Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Neurotoksicitetsvurdering hos voksne Danio rerio ved hjælp af et batteri af adfærdstest i en enkelt tank

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65869
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

Summary

Her præsenterer vi et omfattende adfærdstestbatteri, herunder den nye tank, Shoaling og sociale præferencetest, for effektivt at bestemme de potentielle neurotoksiske virkninger af kemikalier (f.eks. Methamfetamin og glyphosat) på voksne zebrafisk ved hjælp af en enkelt tank. Denne metode er relevant for neurotoksicitet og miljøforskning.

Abstract

Tilstedeværelsen af neuropatologiske virkninger viste sig i mange år at være det vigtigste endepunkt for vurdering af et kemisk stofs neurotoksicitet. Men i de sidste 50 år er virkningerne af kemikalier på modelarternes adfærd blevet aktivt undersøgt. Gradvist blev adfærdsmæssige endepunkter indarbejdet i neurotoksikologiske screeningsprotokoller, og disse funktionelle resultater bruges nu rutinemæssigt til at identificere og bestemme kemikaliers potentielle neurotoksicitet. Adfærdsmæssige analyser hos voksne zebrafisk giver et standardiseret og pålideligt middel til at studere en bred vifte af adfærd, herunder angst, social interaktion, læring, hukommelse og afhængighed. Adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk involverer typisk at placere fisken i en eksperimentel arena og registrere og analysere deres adfærd ved hjælp af videosporingssoftware. Fisk kan udsættes for forskellige stimuli, og deres adfærd kan kvantificeres ved hjælp af en række forskellige målinger. Den nye tanktest er en af de mest accepterede og udbredte tests til at studere angstlignende adfærd hos fisk. Shoaling og social præference test er nyttige til at studere zebrafiskens sociale adfærd. Denne analyse er særlig interessant, da hele stimens opførsel studeres. Disse analyser har vist sig at være meget reproducerbare og følsomme over for farmakologiske og genetiske manipulationer, hvilket gør dem til værdifulde værktøjer til at studere de neurale kredsløb og molekylære mekanismer, der ligger til grund for adfærd. Derudover kan disse assays anvendes i lægemiddelscreening til at identificere forbindelser, der kan være potentielle modulatorer af adfærd.

Vi vil i dette arbejde vise, hvordan man anvender adfærdsmæssige værktøjer i fiskeneurotoksikologi, analyserer effekten af metamfetamin, et rekreativt stof og glyphosat, et miljøforurenende stof. Resultaterne viser det signifikante bidrag fra adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk til forståelsen af de neurotoksikologiske virkninger af miljøforurenende stoffer og lægemidler, ud over at give indsigt i de molekylære mekanismer, der kan ændre neuronal funktion.

Introduction

Zebrafisken (Danio rerio) er en populær model hvirveldyrarter til økotoksikologi, lægemiddelopdagelse og sikkerhedsfarmakologiske undersøgelser. Dens lave omkostninger, veletablerede molekylære genetiske værktøjer og bevarelse af vigtige fysiologiske processer involveret i morfogenese og vedligeholdelse af nervesystemet gør zebrafisk til en ideel dyremodel til neurovidenskabelig forskning, herunder neuroadfærdsmæssig toksikologi 1,2. Det vigtigste endepunkt for evaluering af neurotoksiciteten af et kemikalie var indtil for nylig tilstedeværelsen af neuropatologiske virkninger. På det seneste er adfærdsmæssige endepunkter imidlertid blevet indarbejdet i neurotoksikologiske screeningsprotokoller, og disse funktionelle resultater bruges nu almindeligvis til at identificere og bestemme den potentielle neurotoksicitet af kemikalier 3,4. Desuden er adfærdsmæssige endepunkter yderst relevante fra et økologisk synspunkt, da selv en meget mild adfærdsændring hos fisk kan bringe dyrets overlevelse under naturlige forholdi fare 5.

Et af de mest anvendte adfærdsanalyser i voksen zebrafiskforskning er novel tank test (NTT), som måler angstlignende adfærd 6,7. I dette assay udsættes fisk for nyhed (fisk placeres i en ukendt tank), en mild aversiv stimulus og deres adfærdsmæssige reaktioner observeres. NTT bruges til at vurdere basal lokomotorisk aktivitet, geotaxis, frysning og uregelmæssige bevægelser af fisk, hovedsageligt. Uregelmæssig8 er kendetegnet ved pludselige retningsændringer (zigzagging) og gentagne episoder af accelerationer (darting). Det er en alarmreaktion og observeres normalt før eller efter fryseepisoder. Fryseadfærd svarer til en fuldstændig ophør af fiskens bevægelser (undtagen operkulære og okulære bevægelser), mens den er på bunden af tanken, til forskel fra immobilitet forårsaget af sedation, hvilket forårsager hypolokomotion, akinesi og synkende8. Frysning er normalt relateret til en høj tilstand af stress og angst og er også en del af underdanig adfærd. Kompleks adfærd er fremragende indikatorer for tilstanden af angst hos dyr. NTT har vist sig at være følsom over for farmakologisk og genetisk manipulation9, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til at studere det neurale grundlag for angst og relaterede lidelser.

