Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تقييم السمية العصبية لدى البالغين دانيو ريريو باستخدام مجموعة من الاختبارات السلوكية في خزان واحد

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

هنا ، نقدم بطارية اختبار سلوكي شاملة ، بما في ذلك اختبارات الخزان الجديدة ، والمياه الضحلة ، والتفضيلات الاجتماعية ، لتحديد التأثيرات السمية العصبية المحتملة للمواد الكيميائية (مثل الميثامفيتامين والغليفوسات) على أسماك الزرد البالغة باستخدام خزان واحد. هذه الطريقة ذات صلة بالسمية العصبية والبحوث البيئية.

Abstract

أثبت وجود تأثيرات مرضية عصبية أنه ، لسنوات عديدة ، نقطة النهاية الرئيسية لتقييم السمية العصبية لمادة كيميائية. ومع ذلك ، في السنوات ال 50 الماضية ، تم التحقيق بنشاط في آثار المواد الكيميائية على سلوك الأنواع النموذجية. تدريجيا ، تم دمج نقاط النهاية السلوكية في بروتوكولات فحص السمية العصبية ، وتستخدم هذه النتائج الوظيفية الآن بشكل روتيني لتحديد وتحديد السمية العصبية المحتملة للمواد الكيميائية. توفر المقايسات السلوكية في الزرد البالغ وسيلة موحدة وموثوقة لدراسة مجموعة واسعة من السلوكيات ، بما في ذلك القلق والتفاعل الاجتماعي والتعلم والذاكرة والإدمان. عادة ما تتضمن المقايسات السلوكية في أسماك الزرد البالغة وضع الأسماك في ساحة تجريبية وتسجيل وتحليل سلوكها باستخدام برنامج تتبع الفيديو. يمكن أن تتعرض الأسماك لمحفزات مختلفة ، ويمكن قياس سلوكها باستخدام مجموعة متنوعة من المقاييس. يعد اختبار الخزان الجديد أحد أكثر الاختبارات قبولا واستخداما على نطاق واسع لدراسة السلوك الشبيه بالقلق في الأسماك. اختبارات المياه الضحلة والتفضيل الاجتماعي مفيدة في دراسة السلوك الاجتماعي لسمك الزرد. هذا الفحص مثير للاهتمام بشكل خاص حيث يتم دراسة سلوك المياه الضحلة بأكملها. أثبتت هذه المقايسات أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وحساسة للتلاعبات الدوائية والجينية ، مما يجعلها أدوات قيمة لدراسة الدوائر العصبية والآليات الجزيئية الكامنة وراء السلوك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه المقايسات في فحص الأدوية لتحديد المركبات التي قد تكون معدلات محتملة للسلوك.

سنوضح في هذا العمل كيفية تطبيق الأدوات السلوكية في علم السموم العصبية للأسماك ، وتحليل تأثير الميثامفيتامين ، وهو دواء ترفيهي ، والغليفوسات ، وهو ملوث بيئي. تظهر النتائج المساهمة الكبيرة للمقايسات السلوكية في الزرد البالغ في فهم التأثيرات السمية العصبية للملوثات البيئية والأدوية ، بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية التي قد تغير وظيفة الخلايا العصبية.

Introduction

الزرد (Danio rerio) هو نوع نموذجي شائع من الفقاريات لعلم السموم البيئية واكتشاف الأدوية ودراسات علم الأدوية للسلامة. إن تكلفتها المنخفضة ، والأدوات الوراثية الجزيئية الراسخة ، والحفاظ على العمليات الفسيولوجية الرئيسية المشاركة في تكوين الجهاز العصبي والحفاظ عليه تجعل من الزرد نموذجا حيوانيا مثاليا لأبحاث علم الأعصاب ، بما في ذلك علم السموم السلوكي العصبي1،2. كانت نقطة النهاية الرئيسية لتقييم السمية العصبية للمادة الكيميائية ، حتى وقت قريب ، وجود تأثيرات عصبية. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، تم دمج نقاط النهاية السلوكية في بروتوكولات فحص السمية العصبية ، وتستخدم هذه النتائج الوظيفية الآن بشكل شائع لتحديد وتحديد السمية العصبية المحتملة للمواد الكيميائية 3,4. علاوة على ذلك ، فإن نقاط النهاية السلوكية ذات صلة كبيرة من وجهة نظر بيئية ، حيث أن التغيير السلوكي المعتدل جدا في الأسماك يمكن أن يعرض بقاء للخطر في الظروف الطبيعية5.

أحد أكثر المقايسات السلوكية استخداما في أبحاث الزرد للبالغين هو اختبار الخزان الجديد (NTT) ، والذي يقيس السلوك الشبيه بالقلق 6,7. في هذا الفحص ، تتعرض الأسماك للحداثة (توضع الأسماك في حوض غير مألوف) ، ويلاحظ حافز مكروه خفيف واستجاباتها السلوكية. يستخدم NTT لتقييم النشاط الحركي القاعدي ، والانجذاب الأرضي ، والتجميد ، والحركات غير المنتظمة للأسماك ، بشكل أساسي. يتميز غير المنتظم8 بتغيرات مفاجئة في الاتجاه (متعرج) وحلقات متكررة من التسارع (الاندفاع). إنه رد فعل إنذار وعادة ما يتم ملاحظته قبل أو بعد نوبات التجميد. يتوافق سلوك التجميد مع التوقف التام لحركات الأسماك (باستثناء الحركات الدائرية والعينية) أثناء وجودها في قاع الحوض ، كما يتميز عن الجمود الناجم عن التخدير ، والذي يسبب نقص الحركة ، والحركة ، والغرق8. عادة ما يرتبط التجميد بحالة عالية من التوتر والقلق وهو أيضا جزء من السلوك الخاضع. السلوكيات المعقدة هي مؤشرات ممتازة لحالة قلق. لقد ثبت أن NTT حساسة للتلاعب الدوائيوالجيني 9 ، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة الأساس العصبي للقلق والاضطرابات ذات الصلة.

الزرد من الأنواع الاجتماعية للغاية ، لذلك يمكننا قياس مجموعة واسعة من السلوكيات الاجتماعية. اختبار المياه الضحلة (ST) واختبار التفضيل الاجتماعي (SPT) هما المقايسات الأكثر استخداما لتقييم السلوك الاجتماعي10. يقيس ST ميل الأسماك إلى التجمعمعا 11 من خلال تحديد سلوكها المكاني وأنماط حركتها. ST مفيد لدراسة ديناميكيات المجموعة والقيادة والتعلم الاجتماعي وفهم السلوك الاجتماعي للعديد من أنواع الأسماك12. تم تكييف SPT في الزرد البالغ من تفضيل كراولي لاختبار الجدة الاجتماعية للفئران13 وسرعان ما أصبح مقايسة سلوكية شائعة لدراسة التفاعل الاجتماعي في هذا النوعالنموذجي 14. تم تكييف هذين الاختبارين أيضا للاستخدام في فحوصات فحص المخدرات وأظهرا نتائج واعدة لتحديد المركبات الجديدة التي تعدل السلوك الاجتماعي15,16.

بشكل عام ، تعد المقايسات السلوكية في الزرد البالغ أدوات قوية يمكن أن توفر معلومات قيمة عن آليات السلوك أو الأنماط العصبية للمركبات النشطة والعقاقير التي يساء استخدامها17. يوضح هذا البروتوكول كيفية تنفيذ هذه الأدوات السلوكية7 بموارد المواد الأساسية وكيفية تطبيقها في مقايسات السمية لتوصيف تأثيرات مجموعة واسعة من المركبات العصبية النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، سنرى أنه يمكن تطبيق نفس الاختبارات لتقييم الآثار السلوكية العصبية للتعرض الحاد لمركب عصبي نشط (الميثامفيتامين) ولكن أيضا لتوصيف هذه التأثيرات بعد التعرض المزمن للتركيزات البيئية لمبيد الآفات (الغليفوسات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يضمن الامتثال الصارم للمعايير الأخلاقية الرفاهية والمعاملة المناسبة لسمك الزرد المستخدم في التجارب. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بموجب المبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام (CID-CSIC). تم تنفيذ البروتوكولات والنتائج المعروضة أدناه بموجب الترخيص الممنوح من الحكومة المحلية (الاتفاقية رقم 11336).

1. سكن للاختبار السلوكي

  1. قم بإجراء جميع الاختبارات (المعروضة في الشكل 1) في غرفة سلوكية معزولة عند 27-28 درجة مئوية بين الساعة 10:00 و 17:00.
  2. اغسل كل من أسماك التحكم والأسماك المكشوفة عدة مرات في ماء السمك النظيف [مياه نقية بالتناضح العكسي تحتوي على 90 مجم / لتر من ملح أنظمة أحواض السمك ، 0.58 مللي متر CaSO4 · 2H2O ، و 0.59 mM NaHCO3] قبل بدء التجارب لتجنب أي تلوث محتمل للخزان التجريبي.
  3. تأقلم مع غرفة السلوك 1 ساعة قبل بدء التجارب.
  4. تأكد من أن (≈50:50 ذكر: نسبة الإناث) ساذجة تجريبيا وإجراء جميع الاختبارات السلوكية بطريقة عمياء مع مراقبين غير مدركين للمجموعة التجريبية.
  5. للحصول على نتائج ذات مغزى في المقايسات السلوكية ، احصل على إجمالي عدد 18 شخصا لكل حالة (ن = 18) ، تم الحصول عليها بشكل مثالي بين تجربتين مستقلتين أو أكثر. على سبيل المثال ، في الاختبارات الفردية ، قم بتحليل سلوك 9 لكل حالة ، لكل تكرار. في الاختبارات الجماعية ، قم بتحليل سلوك المياه الضحلة من 6 إلى 9 لكل حالة ، لكل تكرار.
  6. قم بإجراء جميع الاختبارات باتباع نهج اختبار البطارية (انظر مقترحات التخطيط في الشكل 2). أكثر ملاءمة من الناحية الأخلاقية ، تسمح هذه الطريقة بتقليل عدد اللازمة للدراسة ، والامتثال لمبدأ التخفيض 3R7.
  7. في معظم الأحيان ، ترتبط المقايسات السلوكية بالمقايسات البيولوجية ، لذا ضح بالحيوانات باتباع إرشادات القتل الرحيم18 قبل جمع العينات وتحليلها (OMICs أو المواد الكيميائية). إذا لم تثبت نقطة النهاية أنها أخذ عينات ، فأعد تثبيت المجموعة الضابطة في نهاية التجربة. إعادة استخدام الضابطة لأغراض التكاثر أو التجربة بعد بضعة أيام.

Figure 1
الشكل 1: الإعدادات التجريبية. ثلاثة تكوينات للخزان المربع لدراسة مجموعة واسعة من السلوكيات في الزرد البالغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الجدول الزمني التجريبي. اقتراحان تخطيطيان لتسجيل المقايسات السلوكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التكوينات التجريبية للخزان

  1. السلوك الشبيه بالقلق: اختبار الخزان الجديد (NTT)
    1. اضبط الإعداد التجريبي (عدد الخزانات والكاميرات وأجهزة الكمبيوتر) لتسجيل الحد الأقصى لعدد الأسماك في وقت واحد. تستغرق فحوصات السلوك الفردي وقتا طويلا ، لذا قم بتحسين الوقت والمواد والمساحة.
    2. تحضير الخزانات التجريبية ل NTT: خزان مربع (طول 20 سم ، عرض 20 سم ، ارتفاع 25 سم) مغطى بألواح أكريليك على الجدران الجانبية والأسفل لتجنب الانعكاس والتداخل بين الموضوعات.
    3. املأ الخزانات التجريبية ب 7 لتر (ارتفاع عمود الماء: ارتفاع 20 سم) من ماء السمك المؤكسج جيدا عند 28 درجة مئوية.
    4. اضبط موضع الخزان أمام الكاميرا لتجنب الصورة المشوهة.
    5. تحقق من إعداد الإضاءة. توفر الإضاءة الخلفية LED (10000 لوكس) إضاءة متجانسة على كل جزء من الخزان لتسجيل الفيديو في ظروف جيدة.
    6. قم بتشغيل الكاميرات وضبطها باتباع القسم 3.
    7. أدخل الموضوعات ، واحدة تلو الأخرى ، في قاع الخزانات التجريبية قبل البدء في التسجيل في أسرع وقت ممكن.
      ملاحظة: من المهم البدء في التسجيل مع في قاع الخزان.
    8. احرص على عدم إزعاج أثناء التسجيل. استخدام ستارة أو لوحة للحد من التفاعل البصري ليس فقط بين الدبابات ولكن أيضا بين الدعم والخارج.
    9. في نهاية التسجيل (وقت التسجيل القياسي هو 6 دقائق) ، انقل التي اجتازت الاختبار بالفعل إلى خزان آخر حتى لا تختلط بها مع الساذجة.
    10. كرر الإجراء مع جميع الموضوعات المتاحة. من المستحسن أن يكون لديك إجمالي عدد 18 شخصا لكل حالة للحصول على نتائج ذات مغزى في التجارب الفردية (من نسختين متماثلتين مستقلتين أو أكثر).
    11. قم بالتوزيع العشوائي للمجموعة التجريبية المخصصة لكل خزان بين التجارب لتجنب أي تأثيرات محتملة للخزان (إذا كنت تسجل عدة حالات في نفس الوقت).
  2. السلوك المجتمعي الاجتماعي: اختبار المياه الضحلة (ST)
    1. التكوين التجريبي ل ST هو نفس التكوين التجريبي ل NTT (يمكن إعادة استخدام نفس الخزانات مباشرة).
    2. اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.6. لإعداد ST.
    3. أدخل المياه الضحلة (من 6 إلى 9 أشخاص في نفس الوقت) في قاع الخزانات التجريبية قبل البدء في التسجيل في أسرع وقت ممكن.
      ملاحظة: من المهم البدء في التسجيل مع في قاع الخزان.
    4. اتبع الخطوات 2.1.8-2.1.11. لأداء ST.
    5. كرر الإجراء مع جميع الموضوعات المتاحة. للحصول على نتائج ذات مغزى في هذا الفحص ، قم بعمل نسختين متماثلتين مستقلتين على الأقل بنفس حجم البنك في كل نسخة متماثلة.
    6. حافظ على حجم المياه الضحلة متسقا لجميع المجموعات التجريبية وتكرارها داخل نفس التجربة.
  3. السلوك الفردي الاجتماعي: اختبار التفضيل الاجتماعي (SPT)
    1. اضبط الإعداد التجريبي لتحسين المساحة التجريبية ووقت التسجيل.
    2. قم بإعداد الخزانات التجريبية ل SPT: خزان مربع (طول 20 سم ، عرض 20 سم ، ارتفاع 25 سم) شفاف (زجاج أو بلاستيك) لتوفير رؤية جانبية. تتمتع الأسماك البؤرية المفردة بحرية التفاعل مع منطقة افتراضية محددة - المياه الضحلة للأسماك الموضوعة في خزان السكن الخارجي من جانب واحد ، أو مع المنطقة الافتراضية غير المحددة - خزان إسكان خارجي فارغ من جانب واحد.
    3. املأ الخزانات التجريبية ب 5 لتر (ارتفاع عمود الماء: 15 سم ، نفس ارتفاع عمود الماء في خزانات السكن الخارجية) من مياه الأسماك النظيفة عند 28 درجة مئوية.
    4. اضبط موضع الخزان أمام الكاميرا لتجنب الصورة المشوهة.
    5. تأكد من أن النظام يتلقى إضاءة متجانسة.
    6. أدخل الموضوعات ، واحدة تلو الأخرى ، في قاع الخزانات التجريبية قبل البدء فورا في التسجيل مع في المنتصف.
    7. تجنب التفاعلات البصرية بين المراقبين أثناء التسجيل.
    8. في نهاية التسجيل لمدة 6 دقائق ، انقل الحالية إلى خزان آخر حتى لا تختلط مع الساذجة.
    9. كرر الإجراء مع جميع الموضوعات المتاحة. احصل على إجمالي عدد 18 شخصا لكل حالة للحصول على نتائج ذات مغزى في التجارب الفردية (من نسختين متماثلتين مستقلتين أو أكثر).

3. تسجيل الفيديو للاختبارات السلوكية

  1. افتح مدير الكاميرا للتحقق من توفر كاميرا GigE على كل كمبيوتر.
  2. قم بتشغيل برنامج التحكم في كاميرا GigE (مثل قمرة القيادة uEye ، الموضحة هنا). افتح خيار الكاميرا ، وحدد الوضع أحادي اللون ، واضبط حجم الصورة (1: 2).
  3. افتح خصائص الكاميرا
    1. ضمن الكاميرا، اضبط ساعة البكسل على الحد الأقصى، واضبط معدل الإطارات على 30 إطارا في الثانية (fps)، واضبط التعريض الضوئي (ضبط تلقائي أو يدوي إذا كانت الصورة مظلمة جدا).
    2. ضمن الصورة، اضبط الكسب على 0 (تلقائي) ومستويات اللون الأسود (ضبط تلقائي أو يدوي للحصول على تباين جيد).
    3. ضمن الحجم، اضبط حجم النافذة على المنطقة التي تريد نقشها (العرض: العرض-اليسار، الارتفاع: الارتفاع-الأعلى). تسمح هذه الخطوة بتقليل حجم الصورة ، وبالتالي الحجم النهائي للفيديو.
    4. أغلق خصائص الكاميرا.
  4. أنشئ مجلدا عاما لجلسة التجربة لحفظ إعدادات الكاميرا ومقاطع الفيديو.
  5. لحفظ إعدادات الكاميرا، اضبط ملف > حفظ المعلمات > إلى ملف وحدد مجلد التجربة الذي تم إنشاؤه مؤخرا.
    ملاحظة: يمكن بالتالي إعادة تحميل ملف إعدادات الكاميرا في التطبيق لمواصلة العمل بنفس معلمات الصورة في أي وقت (على سبيل المثال عند إيقاف تشغيل الكاميرا فجأة أو لإعادة استخدام نفس الإعدادات ، مما يقلل من وقت الإعداد ويجانس الظروف التجريبية). إذا تجمدت الكاميرا في لحظة واحدة بين مقاطع الفيديو ، فقم بإيقاف التسجيل والخروج وإيقاف تشغيل الكاميرا. أعد تشغيله ، وأعد تحميل معلمات الكاميرا بالانتقال إلى ملف > تحميل المعلمات > إلى ملف ، وأعد تشغيل التسجيل. تحقق مما إذا كان الفيديو الحالي قد تم الحصول عليه بالكامل للتخلص من الأسماك أو تكرارها (قبل التكرار ، امنح بعض الوقت لإعادة التأقلم).
  6. كرر إجراء إعداد الكاميرا هذا (الخطوات 3.1-3.5) على جميع الكاميرات.
  7. عندما يتم تكوين جميع الكاميرات بشكل صحيح ، افتح تسجيل تسلسل الفيديو.
  8. حدد إنشاء للحفظ كملف فيديو جديد، وحدد مجلد التجربة الذي تم إنشاؤه مؤخرا، وأبلغ باسم ملف الفيديو بمعلومات الموضوع ونوع التجربة والتاريخ.
  9. حدد الحد الأقصى للإطارات. اكتب 10800 في صندوق الإطار. يتم تسجيل الفيديو القياسي 6 دقائق (فيديو 1) بمعدل 30 إطارا في الثانية بتنسيق AVI ؛ لذلك ، 6 دقائق × 60 ثانية × 30 إطارا في الثانية = 10800 إطار في المجموع.
  10. حدد Calc. معدل الإطارات أو أشر إلى معدل الإطارات يدويا (سرعة التسجيل: 30 إطارا في الثانية).
  11. كرر إجراء إنشاء ملف الفيديو على جميع أجهزة الكمبيوتر.
  12. قدم الموضوعات ، واحدة تلو الأخرى ، في الجزء السفلي من كل خزانات تجريبية. سيتم تشغيل جميع المقايسات مرة واحدة.
  13. ابدأ السجلات بسرعة بالنقر فوق تسجيل وانتظر للحصول على الحد الأقصى لعدد الإطارات المطلوبة (الخطوة 3.10).
  14. بمجرد تسجيل مقاطع الفيديو ، يظهر مربع دردشة مع الرسالة تم تحقيق الحد الأقصى لعدد الإطارات !. حدد قبول.
  15. حدد إغلاق لإنهاء التسجيل وإغلاق ملف الفيديو.
  16. إزالة الأسماك التي لوحظت للتو. احرص على فصلهم عن الأسماك الساذجة.
  17. حدد مباشرة إنشاء وكرر العملية لمتابعة تسجيل مقاطع الفيديو.
  18. بمجرد الانتهاء من جميع التسجيلات ، حدد إنهاء.
  19. لإيقاف تشغيل الكاميرات، حدد إغلاق الكاميرا والخروج من البرنامج.

4. تحليل مقاطع الفيديو المسجلة

  1. قم بتشغيل برنامج التحليل (انظر جدول المواد).
  2. لتوضيح قالب جديد ، انقر فوق جديد من القالب > تطبيق قالب محدد مسبقا > من ملف الفيديو، وحدد مقطع فيديو لبدء إعداد القالب. حاول اختيار فيديو تمثيلي للتجربة مع موضوع يظهر حركة جيدة وظروف تسجيل جيدة.
  3. في المعلمات ، قم بتكوين المعلمات في النوافذ التالية (من 1 إلى 4/7). حدد النموذج Fish > Adult Zebrafish ، الساحة ساحة المجال المفتوح > ساحة واحدة ، عدد الموضوع لكل ساحة (بالنسبة ل ST ، يلزم وجود حزمة تتبع متعددة [تتبع مواضيع مختلفة في ساحة واحدة]) ، ونوع الكشف عن طريق نقطة المركز وأخيرا ضبط معدل الإطارات إلى 30 إطارا في الثانية. في النوافذ التالية (من 5 إلى 7/7) ، لا تغير المعلمات ؛ التكوين الافتراضي على ما يرام.
  4. قم بتسمية التجربة كقالب وضعها في نفس المجلد مثل بقية الفيديو المخزن. سيتم إنشاء القالب كمجلد تجربة مع العديد من التقسيمات الفرعية التي تحتوي على جميع معلومات الإعداد.
  5. ضمن إعدادات التجربة ، تحقق من الإعداد المحدد (من ملف الفيديو ، الساحة ، عدد الموضوعات ، الإطار في الثانية). هنا ، يمكن تعديل وحدات النظام.
  6. ضمن إعدادات الساحة ، انقر بزر الماوس الأيمن على وسط الشاشة وحدد Grab. من ملف في الشاشة. اختر صورة فيديو ذات نوعية جيدة و قبول لالتقاط هذه الصورة لإعدادات الخلفية. أولا ، قم بمعايرة الصورة ، وإنشاء قاعدة معايرة. استخدم عرض الخزان كمقياس (19 سم). ثم ارسم الساحة. احرص على جعل المربع كافيا لتجنب انعكاسات عندما يقترب الأخير من السطح أو أي ارتباك في نهاية المطاف لبرنامج الأسماك مع المناطق السوداء للحوض. أخيرا ، ارسم مناطق الشكل باستخدام وظيفة الإطار .
    1. بالنسبة إلى NTT و ST ، قسم مقدمة الخزان إلى منطقتين افتراضيتين متساويتين ، أعلى وأسفل (انظر الشكل 1). ارسم مربعين أفقيين متساويين. تغطي الصناديق نصف ساحة لكل منها. قم بتسمية الجزء العلوي والسفلي للمناطق العلوية والسفلية ، على التوالي. احرص على أن يكون للمربعات نفس العرض (9-10 سم) والطول (8-9 سم) ، ولا تتجاوز حدود الساحة (المربع البرتقالي) ، ولا تتداخل ، والتحقق من أن كل منطقة سهم تشير إلى مناطقها بالضبط.
    2. بالنسبة للجنة الفرعية لمنع التعذيب ، قسم الساحة التجريبية من الناحية المفاهيمية إلى ثلاث مناطق متساوية الحجم: فارغة ، مركزية ، ومحددة (انظر الشكل 1). ارسم ثلاثة مربعات رأسية متساوية. قم بتسمية الصندوق الموجه إلى خزان المياه الضحلة على أنه محدد ، والصندوق الموجه إلى الخزان الفارغ على أنه فارغ ، والمربع الأوسط على أنه مركز. احرص على أن يكون للصناديق نفس العرض (6 سم) والطول (18-19 سم) ، ولا تتجاوز حدود الساحة ، ولا تتداخل.
  7. ضمن إعدادات الكشف، تحقق من الفيديو الذي سيتم التعامل معه في ملف الفيديو. ثم تحقق من جودة الكشف (السمك باللون الأصفر والأحمر نقطة المركز). انقر فوق الكشف التلقائي لضبط الاكتشاف ، وإعادة تركيز (اختر صورة يسبح فيها في الملف الشخصي على خلفية بيضاء ، وارسم الصورة عن طريق أخذ جسمه بالكامل ، وتحقق من صحة الاكتشاف بنعم). افتح خيارات متقدمة لتحسين الاكتشاف عن طريق تحديد الطرح الديناميكي ، والموضوع الداكن ، وإعدادات الخلفية ، والتعلم في الخلفية ، وحجم الموضوع ، وتقليل الضوضاء ، وما إلى ذلك.
  8. ضمن إعدادات الإصدارات التجريبية ، ضع إصدارا تجريبيا واحدا واحذف الإصدارات الأخرى (انقر بزر الماوس الأيمن واحذف)
  9. ضمن إعدادات البيانات، قم بإنشاء نوافذ حوار النتائج . تحديد معلمات النتائج لكل وقت ولكل منطقة. على سبيل المثال، قم بإنشاء نافذة نتائج لإخراج البيانات بالدقائق وأخرى لإخراج البيانات حسب الوقت الإجمالي (6 دقائق). اطلب إخراج البيانات لكل منطقة (اطلبها إذا كانت المسافة في كل منطقة مطلوبة). اربط نوافذ النتائج المختلفة بنافذة البدء باستخدام الأسهم.
  10. ضمن تحليل الإعدادات، حدد المعلمات المراد تحليلها ونوع الإحصائيات لكل معلمة. سيتم حساب هذه المعلمات تلقائيا بناء على البيانات التي تم الحصول عليها من التتبع.
    1. بالنسبة إلى NTT وSPT، حدد الخيارات كما هو محدد أدناه:
      1. حدد المسافة المنقولة (حدد الإجمالي) للحصول على المسافة المقطوعة في الساحة (سم) والمسافة المقطوعة في المناطق المعنية (سم).
      2. حدد في المناطق (حدد المناطق والتكرار والتراكمي وزمن الانتقال إلى الأول) للحصول على الوقت المستغرق في المنطقة (المناطق) وزمن الانتقال إلى المدخل الأول في المنطقة (المناطق).
      3. حدد انتقال المنطقة (حدد العتبة: 0 سم ، أضف المنطقة 1 > المنطقة 2 ؛ المنطقة 2 > المنطقة 1 ، في أي مناطق ، التردد) للحصول على عدد المداخل في المناطق.
      4. حدد Mobility Sate (املأ الهاتف المحمول العالي فوق 70٪ ، وغير المتحرك أقل من 3٪ ، والحد الأدنى 150 إطارا ، وحدد التردد والتراكمي والكمون إلى الأول) للحصول على مدة فرط الحركة (التنقل) ، ومدة التجميد (التجميد).
        ملاحظة: راجع قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل حول تقريب سلوك التجميد باستخدام التحليل الآلي وعدد ومدة (مدة) نوبات التجميد.
      5. حدد التسارع وزاوية الدوران (حدد التردد والتراكمي) لتقييم حدوث السلوكيات المعقدة مثل الاندفاع وعدم الانتظام (حركات التسارع السريعة).
    2. بالنسبة إلى ST ، بالإضافة إلى المعلمات الاستكشافية المذكورة أعلاه ، حدد الخيار المسافة بين الموضوعات (حدد جميع الموضوعات ، المتوسط ، الحد الأقصى ، الحد الأدنى) للحصول على متوسط المسافة بين الأسماك (سم) ، ومتوسط المسافة بين أقرب جار (سم) ، ومتوسط المسافة بين الجار الأبعد.
  11. القالب جاهز لاستخدامه. احفظ التعديلات الأخيرة وأغلق القالب دون الحصول على أي بيانات من الفيديو (احتفظ بملف القالب ؛ فهو خفيف وسهل الإدارة والنسخ). إذا كان هناك العديد من تراخيص البرامج ، فقم بتحليل مقاطع الفيديو من نفس القالب المنسوخ إلى كل جهاز كمبيوتر.
  12. لنسخ القالب واستخدامه ، هناك خياران:
    1. افتح ملف القالب باستخدام برنامج تحليل السلوك ، وانتقل إلى ملف > حفظ باسم لإنشاء ملف مطابق جديد.
    2. في واجهة الترحيب، حدد جديد من قالب > تطبيق قالب مخصص > من ملف الفيديو (اختر قالب. ملف EthXV). قم بتسمية التجربة الجديدة واختر موقعها. قد يستغرق البرنامج بضع دقائق لنسخ المعلومات من ملف القالب.
  13. انتقل إلى إعدادات الساحة لإعادة ضبط القالب إذا تم تسجيل الفيديو بكاميرا مختلفة (اتبع الخطوتين 4.6 و4.7).
  14. انتقل إلى إعدادات الاكتشاف أو الاستحواذ للتحقق من الفيديو المحدد وتغيير ملف الفيديو إذا لزم الأمر.
  15. ضمن اكتساب، حدد DDS > جاهز للبدء. قد يستغرق البرنامج بضع دقائق لمعالجة الفيديو.
  16. عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، انتقل إلى محرر المسار. حدد التسارع x16 لقراءة الفيديو المعالج بشكل أسرع وتحقق مما إذا كان التتبع صحيحا.
    ملاحظة: في بعض الأحيان ، قد تكون هناك "خسائر" في التتبع (بسبب انعكاسات أو ارتباك البرنامج نفسه). يمكن تحريرها يدويا من هذا الجزء إذا كانت قليلة ؛ خلاف ذلك ، من الأفضل إعادة معالجة التجربة بأكملها ، وتحسين تعريف اللوحة القماشية والكشف.
  17. ضمن الإحصائيات ، انقر فوق حساب > تصدير البيانات. يقع تصدير البيانات مباشرة في مجلد التجربة.
  18. ضمن تتبع التصور أو خرائط الحرارة ، قم بإنشاء وتصدير (النقر بزر الماوس الأيمن ، تصدير الصورة ، حدد المجلد تصدير ملفات التجربة لحفظ هذه البيانات مع تقرير جدول البيانات) تتبع صور.
  19. انتقل إلى ملف لإغلاق التجربة النشطة وكرر هذا الإجراء للفيديو التالي.

5. التحليل الإحصائي

  1. تحليل الحالة الطبيعية (اختبار Shapiro-Wilk) للبيانات في كل مجموعة.
  2. تقييم التماثل مع اختبار ليفين.
  3. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبارات المقارنة المتعددة ل Dunnett و Tukey لاختبار الاختلافات بين المجموعات عندما لا يمكن رفض معايير الحالة الطبيعية والتجانس.
  4. استخدم اختبار Kruskal-Wallis متبوعا بمقارنة زوجية باستخدام تصحيح Bonferroni لاختبار الاختلافات بين المجموعات عندما يتم رفض معايير الحالة الطبيعية والتجانس.
  5. ارسم البيانات باستخدام برنامج رسومي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم ، سنلقي نظرة على بعض التطبيقات الممكنة لهذه الأدوات السلوكية في علم السموم العصبية للأسماك. تتوافق النتائج التالية مع توصيف التأثيرات الحادة أو الشراهة للميثامفيتامين (METH) ، وهو دواء ترفيهي ، والآثار شبه المزمنة للغليفوسات ، أحد مبيدات الأعشاب الرئيسية الموجودة في النظم الإيكولوجية المائية.

توصيف نموذج السمية العصبية بنهم الميثامفيتامين في الزرد البالغ
عند تقييم تأثير 40 ملغم / لتر من الميث على NTT (الشكل 3) ، أكد اختبار Kruskal-Wallis أن المكشوفة قدمت انجذابا جيولوجيا إيجابيا ، يتميز بانخفاض في وقت الاستكشاف في المنطقة العليا من الخزان التجريبي (H (2) = 35.964 ، P = 1.55 × 10-8) ، وكذلك في المسافة المقطوعة في هذا الجزء (H (2) = 32.272 ، P = 9.82 × 10-8) ، وفي عدد الزيارات (H (2) = 36.527 ، P = 1.17 × 10-8). لاحظنا أيضا زيادة كبيرة في وقت الكمون الذي يسبق الزيارة الأولى إلى المنطقة العليا (H (2) = 17.264 ، P = 0.00018). من المهم ملاحظة أن الاختلافات التي لوحظت في المعلمات المقاسة في NTT بعد التعرض للميثامفيتامين متسقة بمرور الوقت، كما أكد تصحيح Bonferroni (P > 0.8). تم العثور على تأثير كبير لوقت التعرض لسلوك التجميد (H (2) = 13.120 ، P = 0.0014).

Figure 3
الشكل 3: تم تقييم السلوك الشبيه بالقلق في اختبار الخزان الجديد القياسي لمدة 6 دقائق (NTT) لأسماك الزرد البالغة المعرضة ل 40 مجم / لتر من الميثامفيتامين (METH) لمدة 3 ساعات و 48 ساعة. تمت تسوية البيانات من كل تجربة إلى قيم التحكم المقابلة. يتم الإبلاغ عن البيانات المجمعة كمخطط مبعثر مع الوسيط (n = 14-15) ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ؛ اختبار كروسكال واليس مع تصحيح بونفيروني لنقاط نهاية NTT. بيانات من 2 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من بيدروسيانتز وآخرين.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن قياس حركات التجميد من خلال تقييم تكرار التجميد أو زمن وصوله أو مدته أو موقعه. أفضل طريقة لتسجيلها هي بلا شك عين مراقب متمرس ، وهو أمر شاق ومعقد للغاية ، لذلك جربنا بديلا آليا باستخدام برنامج EthoVision للكشف عن سلوك التجميد19. وجدنا أن عدد هجمات التجميد المحسوبة بواسطة البرنامج (الجدول 1 أ) وزمن وصولها ومدتها ترتبط بدقة جيدة بالحلقات التي سجلها المراقب يدويا (الجدول 1 ب). في حين أن الطريقتين متكافئتان من حيث النتائج (P = 0.958 ، اختبار الطالب) ، استخدمنا النهج الآلي لتقييم التجميد هنا. بعد 3 ساعات من التعرض للميثامفيتامين ، زاد وقت التجميد بشكل ملحوظ (P = 0.0012) ، في حين لم يتم العثور على فرق مع المجموعة الضابطة بعد 48 ساعة من التعرض (P = 0.16). لم ينتج عن الميثامفيتامين أي تأثير على الحركات غير المنتظمة في أي من الوقتين.

استخدمنا نموذجين تجريبيين لتقييم التأثيرات على السلوك الاجتماعي بعد التعرض الحاد للميثامفيتامين. وكشف ST (الشكل 4) أن متوسط المسافة وأبعد مسافة بين الأفراد كانت أكبر بكثير بالنسبة للأسماك المعالجة بالميث (H(2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H (2) = 52.504 ، P = 3.97 × 10-12 لمتوسط وأبعد مسافات بين الأسماك ، على التوالي) ، مما يشير إلى النمط الظاهري السلوكي للعزلة الاجتماعية. مرة أخرى ، نلاحظ أنه لم يتم العثور على أي تأثير زمني باستخدام اختبار Bonferroni اللاحق (P > 0.5).

Figure 4
الشكل 4: السلوك الاجتماعي لأسماك الزرد البالغة المنقولة بالماء والمعرضة ل 40 ملغم / لتر من الميثامفيتامين (METH) لمدة 3 ساعات و 48 ساعة. نتائج اختبار المياه الضحلة (ST) ، بما في ذلك متوسط وأبعد مسافات بين الأسماك. يتم الإبلاغ عن البيانات المجمعة كمخطط مبعثر مع الوسيط (n = 18) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ؛ اختبار كروسكال واليس مع تصحيح بونفيروني. بيانات من 2 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من بيدروسيانتز وآخرين.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في SPT (الشكل 5) ، تظهر الأسماك المعالجة انخفاضا كبيرا في الوقت المستغرق والمسافة المقطوعة في المنطقة المحددة (F (2,74) = 14.497 ، P = 4.87 × 10-6 ؛ F (2,73) = 13.461 ، P = 0.00001 للوقت المستغرق والمسافة المقطوعة في المنطقة المحددة ، على التوالي). تؤكد هذه النتائج من جديد النمط الظاهري للعزلة الاجتماعية الذي اقترحته نتائج TS. استبعد اختبار توكي للفرق الهام الصادق (HSD) عدم وجود اختلافات محتملة بين زمنيتي التحليل (P > 0.5).

