as células com mAb O4 anti-rato (1:100) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% soro normal de cabra (NGS) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) ou a 37 °C.
Observação : ignore esta etapa e prossiga para a etapa 7.3 se as células não serão rotuladas com O4. - Enxágue suavemente as lamínulas mergulhando-as em DMEM/5% FBS morno três vezes. Adicionar cabra anti-rato 594 IgM (1: 300) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% NGS e incubar em RT por 15 min no escuro. Enxaguar suavemente três vezes em DMEM/5% FBS quente.
- Fixar as células com ácido acético a 5% a frio/metanol durante 15 minutos a 4 °C. Lave três vezes com 1x PBS e, em seguida, rotule com o anticorpo apropriado: GFAP anticoelho (1: 500), GFAP anti-rato (1: 500) ou Iba1 anticoelho (1: 500) em 1% Triton-X100/10% NGS em 1x DPBS (ver Tabela de Materiais). Incubar por 1 h no TR.
OBS: Mantenha as lamínulas no escuro caso já tenham sido manchadas com O4. - Enxágue suavemente três vezes com PBS. Rótulo com o anticorpo secundário apropriado: anti-camundongo 594 IgG (1: 500), anti-coelho 488 IgG (1: 500) (ver Tabela de Materiais). Incubar por 30 min no TR no escuro.
- Enxágue suavemente três vezes com PBS. Contramanchar com DAPI (1: 1000) por 1 min em RT. Enxágue três vezes com PBS, adicione o meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e monte as lamínulas nas lâminas.
8. Extração de RNA
NOTA: Idealmente, deve haver pelo menos 100.000 células para extrair RNA suficiente para análise. Se necessário, células de 2-3 medulas, podem ser combinadas.
- Extraia o RNA usando um kit de isolamento de RNA disponível comercialmente seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para cada etapa de lavagem com o tampão de lavagem RW1 fornecido no kit, deixe as células no tampão de lavagem por mais 2 min.
- Remova qualquer DNA genômico remanescente usando DNase I de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Incubar com DNase em TR durante 15 minutos e, em seguida, lavar com tampão RW1.
- Para aumentar o rendimento de RNA, antes da eluição incubar as amostras em água livre de RNAse em TR por 10 min. Avalie a integridade e a quantidade de RNA usando um bioanalisador15 (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA.
Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células isoladas de animais neonatais, e alguns detritos podem estar presentes nos primeiros dias. Até 4 dias in vitro (DIV), as células devem estar amplamente livres de detritos, com a maioria das células aderindo ao fundo do frasco. Os astrócitos começarão a formar processos mais longos, enquanto a micróglia assumirá uma forma oval com fusos mais curtos (Figura 2). Em 7 DIV, os astrócitos devem formar uma camada confluente conectada, e a micróglia deve exibir processos cada vez mais curtos (Figura 3).
A pureza pode ser confirmada pela dupla marcação de células ACSA2 com GFAP e O4 para avaliar a contaminação por oligodendrócitos em culturas de astrócitos e células classificadas como CD11b com Iba1 e GFAP para avaliar a contaminação de astrócitos em culturas de micróglia (Tabela 1).
Um protocolo bem-sucedido também produzirá RNA de alta qualidade com degradação mínima e quantidade suficiente (Figura 4A). Eletroferogramas de RNA extraído de células isoladas devem exibir picos proeminentes de 18S e 28S. A superdissociação das células ou o tempo prolongado entre a perfusão e a triagem celular podem levar à degradação do RNA (Figura 4B). A dissociação enzimática e/ou mecânica insuficiente ou a remoção inadequada da mielina podem resultar em redução do rendimento celular e do RNA (Figura 4C). Astrócitos isolados podem ser sequenciados para identificar marcadores inflamatórios. A comparação de astrócitos saudáveis com astrócitos ativados por inflamação (por exemplo, de um animal experimental com encefalomielite autoimune) revelará inibições relativas de vias inflamatórias em astrócitos saudáveis versus inflamatórios (Figura 4D).
Figura 1: Visão geral do preparo da medula espinhal, dissociação tecidual e classificação celular. A figura fornece uma visão geral do processo de preparação da medula espinhal, incluindo dissociação tecidual e classificação celular. Após a dissecção medular, os tecidos sofrem dissociação enzimática e mecânica. A mielina é removida e as células são marcadas com anticorpos anti-ACSA2 ou anti-CD11b para atingir astrócitos e micróglia. As células classificadas podem então ser utilizadas para cultura celular e análise de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de contraste de fase dos astrócitos e da micróglia aos 4 dias in vitro (4DIV). (A) Apresenta um exemplo representativo de células classificadas ACSA2+ com processos estendidos. (B) As células CD11b+ exibem corpos celulares ovais e processos curtos. Barra de escala = 50 μm. Esse número é adaptado de Ahn, J. J. et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens fluorescentes de astrócitos e micróglia aos 8 dias in vitro (8DIV). (A) As células ACSA2+ marcadas com GFAP (verde) e O4 (vermelho) exibem coloração mínima de O4 e formam uma camada confluente conectada de astrócitos. (B) células CD11b+ marcadas com Iba1 (verde) e GFAP (vermelho) apresentam presença mínima de GFAP. Barra de escala = 50 μm. Esse número é adaptado de Ahn, J. J. et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Eletroferogramas representativos das amostras de RNA. (A) Espera-se RNA de alto rendimento e alta qualidade após um isolamento celular bem-sucedido. (B) RNA de baixo rendimento, baixa qualidade ou (C) baixo rendimento e alta qualidade podem ser esperados em casos de morte celular, dissociação insuficiente ou remoção inadequada de detritos. (D) A análise de sequenciamento de RNA de vias inflamatórias selecionadas em astrócitos saudáveis versus astrócitos inflamatórios revela relativa inibição da inflamação em astrócitos saudáveis classificados em comparação com astrócitos inflamatórios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de célula | Contagem total de células | Células classificadas | % Classificado/Total | Viabilidade média % |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabela 1: Rendimento, pureza e viabilidade celular após a classificação para células ACSA-2 e CD11b. Esta tabela é adaptada de Ahn, J. J. et al.16.
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Discussion
O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura celular, citometria de fluxo, histologia e estudos transcriptômicos.
A velocidade de preparação da medula espinhal desempenha um papel crucial para garantir a viabilidade e o rendimento celular ideais. Embora seja imperativo alcançar a depuração efetiva das hemácias durante a perfusão cardíaca, o número de células isoladas pode variar amplamente com base no tempo decorrido entre a perfusão cardíaca e a dissociação enzimática. Observamos que o início da dissociação tecidual mais de 10 min após a perfusão cardíaca levou à diminuição da viabilidade celular. Além disso, a duração da dissociação enzimática inferior a 30 min mostrou-se ineficaz, deixando fragmentos de tecido não digeridos e reduzindo o rendimento celular.
Embora a eliminação completa da dissociação mecânica (como trituração ou picagem) não tenha afetado a viabilidade celular, ela resultou em menos células isoladas devido à presença de fragmentos de tecido não digeridos. A combinação de métodos mecânicos com dissociação enzimática mostrou-se a abordagem mais eficaz para o isolamento celular. No entanto, vale ressaltar que algum nível de estresse celular inevitavelmente ocorre durante a dissociação tecidual, potencialmente impactando estudostranscriptômicos18. Esse é um desafio comum aos procedimentos de dissociação tecidual do SNC19. No entanto, métodos de trituração suave demonstraram minimizar a morte celular, a ativação de transcritos estranhos e a proteólise indesejada16. Além disso, embora células viáveis possam ser obtidas eliminando totalmente a dissociação mecânica, isso pode exigir o uso de animais adicionais. Por uma questão de reprodutibilidade, recomenda-se complementar a dissociação enzimática com corte suave e trituração para maximizar o rendimento celular por medula espinhal. No entanto, os pesquisadores podem optar por modificar o protocolo, eliminando a trituração ou o corte se os alvos de seu estudo forem altamente sensíveis ao estresse celular e exigirem dissociação mínima.
Em resumo, a integração de etapas suaves de dissociação e preparação rápida do tecido garante o rendimento e a viabilidade celulares ideais. A flexibilidade do protocolo é reforçada pela opção de substituir meios frios por meios quentes para manter as células em cultura. Esta metodologia foi otimizada para aplicação em modelos animais de 10 semanas a pelo menos 5 meses de idade, incluindo modelos de doenças.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
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