Zebrafisk er en meget social art, så vi kan måle en bred vifte af social adfærd. Shoaling test (ST) og social præference test (SPT) er de mest anvendte assays til vurdering af social adfærd10. ST måler fiskens tendens til at gruppere11 ved at kvantificere deres rumlige adfærd og bevægelsesmønstre. ST er nyttig til at studere gruppedynamik, lederskab, social læring og forståelse af mange fiskearters sociale adfærd12. SPT i voksne zebrafisk blev tilpasset fra Crawleys præference for social nyhedstest for mus13 og blev hurtigt et populært adfærdsassay til undersøgelse af social interaktion i denne modelart14. Disse to tests er også blevet tilpasset til brug i lægemiddelscreeningsanalyser og har vist løfte om at identificere nye forbindelser, der modulerer social adfærd15,16.

Generelt er adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk kraftfulde værktøjer, der kan give værdifuld information om adfærdsmekanismerne eller neurofænotyperne af aktive forbindelser og misbrugte stoffer17. Denne protokol beskriver, hvordan man implementerer disse adfærdsmæssige værktøjer7 med grundlæggende materielle ressourcer, og hvordan man anvender dem i toksicitetsanalyser for at karakterisere virkningerne af en bred vifte af neuroaktive forbindelser. Derudover vil vi se, at de samme tests kan anvendes til at vurdere de neuroadfærdsmæssige virkninger af akut eksponering for en neuroaktiv forbindelse (metamfetamin), men også for at karakterisere disse virkninger efter kronisk eksponering for miljøkoncentrationer af et pesticid (glyphosat).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Streng overholdelse af etiske standarder garanterer velfærd og korrekt behandling af zebrafisken, der anvendes til forsøg. Alle forsøg blev udført i henhold til de retningslinjer, der er fastlagt af Institutional Animal Care and Use Committees (CID-CSIC). Protokollerne og resultaterne nedenfor blev udført under licens udstedt af den lokale regering (aftalenummer 11336).

1. Dyrestald til adfærdstest

  1. Udfør alle tests (vist i figur 1) i et isoleret adfærdsrum ved 27-28 °C mellem kl. 10.00 og 17.00.
  2. Vask både kontrolfisk og eksponerede fisk flere gange i rent fiskevand [omvendt osmoserenset vand indeholdende 90 mg / L akvariumsystemsalt, 0,58 mM CaSO4 · 2H2O og 0,59 mM NaHCO3] inden forsøgene påbegyndes for at undgå potentiel forurening af forsøgstanken.
  3. Akklimatisere dyr til adfærdsrummet 1 time før forsøgene påbegyndes.
  4. Sørg for, at dyrene (≈50:50 han: kvindelig ratio) er eksperimentelt naive og udfører alle adfærdstest på en blind måde med observatører uvidende om forsøgsgruppen.
  5. For at opnå meningsfulde resultater i adfærdsmæssige assays skal du have et samlet antal på 18 emner pr. Tilstand (n = 18), ideelt opnået mellem to eller flere uafhængige eksperimenter. For eksempel analyserer du i individuelle tests adfærden hos 9 dyr pr. Tilstand pr. Replikat. I gruppetest skal du analysere adfærden hos en stime på 6 til 9 dyr pr. Tilstand pr. Replikat.
  6. Udfør alle test efter en batteritestmetode (se planlægningsforslag i figur 2). Etisk mere egnet gør denne metode det muligt at reducere antallet af dyr, der er nødvendige til undersøgelsen, i overensstemmelse med 3R-reduktionsprincippet7.
  7. Det meste af tiden er adfærdsmæssige analyser forbundet med biologiske assays, så ofre dyrene efter eutanasi-retningslinjer18 , før de indsamler og analyserer prøver (OMIC'er eller kemikalier). Hvis endepunktet ikke viser sig at være prøveudtagning, stabiliseres kontrolgruppen ved forsøgets afslutning. Genbrug kontroldyrene til avls- eller forsøgsformål efter et par dage.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle opsætninger. Tre konfigurationer af den firkantede tank for at studere en bred vifte af adfærd hos voksne zebrafisk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel tidslinje. To planlægningsforslag til registrering af adfærdsmæssige assays. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Eksperimentelle konfigurationer af tanken

  1. Angstlignende adfærd: The Novel Tank Test (NTT)
    1. Juster den eksperimentelle opsætning (antal tanke, kameraer og computere) for at registrere det maksimale antal fisk samtidigt. Individuelle adfærdsanalyser er tidskrævende, så optimer tid, materiale og rum.
    2. Forbered forsøgstankene til NTT: Firkantet tank (20 cm længde, 20 cm bredde, 25 cm højde) dækket med akrylpaneler på sidevægge og bund for at undgå refleksion og interferens mellem emner.
    3. Forsøgstankene fyldes med 7 L (vandsøjlehøjde: 20 cm højde) godt iltet fiskevand ved 28 °C.
    4. Juster tankens position foran kameraet for at undgå forvrænget billede.
    5. Kontroller belysningsopsætningen. LED-baggrundsbelysning (10000 lux) giver en homogen belysning på alle dele af tanken til videooptagelse under gode forhold.
    6. Tænd kameraerne, og juster dem ved at følge punkt 3.
    7. Indfør emnerne, en efter en, i bunden af forsøgstankene, inden du begynder at optage så hurtigt som muligt.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at begynde at optage med dyret i bunden af tanken.
    8. Pas på ikke at forstyrre dyrene under optagelsen. Brug af et gardin eller panel til at begrænse visuel interaktion ikke kun mellem tanke, men også mellem understøtningen og ydersiden.
    9. Ved afslutningen af optagelsen (standard optagetid er 6 min) overføres de dyr, der allerede har gennemgået testen, til en anden tank for ikke at blande dem med de naive dyr.
    10. Gentag proceduren med alle tilgængelige emner. Det anbefales at have et samlet antal på 18 forsøgspersoner pr. betingelse for at opnå meningsfulde resultater i individuelle forsøg (fra to eller flere uafhængige replikater).
    11. Randomiser den eksperimentelle gruppe, der er tildelt hver tank mellem forsøg for at undgå potentielle tankeffekter (hvis du registrerer flere betingelser på samme tid).
  2. Social grupperet adfærd: Shoaling Test (ST)
    1. Den eksperimentelle konfiguration af ST er den samme som for NTT (de samme tanke kan genbruges direkte).
    2. Følg trin 2.1.1-2.1.6. for at konfigurere ST.
    3. Indfør stimen (6 til 9 emner på samme tid) i bunden af forsøgstankene, inden du begynder at optage så hurtigt som muligt.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at begynde at optage med dyret i bunden af tanken.
    4. Følg trin 2.1.8-2.1.11. for at udføre ST.
    5. Gentag proceduren med alle tilgængelige emner. For at opnå meningsfulde resultater i dette assay skal du lave mindst to uafhængige replikater med samme bankstørrelse i hver replikat.
    6. Hold stimens størrelse konsistent for alle eksperimentelle grupper og replikerer inden for det samme eksperiment.
  3. Social individuel adfærd: Den sociale præferencetest (SPT)
    1. Juster den eksperimentelle opsætning for at optimere det eksperimentelle rum og tidspunktet for optagelsen.
    2. Forbered forsøgstankene til SPT: Firkantet tank (20 cm længde, 20 cm bredde, 25 cm højde) gennemsigtig (glas eller plast) for at give lateral synlighed. Den enkelte fokale fisk er fri til at interagere med en konspecifik virtuel zone - en fisks stime placeret i den ensidige udvendige hustank eller med den uspecifikke virtuelle zone - en ensidig ekstern tom hustank.
    3. Forsøgstankene fyldes med 5 L (vandsøjlehøjde: 15 cm, samme højde som vandsøjlen i de ydre bassiner) rent fiskevand ved 28 °C.
    4. Juster tankens position foran kameraet for at undgå forvrænget billede.
    5. Kontroller, at systemet modtager homogen belysning.
    6. Introducer forsøgspersonerne, en efter en, i bunden af forsøgstankene, før du straks begynder at optage med dyret nede i midten.
    7. Undgå visuelle interaktioner mellem observatører og dyr under optagelse.
    8. I slutningen af 6 minutters optagelse overføres de nuværende dyr til en anden tank for ikke at blande dem med de naive dyr.
    9. Gentag proceduren med alle tilgængelige emner. Har i alt 18 forsøgspersoner pr. betingelse for at opnå meningsfulde resultater i individuelle forsøg (fra to eller flere uafhængige replikater).

3. Videooptagelse til adfærdstest

  1. Åbn kameraadministratoren for at kontrollere tilgængeligheden af GigE-kameraet på hver computer.
  2. Start GigE-kamerastyringssoftwaren (såsom uEye Cockpit, beskrevet her). Åbn kameraindstillingen , vælg monokrom tilstand, og juster billedstørrelsen (1: 2).
  3. Åbn Egenskaber for kamera
    1. Under Kamera skal du indstille pixeluret til Maksimum, indstille billedhastigheden til 30 billeder pr. sekund (fps) og justere eksponeringen (Automatisk eller manuel justering, hvis billedet er for mørkt).
    2. Under Billede skal du indstille forstærkningen til 0 (Auto) og Sortniveauerne (Automatisk eller Manuel justering for at opnå en god kontrast).
    3. Under Størrelse skal du justere størrelsen på vinduet til det område, der skal indgraveres (Bredde: Bredde-Venstre, Højde: Højde-Top). Dette trin gør det muligt at reducere billedets størrelse og derfor den endelige størrelse på videoen.
    4. Luk Egenskaber for kamera.
  4. Opret en generel mappe til eksperimentsessionen for at gemme kameraindstillingerne og videoerne.
  5. Hvis du vil gemme kameraindstillingerne, skal du indstille Filer > Gem parametre > Til fil og vælge den eksperimentmappe, der er oprettet for nylig.
    BEMÆRK: Kameraindstillingsfilen kan således genindlæses i applikationen for at fortsætte med at arbejde med de samme billedparametre til enhver tid (f.eks. når kameraet pludselig slukkes eller genbruges de samme indstillinger, hvilket reducerer opsætningstiden og homogeniserer eksperimentelle betingelser). Hvis kameraet på et øjeblik fryser mellem videoer, skal du stoppe optagelsen, afslutte og slukke kameraet. Tænd den igen, genindlæs kameraparametrene ved at gå til Filer > Indlæs parametre > Til fil, og genstart optagelsen. Kontroller, om den aktuelle video er blevet helt erhvervet for at kassere eller gentage fisken (før gentagelse, giv dyrene lidt tid til at akklimatisere igen).
  6. Gentag denne kameraopsætningsprocedure (trin 3.1-3.5) på alle kameraerne.
  7. Når alle kameraerne er konfigureret korrekt, skal du åbne Optag videosekvens.
  8. Vælg Opret for at gemme som en ny videofil, vælg den eksperimentmappe, der er oprettet for nylig, og rapporter oplysningerne om emnet, eksperimenttypen og datoen i videofilens navn.
  9. Vælg Maks. rammer. Skriv 10800 i rammeboksen. Standard video optager 6 min (Video 1) ved 30 fps i AVI-format; Derfor 6 min x 60 s x 30 fps = 10800 billeder i alt.
  10. Vælg Calc. Frame Rate eller angiv billedhastigheden manuelt (optagelseshastighed: 30 fps).
  11. Gentag proceduren for oprettelse af videofil på alle computere.
  12. Indfør emnerne, en efter en, i bunden af hver eksperimentelle tanke. Alle analyser køres på én gang.
  13. Start posterne hurtigt ved at klikke på Optag og vent på at få det maksimale antal ønskede rammer (trin 3.10).
  14. Når videoerne er optaget, vises en chatboks med beskeden Maksimalt antal opnåede rammer !. Vælg Acceptér.
  15. Vælg Luk for at afslutte optagelsen og lukke videofilen.
  16. Fjern de fisk, der lige er blevet observeret. Pas på at adskille dem fra den naive fisk.
  17. Vælg Opret direkte, og gentag processen for at fortsætte med at optage videoer.
  18. Når alle optagelserne er færdige, skal du vælge Afslut.
  19. Hvis du vil slukke kameraerne, skal du vælge Luk kamera og Afslut programmet.