Figure 5
الشكل 5: السلوك الاجتماعي لأسماك الزرد البالغة المنقولة بالماء والمعرضة ل 40 مجم / لتر ميثامفيتامين (METH) لمدة 3 ساعات و 48 ساعة. نتائج اختبار التفضيل الاجتماعي (SPT) ، بما في ذلك وقت ومسافة الأسماك في كل منطقة من المناطق الافتراضية الثلاث للحوض التجريبي: فارغ ، مركزي ، ومحدد. تمت تسوية البيانات من كل تجربة إلى قيم التحكم المقابلة. يتم الإبلاغ عن البيانات المجمعة كمخطط مبعثر مع الوسيط (n = 17-20) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة لدونيت. بيانات من 2 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من بيدروسيانتز وآخرين.15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التأثير السلوكي للتعرض شبه المزمن للمستويات البيئية للغليفوسات
يكشف التحليل السلوكي لآثار التعرض شبه المزمن ل 3 ميكروغرام / لتر من الغليفوسات على NTT (الشكل 6) عن انخفاض كبير في الوقت المستغرق في استكشاف الجزء العلوي (F2,77 = 8.744 ، P = 0.0004) ، والمسافة المقطوعة في هذا الجزء (F2,77 = 9.118 ، P = 0.0003) ، وعدد الزيارات (F2,77 = 3.441 ، P = 0.037). هذه التأثيرات هي سمة من سمات سلوك الانجذاب الجغرافي الإيجابي ، كما هو الحال مع التأثير المتزايد الذي لوحظ في وقت الكمون الذي يسبق الزيارة الأولى إلى أعلى الخزان (H (2) = 9.628 ، P = 0.008). كما تم تحليل التعبير عن السلوكيات غير المنتظمة والمتجمدة للحيوانات المكشوفة في NTT. زادت المدة (H (2) = 17.261 ، P = 0.025) وعدد الحلقات غير المنتظمة (F2,76 = 10.073 ، P = 0.0001) بشكل ملحوظ بواسطة الغليفوسات. في المقابل ، لم يتم العثور على فروق تجميد مع عنصر التحكم (Pearson Chi-Square (2) = 2.964 ، P = 0.253). بالتطبيق على سياق بيئي ، تشير الملاحظات التي تم إجراؤها في NTT إلى أن الغليفوسات يمكن أن يقلل بشكل كبير من السلوك الاستكشافي للأسماك ، مما يعرض قدرتها على البقاء في البرية للخطر.

Figure 6
الشكل 6: تم تقييم السلوك الشبيه بالقلق في اختبار الخزان الجديد القياسي لمدة 6 دقائق (NTT) لأسماك الزرد البالغة المعرضة ل 0.3 ميكروغرام / لتر و 3 ميكروغرام / لتر غليفوسات لمدة أسبوعين. تم تحليل المعلمات السلوكية ، بالإضافة إلى رسم كاريكاتوري للخزان التجريبي مقسم إلى منطقتين افتراضيتين متساويتين ، أعلى وأسفل. تم الإبلاغ عن البيانات كمخطط مبعثر مع الوسيط (ن = 23-29) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة لدونيت (المسافة الإجمالية ، المسافة في الأعلى ، الوقت في الأعلى ، التحولات إلى الأعلى ، نوبات غير منتظمة ، تردد حركة عالية) أو اختبار Kruskal Wallis مع تصحيح Bonferroni (الكمون إلى الأعلى ، المدة غير المنتظمة). لم يتم العثور على فروق (P > 0.05) في مدة التجميد ونوبات التجميد. بيانات من 2-4 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من فاريا وآخرين.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التعليم ، مجموعات غير مستقطبة من المحددات التي يتم تجميعها معا من خلال الضغط الاجتماعي لحماية أنفسهم من المفترسة ، هو ميل طبيعي لدانيو ريريو. يمكن للمدرسة "تشديد" أو "توسيع" اعتمادا على مستوى قلق أو خوفها ، وهو تأثير بصري معين يسهل تحديده تجريبيا (الشكل 7). في تجربة الغليفوسات ، كشف اختبار المياه الضحلة عن زيادة في القلق لدى الأسماك المعرضة ل 3 ميكروغرام / لتر ، ينعكس ذلك من خلال تجميع المياه الضحلة وبالتالي انخفاض كبير في متوسط المسافة وأبعد مسافة بين الأفراد (F2,56 = 5.664 ، P = 0.006 و F2,56 = 7.413 ، P = 0.001 ، لمتوسط وأبعد مسافات بين الأسماك ، على التوالي) مقارنة بالسيطرة.

Figure 7
الشكل 7: السلوك الاجتماعي لأسماك الزرد البالغة المنقولة بالماء المعرضة ل 0.3 ميكروغرام / لتر و 3 ميكروغرام / لتر غليفوسات لمدة أسبوعين. تم الإبلاغ عن البيانات كمخطط مبعثر مع الوسيط (n = 19-20) ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة لدونيت (متوسط المسافة بين الأسماك وأبعد مسافة) بيانات من 2 إلى 4 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم بإذن من فاريا وآخرين.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تقريب سلوك التجميد باستخدام التحليل الآلي. تأتي البيانات الواردة في هذا الجدول من نفس التسجيل (الفيديو 1) الذي تم تحليله بطريقتين مختلفتين. (أ) تقريب سلوك التجميد عن طريق الحساب الآلي باستخدام برنامج EthoVision V13. يتم حساب التنقل المتغير من تغيير منطقة الموضوع بين عينتين ، لذلك يعتمد على تكرار اكتساب هذه المنطقة. لقد وضعنا عتبة منخفضة جدا من الجمود (أقل من 3٪ من الحركة) بالإضافة إلى معدل العينة إلى حد أدنى من الوقت المستمر يبلغ 5 ثوان (أكثر من 150 إطارا). (ب) تحليل سلوك التجميد باستخدام البرنامج التفاعلي لأبحاث المراقبة السلوكية (BORIS، برنامج مجاني ومفتوح المصدر). BORIS هو برنامج لتسجيل الأحداث لترميز الفيديو والملاحظات الحية. باستخدام BORIS، يمكن للمراقب ترميز حلقة التجميد كحدث حالة، وتحديد نقطتي البداية والنهاية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

