Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nevrotoksisitetsvurdering hos voksne Danio rerio ved bruk av et batteri av atferdstester i en enkelt tank

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Her presenterer vi et omfattende atferdstestbatteri, inkludert den nye tanken, Shoaling og sosiale preferansetester, for effektivt å bestemme potensielle nevrotoksiske effekter av kjemikalier (f.eks. Metamfetamin og glyfosat) på voksen sebrafisk ved hjelp av en enkelt tank. Denne metoden er relevant for nevrotoksisitet og miljøforskning.

Abstract

Tilstedeværelsen av nevropatologiske effekter viste seg i mange år å være det viktigste endepunktet for å vurdere nevrotoksisiteten til et kjemisk stoff. I løpet av de siste 50 årene har imidlertid effekten av kjemikalier på oppførselen til modellarter blitt aktivt undersøkt. Gradvis ble atferdsmessige endepunkter innlemmet i nevrotoksikologiske screeningprotokoller, og disse funksjonelle utfallene brukes nå rutinemessig til å identifisere og bestemme potensiell nevrotoksisitet av kjemikalier. Atferdsanalyser hos voksne sebrafisk gir et standardisert og pålitelig middel for å studere et bredt spekter av atferd, inkludert angst, sosial interaksjon, læring, hukommelse og avhengighet. Atferdsanalyser hos voksne sebrafisk innebærer vanligvis å plassere fisken i en eksperimentell arena og registrere og analysere deres oppførsel ved hjelp av videosporingsprogramvare. Fisk kan bli utsatt for ulike stimuli, og deres oppførsel kan kvantifiseres ved hjelp av en rekke beregninger. Den nye tanktesten er en av de mest aksepterte og mest brukte testene for å studere angstlignende oppførsel hos fisk. Shoaling og sosiale preferansetester er nyttige for å studere sebrafiskens sosiale atferd. Denne analysen er spesielt interessant siden oppførselen til hele stimen studeres. Disse analysene har vist seg å være svært reproduserbare og følsomme for farmakologiske og genetiske manipulasjoner, noe som gjør dem til verdifulle verktøy for å studere nevrale kretser og molekylære mekanismer som ligger til grunn for atferd. I tillegg kan disse analysene brukes i narkotikascreening for å identifisere forbindelser som kan være potensielle modulatorer av atferd.

Vi vil vise i dette arbeidet hvordan man bruker atferdsverktøy i fiskens nevrotoksikologi, analyserer effekten av metamfetamin, et rekreasjonsmedisin og glyfosat, et miljøforurensende stoff. Resultatene demonstrerer det betydelige bidraget av atferdsanalyser hos voksne sebrafisk til forståelsen av nevrotoksikologiske effekter av miljøgifter og legemidler, i tillegg til å gi innsikt i molekylære mekanismer som kan endre nevronfunksjonen.

Introduction

Sebrafisken (Danio rerio) er en populær modell virveldyrarter for økotoksikologi, narkotikaforskning og sikkerhetsfarmakologistudier. Dens lave kostnader, veletablerte molekylærgenetiske verktøy og bevaring av viktige fysiologiske prosesser involvert i morfogenese og vedlikehold av nervesystemet gjør sebrafisk til en ideell dyremodell for nevrovitenskapelig forskning, inkludert nevroatferdstoksikologi 1,2. Hovedendepunktet for å evaluere nevrotoksisiteten til et kjemikalie var inntil nylig tilstedeværelsen av nevropatologiske effekter. I det siste har imidlertid atferdsmessige endepunkter blitt innlemmet i nevrotoksikologiske screeningprotokoller, og disse funksjonelle utfallene brukes nå ofte til å identifisere og bestemme potensiell nevrotoksisitet av kjemikalier 3,4. Videre er atferdsmessige endepunkter svært relevante fra et økologisk synspunkt, da selv en svært mild atferdsendring hos fisk kan true dyrets overlevelse under naturlige forhold5.

En av de mest brukte atferdsanalysene i voksen sebrafiskforskning er novel tank test (NTT), som måler angstlignende atferd 6,7. I denne analysen blir fisk utsatt for nyhet (fisk er plassert i en ukjent tank), en mild aversiv stimulus og deres atferdsresponser observeres. NTT brukes hovedsakelig til å vurdere basal bevegelsesaktivitet, geotakse, frysing og uberegnelige bevegelser hos fisk. Uberegnelig8 er preget av brå retningsendringer (zigzagging) og gjentatte episoder av akselerasjoner (darting). Det er en alarmreaksjon og observeres vanligvis før eller etter fryseepisoder. Fryseatferd tilsvarer en fullstendig opphør av fiskens bevegelser (unntatt operkulære og okulære bevegelser) mens den er på bunnen av karet, til forskjell fra immobilitet forårsaket av sedasjon, noe som forårsaker hypolokobevegelse, akinesi og synking8. Frysing er vanligvis relatert til en høy tilstand av stress og angst og er også en del av underdanig oppførsel. Komplekse oppføringer er gode indikatorer på tilstanden til angst hos dyr. NTT har vist seg å være følsom for farmakologisk og genetisk manipulasjon9, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for å studere det nevrale grunnlaget for angst og relaterte lidelser.

Sebrafisk er en svært sosial art, så vi kan måle et bredt spekter av sosial atferd. Shoaling test (ST) og sosial preferansetest (SPT) er de mest brukte analysene for å vurdere sosial atferd10. ST måler fiskens tendens til å gruppere sammen11 ved å kvantifisere deres romlige oppførsel og bevegelsesmønstre. ST er nyttig for å studere gruppedynamikk, ledelse, sosial læring og forstå den sosiale atferden til mange fiskearter12. SPT hos voksne sebrafisk ble tilpasset fra Crawleys preferanse for sosial nyhetstest for mus13 og ble raskt en populær atferdsanalyse for studiet av sosial interaksjon i denne modellarten14. Disse to testene har også blitt tilpasset for bruk i narkotikascreeningsanalyser og har vist løfte om å identifisere nye forbindelser som modulerer sosial atferd 15,16.

Generelt er atferdsanalyser hos voksne sebrafisk kraftige verktøy som kan gi verdifull informasjon om atferdsmekanismer eller nevrofenotyper av aktive forbindelser og misbrukte stoffer17. Denne protokollen beskriver hvordan du implementerer disse atferdsverktøyene7 med grunnleggende materialressurser og hvordan du bruker dem i toksisitetsanalyser for å karakterisere effekten av et bredt spekter av nevroaktive forbindelser. I tillegg vil vi se at de samme testene kan brukes til å vurdere neurobehaviorale effekter av akutt eksponering for en nevroaktiv forbindelse (metamfetamin), men også for å karakterisere disse effektene etter kronisk eksponering for miljøkonsentrasjoner av et plantevernmiddel (glyfosat).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Streng overholdelse av etiske standarder garanterer velferd og riktig behandling av sebrafisken som brukes til eksperimentering. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fastsatt av Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC). Protokollene og resultatene som presenteres nedenfor ble utført under lisens gitt av kommunen (avtalenummer 11336).

1. Dyrehus for atferdstesting

  1. Utfør alle testene (presentert i figur 1) i et isolert atferdsrom ved 27-28 °C mellom kl. 10.00 og 17.00.
  2. Vask både kontrollfisk og eksponert fisk flere ganger i rent fiskevann [omvendt osmose renset vann som inneholder 90 mg / L akvarium systemer salt, 0,58 mM CaSO4 · 2H2O og 0,59 mM NaHCO3] før du starter forsøkene for å unngå potensiell forurensning av eksperimentell tank.
  3. Akklimatisere dyr til atferdsrommet 1 time før du starter forsøkene.
  4. Sørg for at dyrene (≈50:50 mann: hunnforhold) er eksperimentelt naive og utfører all atferdstesting på en blind måte med observatører som ikke er klar over eksperimentgruppen.
  5. For å oppnå meningsfulle resultater i atferdsanalyser, ha et totalt antall på 18 personer per tilstand (n = 18), ideelt sett oppnådd mellom to eller flere uavhengige eksperimenter. For eksempel, i individuelle tester, analyser oppførselen til 9 dyr per tilstand, per replikat. I gruppetester, analyser oppførselen til en stim på 6 til 9 dyr per tilstand, per replikat.
  6. Utfør alle tester etter en batteritesttilnærming (se planforslag i figur 2). Etisk mer egnet, tillater denne metoden å redusere antall dyr som trengs for studien, i samsvar med 3R-reduksjonsprinsippet7.
  7. Mesteparten av tiden er atferdsanalyser knyttet til biologiske analyser, så ofre dyrene etter eutanasiretningslinjer18 før du samler og analyserer prøver (OMICs eller kjemikalier). Hvis endepunktet ikke viser seg å være prøvetaking, må kontrollgruppen stabiliseres på nytt på slutten av eksperimentet. Gjenbruk kontrolldyrene til avls- eller forsøksformål etter noen dager.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle oppsett. Tre konfigurasjoner av den firkantede tanken for å studere et bredt spekter av atferd hos voksne sebrafisker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentell tidslinje. To planleggingsforslag for registrering av atferdsanalyser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Eksperimentelle konfigurasjoner av tanken

  1. Angstlignende oppførsel: The Novel Tank Test (NTT)
    1. Juster det eksperimentelle oppsettet (antall tanker, kameraer og datamaskiner) for å registrere maksimalt antall fisk samtidig. Individuelle atferdsanalyser er tidkrevende, så optimaliser tid, materiale og plass.
    2. Forbered eksperimentelle tanker for NTT: Firkantet tank (20 cm lengde, 20 cm bredde, 25 cm høyde) dekket med akrylpaneler på sidevegger og bunn for å unngå refleksjon og interferens mellom.
    3. Fyll forsøkstankene med 7 L (vannsøylehøyde: 20 cm høyde) godt oksygenrikt fiskevann ved 28 °C.
    4. Juster posisjonen til tanken foran kameraet for å unngå forvrengt bilde.
    5. Kontroller belysningsoppsettet. LED-bakgrunnsbelysning (10000 lux) gir en homogenatbelysning på hele delen av tanken for videoopptak under gode forhold.
    6. Slå på kameraene og juster dem etter avsnitt 3.
    7. Introduser forsøkspersonene, en etter en, i bunnen av eksperimentelle tanker før du begynner å registrere så raskt som mulig.
      MERK: Det er viktig å starte opptak med dyret på bunnen av tanken.
    8. Pass på at du ikke forstyrrer dyrene under opptak. Bruk av gardin eller panel for å begrense visuell interaksjon ikke bare mellom tanker, men også mellom støtten og utsiden.
    9. På slutten av opptaket (standard opptakstid er 6 min), overfør dyrene som allerede har gått gjennom testen til en annen tank for ikke å blande dem med de naive dyrene.
    10. Gjenta prosedyren med alle tilgjengelige emner. Det anbefales å ha et totalt antall på 18 personer per tilstand for å oppnå meningsfulle resultater i individuelle studier (fra to eller flere uavhengige replikater).
    11. Randomiser eksperimentgruppen som er tildelt hver tank mellom forsøk for å unngå potensielle tankeffekter (hvis du registrerer flere forhold samtidig).
  2. Sosial gruppert atferd: Shoaling Test (ST)
    1. Den eksperimentelle konfigurasjonen av ST er den samme som for NTT (de samme tankene kan gjenbrukes direkte).
    2. Følg trinnene 2.1.1-2.1.6. å sette opp ST.
    3. Introduser stimen (6 til 9 personer samtidig) på bunnen av eksperimentelle tanker før du begynner å registrere så raskt som mulig.
      MERK: Det er viktig å starte opptak med dyret på bunnen av tanken.
    4. Følg trinnene 2.1.8-2.1.11. å utføre ST.
    5. Gjenta prosedyren med alle tilgjengelige emner. For å oppnå meningsfulle resultater i denne analysen, må du lage minst to uavhengige replikater med samme bankstørrelse i hver replikasjon.
    6. Oppretthold størrelsen på stimen konsistent for alle eksperimentelle grupper og replikater i samme eksperiment.
  3. Sosial individuell atferd: Den sosiale preferansetesten (SPT)
    1. Juster det eksperimentelle oppsettet for å optimalisere det eksperimentelle rommet og tidspunktet for opptak.
    2. Forbered eksperimentelle tanker for SPT: Firkantet tank (20 cm lengde, 20 cm bredde, 25 cm høyde) gjennomsiktig (glass eller plast) for å gi sidesynlighet. Den enkle fokusfisken er fri til å samhandle med en spesifikk virtuell sone - en fiskestim plassert i den ensidige eksterne hustanken, eller med den uspesifikke virtuelle sonen - en ensidig ekstern tom hustank.
    3. Fyll forsøkstankene med 5 L (vannsøylehøyde: 15 cm, samme høyde som vannsøylen i de utvendige hustankene) rent fiskevann ved 28 °C.
    4. Juster posisjonen til tanken foran kameraet for å unngå forvrengt bilde.
    5. Kontroller at systemet mottar homogen belysning.
    6. Introduser forsøkspersonene, en etter en, i bunnen av eksperimenttankene før du umiddelbart starter opptaket med dyret nede i midten.
    7. Unngå visuelle interaksjoner mellom observatører og dyr under opptak.
    8. På slutten av 6 minutters opptak, overfør de nåværende dyrene til en annen tank for ikke å blande dem med de naive dyrene.
    9. Gjenta prosedyren med alle tilgjengelige emner. Ha et totalt antall på 18 forsøkspersoner per tilstand for å oppnå meningsfulle resultater i individuelle studier (fra to eller flere uavhengige replikater).

3. Videoopptak for atferdstester

  1. Åpne kamerabehandleren for å sjekke tilgjengeligheten til GigE-kameraet på hver datamaskin.
  2. Start GigE-kamerastyringsprogramvaren (for eksempel uEye Cockpit, beskrevet her). Åpne alternativet Kamera , velg Monokrom-modus , og juster bildestørrelsen (1:2).
  3. Åpne kameraegenskaper
    1. Under Kamera setter du Pikselklokke til Maksimum, setter bildefrekvensen til 30 bilder per sekund (fps) og justerer eksponeringen (Auto eller Manuell justering hvis bildet er for mørkt).
    2. Under Bilde setter du forsterkningen til 0 (Auto) og Svartnivå (Auto eller Manuell justering for å få god kontrast).
    3. Under Størrelse justerer du størrelsen på vinduet til området som må graveres (Bredde: Bredde-Venstre, Høyde: Høyde-Topp). Dette trinnet gjør det mulig å redusere størrelsen på bildet og derfor den endelige størrelsen på videoen.
    4. Lukk Kameraegenskaper.
  4. Opprett en generell mappe for eksperimentøkten for å lagre kamerainnstillingene og videoene.
  5. Hvis du vil lagre kamerainnstillingene, angir du Fil > Lagre parametere > Til fil og velger eksperimentmappen som nylig ble opprettet.
    MERK: Kamerainnstillingsfilen kan dermed lastes inn på nytt i programmet for å fortsette å jobbe med de samme bildeparametrene når som helst (f.eks. når kameraet plutselig slås av eller for å gjenbruke de samme innstillingene, noe som reduserer oppsettstiden og homogeniserer eksperimentelle forhold). Hvis kameraet i ett øyeblikk fryser mellom videoer, stopper du opptaket, avslutter og slår av kameraet. Slå den på igjen, last inn kameraparametrene på nytt ved å gå til File > Load Parameters > To File, og start opptaket på nytt. Sjekk om den aktuelle videoen er fullstendig anskaffet for å kaste eller gjenta fisken (før gjenta, gi dyrene litt tid til å akklimatisere seg på nytt).
  6. Gjenta denne kameraoppsettprosedyren (trinn 3.1-3.5) på alle kameraene.
  7. Når alle kameraene er riktig konfigurert, åpner du Ta opp videosekvens.
  8. Velg Opprett for å lagre som en ny videofil, velg eksperimentmappen som nylig ble opprettet, og rapporter informasjonen om emnet, eksperimenttypen og datoen i navnet på videofilen.
  9. Velg Maks. Rammer. Skriv inn 10800 i rammeboksen. Standard video tar opp 6 min (Video 1) ved 30 fps i AVI-format; Derfor 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 bilder totalt.
  10. Velg Calc. Frame Rate eller angi bildefrekvensen manuelt (opptakshastighet: 30 fps).
  11. Gjenta prosedyren for oppretting av videofiler på alle datamaskinene.
  12. Introduser fagene, en etter en, på bunnen av hver eksperimentell tank. Alle analyser vil bli kjørt samtidig.
  13. Start postene raskt ved å klikke på Record og vent på å få maksimalt antall forespurte rammer (trinn 3.10).
  14. Når videoene er spilt inn, vises en chatboks med meldingen Maksimalt antall bilder oppnådd!. Velg Godta.
  15. Plukke ut Lukk for å fullføre innspillingen og lukke videofilen.
  16. Fjern fisken som nettopp er observert. Vær forsiktig med å skille dem fra den naive fisken.
  17. Velg direkte Opprett og gjenta prosessen for å fortsette å spille inn videoer.
  18. Når alle opptakene er gjort, velger du Avslutt.
  19. For å slå av kameraene, velg Lukk kamera og avslutt programmet.

4. Analyse av innspilte videoer

  1. Start analyseprogrammet (se Materialfortegnelse).
  2. For å utdype en ny mal, klikk på Ny fra mal > brukte en forhåndsdefinert mal > fra videofil, og velg en video for å begynne å sette opp malen. Prøv å velge en representativ video av eksperimentet med et emne som viser god mobilitet og gode opptaksforhold.
  3. I Parametere konfigurerer du parametrene i følgende vinduer (1 til 4/7). Velg modellen Fish > Adult Zebrafish, arenaen Open Field Square > One Arena, antall Subject per Arena (for ST kreves en multisporingspakke [spor forskjellige emner i en arena]), typen Deteksjon etter Center-Point og til slutt juster bildefrekvensen til 30 fps. I de følgende vinduene (5 til 7/7) må du ikke endre parametere; standardkonfigurasjonen er OK.
  4. Gi eksperimentet et navn som en mal, og plasser det i samme mappe som resten av den lagrede videoen. Malen opprettes som en eksperimentmappe med flere underinndelinger som inneholder all oppsettinformasjonen.
  5. Under Eksperimentinnstillinger kontrollerer du det definerte oppsettet (fra videofil, arena, antall motiver, ramme per sekund). Her kan systemenhetene endres.
  6. Under Arenainnstillinger høyreklikker du på midten av skjermen og velger Grab. Fra Fil i displayet. Velg et videobilde av god kvalitet og Godta for å ta dette bildet for bakgrunnsinnstillingene. Kalibrer først bildet og generer en kalibrert regel. Bruk tankens bredde som en skala (19 cm). Deretter tegner du arenaen. Vær forsiktig med å lage torget akkurat nok til å unngå refleksjoner av dyret når sistnevnte nærmer seg overflaten eller eventuell forvirring av fiskeprogramvaren med de svarte områdene i tanken. Til slutt tegner du formsonene med Frame-funksjonen .
    1. For NTT og ST, del fronten av tanken i to like virtuelle soner, topp og bunn (se figur 1). Tegn to like horisontale bokser. Boksene dekker en halv arena for hver enkelt. Navngi Topp og Bunn for henholdsvis øvre og nedre sone. Vær forsiktig med at boksene har samme bredde (9-10 cm) og lengde (8-9 cm), ikke overskrider arenagrenser (oransje firkant), og ikke overlapp, og kontroller at hver pilsone angir nøyaktig sonene.
    2. For SPT, del den eksperimentelle arenaen konseptuelt inn i tre like store soner: tom, senter og konspesifikk (se figur 1). Tegn tre like vertikale bokser. Navngi boksen orientert mot stimtanken som Conspecific, boksen orientert mot den tomme tanken som Empty, og den midterste som Center. Vær forsiktig med at boksene har samme bredde (6 cm) og lengde (18-19 cm), ikke overskrider arenagrensene, og ikke overlapper.
  7. Under Gjenkjenningsinnstillinger kontrollerer du hvilken video som skal behandles i videofilen. Kontroller deretter deteksjonskvaliteten (fisk i gult, rødt midtpunkt). Klikk på Auto Detect for å justere deteksjonen, refokusere dyret (velg et bilde som dyret svømmer i profil på den hvite bakgrunnen, tegn bildet ved å ta hele kroppen, og valider deteksjonen med Ja). Åpne avansert for å forbedre gjenkjenningen ved å velge Dynamisk subtraksjon, mørkere motiv, bakgrunnsinnstillinger, bakgrunnslæring, emnestørrelse, støyreduksjon osv.
  8. Under Innstillinger for prøveversjoner setter du én prøveversjon og sletter de andre (høyreklikk og slett)
  9. Under Datainnstillinger oppretter du dialogvinduer for opprett resultater. Parameteriser resultater per gang og per sone. Du kan for eksempel opprette ett resultatvindu for datautdata etter minutter og et annet for datautdata etter total tid (6 min). Be om datautgangen for hver sone (be om det hvis avstanden i hver sone er nødvendig). Koble de forskjellige resultatvinduene til Start-vinduet med piler.
  10. Under Analyser innstillinger velger du parameterne som skal analyseres og typen statistikk for hver parameter. Disse parameterne beregnes automatisk basert på dataene som er innhentet fra sporingen.
    1. For NTT og SPT velger du alternativer som definert nedenfor:
      1. Velg Avstand flyttet (velg Totalt) for å få avstanden som er reist i arenaen (cm) og avstanden som er reist i de respektive sonene (cm).
      2. Velg I soner (velg Soner, Frekvens, Kumulativ og Ventetid til Første) for å ha tiden brukt i sonene (e) og ventetiden til første inngang i sonene (e).
      3. Velg Zone Transition (velg Threshold: 0 cm, Add Zone 1 > Zone 2; Sone 2 > sone 1, i alle soner, frekvens) for å oppnå antall innganger i sonene.
      4. Velg Mobility Sate (fyll inn High mobile over 70%, Immobile under 3%, minimum 150 bilder, og velg frekvens, kumulativ og ventetid til først) for å ha varigheten av hypermobilitet (er), varigheten av frysing (er).
        MERK: Se diskusjonsdelen for mer informasjon om tilnærmingen av fryseatferd ved hjelp av den automatiserte analysen og antall og varighet (er) av fryseepisoder.
      5. Velg Akselerasjon og svingvinkel (velg frekvens og kumulativ) for å evaluere forekomsten av kompleks atferd som dristig og uberegnelig (raske akselerasjonsbevegelser).
    2. For ST, i tillegg til de ovennevnte utforskende parametrene, velg alternativet Avstand mellom (velg alle fagene, gjennomsnitt, maksimum, minimum) for å få gjennomsnittlig avstand mellom fisk (cm), gjennomsnittlig avstand mellom nærmeste nabo (cm) og gjennomsnittlig avstand mellom lengst nabo.
  11. Malen er klar til bruk. Lagre de siste endringene og lukk malen uten å hente data fra videoen (vedlikehold malfilen, den er lett og enkel å administrere og kopiere). Hvis det finnes flere programvarelisenser, analyserer du videoene fra samme mal som er kopiert til hver datamaskin.
  12. Hvis du vil kopiere og bruke malen, er det to alternativer:
    1. Åpne malfilen med atferdsanalyseprogramvaren, gå til File > Save as for å opprette en ny identisk fil.
    2. I velkomstgrensesnittet velger du Ny fra mal > brukte en egendefinert mal > Fra videofil (velg mal. EthXV-filen). Gi det nye eksperimentet navn, og velg plasseringen. Det kan ta noen minutter før programvaren kopierer informasjonen fra malfilen.
  13. Gå til Arenainnstillinger for å justere malen på nytt hvis videoen ble tatt opp med et annet kamera (følg trinn 4.6 og 4.7).
  14. Gå til Detection Settings eller Acquisition for å sjekke hvilken video som er valgt, og endre videofilen om nødvendig.
  15. Under Brukeranskaffelse velger du DDS > Klar til å starte. Det kan ta noen minutter før programvaren behandler videoen.
  16. Når anskaffelsen er fullført, går du til Sporredigering. Velg akselerasjon x16 for å lese den behandlede videoen raskere og sjekke om sporingen er riktig.
    MERK: Noen ganger kan det være "tap" i sporingen (på grunn av refleksjoner eller forvirring av selve programvaren). De kan redigeres manuelt fra denne delen hvis de er få; Ellers er det å foretrekke å reprosessere hele eksperimentet, forbedre definisjonen av lerretet og deteksjonen.
  17. Under Statistikk klikker du på Beregn > Eksporter data. Dataeksport er direkte plassert i eksperimentmappen.
  18. Under Spor visualisering eller varmekart, generer og eksporter (høyreklikk, eksporter bilde, velg mappen Eksporter filer av eksperimentet for å lagre disse dataene med regnearkrapporten) sporingsbilder av dyret.
  19. Gå til Fil for å lukke det aktive eksperimentet og gjenta denne prosedyren for neste video.

5. Statistisk analyse

  1. Analyser normaliteten (Shapiro-Wilk test) av data i hver gruppe.
  2. Vurder homoscedastisitet med Levenes test.
  3. Bruk enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts og Tukeys flere sammenligningstester for å teste forskjeller mellom grupper når kriterier for normalitet og homoscedastisitet ikke kan avvises.
  4. Bruk Kruskal-Wallis-testen etterfulgt av en parvis sammenligning ved hjelp av Bonferroni-korreksjonen for å teste forskjeller mellom grupper når kriterier for normalitet og homoscedastisitet avvises.
  5. Plott dataene med grafisk programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne delen vil vi se på noen mulige anvendelser av disse atferdsverktøyene i fiskens nevrotoksikologi. Følgende resultater samsvarer med karakteriseringen av de akutte eller binge-effektene av metamfetamin (METH), et rekreasjonsstoff, og de subkroniske effektene av glyfosat, et av de viktigste herbicidene som finnes i akvatiske økosystemer.

Karakterisering av en metamfetaminbinge-nevrotoksisitetsmodell hos voksne sebrafisk
Ved evaluering av effekten av 40 mg/l METH på NTT (figur 3) bekreftet Kruskal-Wallis-testen at de eksponerte dyrene presenterte en positiv geotakse, karakterisert ved en reduksjon i letetiden i eksperimenttankens øvre sone (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8), samt i tilbakelagt avstand i denne delen (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8), og i antall besøk (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Vi observerte også en signifikant økning i latenstiden før første besøk i øvre sone (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Det er viktig å bemerke at forskjellene observert i parametrene målt i NTT etter METH-eksponering er konsistente over tid, noe som bekreftes av Bonferroni-korreksjonen (P > 0,8). En signifikant effekt av eksponeringstid ble funnet for fryseatferd (H(2) = 13.120, P = 0.0014).

Figure 3
Figur 3: Angstlignende atferd vurdert i standard 6-minutters ny tanktest (NTT) av voksen sebrafisk utsatt for 40 mg / l metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Data fra hvert eksperiment ble normalisert til de tilsvarende kontrollverdiene. De kombinerte dataene rapporteres som et spredningsdiagram med median (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis-test med Bonferroni-korreksjon for NTT-endepunkter. Data fra 2 uavhengige eksperimenter. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Bedrossiantz et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Frysebevegelser kan kvantifiseres ved å vurdere frekvens, latens, varighet eller plassering av frysing. Den beste måten å score dem på er utvilsomt øyet til en erfaren observatør, noe som er ganske arbeidskrevende og komplekst, så vi prøvde et automatisert alternativ ved hjelp av EthoVision-programvare for å oppdage fryseadferd19. Vi fant at antall, latens og varighet av fryseangrep beregnet av programvaren (tabell 1A) korrelerer med god nøyaktighet med episodene skåret manuelt av observatøren (tabell 1B). Mens de to metodene er likeverdige når det gjelder resultater (P = 0,958, Studentens test), brukte vi den automatiserte tilnærmingen for å vurdere frysingen her. Etter 3 timers eksponering for meth økte frysetiden signifikant (P = 0,0012), mens det ikke ble funnet noen forskjell med kontrollen etter 48 timers eksponering (P = 0,16). METH ga ingen effekt på uberegnelige bevegelser på noen av tidspunktene.

Vi brukte to eksperimentelle paradigmer for å evaluere effektene på sosial atferd etter akutt eksponering for METH. ST (figur 4) viste at gjennomsnittlig avstand og lengst avstand mellom individer var signifikant større for METH-behandlet fisk (H (2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 for henholdsvis gjennomsnittlige og lengste interfiskavstander), som peker på en atferdsfenotype av sosial isolasjon. Igjen bemerker vi at det ikke ble funnet noen tidseffekt ved bruk av Bonferroni post hoc-test (P > 0,5).

Figure 4
Figur 4: Sosial atferd hos voksen sebrafisk vannbåren utsatt for 40 mg/l metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Resultater fra stimtesten (ST), inkludert gjennomsnittet og de lengste interfiskavstandene. De kombinerte dataene rapporteres som et spredningsdiagram med median (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis test med Bonferroni korreksjon. Data fra 2 uavhengige eksperimenter. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Bedrossiantz et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I SPT (figur 5) viser behandlet fisk en signifikant reduksjon i tidsbruk og tilbakelagt distanse i den spesifikke sonen (F(2,74) = 14.497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 for henholdsvis tidsbruk og tilbakelagt distanse i den spesifikke sonen). Disse resultatene bekrefter den sosiale isolasjonsfenotypen foreslått av TS-resultatene. Tukeys Honest Significant Difference (HSD) post hoc-test utelukket ingen mulige forskjeller mellom de to analysetidene (P > 0,5).

Figure 5
Figur 5: Sosial atferd hos voksen sebrafisk vannbåren utsatt for 40 mg/l metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Den sosiale preferansetesten (SPT) resultater, inkludert tid og avstand til fisken i hver av de tre virtuelle sonene i eksperimentell tank: tom, senter og konspesifikk. Data fra hvert eksperiment ble normalisert til de tilsvarende kontrollverdiene. De kombinerte dataene rapporteres som et spredningsdiagram med median (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; enveis ANOVA med Dunnetts flere sammenligningstest. Data fra 2 uavhengige eksperimenter. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Bedrossiantz et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Atferdseffekt av subkronisk eksponering for miljønivåer av glyfosat
Atferdsanalyse av effekten av subkronisk eksponering for 3 μg/L glyfosat på NTT (figur 6) viser en signifikant reduksjon i tid brukt på å utforske toppen (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), tilbakelagt distanse i denne delen (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) og antall besøk (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Disse effektene er karakteristiske for positiv geotaxisatferd, og det samme er den økte effekten observert på latenstiden før det første besøket på toppen av tanken (H (2) = 9,628, P = 0,008). Uttrykket av uberegnelig og frysende oppførsel av de eksponerte dyrene ble også analysert i NTT. Varighet (H(2) = 17,261, P = 0,025) og antall uberegnelige episoder (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) økte signifikant med glyfosat. Derimot ble det ikke funnet fryseforskjeller med kontrollen (Pearson Chi-Square(2) = 2,964, P = 0,253). Anvendt på en økologisk kontekst antyder observasjonene gjort ved NTT at glyfosat kan redusere fiskens utforskende oppførsel betydelig, og true deres evne til å overleve i naturen.

Figure 6
Figur 6: Angstlignende atferd vurdert i standard 6-minutters ny tanktest (NTT) av voksne sebrafisk utsatt for 0,3 μg/L og 3 μg/L glyfosat i 2 uker. Behaviorale parametere analysert, samt en tegneserie av eksperimentell tank delt inn i to like virtuelle soner, topp og bunn. Data rapportert som spredningsplott med median (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; enveis ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (Total distanse, Avstand i toppen, Tid i toppen, Overganger til toppen, Uberegnelige kamper, Høy mobilitetsfrekvens) eller Kruskal Wallis-test med Bonferroni-korreksjon (Latency til toppen, Uberegnelig varighet). Det ble ikke funnet forskjeller (P > 0,05) i frysevarighet og fryseanfall. Data fra 2-4 uavhengige eksperimenter. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Faria et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Skolegang, ikke-polariserte grupper av conspecifics som holdes sammen av sosialt press for å beskytte seg mot rovdyr, er en naturlig tendens til Danio rerio. Skolen kan "stramme" eller "utvide" avhengig av dyrenes nivå av angst eller frykt, en spesiell visuell effekt som er veldig lett å identifisere eksperimentelt (figur 7). I glyfosatforsøket viste stimingstesten en økning i angst hos fisk eksponert for 3 μg/L, reflektert av en gruppering av stimen og dermed en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig avstand og lengst avstand mellom individer (F2,56 = 5,664, P = 0,006 og F2,56 = 7,413, P = 0,001, for gjennomsnittlig og lengst interfiskavstand, henholdsvis) sammenlignet med kontrollen.

Figure 7
Figur 7: Sosial atferd hos voksne sebrafiskvannbårne eksponert for 0,3 μg/L og 3 μg/L glyfosat i 2 uker. Data rapportert som spredningsplott med median (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; enveis ANOVA med Dunnetts multippel sammenligningstest (Gjennomsnittlig interfiskavstand og Lengst avstand) Data fra 2 til 4 uavhengige eksperimenter. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Faria et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: En tilnærming av fryseatferd ved hjelp av en automatisert analyse. Data rapportert i denne tabellen kommer fra samme opptak (Video 1) analysert med to forskjellige metoder. (A) Tilnærming av fryseoppførsel ved automatisert beregning med EthoVision V13-programvare. Den variable mobiliteten beregnes ut fra endringen av emneområdet mellom to prøver, så det avhenger av oppkjøpsfrekvensen til dette området. Vi setter en svært lav terskel for immobilitet (mindre enn 3% mobilitet) samt samplingsfrekvensen til en minimum kontinuerlig tid på 5 s (mer enn 150 bilder). (B) Analyse av fryseatferd med Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, fri programvare med åpen kildekode). BORIS er en programvare for hendelseslogging for videokoding og live observasjoner. Med BORIS kan observatøren kode fryseepisoden som en tilstandshendelse, og definere start- og sluttpunkt. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Video 1: Kontroller fisk i den nye tanktesten. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Karakteristisk angstatferd observert i NTT har vært positivt korrelert med serotoninnivåer analysert i hjernen21. For eksempel, etter eksponering for para-klorfenylalanin (PCPA), en hemmer av 5-HT biosyntese, viste fisk positiv geotakse samt redusert hjerne 5-HT-nivåer22, resultater som ligner de som er oppnådd med METH. Derfor antyder reduksjonen i hjernens serotoninnivåer og visningen av positiv geotakse i METH-eksponert sebrafisk at angstadferden produsert av stoffet er mediert av den serotonerge banen. Interessant nok kan en lignende atferdsfenotype, dvs. en angstdempende effekt på geotaxis, ses hos voksne sebrafisk eksponert i 2 uker til 0,3 3 μg/L og 3 μg/L, to miljørelevante konsentrasjoner av glyfosat. En økning i geotakse ble også tidligere rapportert for voksen sebrafisk med det nevrotoksiske akrylamid 6,23. I alle disse tilfellene var denne atferdsfenotypen (en økning av geotakse i NTT, karakteristisk for anxiogen substans) assosiert med reduksjon av monoaminerge nevrotransmitternivåer. Derfor gir NTT-paradigmet kombinert med nevrokjemisk analyse av hjernen økologisk relevant informasjon, utforskende atferd og foraging effektivitet og forbinder atferdsneurofenotyper med nevrotransmittermodulasjoner.

På den annen side ble det også observert en svekkelse av sosial atferd i begge analysene, ST og SPT, i METH-behandlet fisk. Resultatet oppnådd i denne studien stemmer overens med flere studier med rotter og aper, hvor studiedyrenes akutte og kroniske eksponering for METH resulterer i sosial tilbaketrekning24. Sosiale atferdsendringer knyttet til METH-misbruk har blitt forklart hos mennesker av svekkelser i sosial-kognitiv funksjon24. En angstdempende effekt på stimstørrelsen ble funnet hos sebrafisk eksponert i 2 uker for 3 μg/L glyfosat. Vi observerte en fenokopi av denne effekten hos sebrafisk eksponert for 53 mg/L (0,75 mM) akrylamid i 3 dager 6,23.

NTT-, ST- og SPT-analysene gjør det mulig å effektivt bestemme potensielle nevrotoksiske effekter25 av et bredt spekter av kjemikalier som illustrert ved studien av akutt metamfetamin og subkroniske glyfosattoksisitetsmodeller hos voksne sebrafisk. Atferd er i toksikologi et relevant apikalt endepunkt, som karakteriserer effektene på organismenivåer av et kjemikalie for nevrotoksisitet og miljøforskning. Foruten å være et subletalt endepunkt i laboratorieforhold, kan endringer i atferd, som utforskende eller sosial atferd, være skadelig i naturen. Videre er det foreslåtte atferdsanalysebatteriet en enkel å implementere, halvautomatisert metode11 og derfor svært effektiv hvis analysene er bevisst planlagt (reduksjonsprinsipp)26. Å utføre disse analysene som et testbatteri ved hjelp av en enkelt tank reduserer antall dyr og eksperimentell tids- og avfallsgenerering.

Rekkefølgen på analysene i batteriet er en viktig faktor hvis vi ønsker å studere responsprofilen til en person i hvert forsøk. For dette formålet gjør gjennomføring av de individuelle analysene som følges (se figur 2) det mulig å holde dyret identifisert og å relatere dets utforskende oppførsel til dets sosiale preferanse. I tillegg kan dyrets atferdsresponser relateres til andre biologiske data, for eksempel nevrotransmitterprofil eller genuttrykk, hvis fisken holdes identifisert til prøvetakingssluttpunktet (figur 2A).

Vanligvis tillater atferdsanalyse observasjon av forskjeller mellom grupper. Først beregnes individuelle svar på grunnlag av dyresporing27 før dataene slås sammen etter gruppe. Deretter sammenlignes gjennomsnittet og forskjellen i varians med hensyn til kontrollgruppen for hver atferdsparameter som beregnes. Med stimanalyse12 er det viktig å være veldig tydelig på at variansenheten er gruppen testfisk, ikke enkeltfisk fordi atferden til hver enkelt fisk påvirkes av de andre fiskene i stimen. Dette er måten som brukes i de fleste papirer for å behandle atferdsdata28. Det kan imidlertid være nyttig å revurdere analysen av atferdsparametere ikke på parameter-for-parameter-basis, men som en generell respons per forsøk. For eksempel kan man beregne kovariansen til hver måling som er gjort i et forsøk og rapportere det som en annen måte å måle det samme på: engstelig, utforskende eller selskapelig oppførsel. Det er mange måter å beregne og tolke atferdsdata 28,29. Avhengig av antall forhold, type tester og bildeopptak (2D eller 3D)30,31 kan analysen revurderes fullstendig for å få det beste ut av dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av "Agencia Estatal de Investigación" fra det spanske departementet for vitenskap og innovasjon (prosjekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz ble støttet av et doktorgradsstipend (PRE2018-083513) delfinansiert av den spanske regjeringen og Det europeiske sosialfondet (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 201 sebrafisk nevrotoksisitetstesting videoopptak utforskende aggressiv sosial atferd applikasjoner
Nevrotoksisitetsvurdering hos voksne <em>Danio rerio</em> ved bruk av et batteri av atferdstester i en enkelt tank
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter