Summary
여기에서는 단일 수조를 사용하여 성체 제브라피쉬에 대한 화학 물질(예: 메스암페타민 및 글리포세이트)의 잠재적인 신경 독성 영향을 효과적으로 결정하기 위해 새로운 수조, Shoaling 및 사회적 선호도 테스트를 포함한 포괄적인 행동 테스트 배터리를 제시합니다. 이 방법은 신경 독성 및 환경 연구와 관련이 있습니다.
Abstract
신경 병리학적 효과의 존재는 수년 동안 화학 물질의 신경 독성을 평가하기 위한 주요 종점임이 입증되었습니다. 그러나 지난 50년 동안 화학 물질이 모델 종의 행동에 미치는 영향은 적극적으로 조사되었습니다. 점진적으로 행동 종점이 신경독성학적 스크리닝 프로토콜에 통합되었으며, 이러한 기능적 결과는 이제 화학물질의 잠재적인 신경독성을 식별하고 결정하는 데 일상적으로 사용됩니다. 성체 제브라피시의 행동 분석은 불안, 사회적 상호 작용, 학습, 기억 및 중독을 포함한 광범위한 행동을 연구할 수 있는 표준화되고 신뢰할 수 있는 수단을 제공합니다. 성체 제브라피쉬의 행동 분석에는 일반적으로 물고기를 실험장에 배치하고 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 행동을 기록 및 분석하는 것이 포함됩니다. 물고기는 다양한 자극에 노출될 수 있으며 다양한 지표를 사용하여 행동을 정량화할 수 있습니다. 새로운 수조 테스트는 물고기의 불안과 같은 행동을 연구하기 위해 가장 널리 받아들여지고 널리 사용되는 테스트 중 하나입니다. 떼를 지어 다니고 사회적 선호도 테스트는 제브라피쉬의 사회적 행동을 연구하는 데 유용합니다. 이 분석은 전체 떼의 거동을 연구하기 때문에 특히 흥미롭습니다. 이러한 분석은 재현성이 높고 약리학적 및 유전자 조작에 민감한 것으로 입증되어 행동의 기저에 있는 신경 회로와 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구가 되었습니다. 또한 이러한 분석은 약물 스크리닝에 사용되어 행동의 잠재적 조절제일 수 있는 화합물을 식별할 수 있습니다.
이 연구에서는 기분전환용 약물인 메스암페타민(methamphetamine)과 환경오염물질인 글리포세이트(glyphosate)의 영향을 분석하면서 어류 신경독성학에 행동 도구를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 결과는 신경 기능을 변화시킬 수 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 환경 오염 물질 및 약물의 신경 독성학적 영향을 이해하는 데 성인 제브라피쉬의 행동 분석이 크게 기여했음을 보여줍니다.
Introduction
제브라피시(Danio rerio)는 생태독성학, 약물 발견 및 안전성 약리학 연구에서 인기 있는 척추동물 모델 종입니다. 저렴한 비용, 잘 정립된 분자 유전 도구, 신경계의 형태 형성 및 유지에 관여하는 주요 생리학적 과정의 보존으로 인해 제브라피시는 신경 행동 독성학을 포함한 신경 과학 연구에 이상적인 동물 모델입니다 1,2. 화학 물질의 신경 독성을 평가하기위한 주요 종점은 최근까지 신경 병리학 적 영향의 존재였습니다. 그러나 최근에는 행동 종점이 신경독성학적 스크리닝 프로토콜에 통합되었으며, 이러한 기능적 결과는 이제 화학물질의 잠재적인 신경독성을 식별하고 결정하는 데 일반적으로 사용됩니다 3,4. 더욱이, 어류의 매우 경미한 행동 변화조차도 자연 조건에서 동물의 생존을 위태롭게 할 수 있기 때문에 행동 종점은 생태학적 관점에서 매우 관련성이 높다5.
성체 제브라피시 연구에서 가장 많이 사용되는 행동 분석 중 하나는 불안과 유사한 행동을 측정하는 새로운 수조 테스트(NTT)입니다 6,7. 이 분석에서 물고기는 새로움(물고기가 낯선 수조에 놓임), 가벼운 혐오 자극에 노출되고 행동 반응이 관찰됩니다. NTT는 주로 물고기의 기초 운동 활동, 지오택시, 동결 및 불규칙한 움직임을 평가하는 데 사용됩니다. 불규칙한8은 갑작스런 방향 전환(지그재그)과 반복되는 가속(다팅)이 특징입니다. 그것은 경보 반응이며 일반적으로 동결 에피소드 전후에 관찰됩니다. 동결 행동은 수조 바닥에 있는 동안 물고기의 움직임(수술 및 안구 운동 제외)이 완전히 멈추는 것에 해당하며, 진정으로 인한 부동성과 구별되며, 이는 저운동, 무감각증 및 침몰을 유발합니다8. 얼어붙는 것은 일반적으로 높은 스트레스 및 불안 상태와 관련이 있으며 복종하는 행동의 일부이기도 합니다. 복잡한 행동은 동물의 불안 상태를 나타내는 훌륭한 지표입니다. NTT는 약리학적 및 유전자 조작에 민감한 것으로나타났으며9 불안 및 관련 장애의 신경 기초를 연구하는 데 유용한 도구가 되었다.
제브라피시는 매우 사회적인 종이기 때문에 다양한 사회적 행동을 측정할 수 있습니다. 숄링 테스트(shoaling test, ST)와 사회적 선호도 테스트(social preference test, SPT)는 사회적 행동을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 분석법이다10. ST는 물고기의 공간적 행동과 움직임 패턴을 정량화하여11 물고기가 함께 그룹화하는 경향을 측정합니다. ST는 집단 역동성, 리더십, 사회적 학습을 연구하고 많은 어종의 사회적 행동을 이해하는 데 유용하다12. 성체 제브라피쉬의 SPT는 생쥐13에 대한 사회적 신규성 테스트에 대한 크롤리의 선호도에서 채택되었으며, 이 모델 종14의 사회적 상호작용 연구를 위한 인기 있는 행동 분석법이 되었다. 이 두 가지 검사는 또한 약물 스크리닝 분석에 사용하기 위해 조정되었으며 사회적 행동을 조절하는 새로운 화합물을 식별하기 위한 가능성을 보여주었습니다 15,16.
일반적으로, 성체 제브라피쉬의 행동 분석은 활성 화합물 및 남용 약물의 행동 메커니즘 또는 신경 표현형에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있는 강력한 도구이다17. 이 프로토콜은 기초 물질 자원으로 이러한 행동 도구(behavioral tools)7 를 구현하는 방법과 광범위한 신경 활성 화합물의 효과를 특성화하기 위해 독성 분석에 적용하는 방법을 상세히 설명한다. 또한 신경 활성 화합물(메스암페타민)에 대한 급성 노출의 신경 행동 효과를 평가하기 위해 동일한 테스트를 적용할 수 있을 뿐만 아니라 살충제(글리포세이트)의 환경 농도에 만성적으로 노출된 후 이러한 영향을 특성화할 수도 있습니다.
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Protocol
윤리적 기준을 엄격하게 준수하면 실험에 사용되는 제브라피시의 복지와 적절한 대우가 보장됩니다. 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(CID-CSIC)에서 수립한 지침에 따라 수행되었습니다. 아래에 제시된 프로토콜 및 결과는 지방 정부에서 부여한 라이선스(계약 번호 11336)에 따라 수행되었습니다.
1. 행동검사를 위한 동물사육
- 27-28°C의 격리된 행동실에서 10:00에서 17:00 사이에 모든 테스트( 그림 00 참조)를 수행합니다.
- 실험 탱크의 잠재적인 오염을 방지하기 위해 실험을 시작하기 전에 깨끗한 물고기 물[90mg/L 수족관 시스템 소금, 0.58mM CaSO4·2H2O및 0.59mM NaHCO3를 포함하는 역삼투압 정제수]에서 대조군과 노출된 물고기를 여러 번 씻으십시오.
- 실험을 시작하기 1시간 전에 동물을 행동실에 적응시킵니다.
- 동물(≈50:50 수컷 비율: 암컷 비율)이 실험적으로 순진한지 확인하고 실험 그룹을 알지 못하는 관찰자와 함께 모든 행동 테스트를 블라인드 방식으로 수행합니다.
- 행동 분석에서 의미 있는 결과를 얻으려면 조건당 총 18명의 피험자(n = 18)가 있어야 하며, 이상적으로는 두 개 이상의 독립적인 실험 간에 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 개별 테스트에서 조건당 반복실험당 9마리의 동물 행동을 분석합니다. 그룹 테스트에서는 조건당 반복실험당 6-9마리의 동물 떼의 행동을 분석합니다.
- 배터리 테스트 접근 방식에 따라 모든 테스트를 수행합니다( 그림 2의 계획 제안 참조). 윤리적으로 더 적합한 이 방법을 사용하면 3R 감소 원칙7을 준수하여 연구에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
- 대부분의 경우 행동 분석은 생물학적 분석과 연결되므로 샘플(OMIC 또는 화학 물질)을 수집하고 분석하기 전에 안락사 지침18 에 따라 동물을 희생하십시오. 종점이 표본추출로 판명되지 않으면 실험이 끝날 때 대조군을 다시 안정시킵니다. 대조군 동물은 며칠 후에 번식 또는 실험 목적으로 재사용하십시오.
그림 1: 실험적 설정. 성체 제브라피쉬의 다양한 행동을 연구하기 위한 사각형 수조의 세 가지 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 타임라인. 행동 분석 기록을 위한 두 가지 계획 제안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 탱크의 실험적 구성
- 불안과 유사한 행동: NTT(The Novel Tank Test)
- 실험 설정(수조, 카메라 및 컴퓨터 수)을 조정하여 최대 물고기 수를 동시에 기록합니다. 개별 거동 분석은 시간이 많이 걸리므로 시간, 재료 및 공간을 최적화하십시오.
- NTT를 위한 실험 탱크 준비: 정사각형 탱크(길이 20cm, 너비 20cm, 높이 25cm)는 피사체 간의 반사 및 간섭을 피하기 위해 측벽과 바닥에 아크릴 패널로 덮여 있습니다.
- 28°C에서 산소가 잘 공급된 어수 7L(물기둥 높이: 20cm 높이)로 실험 탱크를 채웁니다.
- 이미지가 왜곡되지 않도록 카메라 앞에서 탱크의 위치를 조정하십시오.
- 조명 설정을 확인하십시오. LED 백라이트 (10000 lux)는 양호한 조건에서 비디오 녹화를 위해 탱크의 모든 부분에 균질 조명을 제공합니다.
- 카메라를 켜고 섹션 3에 따라 조정합니다.
- 가능한 한 빨리 기록을 시작하기 전에 피험자를 실험 탱크의 바닥에 하나씩 넣습니다.
알림: 탱크 바닥에서 동물과 함께 녹음을 시작하는 것이 중요합니다. - 녹음하는 동안 동물을 방해하지 않도록 주의하십시오. 커튼이나 패널을 사용하여 탱크 사이뿐만 아니라 지지대와 외부 사이의 시각적 상호 작용을 제한합니다.
- 기록이 끝날 때(표준 기록 시간은 6분) 이미 테스트를 통과한 동물을 다른 수조로 옮겨 순진한 동물과 섞이지 않도록 합니다.
- 사용 가능한 모든 주제에 대해 절차를 반복합니다. 개별 시험(2회 이상의 독립 반복실험)에서 의미 있는 결과를 얻기 위해 조건당 총 18명의 피험자를 보유하는 것이 좋습니다.
- 잠재적인 탱크 효과를 피하기 위해 시행 사이에 각 탱크에 할당된 실험 그룹을 무작위 배정합니다(동시에 여러 조건을 기록하는 경우).
- 사회적 집단 행동: 숄잉 테스트(ST)
- ST의 실험 구성은 NTT와 동일합니다(동일한 탱크를 직접 재사용할 수 있음).
- 2.1.1-2.1.6단계를 따릅니다. ST를 설정합니다.
- 가능한 한 빨리 기록을 시작하기 전에 실험 탱크의 바닥에 여울(동시에 6-9명의 피험자)을 도입합니다.
알림: 탱크 바닥에서 동물과 함께 녹음을 시작하는 것이 중요합니다. - 2.1.8-2.1.11 단계를 따릅니다. ST를 수행합니다.
- 사용 가능한 모든 주제에 대해 절차를 반복합니다. 이 분석에서 의미 있는 결과를 얻으려면 각 반복실험에서 동일한 뱅크 크기를 갖는 두 개 이상의 독립 반복실험을 수행하십시오.
- 모든 실험군에 대해 떼의 크기를 일정하게 유지하고 동일한 실험 내에서 반복실험합니다.
- 사회적 개인 행동: 사회적 선호도 테스트(SPT)
- 실험 설정을 조정하여 실험 공간과 기록 시간을 최적화합니다.
- SPT용 실험 탱크 준비: 정사각형 탱크(길이 20cm, 너비 20cm, 높이 25cm)는 측면 가시성을 제공하기 위해 투명(유리 또는 플라스틱)입니다. 단일 초점 물고기는 일방적인 외부 하우징 탱크에 배치된 물고기 떼인 동종 가상 영역 또는 일방적인 외부 빈 하우징 탱크인 비특정 가상 영역과 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다.
- 28°C에서 5L(물기둥 높이: 15cm, 외부 하우징 탱크의 물기둥과 동일한 높이)의 깨끗한 물고기 물을 실험 탱크에 채웁니다.
- 이미지가 왜곡되지 않도록 카메라 앞에서 탱크의 위치를 조정하십시오.
- 시스템이 균일한 조명을 받는지 확인하십시오.
- 피험자를 한 명씩 실험 탱크의 바닥에 집어넣은 후 동물을 중앙에 두고 즉시 녹음을 시작합니다.
- 기록하는 동안 관찰자와 동물 간의 시각적 상호 작용을 피하십시오.
- 6분 녹화가 끝나면 현재 동물을 다른 수조로 옮겨 순진한 동물과 섞이지 않도록 합니다.
- 사용 가능한 모든 주제에 대해 절차를 반복합니다. 조건당 총 18명의 피험자를 보유하여 개별 시험(2회 이상의 독립 반복실험)에서 의미 있는 결과를 얻을 수 있습니다.
3. 행동 테스트를 위한 비디오 녹화
- 카메라 관리자를 열어 각 컴퓨터에서 GigE 카메라를 사용할 수 있는지 확인합니다.
- GigE 카메라 제어 소프트웨어(예: uEye Cockpit, 여기에 설명)를 실행합니다. 카메라 옵션을 열고 모노크롬 모드를 선택한 다음 이미지 크기(1:2)를 조정합니다.
- 카메라 속성 열기
- 카메라에서 픽셀 클럭을 최대로 설정하고, 프레임 속도를 초당 30프레임(fps)으로 설정하고, 노출을 조정합니다(이미지가 너무 어두우면 자동 또는 수동 조정).
- 이미지에서 게인을 0(자동)으로 설정하고 블랙 레벨(자동 또는 수동으로 조정하여 좋은 대비를 얻음)을 설정합니다.
- 크기에서 창의 크기를 새겨야 하는 영역(너비: 너비-왼쪽, 높이: 높이-상단)으로 조정합니다. 이 단계를 통해 이미지 크기를 줄여 비디오의 최종 크기를 줄일 수 있습니다.
- 카메라 속성을 닫습니다.
- 실험 세션의 일반 폴더를 만들어 카메라 설정 및 비디오를 저장합니다.
- 카메라 설정을 저장하려면 파일(File) > 파라미터 저장(Save Parameters) > To File(파일로 )을 설정하고 최근에 만든 실험 폴더를 선택합니다.
참고: 따라서 카메라 설정 파일을 응용 프로그램에서 다시 로드하여 언제든지 동일한 이미지 매개변수로 계속 작업할 수 있습니다(예: 카메라가 갑자기 꺼지거나 동일한 설정을 재사용하여 설정 시간을 줄이고 실험 조건을 균질화할 때). 잠시 후 비디오 사이에 카메라가 멈추면 녹화를 중지하고 종료한 다음 카메라를 끕니다. 다시 켜고 File > Load Parameters > To File로 이동하여 카메라 매개변수를 다시 로드한 다음 녹화를 다시 시작합니다. 물고기를 버리거나 반복하기 위해 현재 비디오가 완전히 획득되었는지 확인하십시오(반복하기 전에 동물이 다시 적응할 시간을 주십시오). - 모든 카메라에서 이 카메라 설정 절차(3.1-3.5단계)를 반복합니다.
- 모든 카메라가 올바르게 구성되면 비디오 시퀀스 녹화를 엽니다.
- 만들기를 선택하여 새 비디오 파일로 저장하고, 최근에 만든 실험 폴더를 선택하고, 비디오 파일 이름에 주제, 실험 유형 및 날짜의 정보를 보고합니다.
- Max. Frames(최대 프레임)를 선택합니다. 프레임 상자에 10800을 입력합니다. 표준 동영상은 AVI 형식으로 30fps로 6분(동영상 1)을 녹화합니다. 따라서 6분 x 60초 x 30fps= 총 10800프레임입니다.
- 프레임 속도 계산을 선택하거나 프레임 속도를 수동으로 표시합니다(기록 속도: 30fps).
- 모든 컴퓨터에서 비디오 파일 생성 절차를 반복합니다.
- 각 실험 탱크의 바닥에 있는 피험자를 하나씩 소개합니다. 모든 분석이 한 번에 실행됩니다.
- 녹화를 클릭하여 빠르게 녹화를 시작하고 요청된 최대 프레임 수를 얻을 때까지 기다립니다(3.10단계).
- 비디오가 녹화되면 Maximal number of frames achieved!라는 메시지와 함께 채팅 상자가 나타납니다. 수락을 선택합니다.
- 닫기를 선택하여 녹화를 완료하고 비디오 파일을 닫습니다.
- 방금 관찰한 물고기를 제거하십시오. 순진한 물고기와 분리하도록 주의하십시오.
- 만들기를 직접 선택하고 프로세스를 반복하여 비디오 녹화를 계속합니다.
- 모든 녹음이 완료되면 종료를 선택합니다.
- 카메라를 끄려면 카메라를 닫 고 프로그램 종료 를 선택합니다.
4. 녹화된 영상 분석
- 해석 소프트웨어를 시작합니다( 재료 표 참조).
- 새 템플릿에 대해 자세히 설명하려면 템플릿에서 새로 만들기 > 비디오 파일에서 미리 정의된 템플릿 > 적용을 클릭하고 템플릿을 설정할 비디오를 선택합니다. 피험자가 좋은 이동성과 좋은 녹화 조건을 보이는 실험의 대표 비디오를 선택하십시오.
- 매개 변수에서 다음 창(1 - 4/7)에서 매개 변수를 구성합니다. 물고기 > 성인 제브라피시, 경기장 오픈 필드 광장 > 하나의 경기장, 경기장당 피사체 수(ST의 경우 다중 추적 패키지[한 경기장에서 다양한 피사체 추적] 필요), 중심점별 감지 유형을 선택하고 마지막으로 프레임 속도를 30fps로 조정합니다. 다음 창(5 - 7/7)에서는 매개변수를 변경하지 마십시오. 기본 구성은 OK입니다.
- 실험의 이름을 템플릿으로 지정하고 저장된 비디오의 나머지 부분과 동일한 폴더에 배치합니다. 템플릿은 모든 설정 정보를 포함하는 여러 하위 분할이 있는 실험 폴더로 생성됩니다.
- 실험 설정에서 정의된 설정(비디오 파일, 경기장, 피사체 수, 초당 프레임 수)을 확인합니다. 여기에서 시스템 단위를 수정할 수 있습니다.
- 아레나 설정에서 화면 중앙을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 잡기를 선택합니다. 디스플레이의 파일에서 시작합니다. 좋은 품질의 비디오 이미지를 선택하고 수락하여 배경 설정을 위해 이 이미지를 캡처합니다. 먼저 이미지를 보정하여 보정된 규칙을 생성합니다. 탱크의 너비를 저울 (19cm)로 사용하십시오. 그런 다음 경기장을 그립니다. 동물이 수면에 접근할 때 동물의 반사를 피하거나 물고기 소프트웨어와 수조의 검은색 영역이 혼동되는 것을 피할 수 있을 만큼만 정사각형을 만드도록 주의하십시오. 마지막으로 Frame 함수를 사용하여 모양 영역을 그립니다.
- NTT 및 ST의 경우 탱크 전면을 상단과 하단의 두 개의 동일한 가상 영역으로 나눕니다( 그림 1 참조). 두 개의 동일한 가로 상자를 그립니다. 상자는 각각 경기장의 절반을 차지합니다. 위쪽 영역과 아래쪽 영역에 대해 각각 위쪽 및 아래쪽 이름을 지정합니다. 상자의 너비(9-10cm)와 길이(8-9cm)가 같고, 경기장 경계(주황색 사각형)를 초과하지 않으며, 겹치지 않도록 주의하고, 각 화살표 영역이 해당 영역을 정확히 나타내는지 확인하십시오.
- SPT의 경우 실험 영역을 개념적으로 동일한 크기의 세 가지 영역(비어 있음, 중앙 및 동종)으로 나눕니다( 그림 1 참조). 세 개의 동일한 수직 상자를 그립니다. 여울 탱크를 향하는 상자는 Conspecific으로, 빈 탱크를 향하는 상자는 Empty로, 가운데 탱크를 향하는 상자는 Center로 이름을 지정합니다. 상자의 너비(6cm)와 길이(18-19cm)가 같고, 경기장 제한을 초과하지 않으며, 겹치지 않도록 주의하십시오.
- Detection Settings(탐지 설정)에서 Video File(비디오 파일)에서 처리할 비디오를 확인합니다. 그런 다음 감지 품질(노란색, 빨간색 중심점)을 확인합니다. 자동 감지를 클릭하여 감지를 조정하고 동물의 초점을 다시 맞춥니다(흰색 배경에 동물이 옆모습으로 수영하는 이미지를 선택하고 몸 전체를 촬영하여 그림을 그린 다음 예로 감지를 확인합니다). 고급을 열어 Dynamic Subtraction, Darker Subject, Background Settings, Background Learning, Subject Size, Noise Reduction 등을 선택하여 감지를 개선합니다.
- 평가판 설정에서 하나의 평가판을 넣고 다른 평가판을 삭제합니다(마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 삭제).
- 데이터 설정에서 결과 대화 상자 창을 만듭니다. 시간 및 영역별로 결과를 매개변수화합니다. 예를 들어, 분 단위의 데이터 출력에 대한 결과 창과 총 시간(6분)에 따른 데이터 출력에 대한 결과 창을 각각 하나씩 만듭니다. 각 구역에 대한 데이터 출력을 요청합니다(각 구역의 거리가 필요한 경우 요청). 화살표를 사용하여 다른 결과 창을 시작 창에 연결합니다.
- 분석 설정에서 분석할 매개 변수와 각 매개 변수에 대한 통계 유형을 선택합니다. 이러한 매개변수는 추적에서 얻은 데이터를 기반으로 자동으로 계산됩니다.
- NTT 및 SPT의 경우 아래에 정의된 대로 옵션을 선택합니다.
- 이동 거리를 선택(합계 선택)하여 경기장에서 이동한 거리(cm)와 각 구역에서 이동한 거리(cm)를 구합니다.
- In Zones(영역, 빈도, 누적 및 Latency to First 선택)를 선택하여 영역(들)에서 소요된 시간과 영역(들)의 첫 번째 진입까지의 대기 시간을 갖습니다.
- 영역 전환 선택(임계값 선택: 0cm, 영역 1 > 영역 2 추가; 구역 2 > 구역 1, 모든 구역, 빈도)를 사용하여 구역의 입구 수를 구합니다.
- 이동성 상태(High mobile을 70% 이상으로, Immobile을 3% 미만으로, 최소 150프레임을 채우고 frequency, cumulative, latency를 먼저 선택)를 선택하여 hypermobility의 지속 시간(들), 동결 기간(s)을 갖습니다.
참고: 자동 분석을 사용한 동결 동작의 근사치와 동결 에피소드의 수 및 지속 시간에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - Acceleration(가속) 및 Turn Angle(회전 각도)(빈도 및 누적 선택)을 선택하여 다팅 및 불규칙(빠른 가속 동작)과 같은 복잡한 동작의 발생을 평가합니다.
- ST의 경우 위의 탐색 매개변수 외에도 피사체 사이의 거리(모든 피사체, 평균, 최대, 최소값 선택) 옵션을 선택하여 물고기 사이의 평균 거리(cm), 가장 가까운 이웃 사이의 평균 거리(cm) 및 가장 먼 이웃 사이의 평균 거리를 가져옵니다.
- NTT 및 SPT의 경우 아래에 정의된 대로 옵션을 선택합니다.
- 템플릿을 사용할 준비가 되었습니다. 마지막 수정 사항을 저장하고 비디오에서 데이터를 가져오지 않고 템플릿을 닫습니다 (템플릿 파일 유지 관리, 가볍고 관리 및 복사하기 쉽습니다). 소프트웨어 라이센스가 여러 개인 경우 각 컴퓨터에 복사된 동일한 템플릿의 비디오를 분석합니다.
- 템플릿을 복사하고 사용하려면 다음 두 가지 옵션이 있습니다.
- 동작 분석 소프트웨어로 템플릿 파일을 열고 파일 > 다른 이름으로 저장 으로 이동하여 동일한 새 파일을 만듭니다.
- 시작 인터페이스에서 New from Template(템플릿에서 새로 만들기)을 선택합니다> Applied a Custom Template(비디오 파일에서 사용자 지정 템플릿) > Applied a Custom Template(비디오 파일에서 사용자 지정 템플릿 적용)(템플릿 선택). EthXV 파일). 새 실험의 이름을 지정하고 위치를 선택합니다. 소프트웨어가 템플릿 파일에서 정보를 복사하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 비디오가 다른 카메라로 녹화된 경우 경기장 설정으로 이동하여 템플릿을 다시 조정하십시오(4.6 및 4.7단계 수행).
- Detection Settings(감지 설정) 또는 Acquisition(획득)으로 이동하여 어떤 비디오가 선택되었는지 확인하고 필요한 경우 비디오 파일을 변경합니다.
- Acquisition(획득)에서 DDS > Ready to Start(시작 준비 완료)를 선택합니다. 소프트웨어가 비디오를 처리하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 획득이 완료되면 Track Editor로 이동합니다. 가속 x16을 선택하면 처리된 비디오를 더 빠르게 읽고 추적이 올바른지 확인할 수 있습니다.
알림: 때로는 추적에 "손실"이 있을 수 있습니다(소프트웨어 자체의 반사 또는 혼동으로 인해). 적은 경우 이 부분에서 수동으로 편집할 수 있습니다. 그렇지 않으면 전체 실험을 다시 처리하여 캔버스의 정의와 감지를 개선하는 것이 좋습니다. - Statistics(통계)에서 Calculate > Export Data(데이터 계산)를 클릭합니다. 데이터 내보내기는 실험 폴더에 직접 있습니다.
- 트랙 시각화 또는 히트맵에서 동물의 추적 이미지를 생성하고 내보냅니다(마우스 오른쪽 버튼 클릭, 이미지 내보내기, 실험의 내보내기 파일 폴더 선택, 스프레드시트 보고서와 함께 이 데이터를 저장).
- 파일로 이동하여 활성 실험을 종료하고 다음 비디오에 대해 이 절차를 반복합니다.
5. 통계 분석
- 각 그룹에 있는 데이터의 정규성(Shapiro-Wilk 검정)을 분석합니다.
- Levene의 테스트로 동질성을 평가합니다.
- 일원 분산 분석과 Dunnett 및 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 정규성 및 동질성 기준을 기각할 수 없는 경우 그룹 간의 차이를 검정합니다.
- Kruskal-Wallis 검정을 사용한 다음 Bonferroni 수정을 사용하여 쌍별 비교를 사용하여 정규성 및 동질성 기준이 기각된 경우 그룹 간의 차이를 검정합니다.
- 그래픽 소프트웨어로 데이터를 플로팅합니다.
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Representative Results
이 섹션에서는 어류 신경 독성학에서 이러한 행동 도구의 몇 가지 가능한 응용 프로그램을 살펴볼 것입니다. 다음 결과는 레크리에이션 약물인 메스암페타민(METH)의 급성 또는 폭음 효과와 수중 생태계에서 발견되는 주요 제초제 중 하나인 글리포세이트의 아만성 효과의 특성에 해당합니다.
성인 제브라피쉬의 메스암페타민 폭음 신경독성 모델의 특성 분석
NTT에 대한 40mg/L METH의 효과를 평가할 때(그림 3), Kruskal-Wallis 테스트는 노출된 동물이 실험 탱크의 상부 영역(H(2) = 35.964, P = 1.55 x 10-8)과 이 부분에서 이동한 거리(H(2) = 32.272, P = 9.82 x 10-8) 및 방문 횟수 (H (2) = 36.527, P = 1.17 x 10-8). 또한 상위 영역을 처음 방문하기 전에 대기 시간이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(H(2) = 17.264, P = 0.00018). METH 노출 후 NTT에서 측정된 파라미터에서 관찰된 차이는 Bonferroni 보정(P > 0.8)에 의해 확인된 바와 같이 시간이 지남에 따라 일관된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 동결 거동에 대해 노출 시간의 유의한 영향이 발견되었습니다(H(2) = 13.120, P = 0.0014).
그림 3: 3시간 및 48시간 동안 40mg/L 메스암페타민(METH)에 노출된 성인 제브라피쉬의 표준 6분 신규 수조 테스트(NTT)에서 평가된 불안 유사 행동. 각 실험의 데이터는 해당 제어 값으로 정규화되었습니다. 결합된 데이터는 중앙값(n = 14-15), **p < 0.01, ***p < 0.001의 산점도로 보고됩니다. NTT 엔드포인트에 대한 Bonferroni 보정을 사용한 Kruskal Wallis 테스트. 2개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 이 그림은 Bedrossiantz et al.15의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동결 움직임은 동결 빈도, 대기 시간, 지속 시간 또는 위치를 평가하여 정량화할 수 있습니다. 점수를 매기는 가장 좋은 방법은 의심할 여지 없이 숙련된 관찰자의 눈인데, 이는 매우 힘들고 복잡하기 때문에 EthoVision 소프트웨어를 사용하여 동결 동작을 감지하는 자동화된 대안을 시도했습니다19. 소프트웨어에 의해 계산된 동결 공격의 횟수, 대기 시간 및 지속 시간(표 1A)은 관찰자가 수동으로 채점한 에피소드(표 1B)와 좋은 정확도와 상관관계가 있음을 발견했습니다. 두 방법은 결과 면에서 동일하지만(P = 0.958, 학생 검정) 여기서는 동결을 평가하기 위해 자동화된 접근 방식을 사용했습니다. 필로폰에 3시간 노출된 후 동결 시간이 유의하게 증가한 반면(P =0.0012), 48시간 노출 후(P =0.16) 대조군에서는 차이가 발견되지 않았다. 필로폰은 두 시간 모두 불규칙한 움직임에 아무런 영향을 미치지 않았다.
우리는 두 가지 실험 패러다임을 사용하여 METH에 급성 노출된 후 사회적 행동에 미치는 영향을 평가했습니다. ST(그림 4)는 필로폰을 투여한 어류의 평균 거리와 개체 간의 거리가 유의하게 더 크다는 것을 보여주었다(H(2)=53.261, P=2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P=3.97 x 10-12(각각 평균 및 가장 먼 물고기 간 거리)는 사회적 고립의 행동 표현형을 가리킨다. 다시 말하지만, Bonferroni 사후 검정(P > 0.5)을 사용하여 시간 효과가 발견되지 않았음을 언급합니다.
그림 4: 40mg/L 메스암페타민(METH)에 3시간 및 48시간 동안 노출된 수인성 제브라피시 성체의 사회적 행동. 평균 및 가장 먼 인터피시 거리를 포함한 숄링 테스트(ST) 결과. 결합된 데이터는 중앙값(n = 18), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001인 산점도로 보고됩니다. Bonferroni 보정을 사용한 Kruskal Wallis 테스트. 2개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 이 그림은 Bedrossiantz et al.15의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SPT(그림 5)에서 처리된 물고기는 동종 구역에서 보낸 시간과 이동 거리가 크게 감소했습니다(F(2,74) = 14.497, P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13.461, P = 0.00001(각각 동일 구역에서 소요된 시간 및 이동 거리)입니다. 이러한 결과는 TS 결과가 제시하는 사회적 고립 표현형을 재확인시켜줍니다. Tukey의 HSD(Honest Significant Difference) 사후 검정에서는 두 분석 시간 간에 가능한 차이가 없음을 배제했습니다(P > 0.5).
그림 5: 40mg/L 메스암페타민(METH)에 3시간 및 48시간 동안 노출된 수인성 제브라피시 성체의 사회적 행동. 실험 수조의 세 가지 가상 구역(비어 있음, 중앙 및 동종) 각각에서 물고기의 시간과 거리를 포함한 사회적 선호도 테스트(SPT) 결과. 각 실험의 데이터는 해당 제어 값으로 정규화되었습니다. 결합된 데이터는 중앙값 (n = 17-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001인 산점도로 보고됩니다. Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석. 2개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 이 그림은 Bedrossiantz et al.15의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
글리포세이트의 환경 수준에 대한 아만성 노출의 행동 효과
3μg/L 글리포세이트에 대한 아만성 노출이 NTT에 미치는 영향에 대한 행동 분석(그림 6)은 정상을 탐색하는 데 소요된 시간(F2,77 = 8.744, P = 0.0004), 이 부분의 이동 거리(F2,77 = 9.118, P = 0.0003) 및 방문 횟수(F2,77 = 3.441, P = 0.037)입니다. 이러한 효과는 탱크 상단을 처음 방문하기 전에 지연 시간에 관찰된 증가된 효과와 마찬가지로 양의 지오택시 동작의 특징입니다(H(2) = 9.628, P = 0.008). 노출된 동물의 변덕스럽고 얼어붙은 행동의 발현도 NTT에서 분석되었습니다. 지속 시간(H(2) = 17.261, P = 0.025) 및 불규칙한 에피소드 수(F2,76 = 10.073, P = 0.0001)는 글리포세이트에 의해 유의하게 증가하였다. 대조적으로, 대조군에서는 동결 차이가 발견되지 않았습니다(Pearson 카이-제곱(2) = 2.964, P = 0.253). 생태학적 맥락에 적용하면 NTT의 관찰 결과에 따르면 글리포세이트는 물고기의 탐색 행동을 크게 감소시켜 야생에서 생존할 수 있는 능력을 위태롭게 할 수 있습니다.
그림 6: 2주 동안 0.3μg/L 및 3μg/L 글리포세이트에 노출된 성체 제브라피쉬의 표준 6분 신규 수조 테스트(NTT)에서 평가된 불안 유사 행동. 행동 매개 변수를 분석하고 실험 탱크를 두 개의 동일한 가상 영역, 상단과 하단으로 나누는 만화. 중앙값 (n = 23-29), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001의 산점도로 보고된 데이터; Dunnett의 다중 비교 검정(총 거리, 정상 거리, 정상 시간, 정상으로의 전환, 불규칙한 시합, 높은 이동성 빈도) 또는 Bonferroni 보정을 사용한 Kruskal Wallis 검정(정상까지의 대기 시간, 불규칙한 지속 시간)을 사용한 일원 분산 분석. 빙결 기간과 빙결 시합에서 차이(P > 0.05)가 발견되지 않았습니다. 2-4개의 독립적인 실험 데이터. 이 그림은 Faria et al.20의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
포식자로부터 스스로를 보호하기 위해 사회적 압력에 의해 함께 묶인 양극화되지 않은 동족 집단인 학교 교육은 Danio rerio의 자연스러운 경향입니다. 학교는 동물의 불안이나 공포 수준에 따라 "강화"하거나 "확장"할 수 있으며, 이는 실험적으로 식별하기 매우 쉬운 특정 시각적 효과입니다(그림 7). 글리포세이트 실험에서 숄링 테스트는 3μg/L에 노출된 어류의 불안이 증가했음을 보여주었으며, 이는 숄의 그룹화에 의해 반영되어 개체 간의 평균 거리와 가장 먼 거리가 크게 감소했습니다(F2,56 = 5.664, P = 0.006 및 F2,56 = 7.413, P = 0.001, 평균 및 가장 먼 피쉬 간 거리, 각각)을 대조군과 비교합니다.
그림 7: 2주 동안 0.3μg/L 및 3μg/L 글리포세이트에 노출된 수인성 제브라피시 성체의 사회적 행동. 중앙값(n = 19-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001의 산점도로 보고된 데이터; Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석(평균 물고기 간 거리 및 가장 먼 거리) 2개에서 4개의 독립적인 실험의 데이터. 이 그림은 Faria et al.20의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 자동 분석을 사용한 동결 거동의 근사치. 이 표에 보고된 데이터는 두 가지 다른 방법으로 분석된 동일한 기록(비디오 1)에서 가져온 것입니다. (A) EthoVision V13 소프트웨어를 사용한 자동 계산에 의한 동결 거동 근사치. 가변 이동도는 두 샘플 사이의 피사체 영역 변화에서 계산되므로 이 영역의 획득 빈도에 따라 달라집니다. 매우 낮은 부동성 임계값(이동성 3% 미만)과 샘플링 속도를 최소 연속 시간 5초(150프레임 이상)로 설정했습니다. (B) Behavioral Observation Research Interactive Software(BORIS, 무료 및 오픈 소스 소프트웨어)를 사용한 동결 행동 분석. BORIS는 비디오 코딩 및 실시간 관찰을 위한 이벤트 로깅 소프트웨어입니다. BORIS를 사용하면 관찰자는 동결 에피소드를 상태 이벤트로 코딩하여 시작점과 끝점을 정의할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 새로운 수조 테스트에서 물고기를 통제하십시오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NTT에서 관찰된 특징적인 불안 행동은 뇌에서 분석된 세로토닌 수치와 양의 상관관계가 있다21. 예를 들어, 5-HT 생합성 억제제인 파라-클로로페닐알라닌(PCPA)에 노출된 후, 물고기는 양성 지오택시와 뇌 5-HT 수치 감소를 나타냈으며, 이는 METH로 얻은 결과와 매우 유사했다22. 따라서 뇌 세로토닌 수치의 감소와 METH에 노출된 제브라피시에서 양성 지오택시가 나타나는 것은 약물에 의해 생성된 불안 행동이 세로토닌 경로에 의해 매개됨을 시사합니다. 흥미롭게도, 유사한 행동 표현형, 즉 지오택시에 대한 불안 유발 효과는 환경적으로 관련된 두 가지 글리포세이트 농도인 0.3 3 μg/L 및 3 μg/L에 2주 동안 노출된 성인 제브라피시에서 볼 수 있습니다. 지오택시의 증가는 이전에 신경독성 물질인 아크릴아마이드 6,23을 사용한 성인 제브라피쉬에 대해서도 보고되었습니다. 이 모든 경우에서, 이 행동 표현형(NTT의 지오택시 증가, 불안 유발 물질의 특성)은 모노아민성 신경전달물질 수준의 감소와 관련이 있었다. 따라서 뇌의 신경화학적 분석과 결합된 NTT 패러다임은 생태학적으로 관련된 정보, 탐색 행동 및 먹이 찾기 효율성을 제공하고 행동 신경 표현형을 신경 전달 물질 조절과 연결합니다.
다른 한편으로는, ST와 SPT라는 두 가지 분석법에서 사회적 행동의 손상이 METH를 처리한 물고기에서도 관찰되었습니다. 본 연구에서 얻은 결과는 쥐와 원숭이를 대상으로 한 여러 연구와 일치하며, 연구 동물이 METH에 급성 및 만성 노출되면 사회적 위축을 초래한다24. METH 남용과 관련된 사회적 행동 변화는 인간의 사회인지 기능 장애로 설명된다24. 떼 크기에 대한 불안 유발 효과는 3μg/L 글리포세이트에 2주 동안 노출된 제브라피시에서 발견되었습니다. 우리는 3일 동안 53mg/L(0.75mM) 아크릴아마이드에 노출된 제브라피시에서 이 효과의 표현법을 관찰했습니다 6,23.
NTT, ST 및 SPT 분석은 성인 제브라피쉬의 급성 메스암페타민 및 아만성 글리포세이트 독성 모델에 대한 연구에서 설명되는 바와 같이 광범위한 화학 물질의 잠재적인 신경독성 효과(25 )를 효과적으로 결정할 수 있습니다. 행동은 독성학에서 신경 독성 및 환경 연구를 위한 화학 물질의 유기체 수준에서의 효과를 특성화하는 관련 정점 종점입니다. 실험실 조건에서 치명적이지 않은 종점이 될 뿐만 아니라 탐색적 또는 사회적 행동과 같은 행동의 변화는 본질적으로 해로울 수 있습니다. 더욱이, 제안된 행동 분석 배터리는 구현하기 쉬운 반자동 방법(11 )이므로 분석이 의식적으로 계획되는 경우(환원 원리)26 매우 효율적입니다. 단일 탱크를 사용하여 이러한 분석을 테스트 배터리로 수행하면 동물 수와 실험 시간 및 폐기물 발생을 줄일 수 있습니다.
배터리의 분석 순서는 각 시험에서 개인의 반응 프로파일을 연구하려는 경우 중요한 고려 사항입니다. 이를 위해 개별 분석( 그림 2 참조)을 수행하면 동물을 식별하고 탐색 행동을 사회적 선호도와 연관시킬 수 있습니다. 또한 동물의 행동 반응은 표본 채취의 종료 지점까지 물고기를 식별하면 신경 전달 물질 프로필 또는 유전자 발현과 같은 다른 생물학적 데이터와 관련될 수 있습니다(그림 2A).
일반적으로 행동 분석을 통해 그룹 간의 차이를 관찰할 수 있습니다. 먼저, 개별 반응은 그룹별로 데이터를 통합하기 전에 동물 추적(27)에 기초하여 계산된다. 그런 다음 계산된 각 행동 매개변수에 대해 대조군에 대한 평균과 분산 차이를 비교합니다. 떼 분석(12)에서는 분산 단위가 개별 물고기가 아니라 테스트 물고기 그룹이라는 것을 매우 명확하게 하는 것이 중요한데, 그 이유는 각 개별 물고기의 행동이 떼에 있는 다른 물고기의 영향을 받기 때문이다. 이것은 대부분의 논문에서 행동 데이터를 처리하는 데 사용되는 방법이다28. 그러나 행동 매개변수 분석을 매개변수별 분석이 아니라 시행별 전체 반응으로 재고하는 것이 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 임상시험에서 수행된 각 측정의 공분산을 계산하고 동일한 것을 측정하는 다른 방법(불안, 탐색 또는 사교적 행동)으로 보고할 수 있습니다. 행동 데이터를 계산하고 해석하는 방법에는 여러 가지가 있습니다 28,29. 조건의 수, 테스트 유형 및 이미지 획득(2D 또는 3D)30,31에 따라 데이터를 최대한 활용하기 위해 분석을 완전히 재고할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 스페인 과학혁신부(프로젝트 PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence(CEX2018-000794-S)의 "Agencia Estatal de Investigación"의 지원을 받았습니다. Juliette Bedrossiantz는 스페인 정부와 유럽 사회 기금(ESF)이 공동 자금을 지원하는 박사 학위 보조금(PRE2018-083513)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
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