Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכת רעילות עצבית אצל מבוגרים Danio rerio באמצעות סוללה של מבחנים התנהגותיים במיכל יחיד

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

כאן, אנו מציגים סוללת בדיקות התנהגותית מקיפה, כולל מיכל חדשני, Shoaling ומבחני העדפה חברתית, כדי לקבוע ביעילות את ההשפעות הנוירוטוקסיות האפשריות של כימיקלים (למשל, מתאמפטמין וגלייפוסט) על דגי זברה בוגרים באמצעות מכל יחיד. שיטה זו רלוונטית לנוירוטוקסיות ולמחקר סביבתי.

Abstract

נוכחותן של השפעות נוירופתולוגיות הוכיחה את עצמה, במשך שנים רבות, כנקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של חומר כימי. עם זאת, ב -50 השנים האחרונות, ההשפעות של כימיקלים על ההתנהגות של מיני מודל נחקרו באופן פעיל. בהדרגה, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום באופן שגרתי כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים מספקות אמצעי סטנדרטי ואמין לחקר מגוון רחב של התנהגויות, כולל חרדה, אינטראקציה חברתית, למידה, זיכרון והתמכרות. בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים כוללות בדרך כלל הצבת הדגים בזירת ניסוי והקלטה וניתוח של התנהגותם באמצעות תוכנת מעקב וידאו. דגים יכולים להיחשף לגירויים שונים, וניתן לכמת את התנהגותם באמצעות מגוון מדדים. מבחן המיכל החדשני הוא אחד המבחנים המקובלים והנפוצים ביותר לחקר התנהגות דמוית חרדה בדגים. מבחני הצליפה וההעדפה החברתית שימושיים בחקר ההתנהגות החברתית של דגי זברה. בדיקה זו מעניינת במיוחד מכיוון שנלמדת התנהגותו של השואל כולו. בדיקות אלה הוכיחו את עצמן כניתנות לשחזור ורגישות למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות, מה שהופך אותן לכלים רבי ערך לחקר המעגלים העצביים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתנהגות. בנוסף, בדיקות אלה יכולות לשמש בסינון סמים כדי לזהות תרכובות שעשויות להיות מודולטורים פוטנציאליים של התנהגות.

בעבודה זו נראה כיצד ליישם כלים התנהגותיים בנוירוטוקסיקולוגיה של דגים, תוך ניתוח ההשפעה של מתאמפטמין, סם פנאי, וגלייפוסט, מזהם סביבתי. התוצאות מדגימות את התרומה המשמעותית של בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים להבנת ההשפעות הנוירוטוקסיקולוגיות של מזהמים סביבתיים ותרופות, בנוסף למתן תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים שעשויים לשנות את התפקוד העצבי.

Introduction

דג הזברה (שם מדעי: Danio rerio) הוא מין של חולייתני מודל פופולרי לאקוטוקסיקולוגיה, גילוי תרופות ומחקרי פרמקולוגיה בטיחותית. עלותו הנמוכה, הכלים הגנטיים המולקולריים המבוססים היטב ושימור תהליכים פיזיולוגיים מרכזיים המעורבים במורפוגנזה ובתחזוקה של מערכת העצבים הופכים את דגי הזברה למודל אידיאלי של בעלי חיים למחקר מדעי המוח, כולל טוקסיקולוגיה נוירו-התנהגותית 1,2. נקודת הקצה העיקרית להערכת הרעילות העצבית של כימיקל הייתה, עד לאחרונה, נוכחות של השפעות נוירופתולוגיות. לאחרונה, עם זאת, נקודות קצה התנהגותיות שולבו בפרוטוקולי סינון נוירוטוקסיקולוגיים, ותוצאות תפקודיות אלה משמשות כיום בדרך כלל כדי לזהות ולקבוע את הרעילות העצבית הפוטנציאלית של כימיקלים 3,4. יתר על כן, נקודות קצה התנהגותיות רלוונטיות מאוד מבחינה אקולוגית, שכן אפילו שינוי התנהגותי קל מאוד בדגים עלול לסכן את הישרדות החיה בתנאים טבעיים5.

אחד המבחנים ההתנהגותיים הנפוצים ביותר במחקר דגי זברה בוגרים הוא מבחן טנק חדשני (NTT), המודד התנהגות דמוית חרדה 6,7. בבדיקה זו, דגים נחשפים לחידוש (דגים ממוקמים במיכל לא מוכר), גירוי מרתיע קל ותגובותיהם ההתנהגותיות נצפות. NTT משמש להערכת פעילות מוטורית בסיסית, גיאוטקסים, קפיאה ותנועות לא יציבות של דגים, בעיקר. 8 לא יציב מאופיין בשינויי כיוון פתאומיים (זיגזג) ובאפיזודות חוזרות ונשנות של תאוצות (הטלת חצים). זוהי תגובת אזעקה והוא נצפה בדרך כלל לפני או אחרי פרקים הקפאה. התנהגות הקפאה מקבילה להפסקה מוחלטת של תנועות הדג (למעט תנועות אופרולריות ועיניות) בעודו בתחתית המיכל, להבדיל מחוסר תנועה הנגרם על ידי טשטוש, הגורם לתנועה היפולוקוציונית, אקינזיה ושקיעה8. הקפאה קשורה בדרך כלל למצב גבוה של מתח וחרדה והיא גם חלק מהתנהגות כנועה. התנהגויות מורכבות הן אינדיקטורים מצוינים למצב החרדה של בעלי חיים. NTT הוכח כרגיש למניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות9, מה שהופך אותו לכלי רב ערך לחקר הבסיס העצבי של חרדה והפרעות נלוות.

