Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av renade astrocyter och mikroglia från den vuxna musens ryggmärg, vilket underlättar efterföljande tillämpningar som RNA-analys och cellodling. Den innehåller detaljerade metoder och procedurer för celldissociation som är utformade för att förbättra både kvaliteten och utbytet av isolerade celler.
Abstract
Astrocyter och mikroglia spelar centrala roller i utvecklingen av centrala nervsystemet, skadereaktioner och neurodegenerativa sjukdomar. Dessa mycket dynamiska celler uppvisar snabba reaktioner på miljöförändringar och uppvisar betydande heterogenitet när det gäller morfologi, transkriptionsprofiler och funktioner. Även om vår förståelse av gliacellernas funktioner vid hälsa och sjukdom har utvecklats avsevärt, finns det fortfarande ett behov av in vitro, cellspecifika analyser som utförs i samband med förolämpningar eller skador för att på ett heltäckande sätt karakterisera distinkta cellpopulationer. Att isolera celler från den vuxna musen erbjuder flera fördelar jämfört med cellinjer eller neonatala djur, eftersom det möjliggör analys av celler under patologiska förhållanden och vid specifika tidpunkter. Att fokusera på ryggmärgsspecifik isolering, exklusive hjärnengagemang, möjliggör forskning om ryggmärgspatologier, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit, ryggmärgsskada och amyotrofisk lateralskleros. Detta protokoll presenterar en effektiv metod för att isolera astrocyter och mikroglia från ryggmärgen hos vuxna möss, vilket underlättar omedelbar eller framtida analys med potentiella tillämpningar i funktionella, molekylära eller proteomiska nedströmsstudier.
Introduction
Astrocyter och mikroglia är mångsidiga gliaceller som spelar viktiga roller i det centrala nervsystemet (CNS) och omfattar ansvar som att reglera neuronal funktion, bidra till CNS-utveckling, upprätthålla blod-hjärnbarriären och delta i andra kritiska processer 1,2,3,4 . Förutom sin roll i att upprätthålla homeostas spelar dessa gliaceller också en central roll i skade- och reparationsmekanismer. Mikroglia är välkända för sin fagocytiska, inflammatoriska och migrerande förmåga efter förolämpningar eller skador 5,6,7. Astrocytresponsen vid sjukdom är lika varierande, och omfattar bidrag till inflammation, bildandet av gliaärr och kompromettering av blod-hjärnbarriären 8,9. Även om vår förståelse för mikroglias och astrocyters skadliga och reparativa roller i CNS har ökat, kräver den inneboende heterogeniteten i både deras struktur och funktion robusta verktyg för att studera dem i olika sammanhang.
För att få ytterligare insikt i mikroglias och astrocyters roll i hälsa och sjukdom krävs ett kombinerat tillvägagångssätt med in vivo - och in vitro-undersökningar . In vivo-tekniker utnyttjar den intrikata överhörningen mellan gliaceller och neuroner inom CNS, medan in vitro-metoder visar sig vara värdefulla vid bedömning av encellsfunktioner eller svar under specifika stimuli. Varje metod erbjuder unika fördelar; In vitro-studier är viktiga för att förstå de specifika rollerna för dessa celltyper utan direkt eller indirekt input från närliggande celler. Dessutom ger in vitro-analyser som använder odödliga cellinjer vissa fördelar, inklusive förmågan att föröka sig på obestämd tid, kostnadseffektivitet och enkelt underhåll. Det är dock viktigt att notera att primära celler mer efterliknar normala fysiologiska svar jämfört med cellinjer. Denna fysiologiska relevans är avgörande i funktionella analyser och transkriptomiska analyser.
En av utmaningarna med att få fram primära celler, särskilt från ryggmärgen hos vuxna möss, ligger i provernas kvantitet och livsduglighet. Den vuxna ryggmärgen, som är mindre än hjärnan och innehåller en betydande mängd myelin, utgör unika svårigheter. Även om det finns flera publicerade protokoll som beskriver isoleringen av rena, livskraftiga gliaceller från neonatala djur eller den vuxna mushjärnan 10,11,12,13, kanske dessa metoder inte är lämpliga för att studera sjukdomar och skador som är specifika för ryggmärgen. I detta protokoll erbjuder vi en omfattande procedur för att effektivt isolera rena, livskraftiga mikroglia och astrocyter från den vuxna musens ryggmärg, vilket underlättar nedströmsapplikationer i cellodling och transkriptomiska analyser. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att isolera dessa celler från vuxna möss i åldern 10 veckor till 5 månader, vilket visar dess användbarhet i olika sammanhang, inklusive studier som involverar villkorliga knockout-möss, läkemedelssvar, utvecklingsforskning och åldersrelaterade modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård och alla försöksprocedurer utfördes efter godkännande av Animal Care and Use Committee vid George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Studien använde han- och honmöss av C57BL/6J vildtyp (WT) i åldrarna 10 veckor till 5 månader, som köptes från en kommersiell leverantör (se materialtabell) och inhystes vid George Washington University. En översikt över protokollarbetsflödet visas i figur 1.
1. Förberedelse av ryggmärgen
- Bedöva djuren med Avertin (12,5 mg/ml 2,2,2-tribrometanol och 2,5 % 2-metyl-2-butanol i sterilt vatten) (se materialförteckning). Bekräfta frånvaron av ett svar på tå- och svansnypningar hos mössen.
- Utför hjärtperfusion med kall 1x Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) för att avlägsna mononukleära celler i perifert blod.
- Placera djuret på en grund bricka och gör ett snitt i sidled för att exponera pleurahålan. Stick in en 23 G perfusionsnål ansluten till en peristaltisk pump (se materialförteckning) i vänster kammare och aktivera pumpen. När kall DPBS strömmar genom hjärtat, skapa ett litet snitt i höger förmak.
OBS: En snabbare perfusionshastighet är att föredra i detta steg för att förbättra cellviabiliteten. Blodet ska spolas ut på mindre än 1 minut. Utrensning av levern tyder på framgångsrik perfusion.
- Placera djuret på en grund bricka och gör ett snitt i sidled för att exponera pleurahålan. Stick in en 23 G perfusionsnål ansluten till en peristaltisk pump (se materialförteckning) i vänster kammare och aktivera pumpen. När kall DPBS strömmar genom hjärtat, skapa ett litet snitt i höger förmak.
- Halshugg djuret med en stor sax och ta bort ryggraden14. Sänk ner den i kall 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2 % glukos i en petriskål på is för vävnadssköljning.
- Från och med nu, se till att alla steg utförs i en steril miljö. Använd hydraulisk extrudering14 för att isolera hela ryggmärgen. Använd en 18 G nål och en 10 ml spruta fylld med kall 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2 % glukos. Överför ryggmärgen till en petriskål placerad på ispåsar som innehåller tillräckligt med kall 1x DPBS med Ca2+/Mg2+/0,2 % glukos för att sänka ner hela vävnaden.
- Ta försiktigt bort hjärnhinnorna under ett mikroskop i en huva med laminärt flöde. Överför ryggmärgen till en tom petriskål på ispåsar och skär hela ryggmärgen i 2-3 mm sektioner med hjälp av en kirurgisk skalpell med nr 10-blad.
2. Enzymatisk celldissociation
- Tillsätt enzymblandning 1 och enzymblandning 2 från det kommersiellt tillgängliga Adult Brain Dissociation Kit enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning). Snurra enzymerna i skålen flera gånger för att säkerställa en jämn beläggning av ryggmärgen och inkubera sedan vid 37 °C i 30 minuter. Snurra försiktigt skålen var 5:e minut för att förhindra att vävnaden klumpar sig och underlätta en jämn fördelning av reagens.
- Ta ut skålen ur inkubatorn och tillsätt 350 μL 0,46 mg/ml DNAse I i Minimal Essential Medium (MEM) (se materialförteckning). Blanda genom att snurra försiktigt.
- Tillsätt 1 ml kall DMEM/0,5 % fetalt bovint serum (FBS) och blanda genom att snurra försiktigt. Överför omedelbart hela innehållet till ett 5 ml rör.
3. Mekanisk celldissociation
- Använd en P1000-pipett och triturera försiktigt vävnaden tre gånger och se till att vävnadsbitar dras upp varje gång för att ytterligare dissociera vävnaden. Använd sedan en igensatt 9-tums Pasteur-pipett i glas och triturera försiktigt fem gånger till för att säkerställa att inga bubblor genereras under processen.
- Placera 5 ml röret upprätt och låt vävnaden sätta sig i botten i 30 s. När vävnaden har satt sig, dra upp supernatanten med en P1000-pipett och för den genom ett 30 μm filter in i ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml kall DMEM/0,5 % FBS till samma 5 ml rör med den återstående vävnaden. Använd en Pasteur-pipett och triturera försiktigt tre gånger.
- Låt vävnaden lägga sig i botten i 30 s, passera sedan supernatanten genom ett 30 μm filter och samla upp den i samma 15 ml rör som tidigare. Upprepa steg 3.3 och steg 3.4 en gång till.
- Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur (RT). Ta försiktigt bort och kassera den resulterande supernatanten med hjälp av en vakuumsug.
4. Avlägsnande av myelin
- Ta bort myelin med hjälp av skräpborttagningslösningen (DRS) som medföljer Adult Brain Dissociation Kit enligt tillverkarens protokoll. Efter avlägsnande av skräp, tillsätt 5 ml kall DMEM/0.5 % FBS till cellpelleten och vänd försiktigt röret tre gånger. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
OBS: Om cellerna kommer att användas för in vitro-studier och kommer att förbli i odling, bör förvärmd DMEM/0,5 % FBS användas istället. - Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml DPBS/0,5 % FBS (kallt för RNA-studier och varmt för in vitro-analyser ). Räkna cellerna och bedöm livskraften med hjälp av Trypan Blue.
OBS: Cellsuspensioner från flera djur kan kombineras för att öka cellkoncentrationen. - Tvätta cellerna genom att tillsätta DPBS/0,5 % FBS upp till en total volym på 5 ml. Centrifugera suspensionen vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten med pipett.
5. Isolering av mikroglia och astrocyter
- Märk cellerna med anti-CD11b- eller anti-ACSA-2-mikropärlor enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning).
- Sortera cellerna efter positivt urval med hjälp av MS-kolumnerna enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Efter sorteringen centrifugeras de sorterade cellerna vid 300 x g i 10 minuter och supernatanten kasseras.
6. Pläterande celler för in vitro-analyser
OBS: Om cellerna inte kommer att pläteras och kommer att användas omedelbart för RNA-analys, fortsätt till steg 8.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml varm DMEM/0,5 % FBS. Räkna cellerna och bedöm deras livsduglighet med hjälp av en hemacytometer (se materialförteckning).
- Justera cellkoncentrationen till 75 000 celler per 50 μL. Tillsätt 50 μL av cellsuspensionen till varje poly-L-lysinbelagd täckglas11 i en 24-hålsplatta.
- Inkubera vid 37 °C i 2 timmar så att cellerna kan fästa vid täckglaset.
- Tillsätt försiktigt 450 μL varmt DMEM/5% FBS/Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokocker, se Materialförteckning) till varje brunn.
- Efter 3 dagar, byt ut hälften av materialet mot 250 μL varm DMEM/5 % FBS/Pen-Streptokocker. För underhåll, byt ut mediet helt mot 500 μL varm DMEM/5 % FBS/Pen-Streptokocker var 4-5:e dag.
7. Immunhistokemi
OBS: Det är bäst att utföra immunhistokemiska analyser efter minst 3 dagar när mediet har bytts ut minst en gång. Detta säkerställer att skräp har avlägsnats och att cellerna har fäst helt på täckglaset.
- Ta bort mediet och märk cellerna med anti-mus mAb O4 (1:100) (se materialtabell) i varmt DMEM/5 % FBS/10 % normalt getserum (NGS) i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) eller vid 37 °C.
OBS: Hoppa över detta steg och fortsätt till steg 7.3 om cellerna inte kommer att märkas med O4. - Skölj försiktigt täckglasen genom att doppa dem i varm DMEM/5% FBS tre gånger. Tillsätt get-anti-mouse 594 IgM (1: 300) (se materialtabell) i varm DMEM/5 % FBS/10 % NGS och inkubera vid RT i 15 minuter i mörker. Skölj försiktigt tre gånger i varm DMEM/5% FBS.
- Fixera cellerna med kall 5% ättiksyra/metanol i 15 min vid 4 °C. Tvätta tre gånger med 1x PBS och märk sedan med lämplig antikropp: anti-rabbit GFAP (1: 500), anti-mouse GFAP (1: 500) eller anti-rabbit Iba1 (1: 500) i 1 % Triton-X100/10 % NGS i 1x DPBS (se materialförteckning). Inkubera i 1 h vid RT.
OBS: Förvara täckglas i mörker om de redan har färgats med O4. - Skölj försiktigt tre gånger med PBS. Märk med lämplig sekundär antikropp: anti-mus 594 IgG (1: 500), anti-kanin 488 IgG (1: 500) (se Materialförteckning). Inkubera i 30 min vid RT i mörker.
- Skölj försiktigt tre gånger med PBS. Motfärga med DAPI (1: 1000) i 1 min vid RT. Skölj tre gånger med PBS, tillsätt monteringsmedium (se materialförteckning) och montera täckglas på objektglas.
8. RNA-extraktion
OBS: Helst bör det finnas minst 100 000 celler för att extrahera tillräckligt med RNA för analys. Vid behov kan celler från 2-3 ryggmärgar kombineras.
- Extrahera RNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt RNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning). För varje tvättsteg med RW1-tvättbufferten som medföljer i satsen, lämna cellerna i tvättbufferten i ytterligare 2 minuter.
- Ta bort eventuellt kvarvarande genomiskt DNA med hjälp av DNas I enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Inkubera med DNase vid RT i 15 minuter och tvätta sedan med RW1-buffert.
- För att öka RNA-utbytet, före eluering, inkubera proverna i RNAse-fritt vatten vid RT i 10 minuter. Bedöm RNA-integritet och kvantitet med hjälp av en bioanalysator15 (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De metoder som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att isolera rena och livsdugliga mikroglia och astrocyter från ryggmärgen hos vuxna möss, vilket underlättar olika tillämpningar nedströms, inklusive funktionella eller histologiska analyser in vitro och RNA-analys.
En framgångsrik isolering för in vitro-studier kommer att resultera i kontinuerlig cellproliferation under flera dagar. Vuxna celler uppvisar en långsammare proliferationshastighet jämfört med celler som isolerats från neonatala djur, och en del skräp kan finnas under de första dagarna. Vid 4 dagar in vitro (DIV) bör cellerna i stort sett vara fria från skräp, med de flesta celler som fäster vid kolvens botten. Astrocyter kommer att börja bilda längre utskott, medan mikroglia kommer att anta en oval form med kortare spindlar (Figur 2). Vid 7 DIV bör astrocyter bilda ett sammanhängande konfluentskikt, och mikroglia bör uppvisa färre och kortare processer (Figur 3).
Renheten kan bekräftas genom dubbelmärkning av ACSA2-sorterade celler med GFAP och O4 för att bedöma oligodendrocytkontaminering i astrocytkulturer och CD11b-sorterade celler med Iba1 och GFAP för att utvärdera astrocytkontamination i mikrogliakulturer (tabell 1).
Ett framgångsrikt protokoll kommer också att ge RNA av hög kvalitet med minimal nedbrytning och tillräcklig kvantitet (Figur 4A). Elektroferogram av RNA extraherat från isolerade celler bör uppvisa framträdande 18S- och 28S-toppar. Överdissociation av celler eller förlängd tid mellan perfusion och cellsortering kan leda till RNA-nedbrytning (Figur 4B). Otillräcklig enzymatisk och/eller mekanisk dissociation eller otillräcklig avlägsnande av myelin kan leda till minskat cellutbyte och RNA (figur 4C). Isolerade astrocyter kan sekvenseras för att identifiera inflammatoriska markörer. Att jämföra friska astrocyter med inflammationsaktiverade astrocyter (t.ex. från ett experimentellt djur med autoimmun encefalomyelit) kommer att avslöja relativa hämningar av inflammatoriska vägar i friska kontra inflammatoriska astrocyter (Figur 4D).
Figur 1: Översikt över ryggmärgsberedning, vävnadsdissociation och cellsortering. Figuren ger en översikt över ryggmärgsberedningsprocessen, inklusive vävnadsdissociation och cellsortering. Efter ryggmärgsdissektion genomgår vävnader enzymatisk och mekanisk dissociation. Myelin avlägsnas och cellerna märks med anti-ACSA2- eller anti-CD11b-antikroppar för att rikta in sig på astrocyter och mikroglia. De sorterade cellerna kan sedan användas för cellodling och RNA-analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Faskontrastbilder av astrocyter och mikroglia vid 4 dagar in vitro (4DIV). (A) Visar ett representativt exempel på ACSA2+-sorterade celler med utökade processer. (B) CD11b+-celler uppvisar ovala cellkroppar och korta processer. Skalstapel = 50 μm. Denna figur är hämtad från Ahn, J. J. et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescerande bilder av astrocyter och mikroglia vid 8 dagar in vitro (8DIV). (A) ACSA2+-celler märkta med GFAP (grön) och O4 (röd) uppvisar minimal O4-färgning och bildar ett sammanhängande sammanhängande lager av astrocyter. (B) CD11b+-celler märkta med Iba1 (grön) och GFAP (röd) visar minimal närvaro av GFAP. Skalstapel = 50 μm. Denna figur är hämtad från Ahn, J. J. et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa elektroferogram av RNA-prover. (A) Högavkastande RNA av hög kvalitet förväntas efter en lyckad cellisolering. (B) RNA med låg avkastning, låg kvalitet eller (C) RNA med låg avkastning och hög kvalitet kan förväntas i fall av celldöd, otillräcklig dissociation eller otillräckligt avlägsnande av skräp. (D) RNA-sekvenseringsanalys av utvalda inflammatoriska vägar i friska astrocyter jämfört med inflammatoriska astrocyter visar relativ hämning av inflammation i sorterade friska astrocyter jämfört med inflammatoriska astrocyter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Celltyp | Totalt antal celler | Sorterade celler | % sorterat/totalt | Genomsnittlig lönsamhet i % |
| ACSA2 | 6,3 x 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b | 6,3 x 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tabell 1: Cellutbyte, renhet och viabilitet efter sortering för ACSA-2- och CD11b-celler. Denna tabell är anpassad från Ahn, J. J. et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isoleringen av rena, livskraftiga primära celler är av största vikt för att undersöka strukturen och funktionen hos specifika celltyper. Hos vuxna möss, särskilt i ryggmärgen, innebär denna uppgift betydande utmaningar, eftersom befintliga protokoll ofta inte är anpassade till den vuxna ryggmärgen10,17. Detta protokoll presenterar en effektiv och kostnadseffektiv metod som är tillämplig på olika nedströmsapplikationer, inklusive cellodling, flödescytometri, histologi och transkriptomiska studier.
Hastigheten på ryggmärgsförberedelsen spelar en avgörande roll för att säkerställa optimal cellviabilitet och avkastning. Även om det är absolut nödvändigt att uppnå effektiv eliminering av röda blodkroppar under hjärtperfusion, kan antalet isolerade celler variera kraftigt beroende på den tid som förflutit mellan hjärtperfusion och enzymatisk dissociation. Vi observerade att initiering av vävnadsdissociation mer än 10 minuter efter hjärtperfusion ledde till minskad cellviabilitet. Dessutom visade sig enzymatiska dissociationstider på mindre än 30 minuter vara ineffektiva, vilket lämnade osmälta vävnadsfragment och minskade cellutbytet.
Även om fullständig eliminering av mekanisk dissociation (såsom triturering eller hackning) inte påverkade cellviabiliteten, resulterade det i färre isolerade celler på grund av närvaron av osmälta vävnadsfragment. En kombination av mekaniska metoder med enzymatisk dissociation visade sig vara den mest effektiva metoden för cellisolering. Det är dock värt att notera att en viss nivå av cellulär stress oundvikligen uppstår under vävnadsdissociation, vilket kan påverka transkriptomiska studier18. Detta är en vanlig utmaning vid dissociation av CNS-vävnad19. Icke desto mindre har skonsamma triturationsmetoder visat sig minimera celldöd, aktivering av främmande transkript och oönskad proteolys16. Dessutom, även om livskraftiga celler kan erhållas genom att eliminera mekanisk dissociation helt, kan detta kräva användning av ytterligare djur. För reproducerbarhetens skull rekommenderas att komplettera enzymatisk dissociation med skonsam hackning och triturering för att maximera cellutbytet per ryggmärg. Forskare kan dock välja att modifiera protokollet genom att eliminera trituration eller hackning om studiens mål är mycket känsliga för cellulär stress och kräver minimal dissociation.
Sammanfattningsvis säkerställer integrationen av skonsamma dissociationssteg och snabb vävnadsberedning optimalt cellutbyte och livskraft. Protokollflexibiliteten förstärks av möjligheten att ersätta kalla medier med varma medier för att hålla cellerna i odling. Denna metodik har optimerats för tillämpning i djurmodeller som sträcker sig från 10 veckor till minst 5 månader gamla, inklusive sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi tackar Castle Raley vid George Washington University Genomics Core för RNA-analyser och Q2 Lab Solutions för RNA-sekvenseringsanalyser. Detta arbete stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke [anslag nummer F31NS117085] och Vivian Gill Research Endowment till Dr. Robert H. Miller. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
