Summary
在这里，我们提出了一个全面的行为测试电池，包括新型水箱、浅滩和社会偏好测试，以有效确定使用单个水箱的化学物质（例如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性作用。这种方法与神经毒性和环境研究有关。
Abstract
多年来，神经病理学效应的存在被证明是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而，在过去的 50 年里，人们积极研究了化学物质对模式物种行为的影响。渐渐地，行为终点被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性。成年斑马鱼的行为测定提供了一种标准化和可靠的方法来研究广泛的行为，包括焦虑、社交互动、学习、记忆和成瘾。成年斑马鱼的行为测定通常涉及将鱼置于实验场中，并使用视频跟踪软件记录和分析它们的行为。鱼可以暴露在各种刺激下，它们的行为可以使用各种指标来量化。这种新型的鱼缸测试是研究鱼类焦虑样行为的最被接受和广泛使用的测试之一。浅滩和社会偏好测试有助于研究斑马鱼的社会行为。这种测定特别有趣，因为研究了整个浅滩的行为。这些检测已被证明具有高度可重复性，并且对药理学和遗传操作敏感，使其成为研究行为背后的神经回路和分子机制的宝贵工具。此外，这些测定可用于药物筛选，以鉴定可能成为行为潜在调节剂的化合物。
在这项工作中，我们将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为工具，分析甲基苯丙胺（一种娱乐性药物）和草甘膦（一种环境污染物）的影响。结果表明，成年斑马鱼的行为测定对理解环境污染物和药物的神经毒理学影响做出了重大贡献，此外还提供了对可能改变神经元功能的分子机制的见解。
Introduction
斑马鱼 （Danio rerio） 是一种流行的模式脊椎动物物种，用于生态毒理学、药物发现和安全药理学研究。斑马鱼成本低廉，分子遗传工具完善，对神经系统形态发生和维持的关键生理过程的保护，使斑马鱼成为神经科学研究的理想动物模型，包括神经行为毒理学1,2。直到最近，评估化学品神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在。然而，最近，行为终点已被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性 3,4。此外，从生态学的角度来看，行为终点具有高度相关性，因为即使是鱼类非常轻微的行为变化也可能危及动物在自然条件下的生存5.
成年斑马鱼研究中最常用的行为测定之一是新型水箱测试 （NTT），它测量焦虑样行为 6,7。在这种测定中，鱼暴露于新奇事物（鱼被放置在不熟悉的水箱中），轻微的厌恶刺激并观察它们的行为反应。NTT 主要用于评估鱼类的基础运动活动、地质趋向性、冻结和不稳定的运动。飘忽不定的8 的特征是方向的突然变化（锯齿形）和反复的加速（飞镖）。这是一种警报反应，通常在冻结事件之前或之后观察到。冷冻行为对应于鱼在水箱底部时完全停止运动（鳃盖和眼部运动除外），这与镇静引起的不动不同，镇静引起的不动会导致运动减退、运动不能和下沉8.冻结通常与高度压力和焦虑状态有关，也是顺从行为的一部分。複雜行為是動物焦慮狀態的极好指標。NTT 已被证明对药理学和遗传操作敏感9，使其成为研究焦虑和相关疾病的神经基础的宝贵工具。
斑马鱼是一种高度社会化的物种，因此我们可以测量广泛的社会行为。浅滩试验 （ST） 和社会偏好试验 （SPT） 是评估社会行为最常用的检测方法10.ST 通过量化鱼类的空间行为和运动模式来测量鱼类组合在一起的趋势11。ST 可用于研究群体动态、领导力、社会学习和理解许多鱼类的社会行为12.成年斑马鱼的SPT改编自Crawley对小鼠13的社交新奇性测试的偏好，并迅速成为研究该模型物种14中社会互动的流行行为测定。这两种测试也适用于药物筛选分析，并显示出识别调节社会行为的新化合物的希望15,16。