4. Analyse af optagede videoer

  1. Start analysesoftwaren (se materialetabel).
  2. For at uddybe en ny skabelon skal du klikke på Ny fra skabelon > Anvendt en foruddefineret skabelon > fra videofil og vælge en video for at starte opsætningen af skabelonen. Prøv at vælge en repræsentativ video af eksperimentet med et emne, der udviser god mobilitet og gode optagelsesbetingelser.
  3. I Parametre skal du konfigurere parametrene i følgende vinduer (1 til 4/7). Vælg modellen Fish > Adult Zebrafish, arenaen Open Field Square > One Arena, antallet af emner pr. Arena (for ST kræves en multisporingspakke [spor forskellige emner i en arena]), typen af detektion efter centerpunkt og juster endelig billedhastigheden til 30 fps. I de følgende vinduer (5 til 7/7) må du ikke ændre parametre; standardkonfigurationen er OK.
  4. Navngiv eksperimentet som en skabelon, og placer det i samme mappe som resten af den gemte video. Skabelonen oprettes som en eksperimentmappe med flere underinddelinger, der indeholder alle opsætningsoplysningerne.
  5. Under Eksperimentindstillinger skal du kontrollere den definerede opsætning (fra videofil, arena, antal emner, billede pr. sekund). Her kan systemenhederne ændres.
  6. Under Arena-indstillinger skal du højreklikke på midten af skærmen og vælge Grib. Fra Filer i displayet. Vælg et videobillede af god kvalitet, og accepter for at tage dette billede til baggrundsindstillingerne. Først skal du kalibrere billedet og generere en kalibreret regel. Brug tankens bredde som en skala (19 cm). Tegn derefter arenaen. Vær omhyggelig med at gøre firkanten lige nok til at undgå refleksioner af dyret, når sidstnævnte nærmer sig overfladen eller enhver eventuel forveksling af fiskesoftwaren med tankens sorte områder. Til sidst skal du tegne formzonerne med funktionen Ramme .
    1. For NTT og ST skal du opdele tankens forside i to lige store virtuelle zoner, top og bund (se figur 1). Tegn to lige vandrette kasser. Kasser dækker en halv arena for hver enkelt. Navngiv Top og Bund for henholdsvis de øvre og nedre zoner. Pas på, at kasserne har samme bredde (9-10 cm) og længde (8-9 cm), ikke overskrider arenagrænser (orange firkant) og ikke overlapper hinanden, og kontroller, at hver pilzone angiver nøjagtigt dens zoner.
    2. For SPT opdeles den eksperimentelle arena konceptuelt i tre zoner af samme størrelse: tom, center og konspecifik (se figur 1). Tegn tre lige lodrette kasser. Navngiv den boks, der er orienteret mod stimetanken, som Konspecifik, kassen, der er orienteret mod den tomme tank, som Tom og den midterste som Center. Pas på, at kasserne har samme bredde (6 cm) og længde (18-19 cm), ikke overskrider arenagrænser og ikke overlapper hinanden.
  7. Under Registreringsindstillinger skal du kontrollere, hvilken video der skal behandles i videofilen. Kontroller derefter detektionskvaliteten (fisk i gult, rødt midtpunkt). Klik på Automatisk registrering for at justere registreringen, fokusere dyret igen (vælg et billede, som dyret svømmer i profil på den hvide baggrund, tegn billedet ved at tage hele kroppen, og valider detektionen med Ja). Åbn Avanceret for at forbedre registreringen ved at vælge Dynamisk subtraktion, Mørkere motiv, Baggrundsindstillinger, Baggrundslæring, Motivstørrelse, Støjreduktion osv.
  8. Under Prøveindstillinger skal du placere en prøveversion og slette de andre (højreklik og slet)
  9. Opret dialogboksvinduer til resultater under Dataindstillinger. Parameteriser resultater pr. tid og pr. zone. Du kan f.eks. oprette et resultatvindue for dataoutput efter minutter og et andet for dataoutput efter samlet tid (6 min). Anmod om dataoutput for hver zone (anmod om det, hvis afstanden i hver zone er nødvendig). Link de forskellige resultatvinduer til Start-vinduet med pile.
  10. Under Analysér indstillinger skal du vælge de parametre , der skal analyseres, og typen af statistik for hver parameter. Disse parametre beregnes automatisk baseret på de data, der er erhvervet fra sporingen.
    1. For NTT og SPT skal du vælge indstillinger som defineret nedenfor:
      1. Vælg Flyttet afstand (vælg Total) for at få den tilbagelagte afstand i arenaen (cm) og den tilbagelagte afstand i de respektive zoner (cm).
      2. Vælg I zoner (vælg Zoner, Frekvens, Kumulativ og Ventetid til først) for at få den tid, der er brugt i zonerne, og ventetiden til første indgang i zonerne.
      3. Vælg Zoneovergang (vælg Tærskel: 0 cm, Tilføj zone 1 > zone 2; Zone 2 > Zone 1, i alle zoner, Frekvens) for at få antallet af indgange i zonerne.
      4. Vælg Mobility Sate (udfyld Høj mobil over 70%, Immobil under 3%, minimum 150 billeder, og vælg frekvens, kumulativ og latenstid til først) for at få varigheden af hypermobilitet (er), varigheden af frysning (er).
        BEMÆRK: Se afsnittet Diskussion for at få flere oplysninger om tilnærmelse af fryseadfærd ved hjælp af den automatiserede analyse og antallet og varigheden af fryseepisoder.
      5. Vælg Acceleration og drejevinkel (vælg frekvens og kumulativ) for at evaluere forekomsten af kompleks adfærd såsom darting og uregelmæssig (hurtige accelerationsbevægelser).
    2. For ST skal du ud over ovenstående sonderende parametre vælge indstillingen Afstand mellem emner (vælg alle emner, middelværdi, maksimum, minimum) for at få den gennemsnitlige afstand mellem fisk (cm), den gennemsnitlige afstand mellem nærmeste nabo (cm) og den gennemsnitlige afstand mellem den fjerneste nabo.
  11. Skabelonen er klar til brug. Gem de sidste ændringer, og luk skabelonen uden at hente data fra videoen (vedligehold skabelonfilen; den er let og nem at administrere og kopiere). Hvis der er flere softwarelicenser, skal du analysere videoerne fra den samme skabelon, der er kopieret til hver computer.
  12. Hvis du vil kopiere og bruge skabelonen, er der to muligheder:
    1. Åbn skabelonfilen med adfærdsanalysesoftwaren, gå til Filer > Gem som for at oprette en ny identisk fil.
    2. I velkomstgrænsefladen skal du vælge Ny fra skabelon > Anvendt en brugerdefineret skabelon > Fra videofil (vælg skabelon. EthXV-fil). Navngiv det nye eksperiment, og vælg dets placering. Det kan tage et par minutter for softwaren at kopiere oplysningerne fra skabelonfilen.
  13. Gå til Arena-indstillinger for at justere skabelonen igen, hvis videoen blev optaget med et andet kamera (følg trin 4.6 og 4.7).
  14. Gå til Registreringsindstillinger eller Erhvervelse for at kontrollere, hvilken video der er valgt, og ændre videofilen, hvis det er nødvendigt.
  15. Under Anskaffelse skal du vælge DDS > klar til start. Det kan tage et par minutter for softwaren at behandle videoen.
  16. Når anskaffelsen er færdig, skal du gå til Track Editor. Vælg acceleration x16 for at læse den behandlede video hurtigere og kontrollere, om sporingen er korrekt.
    BEMÆRK: Nogle gange kan der være "tab" i sporingen (på grund af refleksioner eller forvirring af selve softwaren). De kan redigeres manuelt fra denne del, hvis de er få; Ellers foretrækkes det at ombehandle hele eksperimentet, forbedre definitionen af lærredet og detektionen.
  17. Under Statistik skal du klikke på Beregn > eksportér data. Dataeksport er direkte placeret i eksperimentmappen.
  18. Under Spor visualisering eller Heatmaps skal du generere og eksportere (højreklik, eksporter billede, vælg mappen Eksporter filer for eksperimentet for at gemme disse data med regnearksrapporten) sporingsbilleder af dyret.
  19. Gå til Filer for at lukke det aktive eksperiment, og gentag denne procedure for den næste video.

5. Statistisk analyse

  1. Analyser normaliteten (Shapiro-Wilk test) af data i hver gruppe.
  2. Vurder homoscedasticitet med Levenes test.
  3. Brug envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts og Tukeys multiple sammenligningstest til at teste forskelle mellem grupper, når kriterier for normalitet og homoscedasticitet ikke kan afvises.
  4. Brug Kruskal-Wallis-testen efterfulgt af en parvis sammenligning ved hjælp af Bonferroni-korrektionen til at teste forskelle mellem grupper, når kriterier for normalitet og homoscedasticitet afvises.
  5. Plot dataene med grafisk software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit vil vi se på nogle mulige anvendelser af disse adfærdsmæssige værktøjer i fiskneurotoksikologi. Følgende resultater svarer til karakteriseringen af de akutte eller binge effekter af metamfetamin (METH), et rekreativt stof, og de subkroniske virkninger af glyphosat, et af de vigtigste herbicider, der findes i akvatiske økosystemer.

Karakterisering af en metamfetamin binge neurotoksicitetsmodel hos voksne zebrafisk
Ved evaluering af effekten af 40 mg/l METH på NTT (figur 3) bekræftede Kruskal-Wallis-testen, at de eksponerede dyr udviste en positiv geotaxis, karakteriseret ved et fald i efterforskningstiden i forsøgstankens øvre zone (H(2) = 35,964, P = 1,55 x 10-8) såvel som i den tilbagelagte afstand i denne del (H(2) = 32,272, P = 9,82 x 10-8) og i antallet af besøg (H(2) = 36,527, P = 1,17 x 10-8). Vi observerede også en signifikant stigning i latenstiden forud for det første besøg i den øvre zone (H(2) = 17,264, P = 0,00018). Det er vigtigt at bemærke, at de forskelle, der observeres i parametrene målt i NTT efter METH-eksponering, er konsistente over tid, hvilket bekræftes af Bonferroni-korrektionen (P > 0,8). En signifikant effekt af eksponeringstid blev fundet for fryseadfærd (H(2) = 13,120, P = 0,0014).

Figure 3
Figur 3: Angstlignende adfærd vurderet i standard 6-min novel tank test (NTT) af voksne zebrafisk udsat for 40 mg / L metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Data fra hvert eksperiment blev normaliseret til de tilsvarende kontrolværdier. De kombinerede data rapporteres som et spredningsplot med medianen (n = 14-15), **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis-test med Bonferroni-korrektion for NTT-endepunkter. Data fra 2 uafhængige eksperimenter. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Bedrossiantz et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Frysebevægelser kan kvantificeres ved at vurdere hyppigheden, latenstiden, varigheden eller placeringen af frysningen. Den bedste måde at score dem på er utvivlsomt øjet fra en erfaren observatør, hvilket er ret besværligt og komplekst, så vi prøvede et automatiseret alternativ ved hjælp af EthoVision-software til at registrere fryseadfærd19. Vi fandt ud af, at antallet, latenstiden og varigheden af fryseangreb beregnet af softwaren (tabel 1A) korrelerer med god nøjagtighed med de episoder, der scores manuelt af observatøren (tabel 1B). Mens de to metoder er ækvivalente med hensyn til resultater (P = 0,958, elevtest), brugte vi den automatiserede tilgang til at vurdere frysningen her. Efter 3 timers eksponering for METH steg frysetiden signifikant (P = 0,0012), mens der ikke blev fundet nogen forskel med kontrollen efter 48 timers eksponering (P = 0,16). METH producerede ingen effekt på uregelmæssige bevægelser på nogen af tidspunkterne.

Vi brugte to eksperimentelle paradigmer til at evaluere virkningerne på social adfærd efter akut eksponering for METH. ST (figur 4) afslørede, at den gennemsnitlige afstand og fjerneste afstand mellem individer var signifikant større for METH-behandlede fisk (H(2) = 53,261, P = 2,72 x 10-12; H(2)=52,504, P = 3,97 x 10-12 for henholdsvis gennemsnitlige og fjerneste interfish-afstande), hvilket peger på en adfærdsmæssig fænotype af social isolation. Igen bemærker vi, at der ikke blev fundet nogen tidseffekt ved hjælp af Bonferroni post hoc-testen (P > 0,5).

Figure 4
Figur 4: Social adfærd hos voksne zebrafisk vandbårne udsat for 40 mg / L metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Shoaling test (ST) resultater, herunder de gennemsnitlige og de fjerneste interfish afstande. De kombinerede data rapporteres som et spredningsplot med medianen (n = 18), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Kruskal Wallis test med Bonferroni korrektion. Data fra 2 uafhængige eksperimenter. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Bedrossiantz et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

I SPT (figur 5) viser behandlede fisk et signifikant fald i den tid, der tilbringes og tilbagelægges i den specifikke zone (F(2,74) = 14,497, P = 4,87 x 10-6; F(2,73) = 13,461, P = 0,00001 for henholdsvis brugt tid og tilbagelagt afstand i den specifikke zone). Disse resultater bekræfter den sociale isolationsfænotype, der foreslås af TS-resultaterne. Tukeys Honest Significant Difference (HSD) post hoc-test udelukkede ingen mulige forskelle mellem de to analysetider (P > 0,5).

Figure 5
Figur 5: Social adfærd hos voksne zebrafisk vandbårne udsat for 40 mg / L metamfetamin (METH) i 3 timer og 48 timer. Resultaterne af den sociale præferencetest (SPT), herunder tid og afstand for fisken i hver af de tre virtuelle zoner i forsøgstanken: tom, center og konspecifik. Data fra hvert eksperiment blev normaliseret til de tilsvarende kontrolværdier. De kombinerede data rapporteres som et spredningsplot med medianen (n = 17-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest. Data fra 2 uafhængige eksperimenter. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Bedrossiantz et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Adfærdsmæssig effekt af subkronisk eksponering for miljømæssige niveauer af glyphosat
Adfærdsmæssig analyse af virkningerne af subkronisk eksponering for 3 μg/L glyphosat på NTT (figur 6) afslører et signifikant fald i den tid, der bruges på at udforske toppen (F2,77 = 8,744, P = 0,0004), tilbagelagt afstand i denne del (F2,77 = 9,118, P = 0,0003) og antal besøg (F2,77 = 3,441, P = 0,037). Disse effekter er karakteristiske for positiv geotaxisadfærd, ligesom den øgede effekt, der observeres på latenstiden forud for det første besøg på toppen af tanken (H (2) = 9,628, P = 0,008). Udtrykket af uberegnelig og frysende adfærd hos de udsatte dyr blev også analyseret i NTT. Varigheden (H(2) = 17,261, P = 0,025) og antallet af uregelmæssige episoder (F2,76 = 10,073, P = 0,0001) blev signifikant øget med glyphosat. I modsætning hertil blev der ikke fundet fryseforskelle med kontrollen (Pearson Chi-Square(2) = 2,964, P = 0,253). Anvendt i en økologisk kontekst tyder observationerne på NTT på, at glyphosat kan reducere fiskens udforskende adfærd betydeligt og bringe deres evne til at overleve i naturen i fare.

Figure 6
Figur 6: Angstlignende adfærd vurderet i standard 6-min novel tank test (NTT) af voksne zebrafisk udsat for 0,3 μg/L og 3 μg/L glyphosat i 2 uger. Adfærdsparametre analyseret, samt en tegneserie af forsøgstanken opdelt i to lige store virtuelle zoner, top og bund. Data rapporteret som et spredningsplot med medianen (n = 23-29), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (Samlet afstand, Afstand i top, Tid i top, Overgange til top, Uregelmæssige kampe, Høj mobilitetsfrekvens) eller Kruskal Wallis-test med Bonferroni-korrektion (Latency to the top, Erircular duration). Der blev ikke fundet forskelle (P > 0,05) i frysetiden og fryseanfaldene. Data fra 2-4 uafhængige eksperimenter. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Faria et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Skolegang, ikke-polariserede grupper af artsfæller, der holdes sammen af socialt pres for at beskytte sig mod rovdyr, er en naturlig tendens hos Danio rerio. Skolen kan "stramme" eller "udvide" afhængigt af dyrenes niveau af angst eller frygt, en særlig visuel effekt, der er meget let at identificere eksperimentelt (figur 7). I glyphosatforsøget afslørede shoaling-testen en stigning i angst hos fisk udsat for 3 μg/L, hvilket afspejles ved en gruppering af stimerne og dermed et signifikant fald i den gennemsnitlige afstand og fjerneste afstand mellem individer (F2,56 = 5,664, P = 0,006 og F2,56 = 7,413, P = 0,001, for de gennemsnitlige og fjerneste interfish-afstande, henholdsvis) sammenlignet med kontrolelementet.

Figure 7
Figur 7: Social adfærd hos voksne zebrafisk vandbårne udsat for 0,3 μg/L og 3 μg/L glyphosat i 2 uger. Data rapporteret som spredningsplot med medianen (n = 19-20), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (gennemsnitlig interfish afstand og fjerneste afstand) Data fra 2 til 4 uafhængige eksperimenter. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Faria et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: En tilnærmelse af fryseadfærd ved hjælp af en automatiseret analyse. Data, der rapporteres i denne tabel, kommer fra den samme optagelse (Video 1) analyseret med to forskellige metoder. (A) Tilnærmelse af fryseadfærd ved automatisk beregning med EthoVision V13-software. Den variable mobilitet beregnes ud fra ændringen af fagområdet mellem to prøver, så det afhænger af erhvervelsesfrekvensen for dette område. Vi sætter en meget lav tærskel for immobilitet (mindre end 3% mobilitet) samt prøvefrekvensen til en minimum kontinuerlig tid på 5 s (mere end 150 billeder). (B) Analyse af fryseadfærd med Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, gratis og open source-software). BORIS er en event-logging software til videokodning og live observationer. Med BORIS kan observatøren kode fryseepisoden som en tilstandshændelse og definere start- og slutpunkterne. Klik her for at downloade denne tabel.

Video 1: Kontroller fisk i den nye tanktest. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Karakteristisk angstadfærd observeret i NTT er blevet positivt korreleret med serotoninniveauer analyseret i hjerner21. For eksempel, efter eksponering for para-chlorphenylalanin (PCPA), en hæmmer af 5-HT biosyntese, fisk udviste positiv geotaxis samt nedsat hjerne 5-HT niveauer22, resultater meget lig dem, der opnås med METH. Derfor antyder faldet i hjernens serotoninniveauer og visningen af positiv geotaxis i METH-eksponeret zebrafisk, at angstadfærden produceret af lægemidlet medieres af den serotonerge vej. Interessant nok kan en lignende adfærdsfænotype, dvs. en angstfremkaldende effekt på geotaxis, ses hos voksne zebrafisk, der i 2 uger udsættes for 0,3 3 μg/L og 3 μg/L, to miljørelevante koncentrationer af glyphosat. Der er også tidligere rapporteret en stigning i geotaxis for voksne zebrafisk med det neurotoksiske stof acrylamid 6,23. I alle disse tilfælde var denne adfærdsmæssige fænotype (en stigning i geotaxis i NTT, karakteristisk for angstfremkaldende stof) forbundet med formindskelsen af monoaminerge neurotransmitterniveauer. Derfor giver NTT-paradigmet kombineret med neurokemisk analyse af hjernen økologisk relevant information, udforskende adfærd og fourageringseffektivitet og forbinder adfærdsneurofænotyper med neurotransmittermodulationer.

På den anden side blev der også observeret en forringelse af social adfærd i begge analyser, ST og SPT, hos METH-behandlede fisk. Resultatet opnået i denne undersøgelse er i overensstemmelse med flere undersøgelser med rotter og aber, hvor forsøgsdyrenes akutte og kroniske eksponering for METH resulterer i social tilbagetrækning24. Sociale adfærdsændringer forbundet med METH-misbrug er blevet forklaret hos mennesker ved forringelser i social-kognitiv funktion24. Der blev fundet en angstdæmpende effekt på stimestørrelsen hos zebrafisk, der i 2 uger blev udsat for 3 μg/l glyphosat. Vi observerede en fænokopi af denne effekt hos zebrafisk udsat for 53 mg/L (0,75 mM) acrylamid i 3 dage 6,23.

NTT-, ST- og SPT-assays gør det muligt effektivt at bestemme de potentielle neurotoksiske virkninger25 af en lang række kemikalier som illustreret ved undersøgelsen af akutte metamfetamin og subkroniske glyphosattoksicitetsmodeller hos voksne zebrafisk. Adfærd er i toksikologi et relevant apikalt endepunkt, der karakteriserer virkningerne på organismeniveau af et kemikalie til neurotoksicitet og miljøforskning. Udover at være et subletalt endepunkt under laboratorieforhold, kan ændringer i adfærd, såsom sonderende eller social adfærd, være skadelige. Desuden er det foreslåede adfærdsanalysebatteri en let at implementere, halvautomatiseret metode11 og derfor meget effektiv, hvis analyserne er bevidst planlagt (reduktionsprincippet)26. Udførelse af disse analyser som et testbatteri ved hjælp af en enkelt tank reducerer antallet af dyr og forsøgstiden og affaldsgenereringen.

Rækkefølgen af analyserne i batteriet er en vigtig overvejelse, hvis vi ønsker at studere responsprofilen for en person i hvert forsøg. Til dette formål giver gennemførelsen af de individuelle analyser, der følges ( se figur 2), mulighed for at holde dyret identificeret og relatere dets udforskende adfærd til dets sociale præference. Derudover kan dyrets adfærdsmæssige reaktioner relateres til andre biologiske data, såsom dets neurotransmitterprofil eller genekspression, hvis fisken holdes identificeret indtil prøveudtagningens slutpunkt (figur 2A).

Normalt giver adfærdsanalyse mulighed for observation af forskelle mellem grupper. For det første beregnes individuelle svar på grundlag af sporing af dyr27, før dataene samles efter gruppe. Derefter sammenlignes middelværdierne og forskellen i varians i forhold til kontrolgruppen for hver beregnet adfærdsparameter. Med shoaling analyse12 er det afgørende at være meget klar over, at variansenheden er gruppen af testfisk, ikke individuelle fisk, fordi hver enkelt fisks adfærd påvirkes af de andre fisk i stimen. Dette er den måde, der anvendes i de fleste papirer til at behandle adfærdsdata28. Det kan dog være nyttigt at genoverveje analysen af adfærdsparametre, ikke parameter-for-parameter-basis, men som et samlet svar pr. forsøg. For eksempel kan man beregne kovariansen for hver måling foretaget i et forsøg og rapportere det som en anden måde at måle den samme ting på: ængstelig, udforskende eller selskabelig adfærd. Der er mange måder at beregne og fortolke adfærdsdata28,29. Afhængigt af antallet af forhold, testtype og billedoptagelse (2D eller 3D)30,31 kan analysen gentænkes fuldstændigt for at få det bedste ud af dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af "Agencia Estatal de Investigación" fra det spanske ministerium for videnskab og innovation (projekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz blev støttet af et ph.d.-stipendium (PRE2018-083513) medfinansieret af den spanske regering og Den Europæiske Socialfond (ESF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 201 Zebrafisk neurotoksicitetstest videooptagelse udforskende aggressiv social adfærd applikationer
Neurotoksicitetsvurdering hos voksne <em>Danio rerio</em> ved hjælp af et batteri af adfærdstest i en enkelt tank
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedrossiantz, J., Prats, E.,… More

Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter