Summary
В этом протоколе описывается выделение очищенных астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, что облегчает последующие применения, такие как анализ РНК и культивирование клеток. Он включает в себя подробные методы и процедуры клеточной диссоциации, предназначенные для повышения качества и выхода изолированных клеток.
Abstract
Астроциты и микроглия играют ключевую роль в развитии центральной нервной системы, реакциях на травмы и нейродегенеративных заболеваниях. Эти высокодинамичные клетки демонстрируют быструю реакцию на изменения окружающей среды и демонстрируют значительную гетерогенность с точки зрения морфологии, транскрипционных профилей и функций. Несмотря на то, что наше понимание функций глиальных клеток в норме и при болезнях значительно продвинулось, по-прежнему существует потребность в клеточно-специфическом анализе in vitro, проводимом в контексте повреждений или травм, чтобы всесторонне охарактеризовать отдельные клеточные популяции. Изоляция клеток взрослой мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточными линиями или новорожденными животными, поскольку позволяет проводить анализ клеток в патологических условиях и в определенные моменты времени. Кроме того, сосредоточение внимания на специфической изоляции спинного мозга, исключая поражение головного мозга, позволяет исследовать патологии спинного мозга, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, травму спинного мозга и боковой амиотрофический склероз. Этот протокол представляет собой эффективный метод выделения астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, облегчающий немедленный или будущий анализ с потенциальными приложениями в функциональных, молекулярных или протеомных исследованиях.
Introduction
Астроциты и микроглия являются универсальными глиальными клетками, которые играют жизненно важную роль в центральной нервной системе (ЦНС), выполняя такие обязанности, как регуляция функции нейронов, содействие развитию ЦНС, поддержание гематоэнцефалического барьера и участие в других критических процессах 1,2,3,4 . Помимо своей роли в поддержании гомеостаза, эти глиальные клетки также играют ключевую роль в механизмах повреждения и восстановления. Микроглия хорошо известна своими фагоцитарными, воспалительными и миграционными способностями после инсультов или травм 5,6,7. Реакция астроцитов при заболевании столь же разнообразна, включая вклад в воспаление, образование глиальных рубцов и нарушение гематоэнцефалического барьера 8,9. Несмотря на то, что наше понимание пагубной и репаративной роли микроглии и астроцитов в ЦНС выросло, присущая им гетерогенность как в структуре, так и в функциях требует надежных инструментов для их изучения в различных контекстах.
Для получения более глубокого понимания роли микроглии и астроцитов в здоровье и заболевании требуется комбинированный подход исследований in vivo и in vitro . Методы in vivo используют сложные перекрестные помехи между глиальными клетками и нейронами в ЦНС, в то время как методологии in vitro оказываются полезными при оценке функций или ответов отдельных клеток под конкретными стимулами. Каждый метод обладает уникальными преимуществами; Исследования in vitro необходимы для понимания специфической роли этих типов клеток без прямого или косвенного влияния соседних клеток. Кроме того, анализы in vitro с использованием бессмертных клеточных линий имеют определенные преимущества, включая способность к бесконечному размножению, экономическую эффективность и простоту обслуживания. Тем не менее, важно отметить, что первичные клетки более точно имитируют нормальные физиологические реакции по сравнению с клеточными линиями. Эта физиологическая значимость имеет решающее значение в функциональных анализах и транскриптомных анализах.
Одна из проблем при получении первичных клеток, особенно из спинного мозга взрослой мыши, заключается в количестве и жизнеспособности образцов. Спинной мозг взрослого человека, будучи меньше головного мозга и содержащий значительное количество миелина, представляет собой уникальные трудности. Несмотря на то, что существует несколько опубликованных протоколов с подробным описанием выделения чистых, жизнеспособных глиальных клеток из неонатальных животных или головного мозга взрослой мыши 10,11,12,13, эти методики могут не подходить для изучения заболеваний и травм, специфичных для спинного мозга. В этом протоколе мы предлагаем комплексную процедуру эффективного выделения чистой, жизнеспособной микроглии и астроцитов из спинного мозга взрослой мыши, облегчая последующее применение в клеточных культурах и транскриптомных анализах. Этот протокол был успешно использован для изоляции этих клеток от взрослых мышей в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, демонстрируя его полезность в различных контекстах, включая исследования с участием мышей с условным нокаутом, реакцию на лекарственные препараты, исследования развития и возрастные модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были проведены после одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Школе медицины и медицинских наук Университета Джорджа Вашингтона (Вашингтон, округ Колумбия, США; IACUC#2021-004). В исследовании использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J (WT) в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, которые были получены от коммерческого поставщика (см. таблицу материалов) и размещены в Университете Джорджа Вашингтона. Обзор рабочего процесса протокола представлен на рисунке 1.
1. Подготовка спинного мозга
- Обезболивайте животных препаратом Авертин (12,5 мг/мл 2,2,2-трибромэтанола и 2,5% 2-метил-2-бутанола в стерильной воде) (см. таблицу материалов). Подтвердите отсутствие реакции на пощипывание пальцев ног и хвостов у мышей.
- Выполняйте сердечную перфузию с помощью холодного 1x фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) для удаления мононуклеарных клеток периферической крови.
- Поместите животное на неглубокий лоток и сделайте боковой разрез, чтобы обнажить плевральную полость. Введите перфузионную иглу 23 G, подключенную к перистальтическому насосу (см. таблицу материалов), в левый желудочек и активируйте помпу. После того, как холодный ДПБС пройдет через сердце, сделайте небольшой разрез в правом предсердии.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предпочтительна более высокая скорость перфузии для повышения жизнеспособности клеток. Кровь должна быть смыта менее чем за 1 минуту. Очищение печени свидетельствует об успешной перфузии.
- Поместите животное на неглубокий лоток и сделайте боковой разрез, чтобы обнажить плевральную полость. Введите перфузионную иглу 23 G, подключенную к перистальтическому насосу (см. таблицу материалов), в левый желудочек и активируйте помпу. После того, как холодный ДПБС пройдет через сердце, сделайте небольшой разрез в правом предсердии.
- Обезглавьте животное большими ножницами и удалите позвоночный столб14. Погрузите его в холодный 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы в чашке Петри на льду для полоскания тканей.
- Начиная с этого момента, убедитесь, что все этапы выполняются в стерильной среде. Используйте гидравлическую экструзию14 для изоляции всего спинного мозга. Используйте иглу 18 G и шприц объемом 10 мл, наполненный холодным 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы. Перенесите спинной мозг в чашку Петри, помещенную на пакеты со льдом, содержащие достаточное количество холодного 1x DPBS с Ca2+/Mg2+/0,2% глюкозы, чтобы погрузить всю ткань.
- Осторожно удалите мозговые оболочки под микроскопом в ламинарном колпаке. Перенесите спинной мозг в пустую чашку Петри на пакетах со льдом и с помощью хирургического скальпеля с лезвием No 10 разрежьте весь спинной мозг на отрезки по 2-3 мм.
2. Ферментативная диссоциация клеток
- Добавьте смесь ферментов 1 и смесь ферментов 2 из коммерчески доступного набора для диссоциации мозга у взрослых в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Перемешайте ферменты в чашке несколько раз, чтобы обеспечить равномерное покрытие спинного мозга, затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Каждые 5 минут аккуратно встряхивайте чашку, чтобы предотвратить слипание тканей и способствовать равномерному распределению реагентов.
- Извлеките чашку из инкубатора и добавьте 350 мкл 0,46 мг/мл ДНКазы I в минимальную эссенциальную среду (МЭМ) (см. таблицу материалов). Перемешайте, аккуратно взбивая.
- Добавьте 1 мл холодной сыворотки DMEM/0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и перемешайте, слегка взбалтывая. Сразу же перелейте все содержимое в пробирку объемом 5 мл.
3. Механическая диссоциация клеток
- С помощью пипетки P1000 аккуратно растирайте ткань три раза, каждый раз следя за тем, чтобы кусочки ткани вытягивались для дальнейшего диссоциирования ткани. Затем, используя заткнутую стеклянную пипетку Пастера диаметром 9 дюймов, осторожно разотрите еще пять раз, следя за тем, чтобы во время процесса не образовывались пузырьки.
- Поместите пробирку объемом 5 мл вертикально и дайте ткани осесть на дне в течение 30 с. После того, как ткань осядет, наберите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 и пропустите ее через фильтр 30 мкм в коническую пробирку объемом 15 мл.
- В ту же пробирку объемом 5 мл с оставшейся тканью добавляют 1 мл холодного ДМЕМ/0,5% FBS. С помощью пипетки Пастера аккуратно разотрите три раза.
- Дайте ткани осесть на дне в течение 30 с, затем пропустите надосадочную жидкость через фильтр 30 мкм и соберите ее в ту же пробирку объемом 15 мл, что и раньше. Повторите шаги 3.3 и 3.4 еще раз.
- Центрифугируют отфильтрованную клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Аккуратно извлеките и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора.
4. Удаление миелина
- Удалите миелин с помощью раствора для удаления мусора (DRS), входящего в комплект для диссоциации мозга взрослого человека, в соответствии с протоколом производителя. После удаления мусора добавьте 5 мл холодного DMEM/0,5% FBS к грануле ячейки и осторожно переверните пробирку три раза. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут использоваться для исследований in vitro и останутся в культуре, вместо них следует использовать предварительно подогретый DMEM/0,5% FBS. - Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DPBS/0,5% FBS (холодный для исследований РНК и теплый для анализов in vitro ). Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью Trypan Blue.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные суспензии нескольких животных могут быть объединены для увеличения концентрации клеток. - Промойте клетки, добавив DPBS/0,5% FBS до общего объема 5 мл. Центрифугу суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
5. Выделение микроглии и астроцитов
- Пометьте клетки микрогранулами анти-CD11b или анти-ACSA-2 в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов).
- Отсортируйте ячейки методом положительного отбора с помощью столбцов MS в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). После сортировки центрифугируют отсортированные клетки при 300 x g в течение 10 мин и выбрасывают надосадочную жидкость.
6. Гальванические ячейки для анализов in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не будут покрыты плакировкой и будут использоваться сразу для анализа РНК, перейдите к шагу 8.
- Ресуспендант клеток в 1 мл теплого ДМЭМ/0,5% FBS. Подсчитайте количество клеток и оцените их жизнеспособность с помощью гемацитометра (см. таблицу материалов).
- Отрегулируйте концентрацию клеток до 75 000 клеток на 50 мкл. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии к каждому покрытию 11 с поли-L-лизиновым покрытием11 в 24-луночном планшете.
- Инкубируют при 37 °C в течение 2 ч, чтобы клетки прилипли к покровному стеклу.
- Осторожно добавьте в каждую лунку 450 мкл теплого DMEM/5% FBS/пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptoctin, см. таблицу материалов).
- Через 3 дня замените половину носителя 250 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep. Для обслуживания полностью заменяйте носитель 500 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep каждые 4-5 дней.
7. Иммуногистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимический анализ лучше всего проводить не менее чем через 3 дня, когда среда была заменена хотя бы один раз. Это гарантирует, что мусор будет удален, а ячейки полностью прилипнут к покровному стеклу.
- Удалите носитель и пометьте клетки антимышиным mAb O4 (1:100) (см. Таблицу материалов) в теплой DMEM/5% FBS/10% обычной козьей сыворотке (NGS) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) или при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг и перейдите к шагу 7.3, если ячейки не будут помечены O4. - Аккуратно промойте покровные стекла, трижды окунув их в теплый DMEM/5% FBS. Добавьте козий антимышиный 594 IgM (1:300) (см. таблицу материалов) в теплый DMEM/5% FBS/10% NGS и инкубируйте при RT в течение 15 мин в темноте. Аккуратно прополощите три раза в теплом ДМЕМ/5% FBS.
- Зафиксируйте клетки холодной 5%-ной уксусной кислотой/метанолом в течение 15 мин при 4 °C. Промойте три раза 1x PBS, затем пометьте соответствующими антителами: антикроличий GFAP (1:500), антимышиный GFAP (1:500) или антикроличий Iba1 (1:500) в 1% Triton-X100/10% NGS в 1x DPBS (см. Таблицу материалов). Инкубируют в течение 1 ч при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните покровные листы в темноте, если они уже были испачканы O4. - Аккуратно смойте три раза PBS. Метка с соответствующими вторичными антителами: антимышиный 594 IgG (1:500), антикроличий 488 IgG (1:500) (см. таблицу материалов). Инкубируют в течение 30 мин при РТ в темноте.
- Аккуратно смойте три раза PBS. Контрокрашивать DAPI (1:1000) в течение 1 мин при RT. Трижды промыть PBS, добавить монтажную среду (см. Таблицу материалов) и установить покровные стекла на предметные стекла.
8. Экстракция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должно быть не менее 100 000 клеток, чтобы извлечь достаточное количество РНК для анализа. При необходимости могут быть объединены клетки из 2-3 спинного мозга.
- Экстрагируйте РНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Для каждого этапа промывки с помощью буфера для промывки RW1, входящего в комплект, оставляйте ячейки в буфере для стирки еще на 2 минуты.
- Удалите всю оставшуюся геномную ДНК с помощью ДНКазы I в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Инкубируют с ДНКазой при RT в течение 15 мин, затем промывают буфером RW1.
- Для увеличения выхода РНК перед элюированием образцы инкубируют в воде, не содержащей РНКазы, при РТ в течение 10 мин. Оценивают целостность и количество РНК с помощью биоанализатора15 (см. таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методы, описанные в этом протоколе, позволяют выделять чистую и жизнеспособную микроглию и астроциты из спинного мозга взрослой мыши, облегчая различные последующие применения, включая функциональные или гистологические анализы in vitro и анализ РНК.
Успешная изоляция для исследований in vitro приведет к непрерывной пролиферации клеток в течение нескольких дней. Взрослые клетки демонстрируют более медленную скорость пролиферации по сравнению с клетками, выделенными от новорожденных животных, и в первые несколько дней может присутствовать некоторый мусор. К 4 дням in vitro (DIV) клетки должны быть в значительной степени очищены от мусора, при этом большинство клеток прилипает ко дну колбы. Астроциты начнут формировать более длинные отростки, в то время как микроглия примет овальную форму с более короткими веретенами (рис. 2). К 7 DIV астроциты должны образовывать связанный сливающийся слой, а микроглия должна демонстрировать меньшее количество и более короткие процессы (рис. 3).
Чистота может быть подтверждена двойным мечением ACSA2-сортированных клеток с помощью GFAP и O4 для оценки контаминации олигодендроцитов в культурах астроцитов и CD11b-сортированных клеток с помощью Iba1 и GFAP для оценки контаминации астроцитов в культурах микроглии (табл. 1).
Успешный протокол также позволит получить высококачественную РНК с минимальной деградацией и достаточным количеством (рис. 4A). Электроферограммы РНК, выделенной из изолированных клеток, должны демонстрировать выраженные пики 18S и 28S. Чрезмерная диссоциация клеток или длительное время между перфузией и сортировкой клеток могут привести к деградации РНК (рис. 4B). Недостаточная ферментативная и/или механическая диссоциация или неадекватное удаление миелина могут привести к снижению выхода клеток и РНК (рис. 4C). Изолированные астроциты могут быть секвенированы для выявления маркеров воспаления. Сравнение здоровых астроцитов с астроцитами, активируемыми воспалением (например, у экспериментального животного с аутоиммунным энцефаломиелитом) выявит относительное ингибирование воспалительных путей в здоровых и воспалительных астроцитах (рис.
Рисунок 1: Обзор препарирования спинного мозга, диссоциации тканей и сортировки клеток. На рисунке представлен процесс подготовки спинного мозга, включая диссоциацию тканей и сортировку клеток. После рассечения спинного мозга ткани подвергаются ферментативной и механической диссоциации. Миелин удаляется, и клетки помечаются антителами против ACSA2 или CD11b, нацеленными на астроциты и микроглию. Отсортированные клетки затем могут быть использованы для клеточной культуры и анализа РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фазово-контрастные изображения астроцитов и микроглии на 4 дня in vitro (4DIV). (A) Изображен репрезентативный пример ACSA2+ отсортированных клеток с расширенными процессами. (B) Клетки CD11b+ имеют клеточные тела овальной формы и короткие отростки. Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра адаптирована из Ahn, J. J. et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Флуоресцентные изображения астроцитов и микроглии через 8 дней in vitro (8DIV). (A) Клетки ACSA2+, помеченные GFAP (зеленый) и O4 (красный), демонстрируют минимальное окрашивание O4 и образуют связанный сливающийся слой астроцитов. (B) CD11b+ клетки, помеченные Iba1 (зеленый) и GFAP (красный), демонстрируют минимальное присутствие GFAP. Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра адаптирована из Ahn, J. J. et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные электроферограммы образцов РНК. (A) После успешной изоляции клеток ожидается получение высококачественной РНК с высоким выходом. (B) Низкопродуктивная, низкокачественная РНК или (C) низкопродуктивная, высококачественная РНК может быть ожидаемой в случаях гибели клеток, недостаточной диссоциации или неадекватного удаления мусора. (D) Анализ секвенирования РНК отдельных воспалительных путей в здоровых астроцитах по сравнению с воспалительными астроцитами выявляет относительное ингибирование воспаления в отсортированных здоровых астроцитах по сравнению с воспалительными астроцитами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Тип ячейки | Общее количество ячеек | Отсортированные ячейки | % Отсортировано/Всего | Средний % жизнеспособности |
| АКСА2 | 6,3 х 105 | 1,7 х 105 | 27 | 92 |
| КД11б | 6,3 х 105 | 8,0 х 104 | 12.7 | 93 |
Таблица 1: Выход, чистота и жизнеспособность клеток после сортировки на клетки ACSA-2 и CD11b. Эта таблица адаптирована из Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение чистых, жизнеспособных первичных клеток имеет первостепенное значение для изучения структуры и функций конкретных типов клеток. У взрослых мышей, особенно в спинном мозге, эта задача представляет значительные трудности, поскольку существующие протоколы часто не адаптированы к спинному мозгу взрослого человека 10,17. Этот протокол представляет собой эффективный и экономичный метод, применимый к различным последующим приложениям, включая клеточные культуры, проточную цитометрию, гистологию и транскриптомные исследования.
Скорость подготовки спинного мозга играет решающую роль в обеспечении оптимальной жизнеспособности и выхода клеток. Несмотря на то, что во время сердечной перфузии необходимо добиться эффективного клиренса эритроцитов, количество изолированных клеток может варьироваться в широких пределах в зависимости от времени, прошедшего между сердечной перфузией и ферментативной диссоциацией. Мы наблюдали, что инициирование диссоциации тканей более чем через 10 минут после сердечной перфузии приводило к снижению жизнеспособности клеток. Кроме того, продолжительность ферментативной диссоциации менее 30 минут оказалась неэффективной, оставляя непереваренные фрагменты тканей и снижая выход клеток.
Хотя полное устранение механической диссоциации (такой как растирание или измельчение) не повлияло на жизнеспособность клеток, это привело к меньшему количеству клеток, изолированных из-за присутствия непереваренных фрагментов ткани. Сочетание механических методов с ферментативной диссоциацией оказалось наиболее эффективным подходом к выделению клеток. Тем не менее, стоит отметить, что некоторый уровень клеточного стресса неизбежно возникает во время диссоциации тканей, что потенциально влияет на транскриптомные исследования18. Это распространенная проблема при проведении процедур диссоциации тканей ЦНС19. Тем не менее, было показано, что щадящие методы растирания сводят к минимуму гибель клеток, активацию внешнего транскрипта и нежелательный протеолиз16. Кроме того, несмотря на то, что жизнеспособные клетки могут быть получены путем полного устранения механической диссоциации, это может потребовать использования дополнительных животных. Для воспроизводимости рекомендуется дополнять ферментативную диссоциацию мягким измельчением и растиранием для максимизации выхода клеток на спинной мозг. Тем не менее, исследователи могут модифицировать протокол, исключив трение или измельчение, если мишени их исследования очень чувствительны к клеточному стрессу и требуют минимальной диссоциации.
Таким образом, сочетание щадящих этапов диссоциации и быстрой подготовки тканей обеспечивает оптимальный выход и жизнеспособность клеток. Гибкость протокола повышается за счет возможности замены холодных сред на теплые для поддержания клеток в культуре. Эта методология была оптимизирована для применения на животных моделях в возрасте от 10 недель до не менее 5 месяцев, включая модели заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой
Acknowledgments
Мы благодарим Castle Raley из Центра геномики Университета Джорджа Вашингтона за анализ РНК и Q2 Lab Solutions за анализ секвенирования РНК. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта [грант No F31NS117085] и Исследовательским фондом Вивиан Гилл доктору Роберту Х. Миллеру. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