一般来说，成年斑马鱼的行为测定是强大的工具，可以提供有关活性化合物和滥用药物的行为机制或神经表型的宝贵信息17。该协议详细说明了如何使用基本材料资源实现这些行为工具7 ，以及如何将它们应用于毒性测定以表征各种神经活性化合物的作用。此外，我们将看到，相同的测试可用于评估急性暴露于神经活性化合物（甲基苯丙胺）的神经行为影响，也可以表征长期暴露于环境浓度的杀虫剂（草甘膦）后的这些影响。
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Protocol
严格遵守道德标准保证了用于实验的斑马鱼的福利和适当待遇。所有实验程序均根据机构动物护理和使用委员会（CID-CSIC）制定的指南进行。下面介绍的协议和结果是在当地政府授予的许可下进行的（协议编号 11336）。
1. 用于行为测试的动物圈舍
- 在10：00至17：00之间，在27-28°C的隔离行为室中进行所有测试（如 图1所示）。
- 在开始实验之前，在干净的鱼水中多次清洗对照鱼和暴露的鱼[含有 90 mg/L 水族箱系统盐、0.58 mM CaSO4·2H2O 和 0.59 mM NaHCO3 的反渗透纯化水]，以避免对实验罐的任何潜在污染。
- 在开始实验前1小时使动物适应行为室。
- 确保动物（≈50：50雄性：雌性比例）在实验上是幼稚的，并以盲目的方式进行所有行为测试，观察者不知道实验组。
- 为了在行为测定中获得有意义的结果，每个条件总共有 18 名受试者 （n = 18），最好是在两个或多个独立实验之间获得。例如，在单个测试中，分析每个条件、每个重复的 9 只动物的行为。在组测试中，分析每个条件、每个重复 6 到 9 只动物的浅滩的行为。
- 按照电池测试方法执行所有测试（参见 图 2 中的规划建议）。从伦理上讲，这种方法更合适，可以减少研究所需的动物数量，符合 3R 减少原则7。
- 大多数情况下，行为测定与生物测定有关，因此在收集和分析样本（组学或化学品）之前，请按照安乐死指南18 处死动物。如果终点未被证明是采样，则在实验结束时重新稳定对照组。几天后，将对照动物重新用于育种或实验目的。
图 1：实验设置。 方形水箱的三种配置，用于研究成年斑马鱼的各种行为。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：实验时间表。 记录行为测定的两个规划建议。 请点击这里查看此图的较大版本.
2.罐体的实验配置
- 焦虑样行为：新型坦克测试 （NTT）
- 调整实验设置（水箱、相机和计算机的数量）以同时记录最大鱼数。单个行为检测非常耗时，因此要优化时间、材料和空间。
- 为NTT准备实验水箱：方形水箱（长20厘米，宽20厘米，高25厘米），侧壁和底部覆盖有亚克力板，以避免受试者之间的反射和干扰。
- 在28°C下用7L（水柱高度：20cm高度）含氧良好的鱼水填充实验罐。
- 调整水箱在相机前方的位置，以避免图像失真。
- 检查照明设置。LED 背光 （10000 lux） 在水箱的所有部分提供均匀的照明，以便在良好条件下进行视频录制。
- 打开相机并按照第 3 节进行调整。
- 在开始记录之前，将受试者一个接一个地引入实验罐的底部。
注意： 重要的是在水箱底部开始记录动物。 - 在录制过程中注意不要打扰动物。使用窗帘或面板不仅限制储罐之间的视觉互动，而且限制支架与外部之间的视觉互动。
- 在记录结束时（标准记录时间为6分钟），将已经通过测试的动物转移到另一个水箱中，以免它们与幼稚的动物混合。
- 对所有可用的受试者重复该过程。建议每种情况总共有 18 名受试者，以便在单个试验中获得有意义的结果（来自两个或多个独立重复）。
- 在两次试验之间随机分配分配给每个储罐的实验组，以避免任何潜在的储罐效应（如果您同时记录多个条件）。
- 社会群体行为：浅滩测试（ST）
- ST的实验配置与NTT相同（相同的储罐可直接重复使用）。
- 按照步骤 2.1.1-2.1.6 操作。设置 ST。
- 在开始记录之前，在实验罐底部引入浅滩（同时 6 到 9 名受试者）。
注意： 重要的是在水箱底部开始记录动物。 - 按照步骤 2.1.8-2.1.11 操作。执行 ST。
- 对所有可用的受试者重复该过程。为了在该测定中获得有意义的结果，在每次重复中至少进行两个具有相同库大小的独立重复。
- 保持所有实验组的浅滩大小一致，并在同一实验中重复。
- 社会个体行为：社会偏好测试（SPT）
- 调整实验设置以优化实验空间和记录时间。
- 为SPT准备实验罐：方形罐（长20厘米，宽20厘米，高25厘米）透明（玻璃或塑料）以提供横向可见性。单焦点鱼可以自由地与同种虚拟区域（放置在单侧外部住房水箱中的鱼的浅滩）或与非特定虚拟区域（单侧外部空住房水箱）进行交互。
- 在28°C下用5L（水柱高度：15厘米，与外部住房水箱中的水柱高度相同）的清洁鱼水填充实验水箱。
- 调整水箱在相机前方的位置，以避免图像失真。
- 检查系统是否接收到均匀的照明。
- 将受试者一个接一个地引入实验罐的底部，然后立即开始记录，动物在中心向下。
- 在录制过程中避免观察者和动物之间的视觉互动。
- 在 6 分钟记录结束时，将现在的动物转移到另一个水箱中，以免它们与幼稚的动物混合。
- 对所有可用的受试者重复该过程。每种情况共有 18 名受试者，以在单个试验中获得有意义的结果（来自两个或多个独立重复）。
3. 行为测试的视频录制
- 打开相机管理器以检查每台计算机上 GigE 相机的可用性。
- 启动GigE相机控制软件（如uEye Cockpit，此处介绍）。打开 相机 选项，选择 单色 模式，然后调整图像大小 （1：2）。
- 打开 相机属性
- 在 “相机”下，将 “像素时钟 ”设置为 “最大”，将 “帧速率 ”设置为“每 秒 30 帧 （fps）”，然后调整 曝光 （如果图像太暗，则“自动 ”或 “手动 ”调整）。
- 在 “图像”下，将 增益 设置为 0 （自动）和 “黑色电平 ”（自动 或 手动 调整以获得良好的对比度）。
- 在 “大小”下，将窗口的大小调整为需要雕刻的区域（宽度：宽度-左侧，高度：高度-顶部）。此步骤可以减小图像的大小，从而减小视频的最终大小。
- 关闭 相机属性。
- 为实验会话创建一个常规文件夹，以保存相机设置和视频。
- 要保存相机设置，请设置 “文件”>“将参数>保存到文件 ”，然后选择最近创建的实验文件夹。
注意：因此，可以在应用程序中重新加载相机设置文件，以便随时继续使用相同的图像参数（例如，当相机突然关闭或重复使用相同的设置时，减少设置时间并使实验条件均匀化）。如果在某一时刻，相机在视频之间冻结，请停止录制、退出并关闭相机。重新打开它，通过转到 “文件”>“加载参数>到文件”重新加载相机参数，然后重新开始录制。检查当前视频是否已被完全获取以丢弃或重复鱼（在重复之前，给动物一些时间重新适应环境）。 - 在所有摄像机上重复此摄像机设置步骤（步骤3.1-3.5）。
- 正确配置所有摄像机后，打开 录制视频序列。
- 选择 “创建 ”以另存为新的视频文件，选择最近创建的实验文件夹，并以视频文件的名称报告主题信息、实验类型和日期。
- 选择 最大帧数。在框架框中键入 10800。标准视频以 30 fps 的速度录制 6 分钟（视频 1）以 AVI 格式录制;因此，6 分钟 x 60 秒 x 30 fps = 总共 10800 帧。
- 选择 计算帧速率 或手动指示帧速率（录制速度：30 fps）。
- 在所有计算机上重复视频文件创建过程。
- 在每个实验罐的底部逐个介绍主题。所有检测将立即进行。
- 通过单击 “录制 ”快速启动记录，然后等待获取请求的最大帧数（步骤 3.10）。
- 录制视频后，会出现一个聊天框，其中包含消息 Maximal number of frames achieved！。选择 “接受”。
- 选择 “关闭” 以完成录制并关闭视频文件。
- 取出刚刚观察到的鱼。小心将它们与幼稚的鱼分开。
- 直接选择 “创建 ”并重复该过程以继续录制视频。
- 完成所有录制后，选择 退出。
- 要关闭相机，请选择 关闭相机 并 退出 程序。
4. 录制视频分析
- 启动分析软件（参见 材料表）。
- 要详细说明新模板，请单击“ 从模板新建”>“应用了预定义的模板”>“从视频文件”，然后选择一个视频以开始设置模板。尝试选择具有代表性的实验视频，其受试者表现出良好的移动性和良好的录制条件。
- 在 “参数”中，配置以下窗口中的参数（1 到 4/7）。选择模型 Fish > Adult Zebrafish、竞技场 Open Field Square > One Arena、 每个竞技场的对象数量（对于 ST，需要多跟踪包 [在一个竞技场中跟踪多个对象]）、 中心点检测 类型，最后将帧速率调整为 30 fps。在以下窗口（5 到 7/7）中，不要更改参数;默认配置为“正常”。
- 将实验命名为模板，并将其与存储视频的其余部分放在同一文件夹中。该模板将被创建为一个实验文件夹，其中包含包含所有设置信息的多个细分。
- 在 “实验设置”下，检查定义的设置（来自视频文件、竞技场、受试者数量、每秒帧数）。在这里，可以修改系统单元。
- 在 “竞技场设置”下，右键单击屏幕中央，然后选择 “抓取”。 从显示中的文件 。选择质量良好的视频图像并 接受 以捕获此图像以进行背景设置。首先， 校准 图像，生成校准规则。使用水箱的宽度作为刻度（19 厘米）。然后，绘制竞技场。注意使正方形刚好，以避免当动物接近水面时动物的反射，或者最终将鱼软件与鱼缸的黑色区域混淆。最后，使用 Frame 函数绘制形状区域。
- 对于 NTT 和 ST， 将储罐的前部划分为两个相等的虚拟区域，顶部和底部（见 图 1）。绘制两个相等的水平框。每个盒子都覆盖了半个竞技场。分别命名上部和下部区域的 顶部 和 底部 。请注意，盒子的宽度（9-10 厘米）和长度（8-9 厘米）相同，不要超过竞技场边界（橙色正方形），并且不要重叠，检查每个箭头区域是否准确指示其区域。
- 对于SPT，从概念上将实验场划分为三个大小相等的区域：空区、中心区和同种区（见 图1）。绘制三个相等的垂直框。将面向浅滩水箱的箱子命名为 “同种”，将朝向空水箱的箱子命名为 “空”，将中间的箱子命名为 “中心”。请注意，盒子的宽度（6 厘米）和长度（18-19 厘米）相同，不要超过竞技场限制，也不要重叠。
- 在 “检测设置”下，验证要在 视频文件中处理的视频。然后，检查检测质量（黄色鱼，红色中心点）。单击 “自动检测 ”以调整检测，重新聚焦动物（在白色背景上选择动物在剖面上游泳的图像，通过拍摄整个身体来绘制图片，然后使用 “是”验证检测）。打开 “高级 ”，通过选择 “动态减法”、“较暗的主体”、“背景设置”、“背景学习”、“主体大小”、“降噪”等来改进检测。
- 在 “试用设置”下，放置一个试用版并删除其他试用版（右键单击并删除）
- 在“数据设置”下，创建“结果”对话框窗口。参数化每个时间和每个区域的结果。例如，创建一个“结果”窗口，用于按分钟输出数据，另一个窗口用于按总时间（6 分钟）输出数据。请求每个区域的数据输出（如果需要每个区域中的距离，请请求）。使用箭头将不同的“结果”窗口链接到“开始”窗口。
- 在 “分析设置”下，选择要分析的 参数 以及每个参数的 统计信息 类型。这些参数将根据从跟踪中获取的数据自动计算。
- 对于 NTT 和 SPT，选择以下定义的选项：
- 选择 “移动距离 ”（选择 “总计”）可获取在竞技场中行进的距离 （cm） 和在相应区域中行进的距离 （cm）。
- 选择 “在区域中 ”（选择“ 区域”、“频率”、“累积”和 “延迟”到“第一”），以显示在区域中花费的时间以及首次进入区域的延迟。
- 选择 区域过渡 （选择 阈值：0 厘米， 添加区域 1 >区域 2;Zone 2 > Zone 1，在任何区域中， 频率）来获取区域中的入口数。
- 选择 “移动状态 ”（填写“高移动”高于 70%、“不移动”低于 3%、至少 150 帧，并选择频率、累积和延迟到第一个）以获得超移动的持续时间、冻结的持续时间。
注意：有关使用自动分析的冷冻行为的近似值以及冷冻事件的数量和持续时间的更多详细信息，请参阅“讨论”部分。 - 选择 “加速度 ”和 “转弯角度 ”（选择“频率”和“累积”）以评估复杂行为的发生，例如飞镖和不稳定（快速加速运动）。
- 对于 ST，除了上述探索性参数外，还可以选择对象之间的距离选项（选择所有对象、平均值、最大值、最小值）以获得鱼之间的平均距离 （cm）、最近邻居之间的平均距离 （cm） 和最远邻居之间的平均距离。
- 对于 NTT 和 SPT，选择以下定义的选项：
- 该模板已准备好供其使用。 保存 最后的修改并 关闭 模板，而不从视频中获取任何数据（维护模板文件;它轻巧且易于管理和复制）。如果有多个软件许可证，请分析复制到每台计算机的同一模板中的视频。
- 若要复制和使用模板，有两个选项：
- 使用行为分析软件打开模板文件，转到 “文件”>“另存为 ”以创建一个新的相同文件。
- 在欢迎界面中，选择“ 从模板新建”>“应用了从视频文件>自定义模板 ”（选择“模板”。EthXV 文件）。为新实验命名并选择其位置。软件可能需要几分钟才能从模板文件中复制信息。
- 如果视频是使用其他摄像机录制的，请转到 竞技场设置 以重新调整模板（按照步骤 4.6 和 4.7 操作）。
- 转到 “检测设置 ”或 “采集 ”以检查选择了哪个视频，并在必要时更改视频文件。
- 在 “获取”下，选择“ DDS > Ready to Start”。软件可能需要几分钟才能处理视频。
- 采集完成后，转到 Track Editor。选择加速度 x16 可以更快地读取处理后的视频并检查跟踪是否正确。
注意： 有时，跟踪中可能会有“损失”（由于软件本身的反射或混淆）。如果它们很少，可以从这部分手动编辑它们;否则，最好对整个实验进行重新处理，提高画布的清晰度和检测效果。 - 在 “统计信息”下，单击 “计算>导出数据”。数据导出直接位于试验文件夹中。
- 在 跟踪可视化 或 热图下，生成并导出（右键单击，导出图像，选择实验的 文件夹导出文件 以将此数据与电子表格报告一起保存）动物的跟踪图像。
- 转到 “文件 ”以 关闭 活动实验，然后对下一个视频重复此过程。
5. 统计分析
- 分析每组数据的正态性（Shapiro-Wilk 检验）。
- 使用 Levine 检验评估同方差关系。
- 当不能拒绝正态性和同方差性标准时，使用单因素方差分析，然后进行 Dunnett 和 Tukey 的多重比较检验来检验组间差异。
- 当正态性和同方差性标准被拒绝时，使用 Kruskal-Wallis 检验，然后使用 Bonferroni 校正进行成对比较，以检验组间差异。
- 使用图形软件绘制数据。
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Representative Results
在本节中，我们将研究这些行为工具在鱼类神经毒理学中的一些可能应用。以下结果对应于甲基苯丙胺（METH）的急性或暴饮暴食效应（一种娱乐性药物）的特征，以及草甘膦（水生生态系统中发现的主要除草剂之一）的亚慢性效应。
成年斑马鱼甲基苯丙胺暴饮暴食神经毒性模型的表征
在评估 40 mg/L METH 对 NTT 的影响（图 3）时，Kruskal-Wallis 试验证实，暴露的动物呈现出积极的趋向性，其特征是实验罐上部区域的勘探时间减少 （H（2） = 35.964，P = 1.55 x 10-8），以及该部分的行进距离 （H（2） = 32.272， P = 9.82 x 10-8），以及访问次数（H（2） = 36.527，P = 1.17 x 10-8）。我们还观察到首次访问上层区域之前的潜伏期显着增加 （H（2） = 17.264，P = 0.00018）。 需要注意的是，在METH暴露后，在NTT中观察到的参数差异随着时间的推移是一致的，正如Bonferroni校正所证实的那样（P>0.8）。暴露时间对冷冻行为有显著影响 （H（2） = 13.120， P = 0.0014）。
图 3：在暴露于 40 mg/L 甲基苯丙胺 （METH） 3 小时和 48 小时的成年斑马鱼的标准 6 分钟新型水箱测试 （NTT） 中评估的焦虑样行为。 将每个实验的数据归一化为相应的对照值。合并数据报告为散点图，中位数 （n = 14-15），**p < 0.01，***p < 0.001;Kruskal Wallis 对 NTT 终点进行 Bonferroni 校正检验。来自 2 个独立实验的数据。该图经 Bedrossiantz 等人许可转载15。 请点击这里查看此图的较大版本.
可以通过评估冻结的频率、潜伏期、持续时间或位置来量化冻结运动。对它们进行评分的最佳方法无疑是经验丰富的观察者的眼睛，这是相当费力和复杂的，因此我们尝试使用动物运动轨迹跟踪软件的自动替代方案来检测冻结行为19。我们发现，软件计算的冻结攻击的数量、延迟和持续时间（表 1A）与观察者手动评分的剧集（表 1B）具有良好的准确性。虽然这两种方法在结果方面是等效的（P = 0.958，学生检验），但我们使用自动化方法来评估这里的冻结。暴露于MET3 h后，冷冻时间显着增加（P = 0.0012），而暴露48 h后与对照组没有差异（P = 0.16）。METH 对任何时间的不稳定运动都没有影响。
我们使用两种实验范式来评估急性暴露于甲基苯丙氨酸后对社会行为的影响。ST（图4）显示，MEX处理的鱼的平均距离和最远距离显著更大（H（2）=53.261，P=2.72× 10-12;H（2）=52.504，P = 3.97 x 10-12，分别表示平均和最远的鱼间距离），表明存在社会孤立的行为表型。同样，我们指出，使用 Bonferroni 事后检验没有发现时间效应 （P > 0.5）。
图4：成年斑马鱼在水性中暴露于40 mg/L甲基苯丙胺（METH）3 h和48 h的社会行为。 浅滩测试（ST）结果，包括平均和最远的鱼间距离。合并数据报告为散点图，中位数 （n = 18），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001;Kruskal Wallis 测试与 Bonferroni 校正。来自 2 个独立实验的数据。该图经 Bedrossiantz 等人许可转载15。 请点击这里查看此图的较大版本.
在SPT（图5）中，处理过的鱼在同种区花费的时间和行进距离显着减少（F（2,74）= 14.497，P = 4.87 x 10-6;F（2,73） = 13.461，P = 0.00001 分别表示在同种区域中花费的时间和行进距离）。 这些结果重申了 TS 结果所暗示的社会孤立表型。Tukey 的诚实显着差异 （HSD） 事后检验排除了两个分析时间之间没有可能的差异 （P > 0.5）。
图5：成年斑马鱼在水性中暴露于40 mg/L甲基苯丙胺（METH）3 h和48 h的社会行为。 社会偏好测试 （SPT） 结果，包括鱼在实验水箱的三个虚拟区域（空区、中心区和同种区）中每个区域的时间和距离。将每个实验的数据归一化为相应的对照值。合并数据报告为散点图，中位数 （n = 17-20），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001;单因素方差分析与 Dunnett 的多重比较检验。来自 2 个独立实验的数据。该图经 Bedrossiantz 等人许可转载15。 请点击这里查看此图的较大版本.
亚慢性暴露于环境水平草甘膦的行为影响
对亚慢性暴露于3 μg/L草甘膦对NTT影响的行为分析（图6）显示，探索顶部的时间（F2,77 = 8.744，P = 0.0004），在该部分的行进 距离（F2,77 = 9.118，P = 0.0003）和访问次数（F2,77 = 3.441，P = 0.037）。这些效应是正向地质趋向行为的特征，在第一次访问水箱顶部之前观察到的潜伏期增加的影响也是如此（H（2） = 9.628，P = 0.008）。 在NTT中还分析了暴露动物的不稳定和冷冻行为的表达。草甘膦显著增加了草甘膦的持续时间（H（2）=17.261，P=0.025）和不稳定发作次数（F2,76 = 10.073，P = 0.0001）。 相比之下，与对照组没有发现冻结差异（Pearson卡方（2）=2.964，P=0.253）。 应用于生态环境，NTT的观察表明，草甘膦可以显着降低鱼类的探索行为，危及它们在野外生存的能力。
图 6：暴露于 0.3 μg/L 和 3 μg/L 草甘膦 2 周的成年斑马鱼在标准 6 分钟新型水箱试验 （NTT） 中评估的焦虑样行为。 分析了行为参数，以及实验罐的卡通，分为两个相等的虚拟区域，顶部和底部。数据报告为中位数 （n = 23-29） 的散点图，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001;使用 Dunnett 多重比较检验（总距离、顶部距离、顶部时间、过渡到顶部、不稳定回合、高移动频率）或带有 Bonferroni 校正的 Kruskal Wallis 检验（顶部延迟、不稳定持续时间）的单因素方差分析。冷冻持续时间和冷冻回合没有差异（P > 0.05）。来自 2-4 个独立实验的数据。该图经 Faria 等人许可转载20。 请点击这里查看此图的较大版本.
学校教育，非两极分化的同种群体，在社会压力下聚集在一起以保护自己免受掠食者的侵害，是 Danio rerio 的自然趋势。学校可以根据动物的焦虑或恐惧程度“收紧”或“扩大”，这是一种特殊的视觉效果，很容易通过实验来识别（图7）。在草甘膦实验中，浅滩试验显示，暴露于3 μg/L的鱼类的焦虑增加，这反映在浅滩的分组上，因此个体之间的平均距离和最远距离显着减少（F2,56 = 5.664，P = 0.006和F2,56 = 7.413，P = 0.001，对于平均和最远的鱼间距离 ， 分别）与对照组相比。
图7：成年斑马鱼在0.3 μg/L和3 μg/L草甘膦下2周的社会行为。 数据报告为中位数 （n = 19-20） 的散点图，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001;单因素方差分析与 Dunnett 多重比较检验（平均鱼间距离和最远距离）来自 2 到 4 个独立实验的数据。该图经 Faria 等人许可转载20。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：使用自动分析的冻结行为的近似值。 此表中报告的数据来自使用两种不同方法分析的同一录制（视频 1）。（A） 使用动物运动轨迹跟踪软件运动轨迹跟踪软件自动计算冷冻行为的近似值。可变迁移率是根据两个样本之间被试区域的变化计算得出的，因此它取决于该区域的采集频率。我们将非常低的不动阈值（小于 3% 的移动率）以及采样率设置为至少 5 秒（超过 150 帧）的连续时间。（B） 使用行为观察研究交互式软件（BORIS，免费和开源软件）分析冻结行为。BORIS是一款用于视频编码和实时观察的事件记录软件。借助 BORIS，观察者可以将冻结事件编码为状态事件，从而定义起点和终点。 请按此下载此表格。
视频1：在新型水箱测试中控制鱼类。请按此下载此影片。
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Discussion
在 NTT 中观察到的特征性焦虑行为与大脑中分析的血清素水平呈正相关21.例如，在暴露于对氯苯丙氨酸（PCPA），一种5-HT生物合成的抑制剂后，鱼类表现出积极的趋向性以及大脑5-HT水平的降低22，结果与MEH获得的结果非常相似。因此，暴露于甲基苯丙胺的斑马鱼中大脑血清素水平的降低和正向地理趋向性的表现表明，药物产生的焦虑行为是由血清素能途径介导的。有趣的是，在暴露于0.3 3 μg/L和3 μg/L（两种环境相关浓度的草甘膦）2周的成年斑马鱼中，可以看到类似的行为表型，即对趋向性的抗焦虑作用。先前也报道了使用神经毒物丙烯酰胺 6,23 的成年斑马鱼的趋向性增加。在所有这些情况下，这种行为表型（NTT中趋向性的增加，抗焦虑物质的特征）与单胺能神经递质水平的降低有关。因此，NTT范式与大脑的神经化学分析相结合，提供了生态相关信息、探索行为和觅食效率，并将行为神经表型与神经递质调节联系起来。
另一方面，在MEX处理的鱼类中也观察到两种测定（ST和SPT）的社会行为受损。本研究获得的结果与对大鼠和猴子的几项研究一致，其中研究动物急性和慢性暴露于 METH 导致社交退缩24.与METH滥用相关的社会行为变化在人类中可以通过社会认知功能的损害来解释24。在暴露于3 μg/L草甘膦2周的斑马鱼中发现对浅滩大小的抗焦虑作用。我们在暴露于 53 mg/L （0.75 mM） 丙烯酰胺 3 天的斑马鱼中观察到这种效应的表型 6,23。
NTT、ST 和 SPT 测定可以有效地确定各种化学品的潜在神经毒性作用25 ，如成年斑马鱼急性甲基苯丙胺和亚慢性草甘膦毒性模型的研究所说明的那样。在毒理学中，行为是一个相关的顶端终点，它表征了化学物质在生物体水平上对神经毒性和环境研究的影响。除了在实验室条件下是亚致死终点外，行为的改变，如探索性行为或社交行为，本质上可能是有害的。此外，所提出的行为分析电池是一种易于实施的半自动方法11 ，因此，如果有意识地计划分析（还原原理）26，则非常有效。使用单个罐作为测试电池进行这些测定可减少动物数量、实验时间和废物产生。
如果我们想研究每个试验中个体的反应特征，电池中检测的顺序是一个重要的考虑因素。为此，进行所遵循的个体测定（见 图2）可以保持动物的识别，并将其探索行为与其社会偏好联系起来。此外，如果在取样结束之前一直对鱼进行鉴定，则动物的行为反应可能与其他生物学数据有关，例如其神经递质谱或基因表达（图2A）。
通常，行为分析可以观察组之间的差异。首先，在按组合并数据之前，根据动物跟踪27 计算个体反应。然后，比较计算的每个行为参数的均值和相对于对照组的方差差。在浅滩分析12中，必须非常清楚方差单位是测试鱼群，而不是单个鱼，因为每条鱼的行为都受到浅滩中其他鱼的影响。这是大多数论文中用于处理行为数据的方法28.然而，重新考虑行为参数的分析可能不是基于逐个参数，而是作为每个试验的总体反应。例如，可以计算试验中每个测量值的协方差，并将其报告为测量同一事物的不同方式：焦虑、探索或合群行为。有许多方法可以计算和解释行为数据28,29。根据条件的数量、测试类型和图像采集（2D 或 3D）30,31，可以完全重新考虑分析，以便充分利用数据。
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Disclosures
作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙科学与创新部的“Agencia Estatal de Investigación”（项目 PID2020-113371RB-C21）、IDAEA-CSIC、Severo Ochoa 卓越中心 （CEX2018-000794-S） 的支持。朱丽叶·贝德罗西安茨（Juliette Bedrossiantz）得到了西班牙政府和欧洲社会基金（ESF）共同资助的博士资助（PRE2018-083513）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
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