דגי זברה הם מין חברתי מאוד, כך שאנו יכולים למדוד מגוון רחב של התנהגויות חברתיות. מבחן השולינג (ST) ומבחן ההעדפה החברתית (SPT) הם המבחנים הנפוצים ביותר להערכת התנהגות חברתית10. ST מודד את הנטייה של דגים להתקבץ יחד11 על ידי כימות ההתנהגות המרחבית שלהם ודפוסי התנועה שלהם. ST שימושי לחקר דינמיקה קבוצתית, מנהיגות, למידה חברתית והבנת ההתנהגות החברתית של מיני דגים רבים12. ה-SPT בדגי זברה בוגרים הותאם מהעדפתו של קרולי למבחן חידוש חברתי עבור עכברים13 והפך במהרה למבחן התנהגותי פופולרי לחקר אינטראקציה חברתית במין מודל זה14. שתי בדיקות אלה הותאמו גם לשימוש בבדיקות סינון סמים והראו הבטחה לזיהוי תרכובות חדשות המווסתות התנהגות חברתית15,16.

באופן כללי, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לספק מידע רב ערך על מנגנוני ההתנהגות או על הנוירופנוטיפים של תרכובות פעילות וסמים שעברו התעללות17. פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם כלים התנהגותיים אלה7 עם משאבים חומריים בסיסיים וכיצד ליישם אותם במבחני רעילות כדי לאפיין את ההשפעות של מגוון רחב של תרכובות נוירואקטיביות. בנוסף, נראה כי ניתן ליישם את אותן בדיקות כדי להעריך את ההשפעות הנוירו-התנהגותיות של חשיפה חריפה לתרכובת נוירואקטיבית (מתאמפטמין), אך גם כדי לאפיין השפעות אלה לאחר חשיפה כרונית לריכוזים סביבתיים של חומר הדברה (גלייפוסט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עמידה קפדנית בסטנדרטים אתיים מבטיחה רווחה וטיפול נאות בדגי הזברה המשמשים לניסויים. כל הליכי הניסוי בוצעו על פי ההנחיות שנקבעו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CID-CSIC). הפרוטוקולים והתוצאות המוצגים להלן בוצעו על פי רישיון שניתן על ידי השלטון המקומי (הסכם מספר 11336).

1. דיור לבעלי חיים לבדיקות התנהגותיות

  1. בצעו את כל הבדיקות (המוצגות באיור 1) בחדר התנהגותי מבודד בטמפרטורה של 27-28 מעלות צלזיוס בין השעות 10:00 ל-17:00.
  2. יש לשטוף הן את דגי הבקרה והן את הדגים החשופים מספר פעמים במי דגים נקיים [מים מטוהרים באוסמוזה הפוכה המכילים 90 מ"ג/ליטר מלח מערכות אקווריום, 0.58 mM CaSO4·2H2O ו-0.59 mM NaHCO3] לפני תחילת הניסויים כדי למנוע זיהום פוטנציאלי של מיכל הניסוי.
  3. התאקלם בעלי חיים לחדר ההתנהגות שעה לפני תחילת הניסויים.
  4. יש לוודא שבעלי החיים (יחס ≈50:50 זכר: נקבה) הם נאיביים מבחינה ניסויית ומבצעים את כל הבדיקות ההתנהגותיות באופן עיוור כאשר משקיפים אינם מודעים לקבוצת הניסוי.
  5. כדי להשיג תוצאות משמעותיות במבחני התנהגות, יש מספר כולל של 18 נבדקים לכל מצב (n = 18), המתקבלים באופן אידיאלי בין שני ניסויים עצמאיים או יותר. לדוגמה, בבדיקות בודדות, לנתח את ההתנהגות של 9 בעלי חיים לכל מצב, לכל לשכפל. בבדיקות קבוצתיות, לנתח את ההתנהגות של שועל של 6 עד 9 בעלי חיים לכל מצב, לכל משוכפל.
  6. בצע את כל הבדיקות בהתאם לגישת בדיקת הסוללה (ראה הצעות תכנון באיור 2). מבחינה אתית מתאימה יותר, שיטה זו מאפשרת להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר, תוך עמידה בעיקרון הפחתת 3R7.
  7. לרוב, בדיקות התנהגותיות קשורות לבדיקות ביולוגיות, לכן יש להקריב את בעלי החיים בהתאם להנחיותהמתת חסד 18 לפני איסוף וניתוח דגימות (OMICs או כימיקלים). אם נקודת הקצה אינה מתגלה כדגימה, ייצב מחדש את קבוצת הביקורת בסוף הניסוי. שימוש חוזר בחיות הביקורת למטרות רבייה או ניסוי לאחר מספר ימים.

Figure 1
איור 1: מערכי ניסוי. שלוש תצורות של המיכל המרובע כדי לחקור מגוון רחב של התנהגויות בדגי זברה בוגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ציר הזמן של הניסוי. שתי הצעות תכנון להקלטת מבחני התנהגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. תצורות ניסיוניות של הטנק

  1. התנהגות דמוית חרדה: מבחן הטנק החדש (NTT)
    1. התאם את מערך הניסוי (מספר המכלים, המצלמות והמחשבים) כדי להקליט את המספר המרבי של דגים בו זמנית. מבחני התנהגות אינדיבידואליים גוזלים זמן, לכן מטב את הזמן, החומר והמרחב.
    2. הכינו את מיכלי הניסוי ל-NTT: מיכל מרובע (20 ס"מ אורך, 20 ס"מ רוחב, 25 ס"מ גובה) מכוסה לוחות אקריליים על קירות רוחביים ותחתית כדי למנוע השתקפות והפרעה בין הנבדקים.
    3. מלא את מיכלי הניסוי עם 7 L (גובה עמודת מים: 20 ס"מ גובה) של מי דגים מחומצנים היטב ב 28 ° C.
    4. התאם את מיקום המיכל מול המצלמה כדי למנוע תמונה מעוותת.
    5. בדוק את הגדרת התאורה. תאורת LED אחורית (10000 לוקס) מספקת תאורה הומוגנית בכל חלקי המיכל להקלטת וידאו בתנאים טובים.
    6. הפעל את המצלמות וכוונן אותן בהתאם לסעיף 3.
    7. הכניסו את הנבדקים, אחד אחד, לתחתית מיכלי הניסוי לפני שתתחילו להקליט מהר ככל האפשר.
      הערה: חשוב להתחיל להקליט עם בעל החיים בתחתית המיכל.
    8. היזהר לא להפריע לבעלי החיים במהלך ההקלטה. שימוש בווילון או פאנל כדי להגביל את האינטראקציה החזותית לא רק בין טנקים אלא גם בין התמיכה לחוץ.
    9. בסוף ההקלטה (זמן ההקלטה הסטנדרטי הוא 6 דקות), מעבירים את החיות שכבר עברו את הניסוי למכל אחר כדי לא לערבב אותן עם החיות התמימות .
    10. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. מומלץ לקבל מספר כולל של 18 נבדקים בכל מצב כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים בודדים (משני עותקים בלתי תלויים או יותר).
    11. חלק באופן אקראי את קבוצת הניסוי שהוקצתה לכל טנק בין ניסויים כדי למנוע השפעות פוטנציאליות של טנק (אם אתה מקליט מספר תנאים בו זמנית).
  2. התנהגות חברתית מקובצת: מבחן השולינג (ST)
    1. תצורת הניסוי של ST זהה לזו של NTT (ניתן לעשות שימוש חוזר באותם טנקים ישירות).
    2. בצע את השלבים 2.1.1-2.1.6. כדי להגדיר את ST.
    3. הציגו את השואל (6 עד 9 נבדקים בו זמנית) בתחתית מיכלי הניסוי לפני שתתחילו להקליט מהר ככל האפשר.
      הערה: חשוב להתחיל להקליט עם בעל החיים בתחתית המיכל.
    4. בצע את השלבים 2.1.8-2.1.11. כדי לבצע את ST.
    5. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. כדי להשיג תוצאות משמעותיות בבדיקה זו, בצע לפחות שני עותקים משוכפלים עצמאיים עם אותו גודל בנק בכל שכפול.
    6. לשמור על גודל השואל עקבי עבור כל קבוצות הניסוי ולשכפל בתוך אותו ניסוי.
  3. התנהגות אישית חברתית: מבחן העדפה חברתית (SPT)
    1. התאם את מערך הניסוי כדי לייעל את מרחב הניסוי ואת זמן ההקלטה.
    2. הכינו את מיכלי הניסוי ל-SPT: מיכל מרובע (20 ס"מ אורך, 20 ס"מ רוחב, 25 ס"מ גובה) שקוף (זכוכית או פלסטיק) כדי להציע ראות רוחבית. דג המוקד הבודד חופשי לקיים אינטראקציה עם אזור וירטואלי ספציפי - שול דג המוצב במיכל הדיור החיצוני החד-צדדי, או עם האזור הווירטואלי הלא ספציפי - מיכל דיור ריק חיצוני חד-צדדי.
    3. מלא את מיכלי הניסוי עם 5 L (גובה עמודת מים: 15 ס"מ, באותו גובה כמו עמוד המים במיכלי הדיור החיצוניים) של מי דגים נקיים ב 28 °C (75 °F).
    4. התאם את מיקום המיכל מול המצלמה כדי למנוע תמונה מעוותת.
    5. בדקו שהמערכת מקבלת תאורה הומוגנית.
    6. הכניסו את הנבדקים, אחד אחד, לתחתית מכלי הניסוי לפני שתתחילו מיד להקליט עם החיה למטה במרכז.
    7. הימנע מאינטראקציות חזותיות בין צופים לבעלי חיים במהלך ההקלטה.
    8. בסוף ההקלטה בת 6 הדקות, העבירו את החיות הנוכחיות לטנק אחר כדי לא לערבב אותן עם החיות התמימות .
    9. חזור על ההליך עם כל הנושאים הזמינים. יש מספר כולל של 18 נבדקים לכל מצב כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים בודדים (משני משכפלים עצמאיים או יותר).

3. הקלטת וידאו למבחנים התנהגותיים

  1. פתח את מנהל המצלמה כדי לבדוק את זמינות מצלמת GigE בכל מחשב.
  2. הפעל את תוכנת השליטה במצלמת GigE (כגון uEye Cockpit, המתוארת כאן). פתח את האפשרות מצלמה , בחר מצב מונוכרום והתאם את גודל התמונה (1:2).
  3. פתח מאפייני מצלמה
    1. תחת מצלמה, הגדר את שעון הפיקסלים למרבי, הגדר את קצב הפריימים ל- 30 פריימים לשנייה (fps) וכוונן את החשיפה (התאמה אוטומטית או ידנית אם התמונה כהה מדי).
    2. תחת תמונה, הגדר את הרווח ל- 0 (אוטומטי) ואת רמות השחור (כוונון אוטומטי או ידני לקבלת חדות טובה).
    3. תחת גודל, התאם את גודל החלון לאזור שיש לחרוט (רוחב: רוחב-שמאל, גובה: גובה-למעלה). שלב זה מאפשר להקטין את גודל התמונה, ולכן, את הגודל הסופי של הסרטון.
    4. סגור את מאפייני המצלמה.
  4. צור תיקייה כללית עבור הפעלת הניסוי כדי לשמור את הגדרות המצלמה ואת סרטוני הווידאו.
  5. כדי לשמור את הגדרות המצלמה, הגדר File > Save Parameters > To File ובחר בתיקיית הניסוי שנוצרה לאחרונה.
    הערה: כך ניתן לטעון מחדש את קובץ הגדרות המצלמה ביישום כדי להמשיך לעבוד עם אותם פרמטרים של תמונה בכל עת (לדוגמה, כאשר המצלמה כבויה לפתע או לעשות שימוש חוזר באותן הגדרות, מה שמקצר את זמן ההתקנה ויוצר הומוגניות בתנאי הניסוי). אם, ברגע אחד, המצלמה קופאת בין סרטונים, הפסק להקליט, צא וכבה את המצלמה. הפעל אותו שוב, טען מחדש את פרמטרי המצלמה על ידי מעבר אל פרמטרים של טעינת קבצים > > לקובץ והפעל מחדש את ההקלטה. בדוק אם הסרטון הנוכחי נרכש לחלוטין כדי להשליך או לחזור על הדג (לפני החזרה, תן לבעלי החיים קצת זמן להתאקלם מחדש).
  6. חזור על הליך הגדרת מצלמה זה (שלבים 3.1-3.5) בכל המצלמות.
  7. כאשר כל המצלמות מוגדרות כראוי, פתח את הקלט רצף וידאו.
  8. בחר צור כדי לשמור כקובץ וידאו חדש, בחר את תיקיית הניסוי שנוצרה לאחרונה ודווח בשם קובץ הווידאו על פרטי הנושא, סוג הניסוי והתאריך.
  9. בחר Max. Frames. הקלד 10800 בתיבת המסגרות. וידאו סטנדרטי מקליט 6 דקות (וידאו 1) ב 30 fps בפורמט AVI; לכן, 6 דקות x 60 s x 30 fps = 10800 מסגרות בסך הכל.
  10. בחר Calc. קצב פריימים או ציין את קצב המסגרות באופן ידני (מהירות הקלטה: 30 fps).
  11. חזור על הליך יצירת קובץ הווידאו בכל המחשבים.
  12. הציגו את הנבדקים, אחד אחד, בתחתית כל טנק ניסוי. כל הבדיקות יופעלו בבת אחת.
  13. התחל את הרשומות במהירות על ידי לחיצה על הקלט והמתן לקבלת המספר המרבי של המסגרות המבוקשות (שלב 3.10).
  14. לאחר הקלטת הסרטונים, מופיעה תיבת צ'אט עם ההודעה מספר מרבי של פריימים שהושגו!. בחר קבל.
  15. בחר סגור כדי לסיים את ההקלטה ולסגור את קובץ הווידאו.
  16. הסר את הדגים שנצפו זה עתה. היזהרו להפריד אותם מהדגים התמימים.
  17. בחר ישירות צור וחזור על התהליך כדי להמשיך להקליט סרטונים.
  18. לאחר סיום כל ההקלטות, בחר יציאה.
  19. כדי לכבות את המצלמות, בחר סגור מצלמה וצא מהתוכנית.

4. ניתוח סרטונים מוקלטים

  1. הפעל את תוכנת הניתוח (ראה טבלת חומרים).
  2. כדי לפרט על תבנית חדשה, לחץ על חדש מתבנית > החלת תבנית מוגדרת מראש > מקובץ וידאו, ובחר סרטון כדי להתחיל בהגדרת התבנית. נסו לבחור סרטון מייצג של הניסוי עם נבדק המציג ניידות טובה ותנאי הקלטה טובים.
  3. ב פרמטרים, הגדר את הפרמטרים בחלונות הבאים (1 עד 4/7). בחר את המודל דגים > דגי זברה בוגרים, את הזירה Open Field Square > One Arena, את מספר הנושא לכל זירה (עבור ST, נדרשת חבילת מעקב מרובת [עקוב אחר נושאים שונים בזירה אחת]), את סוג הזיהוי לפי נקודת מרכז ולבסוף התאם את קצב הפריימים ל- 30 fps. בחלונות הבאים (5 עד 7/7), אל תשנה פרמטרים; תצורת ברירת המחדל היא בסדר.
  4. תן שם לניסוי כתבנית ומקם אותו באותה תיקייה כמו שאר הווידאו המאוחסן. התבנית תיווצר כתיקיית ניסוי עם מספר חלוקות משנה המכילות את כל מידע ההתקנה.
  5. תחת הגדרות ניסוי, בדוק את ההגדרה שהוגדרה (מקובץ וידאו, זירה, מספר נושאים, מסגרת לשנייה). כאן, יחידות המערכת ניתן לשנות.
  6. תחת הגדרות ארנה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מרכז המסך ובחר תפוס. מתוך קובץ בתצוגה. בחר תמונת וידאו באיכות טובה וקבל כדי לצלם תמונה זו עבור הגדרות הרקע. תחילה, כייל את התמונה וצור כלל מכויל. השתמש ברוחב הטנק כקנה מידה (19 ס"מ). לאחר מכן, ציירו את הזירה. היזהר לעשות את הריבוע בדיוק מספיק כדי למנוע השתקפויות של החיה כאשר האחרון מתקרב לפני השטח או כל בלבול בסופו של דבר של תוכנת הדג עם האזורים השחורים של המיכל. לבסוף, צייר את אזורי הצורה באמצעות הפונקציה מסגרת .
    1. עבור NTT ו-ST, חלקו את חזית המיכל לשני אזורים וירטואליים שווים, עליון ותחתון (ראו איור 1). צייר שתי תיבות אופקיות שוות. קופסאות מכסות חצי זירה לכל אחת. תן שם לעליון ולחלק התחתון עבור האזורים העליונים והתחתונים, בהתאמה. יש להקפיד שהתיבות יהיו באותו רוחב (9-10 ס"מ) ואורך (8-9 ס"מ), לא לחרוג מגבולות הזירה (ריבוע כתום), ולא לחפוף, לבדוק שכל אזור חץ מציין בדיוק את האזורים שלו.
    2. עבור SPT, חלקו את זירת הניסוי באופן מושגי לשלושה אזורים שווים בגודלם: ריק, מרכז וספציפי (ראו איור 1). צייר שלוש תיבות אנכיות שוות. תן שם לתיבה המכוונת למיכל השואל כ - Conspecific, התיבה המכוונת למיכל הריק כ - Empty, והאמצעית כ - Center. יש להקפיד שהקופסאות יהיו באותו רוחב (6 ס"מ) ואורך (18-19 ס"מ), לא יחרגו ממגבלות הזירה ולא יחפפו.
  7. תחת הגדרות זיהוי, ודא באיזה וידאו לטפל בקובץ הווידאו. לאחר מכן, בדוק את איכות הזיהוי (דגים בצהוב, נקודת מרכז אדומה). לחץ על זיהוי אוטומטי כדי להתאים את הזיהוי, מיקוד מחדש של החיה (בחר תמונה שהחיה שוחה בפרופיל על הרקע הלבן, צייר את התמונה על ידי צילום כל גופו, ואמת את הזיהוי עם כן). פתח את 'מתקדם' כדי לשפר את הזיהוי על-ידי בחירה באפשרות חיסור דינמי, נושא כהה יותר, הגדרות רקע, למידת רקע, גודל נושא, הפחתת רעשים וכו'.
  8. תחת הגדרות גירסאות ניסיון, העבר גירסת ניסיון אחת ומחק את האחרות (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ומחק)
  9. תחת הגדרות נתונים, צור חלונות דו-שיח של תוצאות . פרמטר תוצאות לכל זמן ולכל אזור. לדוגמה, צור חלון תוצאות אחד לפלט נתונים לפי דקות וחלון אחר לפלט נתונים לפי זמן כולל (6 דקות). בקש את פלט הנתונים עבור כל אזור (בקש אותו אם יש צורך במרחק בכל אזור). קשר את חלונות התוצאות השונים לחלון התחל באמצעות חצים.
  10. תחת נתח הגדרות, בחר את הפרמטרים לניתוח ואת סוג הנתונים הסטטיסטיים עבור כל פרמטר. פרמטרים אלה יחושבו באופן אוטומטי בהתבסס על הנתונים המתקבלים מהמעקב.
    1. עבור NTT ו- SPT, בחר אפשרויות כמוגדר להלן:
      1. בחר מרחק שהועבר (בחר סה"כ) כדי להשיג את המרחק שעבר בזירה (cm) ואת המרחק שעבר באזורים המתאימים (cm).
      2. בחר In Zones (בחר אזורים, תדירות, מצטבר והשהיה לראשון) כדי לקבל את הזמן המושקע באזורים (ים) ואת ההשהיה לכניסה הראשונה באזורים (ים).
      3. בחר מעבר אזור (בחר סף: 0 ס"מ, הוסף אזור 1 > אזור 2; אזור 2 > אזור 1, בכל אזור, תדירות) כדי לקבל את מספר הכניסות באזורים.
      4. בחר Mobility Sate (מלא נייד גבוה מעל 70%, Immobile מתחת ל- 3%, לפחות 150 מסגרות ובחר תדירות, מצטבר והשהיה לראשון) כדי לקבל את משך הניידות הגבוהה, משך ההקפאה (ים).
        הערה: עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים אודות קירוב התנהגות הקפאה באמצעות הניתוח האוטומטי והמספר ומשך הזמן של אפיזודות הקפאה.
      5. בחר תאוצה וזווית סיבוב (בחר תדר וצבירה) כדי להעריך את התרחשותן של התנהגויות מורכבות כגון הטלת חצים ואי יציבות (תנועות תאוצה מהירות).
    2. עבור ST, בנוסף לפרמטרים הגישוש לעיל, בחר באפשרות מרחק בין נושאים (בחר את כל הנושאים, ממוצע, מקסימום, מינימום) כדי לקבל את המרחק הממוצע בין דגים (cm), המרחק הממוצע בין השכן הקרוב ביותר (cm), ואת המרחק הממוצע בין השכן הרחוק ביותר.
  11. התבנית מוכנה לשימושה. שמור את השינויים האחרונים וסגור את התבנית מבלי לרכוש נתונים מהסרטון (שמור על קובץ התבנית; הוא קל וקל לניהול ולהעתקה). אם קיימים מספר רשיונות תוכנה, נתח את סרטוני הווידאו מאותה תבנית שהועתקה לכל מחשב.
  12. כדי להעתיק את התבנית ולהשתמש בה, קיימות שתי אפשרויות:
    1. פתח את קובץ התבנית באמצעות תוכנת ניתוח ההתנהגות, עבור אל File > Save as כדי ליצור קובץ זהה חדש.
    2. בממשק הפתיחה, בחר חדש מתבנית > החלת תבנית מותאמת אישית > מקובץ וידאו (בחר תבנית. קובץ EthXV). תן שם לניסוי החדש ובחר את מיקומו. התוכנה עשויה להימשך מספר דקות כדי להעתיק את המידע מקובץ התבנית.
  13. עבור אל הגדרות זירה כדי להתאים מחדש את התבנית אם הסרטון הוקלט במצלמה אחרת (בצע את שלבים 4.6 ו- 4.7).
  14. עבור אל הגדרות זיהוי או רכישה כדי לבדוק איזה סרטון נבחר ושנה את קובץ הווידאו במידת הצורך.
  15. תחת רכישה, בחר DDS > מוכן להתחיל. ייתכן שיחלפו מספר דקות עד שהתוכנה תעבד את הסרטון.
  16. בסיום הרכישה, עבור אל עורך המסלולים. בחר תאוצה x16 כדי לקרוא את הסרטון המעובד מהר יותר ולבדוק אם המעקב נכון.
    הערה: לפעמים, ייתכנו "הפסדים" במעקב (עקב השתקפויות או בלבול של התוכנה עצמה). ניתן לערוך אותם ידנית מחלק זה אם הם מעטים; אחרת, עדיף לעבד מחדש את כל הניסוי, לשפר את ההגדרה של הבד ואת האיתור.
  17. תחת סטטיסטיקה, לחץ על חשב > ייצוא נתונים. ייצוא הנתונים ממוקם ישירות בתיקיית הניסוי.
  18. תחת מעקב אחר פריטים חזותיים או מפות חום, צור וייצא (לחיצה ימנית, ייצוא תמונה, בחר את התיקיה ייצוא קבצים של הניסוי כדי לשמור נתונים אלה עם דוח הגיליון האלקטרוני) מעקב אחר תמונות של החיה.
  19. עבור אל קובץ כדי לסגור את הניסוי הפעיל וחזור על הליך זה עבור הווידאו הבא.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח את הנורמליות (מבחן שפירא-וילק) של נתונים בכל קבוצה.
  2. להעריך הומוסדסטיות עם הבדיקה של לוין.
  3. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני ואחריו במבחני ההשוואה המרובים של דנט וטוקי כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות כאשר לא ניתן לדחות קריטריונים של נורמליות והומוסדסטיות.
  4. השתמש במבחן קרוסקל-וואליס ואחריו השוואה זוגית באמצעות תיקון בונפרוני כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות כאשר קריטריונים של נורמליות והומוסדסטיות נדחים.
  5. התווה את הנתונים באמצעות תוכנה גרפית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בחלק זה, נבחן כמה יישומים אפשריים של כלים התנהגותיים אלה בנוירוטוקסיקולוגיה של דגים. התוצאות הבאות תואמות את אפיון ההשפעות החריפות או הבולמוסיות של מתאמפטמין (METH), סם פנאי, ואת ההשפעות התת-כרוניות של גלייפוסט, אחד מקוטלי העשבים העיקריים הנמצאים במערכות אקולוגיות ימיות.

אפיון מודל רעילות עצבית מוגזמת מתאמפטמין בדגי זברה בוגרים
בעת הערכת ההשפעה של 40 מ"ג/ליטר METH על NTT (איור 3), מבחן קרוסקל-וואליס אישר כי החיות שנחשפו הציגו גיאוטקסיות חיובית, המאופיינת בירידה בזמן החיפוש באזור העליון של מכל הניסוי (H(2) = 35.964, P = 1.55 x 10-8), כמו גם במרחק שעבר בחלק זה (H(2) = 32.272, P = 9.82 x 10-8), ובמספר הביקורים (H(2) = 36.527, P = 1.17 x 10-8). ראינו גם עלייה משמעותית בזמן ההשהיה שקדם לביקור הראשון באזור העליון (H(2) = 17.264, P = 0.00018). חשוב לציין כי ההבדלים שנצפו בפרמטרים שנמדדו ב- NTT לאחר חשיפה ל- METH עקביים לאורך זמן, כפי שאושר על ידי תיקון Bonferroni (P > 0.8). נמצאה השפעה מובהקת של זמן החשיפה להתנהגות הקפאה (H(2) = 13.120, P = 0.0014).

Figure 3
איור 3: התנהגות דמוית חרדה שהוערכה במבחן טנק חדשני סטנדרטי (NTT) בן 6 דקות של דגי זברה בוגרים שנחשפו למתאמפטמין (METH) במינון 40 מ"ג/ליטר במשך 3 שעות ו-48 שעות. הנתונים מכל ניסוי נורמלו לערכי הבקרה המתאימים. הנתונים המשולבים מדווחים כתרשים פיזור עם החציון (n = 14-15), **p < 0.01, ***p < 0.001; מבחן Kruskal Wallis עם תיקון Bonferroni עבור נקודות קצה NTT. נתונים משני ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שוחזר באישור Bedrossiantz et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן לכמת תנועות הקפאה על ידי הערכת התדירות, ההשהיה, משך הזמן או המיקום של ההקפאה. הדרך הטובה ביותר להבקיע אותם היא ללא ספק עינו של צופה מנוסה, שהיא די מייגעת ומורכבת, ולכן ניסינו חלופה אוטומטית באמצעות תוכנת EthoVision לזיהוי התנהגות קפיאה19. מצאנו שהמספר, ההשהיה ומשך הזמן של התקפות הקפאה שחושבו על-ידי התוכנה (טבלה 1A) תואמות בדיוק טוב את האפיזודות שנקלעו ידנית על-ידי הצופה (טבלה 1B). בעוד ששתי השיטות שקולות מבחינת התוצאות (P = 0.958, מבחן התלמיד), השתמשנו בגישה האוטומטית כדי להעריך את הקיפאון כאן. לאחר 3 שעות של חשיפה למת', זמן ההקפאה גדל באופן משמעותי (P = 0.0012), בעוד שלא נמצא הבדל עם קבוצת הביקורת לאחר 48 שעות של חשיפה (P = 0.16). METH לא השפיע על תנועות לא יציבות בשני הזמנים.

השתמשנו בשתי פרדיגמות ניסיוניות כדי להעריך את ההשפעות על התנהגות חברתית לאחר חשיפה חריפה למת'. ST (איור 4) גילה שהמרחק הממוצע והמרחק הגדול ביותר בין פרטים היו גדולים משמעותית עבור דגים שטופלו ב-METH (H(2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 עבור מרחקים ממוצעים ורחוקים ביותר בין דגים, בהתאמה), מה שמצביע על פנוטיפ התנהגותי של בידוד חברתי. שוב, נעיר כי לא נמצאה השפעת זמן באמצעות מבחן Bonferroni post hoc (P > 0.5).

Figure 4
איור 4: התנהגות חברתית של דגי זברה בוגרים הנישאים במים ונחשפו למתאמפטמין (METH) במינון 40 מ"ג/ליטר במשך 3 שעות ו-48 שעות. תוצאות בדיקת Shoaling (ST), כולל המרחקים הממוצעים והרחוקים ביותר בין דגים. הנתונים המשולבים מדווחים כתרשים פיזור עם החציון (n = 18), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; מבחן Kruskal Wallis עם תיקון Bonferroni. נתונים משני ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שוחזר באישור Bedrossiantz et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ב-SPT (איור 5), דגים שטופלו מראים ירידה משמעותית בזמן השהייה והמרחק שנסעו באזור הספציפי (F(2,74) = 14.497, P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13.461, P = 0.00001 עבור זמן השהייה והמרחק שנסע באזור הספציפי, בהתאמה). תוצאות אלה מאששות מחדש את פנוטיפ הבידוד החברתי המוצע על ידי תוצאות TS. בדיקת Tukey's Honest Significant Difference (HSD) לאחר הוק שללה שאין הבדלים אפשריים בין שני זמני הניתוח (P > 0.5).

Figure 5
איור 5: התנהגות חברתית של דגי זברה בוגרים הנישאים במים ונחשפו למתאמפטמין (METH) במינון 40 מ"ג/ליטר במשך 3 שעות ו-48 שעות. תוצאות מבחן ההעדפה החברתית (SPT), כולל הזמן והמרחק של הדגים בכל אחד משלושת האזורים הווירטואליים של מכל הניסוי: ריק, מרכז וספציפי. הנתונים מכל ניסוי נורמלו לערכי הבקרה המתאימים. הנתונים המשולבים מדווחים כתרשים פיזור עם החציון (n = 17-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ANOVA חד כיווני עם מבחן ההשוואה המרובה של דנט. נתונים משני ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שוחזר באישור Bedrossiantz et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השפעה התנהגותית של חשיפה תת-כרונית לרמות סביבתיות של גלייפוסט
ניתוח התנהגותי של ההשפעות של חשיפה תת-כרונית לגלייפוסט 3 מיקרוגרם/ליטר על NTT (איור 6) מגלה ירידה משמעותית בזמן שהוקדש לחקר הפסגה (F2,77 = 8.744, P = 0.0004), מרחק הנסיעה בחלק זה (F2,77 = 9.118, P = 0.0003) ומספר הביקורים (F2,77 = 3.441, P = 0.037). השפעות אלה אופייניות להתנהגות גיאוטקסית חיובית, כמו גם ההשפעה המוגברת שנצפתה על זמן החביון שקדם לביקור הראשון בראש המיכל (H(2) = 9.628, P = 0.008). ביטוי התנהגויות לא יציבות וקופאות של בעלי החיים החשופים נותח גם ב-NTT. משך הזמן (H(2) = 17.261, P = 0.025) ומספר הפרקים הבלתי יציבים (F2,76 = 10.073, P = 0.0001) הוגדלו באופן משמעותי על ידי גלייפוסט. לעומת זאת, לא נמצאו הבדלי הקפאה עם הבקרה (Pearson Chi-Square(2) = 2.964, P = 0.253). התצפיות שנעשו ב-NTT מצביעות על כך שגלייפוסט יכול להפחית באופן משמעותי את התנהגות הגישוש של דגים, ולסכן את יכולתם לשרוד בטבע.

Figure 6
איור 6: התנהגות דמוית חרדה שהוערכה במבחן טנק חדשני סטנדרטי בן 6 דקות (NTT) של דגי זברה בוגרים שנחשפו לגלייפוסט של 0.3 מיקרוגרם/ליטר ו-3 מק"ג/ליטר במשך שבועיים. פרמטרים התנהגותיים נותחו, כמו גם קריקטורה של טנק הניסוי מחולק לשני אזורים וירטואליים שווים, העליון והתחתון. הנתונים שדווחו כתרשים פיזור עם החציון (n = 23-29), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ANOVA חד-כיווני עם מבחן השוואה מרובה של Dunnett (מרחק כולל, מרחק למעלה, זמן למעלה, מעברים למעלה, התקפים לא יציבים, תדירות ניידות גבוהה) או מבחן Kruskal Wallis עם תיקון Bonferroni (חביון לפסגה, משך לא יציב). לא נמצאו הבדלים (P > 0.05) במשך ההקפאה ובהתקפי ההקפאה. נתונים מ 2-4 ניסויים עצמאיים. נתון זה שוחזר באישור Faria et al.20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חינוך, קבוצות לא מקוטבות של פרטים המוחזקים יחד על ידי לחץ חברתי כדי להגן על עצמם מפני טורפים, היא נטייה טבעית של Danio rerio. בית הספר יכול "להתהדק" או "להתרחב" כתלות ברמת החרדה או הפחד של החיות, אפקט חזותי מסוים שקל מאוד לזהות בניסוי (איור 7). בניסוי הגלייפוסט, מבחן השולינג גילה עלייה בחרדה בדגים שנחשפו ל-3 מיקרוגרם/ליטר, המתבטאת בקיבוץ השואל ובכך ירידה משמעותית במרחק הממוצע והמרחק הגדול ביותר בין פרטים (F2,56 = 5.664, P = 0.006 ו-F2,56 = 7.413, P = 0.001, עבור המרחקים הממוצעים והרחוקים ביותר בין דגים, בהתאמה) בהשוואה לבקרה.

Figure 7
איור 7: התנהגות חברתית של דגי זברה בוגרים הנישאים במים ונחשפו לגלייפוסט של 0.3 מיקרוגרם/ליטר ו-3 מק"ג/ליטר במשך שבועיים. הנתונים שדווחו כתרשים פיזור עם החציון (n = 19-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואה המרובה של דנט (מרחק בין-דגים ממוצע ומרחק רחוק ביותר) נתונים מ-2 עד 4 ניסויים עצמאיים. נתון זה שוחזר באישור Faria et al.20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: קירוב של התנהגות הקפאה באמצעות ניתוח אוטומטי. הנתונים המדווחים בטבלה זו מגיעים מאותה הקלטה (וידאו 1) שנותחה בשתי שיטות שונות. (A) קירוב של התנהגות הקפאה על ידי חישוב אוטומטי עם תוכנת EthoVision V13. הניידות המשתנה מחושבת משינוי אזור הנושא בין שתי דגימות, ולכן היא תלויה בתדירות הרכישה של אזור זה. קבענו סף נמוך מאוד של חוסר תנועה (פחות מ -3% ניידות) וכן את קצב הדגימה לזמן רציף מינימלי של 5 שניות (יותר מ -150 פריימים). (B) ניתוח התנהגות הקפאה באמצעות תוכנה אינטראקטיבית למחקר תצפית התנהגותית (BORIS, תוכנה חופשית וקוד פתוח). BORIS היא תוכנה לרישום אירועים לקידוד וידאו ותצפיות חיות. עם BORIS, הצופה יכול לקודד את פרק ההקפאה כאירוע מצב, ולהגדיר את נקודות ההתחלה והסיום. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

סרטון 1: דגי בקרה במבחן המיכל החדש. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התנהגויות חרדה אופייניות שנצפו ב- NTT נמצאו בקורלציה חיובית עם רמות סרוטונין שנותחו במוח21. לדוגמה, לאחר חשיפה לפארא-כלורופנילאלנין (PCPA), מעכב של ביוסינתזה של 5-HT, דגים הציגו גיאוטקסיס חיובי כמו גם ירידה ברמות 5-HT במוח22, תוצאות דומות מאוד לאלה שהתקבלו עם METH. לכן, הירידה ברמות הסרוטונין במוח והצגת גיאוטקסיס חיובי בדגי זברה שנחשפו למת' מצביעים על כך שהתנהגות החרדה המיוצרת על ידי התרופה מתווכת על ידי המסלול הסרוטונרגי. באופן מעניין, פנוטיפ התנהגותי דומה, כלומר השפעה נוגדת חרדה על גיאוטקסים, ניתן לראות בדגי זברה בוגרים שנחשפו במשך שבועיים ל-0.3 3 מיקרוגרם/ליטר ו-3 מק"ג/ליטר, שני ריכוזים רלוונטיים לסביבה של גלייפוסט. עלייה בגיאוטקסיס דווחה בעבר גם עבור דגי זברה בוגרים עם אקרילאמיד נוירוטוקסיקנט 6,23. בכל המקרים הללו, פנוטיפ התנהגותי זה (עלייה של geotaxis ב NTT, אופייני של חומר חרדה) היה קשור עם הפחתת רמות נוירוטרנסמיטר monoaminergic. לכן, פרדיגמת NTT בשילוב עם ניתוח נוירוכימי של המוח מספקת מידע רלוונטי מבחינה אקולוגית, התנהגות גישושית ויעילות ליקוט מזון ומחברת נוירופנוטיפים התנהגותיים עם מודולציות נוירוטרנסמיטרים.

מצד שני, ליקוי בהתנהגויות חברתיות בשתי הבדיקות, ST ו-SPT, נצפה גם בדגים שטופלו ב-METH. התוצאה המתקבלת במחקר זה עולה בקנה אחד עם מספר מחקרים עם חולדות וקופים, שבהם החשיפה החריפה והכרונית של חיות המחקר ל- METH גורמת לנסיגה חברתית24. שינויים בהתנהגות חברתית הקשורים לשימוש לרעה ב- METH הוסברו בבני אדם על ידי ליקויים בתפקוד החברתי-קוגניטיבי24. השפעה חרדתית על גודל השואל נמצאה בדגי זברה שנחשפו במשך שבועיים לגלייפוסט של 3 מיקרוגרם/ליטר. ראינו פנוסקופיה של השפעה זו בדגי זברה שנחשפו לאקרילאמיד 53 מ"ג/ליטר (0.75 מילימול) במשך 3 ימים 6,23.

מבחני NTT, ST ו-SPT מאפשרים לקבוע ביעילות את ההשפעות הנוירוטוקסיות הפוטנציאליות25 מתוך מגוון רחב של כימיקלים, כפי שמודגם במחקר של מטאמפטמין חריף ומודלים של רעילות גלייפוסט תת-כרונית בדגי זברה בוגרים. התנהגות היא, בטוקסיקולוגיה, נקודת קצה אפיקלית רלוונטית, המאפיינת את ההשפעות ברמות האורגניזם של כימיקל על רעילות עצבית ומחקר סביבתי. מלבד היותם נקודת קצה תת-קטלנית בתנאי מעבדה, שינויים בהתנהגויות, כגון גישוש או התנהגות חברתית, יכולים להיות מזיקים בטבע. יתר על כן, מקבץ ניתוח ההתנהגות המוצע הוא קל ליישום, אוטומטי למחצהשיטה 11 , ולכן יעיל מאוד אם הבדיקות מתוכננות במודע (עקרון ההפחתה)26. ביצוע בדיקות אלה כסוללת ניסוי באמצעות מכל יחיד מפחית את מספר בעלי החיים ואת זמן הניסוי ואת יצירת הפסולת.

סדר הבדיקות בסוללה הוא שיקול חשוב אם ברצוננו ללמוד את פרופיל התגובה של אדם בכל ניסוי. לשם כך, ביצוע הבדיקות האינדיבידואליות (ראו איור 2) מאפשר לשמור על החיה מזוהה ולקשר את התנהגותה החקרנית להעדפתה החברתית. נוסף על כך, התגובות ההתנהגותיות של החיה יכולות להיות קשורות לנתונים ביולוגיים אחרים, כמו למשל פרופיל המוליכים העצביים או ביטוי הגנים שלה, אם הדגים נשמרים מזוהים עד לנקודת הסיום של הדגימה (איור 2A).

בדרך כלל, ניתוח התנהגותי מאפשר התבוננות בהבדלים בין קבוצות. ראשית, תגובות פרטניות מחושבות על בסיס מעקב אחר בעלי חיים27 לפני איגום הנתונים לפי קבוצות. לאחר מכן, האמצעים וההבדל בשונות ביחס לקבוצת הביקורת מושווים עבור כל פרמטר התנהגותי מחושב. בניתוח12, קריטי להיות ברור מאוד שיחידת השונות היא קבוצת דגי הבדיקה, ולא דגים בודדים, מכיוון שהתנהגותו של כל דג בודד מושפעת מהדגים האחרים בשואל. זוהי הדרך המשמשת ברוב המאמרים לעיבוד נתונים התנהגותיים28. עם זאת, כדאי לחשוב מחדש על ניתוח פרמטרים התנהגותיים לא על בסיס פרמטר אחר פרמטר אלא כתגובה כוללת לכל ניסוי. לדוגמה, אפשר לחשב את השונות המשותפת של כל מדידה שנעשתה בניסוי ולדווח עליה כדרך אחרת למדוד את אותו הדבר: התנהגות חרדתית, חקרנית או חברותית. ישנן דרכים רבות לחשב ולפרש נתונים התנהגותיים 28,29. בהתאם למספר התנאים, סוג הבדיקות ורכישת התמונה (דו-ממדית או תלת-ממדית)30,31 ניתן לחשוב מחדש לחלוטין על הניתוח על מנת להפיק את המיטב מהנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי "Agencia Estatal de Investigación" ממשרד המדע והחדשנות הספרדי (פרויקט PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa מרכז מצוינות (CEX2018-000794-S). ז'ולייט בדרוסיאנץ נתמכה על ידי מענק דוקטורט (PRE2018-083513) במימון משותף של ממשלת ספרד והקרן החברתית האירופית (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 201 דגי זברה בדיקת רעילות עצבית הקלטת וידאו גישוש אגרסיביות התנהגויות חברתיות יישומים
הערכת רעילות עצבית אצל מבוגרים <em>Danio rerio</em> באמצעות סוללה של מבחנים התנהגותיים במיכל יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter