Summary
Denne protokollen skisserer isoleringen av rensede astrocytter og mikroglia fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter påfølgende applikasjoner som RNA-analyse og cellekultur. Den inneholder detaljerte celledissosiasjonsmetoder og prosedyrer designet for å forbedre både kvaliteten og utbyttet av isolerte celler.
Abstract
Astrocytter og mikroglia spiller sentrale roller i utvikling av sentralnervesystemet, skaderesponser og nevrodegenerative sykdommer. Disse svært dynamiske cellene utviser raske responser på miljøendringer og viser betydelig heterogenitet når det gjelder morfologi, transkripsjonsprofiler og funksjoner. Mens vår forståelse av funksjonene til gliaceller i helse og sykdom har avansert betydelig, er det fortsatt behov for in vitro, cellespesifikke analyser utført i sammenheng med fornærmelser eller skader for å omfattende karakterisere forskjellige cellepopulasjoner. Isolering av celler fra den voksne musen gir flere fordeler i forhold til cellelinjer eller nyfødte dyr, da det muliggjør analyse av celler under patologiske forhold og på bestemte tidspunkter. Videre muliggjør fokus på ryggmargsspesifikk isolasjon, unntatt hjernens involvering, forskning på ryggmargspatologier, inkludert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, ryggmargsskade og amyotrofisk lateral sklerose. Denne protokollen presenterer en effektiv metode for å isolere astrocytter og mikroglia fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter umiddelbar eller fremtidig analyse med potensielle anvendelser i funksjonelle, molekylære eller proteomiske nedstrømsstudier.
Introduction
Astrocytter og mikroglia er allsidige gliaceller som spiller viktige roller i sentralnervesystemet (CNS), som omfatter ansvar som å regulere nevronfunksjonen, bidra til CNS-utvikling, opprettholde blod-hjernebarrieren og delta i andre kritiske prosesser 1,2,3,4 . Foruten deres rolle i å opprettholde homeostase, spiller disse gliacellene også en sentral rolle i skade- og reparasjonsmekanismer. Mikroglia er kjent for sine fagocytiske, inflammatoriske og migrerende evner etter fornærmelser eller skader 5,6,7. Astrocytresponser ved sykdom er like varierte, og omfatter bidrag til betennelse, dannelse av gliaarr og kompromiss av blod-hjernebarrieren 8,9. Selv om vår forståelse av de skadelige og reparerende rollene til mikroglia og astrocytter i CNS har vokst, krever den iboende heterogeniteten i både struktur og funksjon robuste verktøy for å studere dem i ulike sammenhenger.
Å få ytterligere innsikt i rollene til mikroglia og astrocytter i helse og sykdom krever en kombinert tilnærming av in vivo og in vitro undersøkelser. In vivo-teknikker utnytter den intrikate crosstalken mellom gliaceller og nevroner i CNS, mens in vitro-metoder viser seg å være verdifulle når man vurderer enkeltcellefunksjoner eller responser under spesifikke stimuli. Hver metode gir unike fordeler; In vitro-studier er avgjørende for å forstå de spesifikke rollene til disse celletypene uten direkte eller indirekte innspill fra naboceller. I tillegg gir in vitro-analyser ved bruk av udødelige cellelinjer visse fordeler, inkludert evnen til å spre seg på ubestemt tid, kostnadseffektivitet og enkel vedlikehold. Det er imidlertid viktig å merke seg at primære celler nærmer seg normale fysiologiske responser sammenlignet med cellelinjer. Denne fysiologiske relevansen er avgjørende i funksjonelle analyser og transkriptomiske analyser.
En av utfordringene med å skaffe primære celler, spesielt fra den voksne musens ryggmarg, ligger i mengden og levedyktigheten til prøvene. Den voksne ryggmargen, som er mindre enn hjernen og inneholder en betydelig mengde myelin, utgjør unike vanskeligheter. Mens det er flere publiserte protokoller som beskriver isolering av rene, levedyktige gliaceller fra nyfødte dyr eller den voksne musehjernen 10,11,12,13, kan disse metodene ikke være egnet for å studere sykdommer og skader som er spesifikke for ryggmargen. I denne protokollen tilbyr vi en omfattende prosedyre for effektivt å isolere rene, levedyktige mikroglia og astrocytter fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter nedstrøms applikasjoner i cellekultur og transkriptomiske analyser. Denne protokollen har blitt brukt til å isolere disse cellene fra voksne mus i alderen 10 uker til 5 måneder, og demonstrerer bruken i ulike sammenhenger, inkludert studier som involverer betingede knockoutmus, legemiddelresponser, utviklingsforskning og aldersrelaterte modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrepleie- og eksperimentelle prosedyrer ble utført etter godkjenning av Animal Care and Use Committee ved The George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, DC, USA; IACUC#2021-004). Studien benyttet mannlige og kvinnelige C57BL / 6J villtype (WT) mus i alderen 10 uker til 5 måneder, som ble hentet fra en kommersiell leverandør (se materialtabell) og plassert på The George Washington University. En oversikt over protokollarbeidsflyten er presentert i figur 1.
1. Forberedelse av ryggmargen
- Bedøv dyrene med Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribromoetanol og 2,5 % 2-metyl-2-butanol i sterilt vann) (se materialfortegnelse). Bekreft fraværet av respons på tå og hale klemmer i musene.
- Utfør hjerteperfusjon med kald 1x Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) for å fjerne mononukleære celler i perifert blod.
- Plasser dyret på et grunt brett og gjør et lateralt snitt for å eksponere pleurhulen. Sett en 23 G perfusjonskanyle koblet til en peristaltisk pumpe (se materialfortegnelsen) inn i venstre ventrikkel og aktiver pumpen. Når det er kaldt DPBS strømmer gjennom hjertet, lag et lite snitt i høyre atrium.
MERK: En raskere perfusjonshastighet foretrekkes i dette trinnet for å forbedre cellens levedyktighet. Blodet skal skylles ut på under 1 min. Rydding av leveren indikerer vellykket perfusjon.
- Plasser dyret på et grunt brett og gjør et lateralt snitt for å eksponere pleurhulen. Sett en 23 G perfusjonskanyle koblet til en peristaltisk pumpe (se materialfortegnelsen) inn i venstre ventrikkel og aktiver pumpen. Når det er kaldt DPBS strømmer gjennom hjertet, lag et lite snitt i høyre atrium.
- Halshugg dyret med stor saks og fjern ryggsøylen14. Senk den i kald 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2% glukose i en petriskål på is for vevsskylling.
- Fra og med nå, sørg for at alle trinnene utføres i et sterilt miljø. Bruk hydraulisk ekstrudering14 for å isolere hele ryggmargen. Bruk en 18 G kanyle og en 10 ml sprøyte fylt med kald 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2% glukose. Overfør ryggmargen til en petriskål plassert på isposer som inneholder tilstrekkelig kald 1x DPBS med Ca2 + / Mg2 + / 0,2% glukose for å senke hele vevet.
- Fjern forsiktig meningene under et mikroskop i en laminær strømningshette. Overfør ryggmargen til en tom petriskål på isposer, og bruk en kirurgisk skalpell nr. 10 til å kutte hele ryggmargen i 2-3 mm seksjoner.
2. Enzymatisk celledissosiasjon
- Tilsett Enzyme mix 1 og Enzyme mix 2 fra det kommersielt tilgjengelige Adult Brain Dissociation Kit etter produsentens protokoll (se Materialfortegnelse). Virvle enzymene i fatet flere ganger for å sikre jevnt belegg i ryggmargen, og inkuber deretter ved 37 °C i 30 minutter. Hvert 5. minutt, virvle fatet forsiktig for å forhindre at vev klumper seg og letter jevn fordeling av reagenser.
- Fjern parabolen fra inkubatoren og tilsett 350 μL 0,46 mg/ml DNAse I i minimalt essensielt medium (MEM) (se materialfortegnelse). Bland ved forsiktig virvling.
- Tilsett 1 ml kaldt DMEM / 0,5% Fetal Bovine Serum (FBS) og bland ved forsiktig virvling. Overfør umiddelbart hele innholdet til et 5 ml rør.
3. Mekanisk celledissosiasjon
- Bruk en P1000-pipette til å triturere vevet forsiktig tre ganger, slik at vevsbitene trekkes opp hver gang for å dissosiere vevet ytterligere. Deretter bruker du en plugget 9" Pasteur-pipette til å triturere forsiktig fem ganger til, slik at det ikke genereres bobler under prosessen.
- Plasser 5 ml røret oppreist og la vevet sette seg i bunnen i 30 s. Når vevet har lagt seg, trekkes supernatanten opp ved hjelp av en P1000-pipette og føres gjennom et 30 μm filter til et 15 ml konisk rør.
- Til det samme 5 ml røret med gjenværende vev, tilsett 1 ml kald DMEM / 0,5% FBS. Bruk en Pasteur-pipette, triturer forsiktig tre ganger.
- La vevet legge seg på bunnen i 30 s, før deretter supernatanten gjennom et 30 μm filter og samle det inn i det samme 15 ml røret som før. Gjenta trinn 3.3 og trinn 3.4 en gang til.
- Sentrifuger den filtrerte cellesuspensjonen ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Fjern og kast forsiktig den resulterende supernatanten ved hjelp av en vakuumaspirator.
4. Fjerning av Myelin
- Fjern myelin ved hjelp av ruskfjerningsløsningen (DRS) som følger med i Adult Brain Dissociation Kit etter produsentens protokoll. Etter fjerning av rusk, tilsett 5 ml kald DMEM / 0.5% FBS til cellepelleten og snu røret forsiktig tre ganger. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
MERK: Hvis cellene skal brukes til in vitro-studier og vil forbli i kultur, bør forvarmet DMEM / 0.5% FBS brukes i stedet. - Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml DPBS/0,5 % FBS (kald for RNA-studier og varm for in vitro-analyser ). Telle cellene og vurdere levedyktigheten ved hjelp av Trypan Blue.
MERK: Cellesuspensjoner fra flere dyr kan kombineres for å øke cellekonsentrasjonen. - Vask cellene ved å legge DPBS / 0,5% FBS opp til et totalt volum på 5 ml. Sentrifuger suspensjonen ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten med en pipette.
5. Mikroglia og astrocyttisolasjon
- Merk cellene med anti-CD11b eller anti-ACSA-2 mikroperler etter produsentens protokoll (se Materialfortegnelse).
- Sorter cellene etter positivt utvalg ved hjelp av MS-kolonnene i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse). Etter sortering, sentrifuger de sorterte cellene ved 300 x g i 10 minutter og kast supernatanten.
6. Pletteringsceller for in vitro-analyser
MERK: Hvis celler ikke vil bli belagt og vil bli brukt umiddelbart for RNA-analyse, fortsett til trinn 8.
- Resuspender cellene i 1 ml varm DMEM / 0,5% FBS. Telle cellene og vurdere deres levedyktighet ved hjelp av et hemacytometer (se materialtabell).
- Juster cellekonsentrasjonen til 75 000 celler per 50 μL. Tilsett 50 μL av cellesuspensjonen til hvert poly-L-lysinbelagt deksel11 i en 24-brønnsplate.
- Inkuber ved 37 °C i 2 timer slik at cellene fester seg til dekselet.
- Tilsett forsiktig 450 μL varm DMEM / 5% FBS / Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep, se materialtabell) til hver brønn.
- Etter 3 dager, bytt halvparten av mediet med 250 μL varm DMEM / 5% FBS / Pen-Strep. For vedlikehold, bytt ut mediet helt med 500 μL varm DMEM / 5% FBS / Pen-Strep hver 4-5 dag.
7. Immunhistokjemi
MERK: Det er best å utføre immunhistokjemiske analyser etter minst 3 dager når mediet har blitt erstattet minst en gang. Dette sikrer at rusk er fjernet og celler har festet seg helt til dekselet.
- Fjern mediet og merk cellene med anti-mus mAb O4 (1:100) (se materialfortegnelse) i varmt DMEM / 5% FBS / 10% normalt geitserum (NGS) i 15 minutter ved romtemperatur (RT) eller ved 37 ° C.
MERK: Hopp over dette trinnet og fortsett til trinn 7.3 hvis cellene ikke vil bli merket med O4. - Skyll forsiktig dekslene ved å dyppe dem i varm DMEM / 5% FBS tre ganger. Legg geit anti-mus 594 IgM (1: 300) (se tabell over materialer) i varm DMEM / 5% FBS / 10% NGS og ruge på RT i 15 min i mørket. Skyll forsiktig tre ganger i varm DMEM / 5% FBS.
- Fiks cellene med kald 5% eddiksyre/metanol i 15 min ved 4 °C. Vask tre ganger med 1x PBS, og merk deretter med riktig antistoff: antikanin GFAP (1: 500), anti-mus GFAP (1: 500) eller antikanin Iba1 (1: 500) i 1% Triton-X100 / 10% NGS i 1x DPBS (se materialfortegnelse). Inkubere i 1 time ved RT.
MERK: Hold dekkslips i mørket hvis de allerede har blitt farget med O4. - Skyll forsiktig tre ganger med PBS. Merk med passende sekundært antistoff: anti-mus 594 IgG (1: 500), antikanin 488 IgG (1: 500) (se materialfortegnelse). Inkuber i 30 min ved RT i mørket.
- Skyll forsiktig tre ganger med PBS. Motbeis med DAPI (1: 1000) i 1 min ved RT. Skyll tre ganger med PBS, legg til monteringsmedium (se materialfortegnelse), og monter deksler på lysbilder.
8. RNA-ekstraksjon
MERK: Ideelt sett bør det være minst 100 000 celler for å trekke ut tilstrekkelig RNA for analyse. Om nødvendig kan celler fra 2-3 ryggmargen kombineres.
- Pakk ut RNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA-isolasjonssett etter produsentens protokoll (se Materialfortegnelse). For hvert vasketrinn med RW1-vaskebufferen som følger med i settet, la cellene ligge i vaskebufferen i ytterligere 2 minutter.
- Fjern eventuelt gjenværende genomisk DNA ved hjelp av DNase I i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). Inkuber med DNase ved RT i 15 minutter, vask deretter med RW1-buffer.
- For å øke RNA-utbyttet, før eluering, inkuber prøvene i RNAse-fritt vann ved RT i 10 minutter. Vurdere RNA-integritet og -mengde ved hjelp av en bioanalysator15 (se materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodene som er skissert i denne protokollen muliggjør isolering av rene og levedyktige mikroglia og astrocytter fra ryggmargen til den voksne musen, noe som letter ulike nedstrømsapplikasjoner, inkludert in vitro funksjonelle eller histologiske analyser og RNA-analyse.
En vellykket isolering for in vitro-studier vil resultere i kontinuerlig celleproliferasjon over flere dager. Voksne celler viser en langsommere spredningshastighet sammenlignet med celler isolert fra nyfødte dyr, og noe rusk kan være tilstede de første dagene. Ved 4 dager in vitro (DIV) bør cellene stort sett være fri for rusk, med de fleste celler som fester seg til kolbebunnen. Astrocytter vil begynne å danne lengre prosesser, mens mikroglia vil anta en oval form med kortere spindler (figur 2). Ved 7 DIV skal astrocytter danne et sammenhengende konfluerende lag, og mikroglia skal vise færre og kortere prosesser (figur 3).
Renhet kan bekreftes ved dobbeltmerking av ACSA2-sorterte celler med GFAP og O4 for å vurdere oligodendrocyttforurensning i astrocyttkulturer og CD11b-sorterte celler med Iba1 og GFAP for å evaluere astrocyttforurensning i mikrogliakulturer (tabell 1).
En vellykket protokoll vil også gi RNA av høy kvalitet med minimal nedbrytning og tilstrekkelig mengde (figur 4A). Elektroferogrammer av RNA ekstrahert fra isolerte celler bør vise fremtredende 18S og 28S topper. Overdissosiasjon av celler eller lengre tid mellom perfusjon og cellesortering kan føre til RNA-nedbrytning (figur 4B). Utilstrekkelig enzymatisk og/eller mekanisk dissosiasjon eller utilstrekkelig myelinfjerning kan resultere i redusert celleutbytte og RNA (figur 4C). Isolerte astrocytter kan sekvenseres for å identifisere betennelsesmarkører. Sammenligning av friske astrocytter med inflammasjonsaktiverte astrocytter (f.eks. fra et eksperimentelt autoimmunt encefalomyelittdyr) vil avsløre relative hemminger av inflammatoriske veier i friske versus inflammatoriske astrocytter (figur 4D).
Figur 1 Oversikt over ryggmargspreparering, vevsdissosiasjon og cellesortering. Figuren gir en oversikt over prosessen med klargjøring av ryggmargen, inkludert vevsdissosiasjon og cellesortering. Etter ryggmargsdisseksjon gjennomgår vev enzymatisk og mekanisk dissosiasjon. Myelin fjernes, og celler er merket med anti-ACSA2 eller anti-CD11b antistoffer for å målrette astrocytter og mikroglia. De sorterte cellene kan deretter brukes til cellekultur og RNA-analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fasekontrastbilder av astrocytter og mikroglia ved 4 dager in vitro (4DIV). (A) Viser et representativt eksempel på ACSA2+ sorterte celler med utvidede prosesser. (B) CD11b + celler viser ovalformede cellelegemer og korte prosesser. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescerende bilder av astrocytter og mikroglia ved 8 dager in vitro (8DIV). (A) ACSA2+-celler merket med GFAP (grønn) og O4 (rød) viser minimal O4-farging og danner et sammenhengende konfluent lag av astrocytter. (B) CD11b+-celler merket med Iba1 (grønn) og GFAP (rød) viser minimal tilstedeværelse av GFAP. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative elektroferogrammer av RNA-prøver. (A) Høyt utbytte, høy kvalitet RNA forventes etter en vellykket celleisolasjon. (B) Lavt utbytte, RNA av lav kvalitet eller (C) lavt utbytte, RNA av høy kvalitet kan forventes i tilfeller av celledød, utilstrekkelig dissosiasjon eller utilstrekkelig fjerning av rusk. (D) RNA-sekvenseringsanalyse av utvalgte inflammatoriske veier i friske astrocytter versus inflammatoriske astrocytter avslører relativ hemming av betennelse i sorterte friske astrocytter sammenlignet med inflammatoriske astrocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Celletype | Totalt antall celler | Sorterte celler | % sortert/totalt | Gjennomsnitt% levedyktighet |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabell 1: Celleutbytte, renhet og levedyktighet etter sortering for ACSA-2- og CD11b-celler. Denne tabellen er tilpasset fra Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering av rene, levedyktige primærceller er avgjørende for å undersøke strukturen og funksjonen til spesifikke celletyper. Hos den voksne musen, spesielt i ryggmargen, byr denne oppgaven på betydelige utfordringer, da eksisterende protokoller ofte ikke er tilpasset den voksne ryggmargen10,17. Denne protokollen presenterer en effektiv og kostnadseffektiv metode som gjelder for ulike nedstrømsapplikasjoner, inkludert cellekultur, flowcytometri, histologi og transkriptomiske studier.
Hastigheten til ryggmargsforberedelse spiller en avgjørende rolle for å sikre optimal celle levedyktighet og utbytte. Selv om det er viktig å oppnå effektiv clearance av røde blodlegemer under hjerteperfusjon, kan antall isolerte celler variere mye basert på tiden som går mellom hjerteperfusjon og enzymatisk dissosiasjon. Vi observerte at initiering av vevsdissosiasjon mer enn 10 minutter etter hjerteperfusjon førte til redusert cellelevedyktighet. I tillegg viste enzymatisk dissosiasjonsvarighet på mindre enn 30 minutter seg å være ineffektiv, og etterlot ufordøyde vevsfragmenter og reduserte celleutbyttet.
Selv om fullstendig eliminering av mekanisk dissosiasjon (som triturering eller hakking) ikke påvirket cellens levedyktighet, resulterte det i færre celler isolert på grunn av tilstedeværelsen av ufordøyd vevfragmenter. En kombinasjon av mekaniske metoder med enzymatisk dissosiasjon viste seg å være den mest effektive tilnærmingen for celleisolasjon. Det er imidlertid verdt å merke seg at et visst nivå av cellulær stress uunngåelig oppstår under vevsdissosiasjon, noe som potensielt påvirker transkriptomiske studier18. Dette er en vanlig utfordring med prosedyrer for CNS-vevsdissosiasjon19. Likevel har milde tritureringsmetoder vist seg å minimere celledød, ekstern transkripsjonsaktivering og uønsket proteolyse16. Videre, selv om levedyktige celler kan oppnås ved å eliminere mekanisk dissosiasjon helt, kan dette nødvendiggjøre bruk av flere dyr. For reproduserbarhetens skyld anbefales det å komplementere enzymatisk dissosiasjon med forsiktig hakking og triturering for å maksimere celleutbyttet per ryggmarg. Forskere kan imidlertid velge å endre protokollen ved å eliminere triturering eller hakking hvis studiens mål er svært følsomme for cellulær stress og krever minimal dissosiasjon.
Oppsummert sikrer integreringen av milde dissosiasjonstrinn og rask vevsforberedelse optimalt celleutbytte og levedyktighet. Protokollfleksibilitet forbedres av muligheten til å erstatte kalde medier med varme medier for å opprettholde celler i kultur. Denne metoden er optimalisert for bruk i dyremodeller fra 10 uker til minst 5 måneder gamle, inkludert sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi takker Castle Raley ved George Washington University Genomics Core for RNA-analyser og Q2 Lab Solutions for RNA-sekvenseringsanalyser. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke [tilskuddsnummer F31NS117085] og Vivian Gill Research Endowment til Dr. Robert H. Miller. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
