Summary
Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.
Abstract
Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sistemi gelişiminde, yaralanma yanıtlarında ve nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Bu son derece dinamik hücreler, çevresel değişikliklere hızlı tepkiler sergiler ve morfoloji, transkripsiyonel profiller ve işlevler açısından önemli heterojenlik gösterir. Glial hücrelerin sağlık ve hastalıktaki işlevlerine ilişkin anlayışımız önemli ölçüde ilerlemiş olsa da, farklı hücre popülasyonlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için hakaret veya yaralanmalar bağlamında yürütülen in vitro, hücreye özgü analizlere ihtiyaç duyulmaktadır. Yetişkin fareden hücrelerin izole edilmesi, hücrelerin patolojik koşullar altında ve belirli zaman noktalarında analizine izin verdiği için hücre hatlarına veya yenidoğan hayvanlara göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, beyin tutulumu hariç omuriliğe özgü izolasyona odaklanmak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit, omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere omurilik patolojilerinin araştırılmasını sağlar. Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için etkili bir yöntem sunarak, fonksiyonel, moleküler veya proteomik aşağı akış çalışmalarında potansiyel uygulamalarla acil veya gelecekteki analizleri kolaylaştırır.
Introduction
Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sisteminde (MSS) hayati roller oynayan, nöronal fonksiyonu düzenlemek, CNS gelişimine katkıda bulunmak, kan-beyin bariyerini korumak ve diğer kritik süreçlere katılmak gibi sorumlulukları kapsayan çok yönlü glial hücrelerdir 1,2,3,4 . Homeostazın korunmasındaki rollerinin yanı sıra, bu glial hücreler ayrıca yaralanma ve onarım mekanizmalarında da önemli bir rol oynar. Mikroglia, hakaret veya yaralanmaları takiben fagositik, inflamatuar ve göç etme yetenekleriyle bilinir 5,6,7. Hastalıktaki astrosit yanıtları eşit derecede çeşitlidir, iltihaplanmaya, glial skarların oluşumuna ve kan-beyin bariyerinin tehlikeye atılmasınakatkıları kapsar 8,9. CNS'deki mikroglia ve astrositlerin zararlı ve onarıcı rolleri hakkındaki anlayışımız artmış olsa da, hem yapılarında hem de işlevlerinde doğal heterojenlik, onları çeşitli bağlamlarda incelemek için sağlam araçlar gerektirmektedir.
Mikroglia ve astrositlerin sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek, in vivo ve in vitro araştırmaların birleşik bir yaklaşımını gerektirir. İn vivo teknikler, CNS içindeki glial hücreler ve nöronlar arasındaki karmaşık karışmadan yararlanırken, in vitro metodolojiler, tek hücreli fonksiyonları veya spesifik uyaranlar altındaki yanıtları değerlendirirken değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Her yöntem benzersiz avantajlar sunar; İn vitro çalışmalar, komşu hücrelerden doğrudan veya dolaylı girdi olmadan bu hücre tiplerinin spesifik rollerini anlamak için gereklidir. Ek olarak, ölümsüz hücre hatlarını kullanan in vitro tahliller, süresiz olarak çoğalma yeteneği, maliyet verimliliği ve bakım kolaylığı dahil olmak üzere belirli faydalar sunar. Bununla birlikte, birincil hücrelerin, hücre hatlarına kıyasla normal fizyolojik tepkileri daha yakından taklit ettiğine dikkat etmek önemlidir. Bu fizyolojik alaka, fonksiyonel testlerde ve transkriptomik analizlerde çok önemlidir.
Özellikle yetişkin fare omuriliğinden birincil hücrelerin elde edilmesindeki zorluklardan biri, örneklerin miktarı ve canlılığında yatmaktadır. Beyinden daha küçük olan ve önemli miktarda miyelin içeren yetişkin omuriliği, benzersiz zorluklar doğurur. Yenidoğan hayvanlardan veya yetişkin fare beyninden saf, canlı glial hücrelerin izolasyonunu detaylandıran birkaç yayınlanmış protokol olsa da 10,11,12,13, bu metodolojiler omuriliğe özgü hastalıkları ve yaralanmaları incelemek için uygun olmayabilir. Bu protokolde, yetişkin fare omuriliğinden saf, canlı mikroglia ve astrositleri verimli bir şekilde izole etmek için kapsamlı bir prosedür sunuyoruz, hücre kültürü ve transkriptomik analizlerde aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırıyoruz. Bu protokol, bu hücreleri 10 haftadan 5 aya kadar olan yetişkin farelerden izole etmek için başarıyla kullanılmış ve koşullu nakavt fareleri, ilaç tepkileri, gelişimsel araştırmalar ve yaşa bağlı modelleri içeren çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda faydasını göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, George Washington Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi'nde (Washington, D.C., ABD; IACUC#2021-004). Çalışmada, ticari bir tedarikçiden temin edilen ve George Washington Üniversitesi'nde bulunan 10 haftadan 5 aya kadar erkek ve dişi C57BL / 6J vahşi tip (WT) fareler kullanıldı. Protokol iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.
1. Omuriliğin hazırlanması
- Hayvanları Avertin (steril suda 12.5 mg/mL 2,2,2-Tribromoetanol ve %2,5 2-metil-2-bütanol) kullanarak uyuşturun (bkz. Farelerde ayak parmağı ve kuyruk tutamlarına yanıt verilmediğini onaylayın.
- Periferik kan mononükleer hücrelerini çıkarmak için soğuk 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
- Hayvanı sığ bir tepsiye yerleştirin ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Peristaltik bir pompaya bağlı 23 G'lik bir perfüzyon iğnesini (Malzeme Tablosuna bakınız) sol ventriküle yerleştirin ve pompayı etkinleştirin. Soğuk DPBS kalpten aktıktan sonra, sağ atriyumda küçük bir kesi oluşturun.
NOT: Hücre canlılığını artırmak için bu adımda daha hızlı bir perfüzyon hızı tercih edilir. Kan 1 dakikadan kısa sürede boşaltılmalıdır. Karaciğerin temizlenmesi başarılı perfüzyonu gösterir.
- Hayvanı sığ bir tepsiye yerleştirin ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Peristaltik bir pompaya bağlı 23 G'lik bir perfüzyon iğnesini (Malzeme Tablosuna bakınız) sol ventriküle yerleştirin ve pompayı etkinleştirin. Soğuk DPBS kalpten aktıktan sonra, sağ atriyumda küçük bir kesi oluşturun.
- Büyük makas kullanarak hayvanın başını kesin ve omurgayıçıkarın 14. Doku durulaması için buz üzerinde bir Petri kabında Ca2+/Mg2+/%0.2 glikoz ile soğuk 1x DPBS'ye daldırın.
- Şu andan itibaren, tüm adımların steril bir ortamda gerçekleştirildiğinden emin olun. Tüm omuriliği izole etmek için hidrolik ekstrüzyon14 kullanın. 18 G'lik bir iğne veCa2 +/Mg2 +/% 0.2 glikozlu soğuk 1x DPBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Omuriliği, tüm dokuyu batırmak için Ca2 + / Mg2 +/% 0.2 glikoz ile yeterli soğuk 1x DPBS içeren buz paketleri üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına aktarın.
- Meninksleri laminer akış başlığı içinde mikroskop altında dikkatlice çıkarın. Omuriliği buz paketleri üzerinde boş bir Petri kabına aktarın ve 10 numaralı bıçaklı cerrahi neşter kullanarak tüm omuriliği 2-3 mm'lik bölümlere ayırın.
2. Enzimatik hücre ayrışması
- Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinden Enzim karışımı 1 ve Enzim karışımı 2'yi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Omuriliğin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için enzimleri çanakta birkaç kez döndürün, ardından 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir, doku topaklanmasını önlemek ve reaktiflerin eşit dağılımını kolaylaştırmak için kabı hafifçe döndürün.
- Çanağı inkübatörden çıkarın ve Minimal Esansiyel Ortama (MEM) 350 μL 0.46 mg/mL DNAse I ekleyin (bkz. Hafifçe döndürerek karıştırın.
- 1 mL soğuk DMEM/%0.5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ekleyin ve hafifçe döndürerek karıştırın. Tüm içeriği hemen 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
3. Mekanik hücre ayrışması
- Bir P1000 pipeti kullanarak, dokuyu üç kez nazikçe ezin ve dokuyu daha da ayrıştırmak için her seferinde doku parçalarının çekildiğinden emin olun. Ardından, tıkalı bir 9" cam Pasteur pipeti kullanarak, işlem sırasında kabarcık oluşmadığından emin olmak için beş kez daha hafifçe ezin.
- 5 mL'lik tüpü dik olarak yerleştirin ve dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin. Doku yerleştikten sonra, bir P1000 pipeti kullanarak süpernatanı çekin ve 30 μm'lik bir filtreden 15 mL'lik bir konik tüpe geçirin.
- Kalan doku ile aynı 5 mL'lik tüpe 1 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak üç kez hafifçe ezin.
- Dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin, ardından süpernatanı 30 μm'lik bir filtreden geçirin ve daha önce olduğu gibi aynı 15 mL'lik tüpe toplayın. Adım 3.3 ve adım 3.4'ü bir kez daha tekrarlayın.
- Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir vakum aspiratörü kullanarak dikkatlice çıkarın ve atın.
4. Miyelin giderimi
- Kalıntı temizleme solüsyonunu kullanarak miyelini çıkarın (DRS) üreticinin protokolünü izleyerek Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinde sağlanır. Enkaz çıkarıldıktan sonra, hücre peletine 5 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin ve tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Hücreler in vitro çalışmalar için kullanılacaksa ve kültürde kalacaksa, bunun yerine önceden ısıtılmış DMEM/%0.5 FBS kullanılmalıdır. - Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DPBS /% 0.5 FBS (RNA çalışmaları için soğuk ve in vitro deneyler için sıcak) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve Trypan Blue kullanarak canlılığı değerlendirin.
NOT: Hücre konsantrasyonunu artırmak için birden fazla hayvandan alınan hücre süspansiyonları birleştirilebilir. - Toplam 5 mL hacme kadar DPBS /% 0.5 FBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
5. Mikroglia ve astrosit izolasyonu
- Hücreleri, üreticinin protokolünü izleyerek anti-CD11b veya anti-ACSA-2 mikro boncuklarla etiketleyin (bkz.
- Üreticinin talimatlarına göre MS sütunlarını kullanarak hücreleri pozitif seçime göre sıralayın (bkz. Malzeme Tablosu). Sıralamadan sonra, sıralanan hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
6. İn vitro tahliller için kaplama hücreleri
NOT: Hücreler kaplanmayacaksa ve hemen RNA analizi için kullanılacaksa, 8. adıma geçin.
- Hücreleri 1 mL sıcak DMEM /% 0.5 FBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve bir hemasitometre kullanarak canlılıklarını değerlendirin (bkz.
- Hücre konsantrasyonunu 50 μL başına 75.000 hücreye ayarlayın. 24 oyuklu bir plakada her bir Poli-L-lizin kaplı lamel11'e 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Her bir oyuğa dikkatlice 450 μL ılık DMEM /% 5 FBS / Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- 3 gün sonra, ortamın yarısını 250 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile değiştirin. Bakım için, ortamı her 4-5 günde bir 500 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile tamamen değiştirin.
7. İmmünohistokimya
NOT: İmmünohistokimya analizlerinin, ortam en az bir kez değiştirildikten en az 3 gün sonra yapılması en iyisidir. Bu, döküntülerin çıkarılmasını ve hücrelerin lamel üzerine tamamen yapışmasını sağlar.
- Ortamı çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de 15 dakika boyunca ılık DMEM/%5 FBS/%10 normal keçi serumu (NGS) içinde fare önleyici mAb O4 (1:100) ( Malzeme Tablosuna bakın) ile etiketleyin.
NOT: Bu adımı atlayın ve hücreler O4 ile etiketlenmeyecekse 7.3 adımına geçin. - Lamelleri üç kez ılık DMEM/%5 FBS'ye batırarak nazikçe durulayın. Keçi anti-fare 594 IgM (1: 300) ( Malzeme Tablosuna bakın) ılık DMEM/%5 FBS/%10 NGS'ye ekleyin ve karanlıkta 15 dakika RT'de inkübe edin. Ilık DMEM/%5 FBS'de üç kez nazikçe durulayın.
- Hücreleri soğuk %5 asetik asit/metanol ile 4 °C'de 15 dakika sabitleyin. 1x PBS ile üç kez yıkayın, ardından uygun antikorla etiketleyin: anti-tavşan GFAP (1: 500), anti-fare GFAP (1: 500) veya anti-tavşan Iba1 (1: 500) içinde %1 Triton-X100/1x DPBS'de %10 NGS (bkz. RT'de 1 saat inkübe edin.
NOT: Lameller zaten O4 ile lekelenmişse karanlıkta saklayın. - PBS ile üç kez nazikçe durulayın. Uygun ikincil antikorla etiketleyin: anti-fare 594 IgG (1: 500), anti-tavşan 488 IgG (1: 500) (bkz. Karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
- PBS ile üç kez nazikçe durulayın. RT'de 1 dakika boyunca DAPI (1: 1000) ile karşı boyayın. PBS ile üç kez durulayın, montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve lamellerin slaytlara monte edilmesi.
8. RNA ekstraksiyonu
NOT: İdeal olarak, analiz için yeterli RNA'yı çıkarmak için en az 100.000 hücre olmalıdır. Gerekirse, 2-3 omurilikten hücreler birleştirilebilir.
- Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı çıkarın (bkz. Kitte verilen RW1 yıkama tamponu ile her yıkama adımı için, hücreleri 2 dakika daha yıkama tamponunda bırakın.
- Kalan genomik DNA'yı, üreticinin talimatlarına göre DNaz I kullanarak çıkarın (bkz. RT'de DNaz ile 15 dakika inkübe edin, ardından RW1 tamponu ile yıkayın.
- RNA verimini artırmak için, elüsyondan önce, numuneleri RT'de RNAse içermeyen suda 10 dakika inkübe edin. Bir biyoanalizör15 kullanarak RNA bütünlüğünü ve miktarını değerlendirin (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde özetlenen yöntemler, yetişkin fare omuriliğinden saf ve canlı mikroglia ve astrositlerin izolasyonunu sağlayarak, in vitro fonksiyonel veya histolojik testler ve RNA analizi dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırır.
İn vitro çalışmalar için başarılı bir izolasyon, birkaç gün boyunca sürekli hücre proliferasyonuna neden olacaktır. Yetişkin hücreler, yenidoğan hayvanlardan izole edilen hücrelere kıyasla daha yavaş bir proliferasyon hızı sergiler ve ilk birkaç gün içinde bazı kalıntılar mevcut olabilir. 4 güne kadar in vitro (DIV), hücreler büyük ölçüde döküntülerden arındırılmış olmalı ve çoğu hücre şişenin dibine yapışmalıdır. Astrositler daha uzun süreçler oluşturmaya başlarken, mikroglia daha kısa iğlerle oval bir şekil alacaktır (Şekil 2). 7 DIV ile, astrositler bağlı bir birleşik tabaka oluşturmalı ve mikroglia daha az ve daha kısa süreçler göstermelidir (Şekil 3).
Saflık, astrosit kültürlerinde oligodendrosit kontaminasyonunu değerlendirmek için GFAP ve O4 ile ACSA2 ile sıralanmış hücrelerin ve mikroglia kültürlerinde astrosit kontaminasyonunu değerlendirmek için CD11b ile sıralanmış hücrelerin Iba1 ve GFAP ile çift etiketlenmesiyle doğrulanabilir (Tablo 1).
Başarılı bir protokol aynı zamanda minimum bozunma ve yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA verecektir (Şekil 4A). İzole hücrelerden ekstrakte edilen RNA'nın elektroferogramları, belirgin 18S ve 28S pikleri sergilemelidir. Hücrelerin aşırı ayrışması veya perfüzyon ile hücre sıralaması arasındaki uzun süre, RNA bozulmasına yol açabilir (Şekil 4B). Yetersiz enzimatik ve/veya mekanik ayrışma veya yetersiz miyelin uzaklaştırımı, hücre veriminin ve RNA'nın azalmasına neden olabilir (Şekil 4C). İzole astrositler, inflamatuar belirteçleri tanımlamak için sıralanabilir. Sağlıklı astrositlerin inflamasyonla aktive olan astrositlerle karşılaştırılması (örneğin, deneysel bir otoimmün ensefalomiyelit hayvanından), sağlıklı ve enflamatuar astrositlerde inflamatuar yolların göreceli inhibisyonlarını ortaya çıkaracaktır (Şekil 4D).
Şekil 1: Omurilik hazırlığı, doku ayrışması ve hücre sıralamasına genel bakış. Şekil, doku ayrışması ve hücre sıralaması dahil olmak üzere omurilik hazırlama sürecine genel bir bakış sağlar. Omurilik diseksiyonundan sonra dokular enzimatik ve mekanik ayrışmaya uğrar. Miyelin çıkarılır ve hücreler, astrositleri ve mikrogliaları hedeflemek için anti-ACSA2 veya anti-CD11b antikorları ile etiketlenir. Sıralanan hücreler daha sonra hücre kültürü ve RNA analizi için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 4 gün in vitro (4DIV) astrositlerin ve mikrogliaların faz kontrast görüntüleri. (A) Genişletilmiş işlemlere sahip ACSA2+ sıralanmış hücrelerin temsili bir örneğini gösterir. (B) CD11b+ hücreleri, oval şekilli hücre gövdeleri ve kısa süreçler gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 8 gün in vitro (8DIV) astrositlerin ve mikrogliaların floresan görüntüleri. (A) GFAP (yeşil) ve O4 (kırmızı) ile etiketlenmiş ACSA2+ hücreleri, minimal O4 boyaması sergiler ve bağlı bir birleşik astrosit tabakası oluşturur. (B) Iba1 (yeşil) ve GFAP (kırmızı) ile etiketlenmiş CD11b + hücreleri, GFAP'ın minimum varlığını gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RNA örneklerinin temsili elektroferogramları. (A) Başarılı bir hücre izolasyonundan sonra yüksek verimli, yüksek kaliteli RNA beklenir. (B) Hücre ölümü, yetersiz ayrışma veya yetersiz enkaz çıkarma durumlarında düşük verim, düşük kaliteli RNA veya (C) düşük verim, yüksek kaliteli RNA beklenebilir. (D) İnflamatuar astrositlere karşı sağlıklı astrositlerde seçilmiş inflamatuar yolların RNA dizileme analizi, enflamatuar astrositlere kıyasla sıralanmış sağlıklı astrositlerde inflamasyonun göreceli inhibisyonunu ortaya koymaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hücre tipi | Toplam hücre sayısı | Sıralanmış hücreler | % Sıralanmış/Toplam | Ortalama % canlılık |
| ACSA2 | 6,3 × 105 | 1,7 x 105 | 27 | 92 |
| CD11b (CD11b) | 6,3 × 105 | 8,0 x 104 | 12.7 | 93 |
Tablo 1: ACSA-2 ve CD11b hücreleri için ayırma sonrası hücre verimi, saflığı ve canlılığı. Bu tablo Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saf, canlı birincil hücrelerin izolasyonu, belirli hücre tiplerinin yapısını ve işlevini araştırmak için çok önemlidir. Yetişkin farede, özellikle omurilikte, mevcut protokoller genellikle yetişkin omuriliğe göre uyarlanmadığından, bu görev önemli zorluklar doğurur10,17. Bu protokol, hücre kültürü, akış sitometrisi, histoloji ve transkriptomik çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarına uygulanabilen verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sunar.
Omurilik hazırlama hızı, optimum hücre canlılığını ve verimini sağlamada çok önemli bir rol oynar. Kardiyak perfüzyon sırasında kırmızı kan hücrelerinin etkili bir şekilde temizlenmesi zorunlu olsa da, izole edilen hücrelerin sayısı, kardiyak perfüzyon ve enzimatik ayrışma arasında geçen süreye bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Kardiyak perfüzyondan 10 dakikadan daha uzun bir süre sonra doku ayrışmasının başlatılmasının hücre canlılığının azalmasına yol açtığını gözlemledik. Ek olarak, 30 dakikadan daha kısa enzimatik ayrışma sürelerinin etkisiz olduğu kanıtlandı, sindirilmemiş doku parçaları bıraktı ve hücre verimini azalttı.
Mekanik ayrışmanın (öğütme veya doğrama gibi) tamamen ortadan kaldırılması hücre canlılığını etkilemese de, sindirilmemiş doku parçalarının varlığı nedeniyle izole edilen daha az hücre ile sonuçlandı. Mekanik yöntemlerin enzimatik ayrışma ile kombinasyonunun hücre izolasyonu için en etkili yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, doku ayrışması sırasında kaçınılmaz olarak bir miktar hücresel stresin meydana geldiğini ve potansiyel olarak transkriptomik çalışmaları etkilediğini belirtmekte fayda var18. Bu, CNS doku ayrışma prosedürlerinde yaygın bir zorluktur19. Bununla birlikte, nazik öğütme yöntemlerinin hücre ölümünü, yabancı transkript aktivasyonunu ve istenmeyen proteolizi en aza indirdiği gösterilmiştir16. Ayrıca, mekanik ayrışmayı tamamen ortadan kaldırarak canlı hücreler elde edilebilse de, bu ek hayvanların kullanılmasını gerektirebilir. Tekrarlanabilirlik adına, omurilik başına hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için enzimatik ayrışmayı nazik doğrama ve ezme ile tamamlamanız önerilir. Bununla birlikte, araştırmacılar, çalışmalarının hedefleri hücresel strese karşı oldukça hassassa ve minimum ayrışma gerektiriyorsa, öğütmeyi veya doğramayı ortadan kaldırarak protokolü değiştirmeyi seçebilirler.
Özetle, nazik ayrışma adımlarının ve hızlı doku hazırlığının entegrasyonu, optimum hücre verimi ve canlılığı sağlar. Protokol esnekliği, hücreleri kültürde tutmak için soğuk ortamı sıcak ortamla değiştirme seçeneği ile geliştirilmiştir. Bu metodoloji, hastalık modelleri de dahil olmak üzere 10 haftadan en az 5 aya kadar değişen hayvan modellerinde uygulama için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse
Acknowledgments
RNA analizleri için George Washington Üniversitesi Genomik Çekirdeği'nden Castle Raley'e ve RNA dizileme analizleri için Q2 Lab Solutions'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü [hibe numarası F31NS117085] ve Dr. Robert H. Miller'a Vivian Gill Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