فيديو 1: السيطرة على الأسماك في اختبار الحوض الجديد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ارتبطت سلوكيات القلق المميزة التي لوحظت في NTT بشكل إيجابي بمستويات السيروتونين التي تم تحليلها في الأدمغة21. على سبيل المثال ، بعد التعرض لبارا كلوروفينيلالانين (PCPA) ، وهو مثبط للتخليق الحيوي 5-HT ، أظهرت الأسماك انجذابا جيوسيا إيجابيا بالإضافة إلى انخفاض مستويات 5-HT في الدماغ22 ، وهي نتائج مشابهة جدا لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام الميثامفيتامين. لذلك ، فإن الانخفاض في مستويات السيروتونين في الدماغ وعرض الانجذاب الأرضي الإيجابي في الزرد المعرض للميث يشير إلى أن سلوك القلق الذي ينتجه الدواء يتم بوساطة مسار هرمون السيروتونين. ومن المثير للاهتمام ، أن النمط الظاهري السلوكي المماثل ، أي تأثير القلق على الانجذاب الأرضي ، يمكن رؤيته في أسماك الزرد البالغة المعرضة لمدة أسبوعين إلى 0.3 3 ميكروغرام / لتر و 3 ميكروغرام / لتر ، وهما تركيزان بيئيان من الغليفوسات. كما تم الإبلاغ سابقا عن زيادة في الانجذاب الجغرافي لسمك الزرد البالغ مع مادة الأكريلاميد السامة للأعصاب 6,23. في جميع هذه الحالات ، ارتبط هذا النمط الظاهري السلوكي (زيادة الانجذاب الجغرافي في NTT ، سمة من سمات المادة المسببة للقلق) بتضاؤل مستويات الناقل العصبي أحادي الأمين. لذلك ، يوفر نموذج NTT جنبا إلى جنب مع التحليل الكيميائي العصبي للدماغ معلومات ذات صلة بيئيا ، وسلوك استكشافي ، وكفاءة البحث عن الطعام ويربط الأنماط العصبية السلوكية بتشكيلات الناقل العصبي.

من ناحية أخرى ، لوحظ أيضا ضعف في السلوكيات الاجتماعية في كل من المقايسات ، ST و SPT ، في الأسماك المعالجة ب METH. تتوافق النتيجة التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مع العديد من الدراسات التي أجريت على الجرذان ، حيث يؤدي التعرض الحاد والمزمن لحيوانات الدراسة إلى الميثامفيتامين إلى الانسحاب الاجتماعي24. تم تفسير التغيرات السلوكية الاجتماعية المرتبطة بتعاطي الميثامفيتامين في البشر من خلال ضعف في الوظيفة الاجتماعيةالمعرفية 24. تم العثور على تأثير مسبب للقلق على حجم المياه الضحلة في الزرد المعرض لمدة 2 أسابيع إلى 3 ميكروغرام / لتر غليفوسات. لاحظنا نسخة ظاهرية من هذا التأثير في الزرد المعرضة ل 53 مجم / لتر (0.75 مللي مول) أكريلاميد لمدة 3 أيام6،23.

تسمح مقايسات NTT و ST و SPT بتحديد التأثيرات السمية العصبية المحتملة بشكل فعال25 لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية كما هو موضح في دراسة نماذج سمية الميثامفيتامين الحاد وشبه المزمنة في الزرد البالغ. السلوك هو ، في علم السموم ، نقطة نهاية قمية ذات صلة ، تميز التأثيرات على المستويات العضوية لمادة كيميائية للسمية العصبية والبحوث البيئية. إلى جانب كونها نقطة نهاية شبه مميتة في ظروف المختبر ، فإن التغييرات في السلوكيات ، مثل السلوك الاستكشافي أو الاجتماعي ، يمكن أن تكون ضارة بطبيعتها. علاوة على ذلك ، فإن بطارية التحليل السلوكي المقترحة هي طريقة سهلة التنفيذ وشبه آلية11 ، وبالتالي فهي فعالة للغاية إذا تم التخطيط للمقايسات بوعي (مبدأ التخفيض)26. يؤدي إجراء هذه المقايسات كبطارية اختبار باستخدام خزان واحد إلى تقليل عدد والوقت التجريبي وتوليد النفايات.

يعد ترتيب المقايسات في البطارية أحد الاعتبارات المهمة إذا أردنا دراسة ملف تعريف الاستجابة للفرد في كل تجربة. لهذا الغرض ، فإن إجراء المقايسات الفردية المتبعة (انظر الشكل 2) يسمح بالحفاظ على محددا وربط سلوكه الاستكشافي بتفضيله الاجتماعي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون الاستجابات السلوكية للحيوان مرتبطة بالبيانات البيولوجية الأخرى ، مثل ملف تعريف الناقل العصبي أو التعبير الجيني ، إذا تم تحديد الأسماك حتى نقطة نهاية أخذ العينات (الشكل 2 أ).

عادة ، يسمح التحليل السلوكي بملاحظة الاختلافات بين المجموعات. أولا ، يتم حساب الاستجابات الفردية على أساس تتبع27 قبل تجميع البيانات حسب المجموعة. بعد ذلك ، تتم مقارنة الوسائل والفرق في التباين فيما يتعلق بالمجموعة الضابطة لكل معلمة سلوكية محسوبة. مع تحليل المياه الضحلة12 ، من الأهمية بمكان أن نكون واضحين جدا أن وحدة التباين هي مجموعة أسماك الاختبار ، وليس الأسماك الفردية لأن سلوك كل سمكة فردية يتأثر بالأسماك الأخرى في المياه الضحلة. هذه هي الطريقة المستخدمة في معظم الأوراق لمعالجة البيانات السلوكية28. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد إعادة التفكير في تحليل المعلمات السلوكية ليس على أساس كل معلمة على حدة ولكن كاستجابة شاملة لكل تجربة. على سبيل المثال ، يمكن للمرء حساب التباين المشترك لكل قياس تم إجراؤه في تجربة والإبلاغ عنه كطريقة مختلفة لقياس نفس الشيء: سلوك قلق أو استكشافي أو اجتماعي. هناك العديد من الطرق لحساب وتفسير البيانات السلوكية28,29. اعتمادا على عدد الشروط ونوع الاختبارات والحصول على الصور (2D أو 3D)30,31 ، يمكن إعادة التفكير في التحليل بالكامل من أجل الحصول على أفضل النتائج من البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل "الوكالة الحكومية للتحقيق" من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (المشروع PID2020-113371RB-C21) ، IDAEA-CSIC ، مركز سيفيرو أوتشوا للتميز (CEX2018-000794-S). تم دعم جولييت بيدروسيانتز بمنحة دكتوراه (PRE2018-083513) بتمويل مشترك من الحكومة الإسبانية والصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 201 ، الزرد ، اختبار السمية العصبية ، تسجيل الفيديو ، الاستكشافية ، العدوانية ، السلوكيات الاجتماعية ، التطبيقات
تقييم السمية العصبية لدى <em>البالغين دانيو ريريو</em> باستخدام مجموعة من الاختبارات السلوكية في خزان واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter