Summary
ここでは、ゼブラフィッシュの成魚に対する化学物質(メタンフェタミンやグリホサートなど)の潜在的な神経毒性効果を1つの水槽で効果的に判定するために、新しい水槽、ショーリング、社会的選好試験など、包括的な行動試験バッテリーを紹介します。この方法は、神経毒性および環境研究に関連しています。
Abstract
神経病理学的影響の存在は、長年にわたり、化学物質の神経毒性を評価するための主要なエンドポイントであることが証明されました。しかし、過去50年間、モデル種の行動に対する化学物質の影響が活発に調査されてきました。次第に、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれ、これらの機能的結果は現在、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために日常的に使用されています。成体のゼブラフィッシュの行動アッセイは、不安、社会的相互作用、学習、記憶、依存症など、幅広い行動を研究するための標準化された信頼性の高い手段を提供します。成魚のゼブラフィッシュの行動アッセイでは、通常、実験場に魚を置き、ビデオ追跡ソフトウェアを使用してその行動を記録および分析します。魚はさまざまな刺激にさらされ、その行動はさまざまな指標を使用して定量化できます。新しい水槽試験は、魚の不安様行動を研究するために最も受け入れられ、広く使用されている試験の1つです。群れと社会的選好のテストは、ゼブラフィッシュの社会的行動を研究するのに役立ちます。このアッセイは、群れ全体の挙動が研究されているので、特に興味深いものです。これらのアッセイは、再現性が高く、薬理学的および遺伝子操作に対して感度が高いことが証明されており、行動の根底にある神経回路と分子メカニズムを研究するための貴重なツールとなっています。さらに、これらのアッセイは、行動の潜在的な調節因子である可能性のある化合物を特定するための薬物スクリーニングに使用できます。
本研究では、魚類の神経毒性学における行動ツールの適用方法を示し、娯楽用薬物であるメタンフェタミンと環境汚染物質であるグリホサートの効果を分析します。この結果は、ゼブラフィッシュの成体における行動アッセイが、環境汚染物質や薬物の神経毒性学的影響の理解に大きく貢献していることを実証するとともに、神経機能を変化させる可能性のある分子機構に関する手掛かりも得ている。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、生態毒性学、創薬、安全性薬理学の研究で人気のあるモデル脊椎動物種です。ゼブラフィッシュは、低コストで分子遺伝学的ツールが確立されており、神経系の形態形成と維持に関与する主要な生理学的プロセスの保存により、神経行動毒性学を含む神経科学研究に理想的な動物モデルとなっています1,2。化学物質の神経毒性を評価するための主な評価項目は、最近まで、神経病理学的影響の存在でした。しかし、最近では、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれており、これらの機能的結果は、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために一般的に使用されています3,4。さらに、行動エンドポイントは生態学的観点から非常に関連性が高く、魚の非常に穏やかな行動変化でさえ、自然条件での動物の生存を危険にさらす可能性があります5。
ゼブラフィッシュの成体研究で最もよく使われる行動アッセイの1つに、不安様行動を測定する新しい水槽試験(NTT)があります6,7。このアッセイでは、魚は新規性(魚はなじみのない水槽に入れられます)、穏やかな嫌悪刺激にさらされ、それらの行動反応が観察されます。NTTは、主に魚類の基礎運動、走地行動、凍結、不規則な動きの評価に用いられています。不規則な8は、方向の急激な変化(ジグザグ)と加速の繰り返し(ダーティング)を特徴としています。これはアラーム反応であり、通常、凍結エピソードの前後に観察されます。凍結行動は、鎮静によって引き起こされる不動と区別されるように、水槽の底にいる間の魚の動きの完全な停止(手術および眼球の動きを除く)に対応し、低発運動、無動症、および沈没を引き起こします8。凍結は通常、ストレスや不安の高い状態に関連しており、従順な行動の一部でもあります。複雑な行動は、動物の不安状態を示す優れた指標です。NTTは、薬理学的および遺伝子操作に敏感であることが示されており9、不安および関連する障害の神経基盤を研究するための貴重なツールとなっています。
ゼブラフィッシュは社会性が高い種なので、さまざまな社会行動を測定できます。浅瀬テスト(ST)と社会的選好テスト(SPT)は、社会的行動を評価するために最もよく使用されるアッセイです10。STは、魚の空間的行動と移動パターンを定量化することにより、魚がグループ化される傾向を測定します11。STは、集団力学、リーダーシップ、社会的学習を研究し、多くの魚種の社会的行動を理解するのに役立ちます12。成体のゼブラフィッシュのSPTは、マウスの社会的新規性テストに対するクローリーの好みから適応され13、すぐにこのモデル種における社会的相互作用の研究のための一般的な行動アッセイになりました14。これら2つの試験は、薬物スクリーニングアッセイでの使用にも適応されており、社会的行動を調節する新規化合物の同定に有望であることが示されています15,16。
一般に、成体のゼブラフィッシュにおける行動アッセイは、活性化合物や乱用薬物の行動メカニズムや神経表現型に関する貴重な情報を提供できる強力なツールです17。このプロトコルでは、これらの行動ツール7 を基本的な材料資源で実装する方法と、幅広い神経活性化合物の効果を特徴付けるために毒性アッセイに適用する方法を詳しく説明します。さらに、同じテストを適用して、神経活性化合物(メタンフェタミン)への急性曝露の神経行動学的影響を評価するだけでなく、農薬(グリホサート)の環境濃度への慢性曝露後のこれらの影響を特徴付けることもできます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
倫理基準を厳格に遵守することで、実験に使用されたゼブラフィッシュの福祉と適切な処理が保証されます。すべての実験手順は、動物実験委員会(CID-CSIC)によって確立されたガイドラインに基づいて実施されました。以下に示すプロトコルと結果は、地方自治体から付与されたライセンス(契約番号11336)に基づいて実施されました。
1.行動実験用動物飼育施設
- 10:00から17:00の間に27〜28°Cの隔離された行動室ですべてのテスト( 図1に表示)を実行します。
- 実験開始前に、対照魚とばく露魚の両方をきれいな魚水(90 mg/L水槽系塩、0.58 mM CaSO4·2H2O、および0.59 mM NaHCO3を含む逆浸透精製水)で数回洗浄し、実験水槽の汚染の可能性を回避します。
- 実験開始の1時間前に動物を行動室に慣らします。
- 動物(≈50:50、雄:雌の比率)が実験的にナイーブであることを確認し、実験群に気づかない観察者とともに、すべての行動テストを盲目的に実施します。
- 行動アッセイで有意義な結果を得るには、条件ごとに合計18人の被験者(n = 18)を用意し、理想的には2つ以上の独立した実験の間に取得します。たとえば、個々のテストで、反復ごとに条件ごと、反復ごとに9匹の動物の行動を解析します。グループテストでは、6〜9匹の動物の群れの行動を、反復ごとの条件ごとに分析します。
- バッテリーテストのアプローチに従って、すべてのテストを実行します( 図2の計画提案を参照)。倫理的により適したこの方法は、3R削減原則7に準拠して、研究に必要な動物の数を減らすことを可能にします。
- ほとんどの場合、行動アッセイは生物学的アッセイと関連しているため、サンプル(OMICまたは化学物質)を採取して分析する前に、安楽死ガイドライン18 に従って動物を犠牲にしてください。エンドポイントがサンプリングであることが証明されない場合は、実験の最後に対照群を再安定化します。数日後、コントロール動物を繁殖または実験目的で再利用します。
図1:実験装置。 ゼブラフィッシュ成魚の幅広い行動を研究するための正方形の水槽の3つの構成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:実験のタイムライン。 行動アッセイの記録のための2つの計画提案。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
2. タンクの実験構成
- 不安様行動:The Novel Tank Test (NTT)
- 実験装置(水槽、カメラ、コンピューターの数)を調整して、同時に最大数の魚を記録します。個々の行動アッセイには時間がかかるため、時間、材料、スペースを最適化します。
- NTT用の実験水槽:角型水槽(長さ20cm、幅20cm、高さ25cm)を用意し、側面壁と底面にアクリルパネルを貼り、被写体同士の反射や干渉を避ける。
- 実験水槽に、28°Cで7L(水柱の高さ:高さ20cm)の十分な酸素を含んだ魚水を入れます。
- カメラの前のタンクの位置を調整して、画像が歪まないようにします。
- イルミネーションの設定を確認してください。LEDバックライト(10000ルクス)は、タンクのすべての部分に均質な照明を提供し、良好な条件でのビデオ録画を可能にします。
- カメラの電源を入れ、セクション3に従って調整します。
- 被験者を1人ずつ実験水槽の底に投入してから、できるだけ早く記録を開始します。
注意: 水槽の底にいる動物から記録を開始することが重要です。 - 録音中は動物の邪魔にならないように注意してください。カーテンやパネルを使用して、タンク間だけでなく、サポートと外部との視覚的な相互作用も制限します。
- 記録の最後に(標準記録時間は6分)、すでにテストを通過した動物を別の水槽に移し、ナイーブ動物と混ざらないようにします。
- 使用可能なすべてのサブジェクトで手順を繰り返します。個々の試験(2つ以上の独立した反復から)で意味のある結果を得るために、条件ごとに合計18人の被験者を用意することをお勧めします。
- 試験の合間に各タンクに割り当てられた実験グループを無作為化して、潜在的なタンク効果を回避します(複数の条件を同時に記録している場合)。
- 社会的にグループ化された行動:浅瀬テスト(ST)
- STの実験構成はNTTと同じです(同じタンクを直接再利用できます)。
- 手順2.1.1-2.1.6に従います。STを設定します。
- 実験水槽の底に浅瀬(同時に6〜9人の被験者)を導入してから、できるだけ早く記録を開始します。
注意: 水槽の底にいる動物から記録を開始することが重要です。 - 手順2.1.8-2.1.11に従います。をクリックして ST を実行します。
- 使用可能なすべてのサブジェクトで手順を繰り返します。このアッセイで有意義な結果を得るには、各レプリケートで同じバンクサイズを持つ少なくとも2つの独立したレプリケートを作成します。
- すべての実験グループで群れのサイズを一定に保ち、同じ実験内で複製します。
- 社会的個人行動:社会的選好テスト(SPT)
- 実験のセットアップを調整して、実験の記録のスペースと時間を最適化します。
- SPT用の実験タンクを準備します:横方向の視認性を提供するために、透明(ガラスまたはプラスチック)の正方形のタンク(長さ20 cm、幅20 cm、高さ25 cm)。単焦点魚は、同種の仮想ゾーン(片側の外部飼育水槽に置かれた魚の群れ)と、または非特定の仮想ゾーン(片側の外部空の飼育水槽)と自由に相互作用することができます。
- 実験水槽に28°Cで5L(水柱の高さ:15cm、外部飼育槽の水柱と同じ高さ)のきれいな魚水を入れます。
- カメラの前のタンクの位置を調整して、画像が歪まないようにします。
- システムが均一な照明を受けることを確認します。
- 被験者を1人ずつ実験水槽の底に入れ、すぐに動物を中央にして記録を開始します。
- 記録中は、観察者と動物の視覚的な相互作用を避けてください。
- 6分間の録音が終わったら、現在の動物を別の水槽に移し、素朴な動物と混ざらないようにします。
- 使用可能なすべてのサブジェクトで手順を繰り返します。個々の試験で意味のある結果を得るために、条件ごとに合計 18 人の被験者を用意します (2 つ以上の独立した反復から)。
3.行動テスト用のビデオ録画
- カメラマネージャーを開き、各コンピューターでGigEカメラが使用可能かどうかを確認します。
- GigE カメラ制御ソフトウェア (こちらで説明する uEye Cockpit など) を起動します。[ カメラ ]オプションを開き、 モノクロ モードを選択して、画像サイズ(1:2)を調整します。
- カメラのプロパティを開く
- [カメラ] で、[ピクセル クロック] を [最大] に設定し、[フレーム レート] を 30 フレーム/秒 (fps) に設定して、[露出] を調整します (画像が暗すぎる場合は、[自動] または [手動] で調整します)。
- [画像]で、[ゲイン]を0(自動)に設定し、黒レベル([自動]または[手動]を調整してコントラストを良好にします)に設定します。
- サイズ(Size)で、ウィンドウのサイズを刻印する領域(幅:幅-左、高さ:高さ-上)に調整します。このステップにより、画像のサイズを縮小できるため、ビデオの最終的なサイズを縮小できます。
- [カメラのプロパティ] を閉じます。
- 実験セッション用の汎用フォルダーを作成して、カメラの設定とビデオを保存します。
- カメラ設定を保存するには、[ファイル] > [パラメーターの保存] > [ファイルへ ] を設定し、最近作成した実験フォルダーを選択します。
注:したがって、カメラ設定ファイルをアプリケーションに再ロードして、いつでも同じ画像パラメータで作業を続けることができます(たとえば、カメラの電源が突然オフになったときや、同じ設定を再利用して、セットアップ時間を短縮し、実験条件を均一化します)。ある瞬間にカメラがビデオ間でフリーズした場合は、録画を停止して終了し、カメラの電源を切ります。電源を入れ直し、[ File] > Load Parameters > To File に移動してカメラ パラメーターをリロードし、録画を再開します。現在のビデオが完全に取得されているかどうかを確認して、魚を捨てたり繰り返したりします(繰り返す前に、動物が再順応する時間を与えてください)。 - すべてのカメラでこのカメラ設定手順(手順3.1〜3.5)を繰り返します。
- すべてのカメラが正しく設定されたら、[ ビデオシーケンスの録画]を開きます。
- [作成] を選択して新しいビデオ ファイルとして保存し、最近作成した実験フォルダーを選択して、被験者の情報、実験の種類、および日付をビデオ ファイルの名前で報告します。
- 「最大フレーム数」を選択します。フレームボックスに「10800」と入力します。標準ビデオは、AVI 形式で 30 fps で 6 分間 (ビデオ 1) を記録しています。したがって、6分×60秒×30fps=合計10800フレームとなります。
- [フレームレートの計算]を選ぶか、フレームレートを手動で指定します(記録速度:30 fps)。
- すべてのコンピュータでビデオファイルの作成手順を繰り返します。
- 各実験槽の底に被験者を1人ずつ紹介する。すべてのアッセイが一度に実行されます。
- [記録]をクリックしてレコードをすばやく開始し、要求されたフレームの最大数を取得するのを待ちます(手順3.10)。
- ビデオが録画されると、チャットボックスが表示され、「 最大フレーム数が達成されました!」というメッセージが表示されます。[ 同意する] を選択します。
- [ 閉じる ] を選択して録画を終了し、ビデオ ファイルを閉じます。
- 観察したばかりの魚を取り除きます。素朴な魚からそれらを分離するように注意してください。
- [作成]を直接選択し、プロセスを繰り返してビデオの録画を続行します。
- すべての記録が完了したら、[ 終了] を選択します。
- カメラをオフにするには、[ カメラを閉じる ]を選択してプログラムを 終了します 。
4.録画されたビデオの分析
- 解析ソフトウェアを起動します( 材料表を参照)。
- 新しいテンプレートを詳しく説明するには、[ テンプレートから新規作成] > [ビデオ ファイルから定義済みのテンプレートを適用>] をクリックし、ビデオを選択してテンプレートの設定を開始します。良好な可動性と良好な記録条件を示す被験者による実験の代表的なビデオを選択するようにしてください。
- [パラメーター] で、次のウィンドウ (1 から 4/7) でパラメーターを構成します。魚>大人のゼブラフィッシュのモデル、アリーナのオープンフィールドスクエア>1つのアリーナ、アリーナごとの被写体の数(STの場合、マルチトラッキングパッケージ[1つのアリーナでさまざまな被写体を追跡する]が必要)、センターポイントによる検出の種類を選択し、最後にフレームレートを30fpsに調整します。次のウィンドウ(5〜7/7)では、パラメータを変更しないでください。デフォルト設定はOKです。
- 実験にテンプレートとして名前を付け、保存されている残りのビデオと同じフォルダーに配置します。テンプレートは、すべてのセットアップ情報を含むいくつかのサブディビジョンを持つ実験フォルダーとして作成されます。
- [実験設定]で、定義された設定(ビデオファイル、アリーナ、被験者数、フレーム/秒)を確認します。ここでは、システム単位を変更できます。
- [アリーナ設定]で、画面の中央を右クリックし、[グラブ]を選択します。ディスプレイのファイルから。高品質のビデオ画像を選択し、 受け入れる 背景設定用にこの画像をキャプチャします。まず、画像をキャリブレーションし、キャリブレーションされたルールを生成します。タンクの幅をスケールとして使用します(19 cm)。次に、アリーナを描きます。動物が水面に近づいたときに動物が反射したり、魚のソフトウェアと水槽の黒い領域が最終的に混同されたりしないように、正方形に注意してください。最後に、Frame関数で図形ゾーンを描画します。
- NTT と ST の場合は、 タンクの前面を上と下の 2 つの等しい仮想ゾーンに分割します ( 図 1 を参照)。2 つの等しい水平ボックスを描画します。ボックスは、それぞれアリーナの半分をカバーしています。上部ゾーンと下部ゾーンにそれぞれ「 Top 」と「 Bottom 」という名前を付けます。ボックスの幅(9〜10 cm)と長さ(8〜9 cm)が同じで、アリーナの境界(オレンジ色の四角)を超えず、重ならないように注意し、各矢印ゾーンがそのゾーンを正確に示していることを確認してください。
- SPT では、実験領域を概念的に 3 つの等しいサイズのゾーン (空、中心、および同種) に分割します ( 図 1 を参照)。3 つの等しい垂直ボックスを描画します。浅瀬の水槽を向いたボックスに「 Conspecific」、空の水槽を向いた箱を 「Empty」、中央の箱に「 Center」という名前を付けます。ボックスの幅(6 cm)と長さ(18〜19 cm)が同じで、アリーナの制限を超えず、重ならないように注意してください。
- [検出設定]で、ビデオファイルで処理するビデオを確認します。次に、検出品質を確認します(黄色、赤の中心点の魚)。[自動検出]をクリックして検出を調整し、動物の焦点を合わせます(白い背景に動物が横泳いでいる画像を選択し、全身を撮影して写真を描き、[はい]で検出を検証します)。「詳細」を開き、「動的減算」、「暗い被写体」、「背景設定」、「背景学習」、「被写体サイズ」、「ノイズリダクション」などを選択して、検出を改善します。
- [トライアルの設定] で、トライアルを 1 つ配置し、他のトライアルを削除します (右クリックして削除します)。
- [データ設定]で、[結果]ダイアログウィンドウを作成します。時間ごとおよびゾーンごとの結果をパラメーター化します。たとえば、分単位でデータを出力するための結果ウィンドウと、合計時間(6分)によるデータ出力用の結果ウィンドウを作成します。各ゾーンのデータ出力を要求します(各ゾーンの距離が必要な場合に要求します)。さまざまな結果ウィンドウを矢印でスタート ウィンドウにリンクします。
- 「分析設定」で、分析するパラメータと各パラメータの「統計」のタイプを選択します。これらのパラメータは、トラッキングから取得したデータに基づいて自動的に計算されます。
- NTT と SPT の場合は、以下に定義するオプションを選択します。
- 移動距離(合計を選択)を選択して、アリーナでの移動距離(cm)とそれぞれのゾーンでの移動距離(cm)を取得します。
- [In Zones]([Zones]、[Frequency]、[Cummulative]、および [Latency to First] を選択)を選択して、ゾーンで費やされた時間と、ゾーンの最初のエントリまでの遅延を設定します。
- ゾーン遷移を選択します(しきい値:0 cmを選択し、ゾーン1>ゾーン2を追加します。ゾーン 2 > ゾーン 1、任意のゾーン、周波数) を使用して、ゾーン内の入り口の数を取得します。
- [Mobility Sate (High mobile above 70%, Immobile below 3%, minimum 150 frames] に入力し、frequency、cumulative、latency to first を選択) を選択して、ハイパーモビリティの持続時間、凍結の持続時間 (s) を指定します。
注:自動分析を使用したフリーズ動作の近似、およびフリーズエピソードの数と期間の詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。 - 加速度と回転角度(周波数と累積を選択)を選択して、ダーティングや不規則(加速の速い動き)などの複雑な動作の発生を評価します。
- STの場合、上記の探索的パラメータに加えて、被験者間の距離(すべての被験者、平均、最大、最小を選択)オプションを選択して、魚間の平均距離(cm)、最近傍間の平均距離(cm)、および最も遠い近傍間の平均距離を取得します。
- NTT と SPT の場合は、以下に定義するオプションを選択します。
- テンプレートを使用する準備が整いました。最後に変更した内容 を保存し 、ビデオからデータを取得せずにテンプレート を閉じ ます(テンプレートファイルは管理します。複数のソフトウェアライセンスがある場合は、各コンピューターにコピーされた同じテンプレートからビデオを分析します。
- テンプレートをコピーして使用するには、次の 2 つのオプションがあります。
- 行動分析ソフトウェアでテンプレートファイルを開き、[ ファイル]>[名前を付けて保存 ]に移動して、新しい同一のファイルを作成します。
- ようこそインターフェイスで、[ テンプレートから新規作成] > [カスタム テンプレートを適用した] > [ビデオ ファイルから ] を選択します (テンプレートを選択します。EthXV ファイル)。新しい実験に名前を付け、その場所を選択します。ソフトウェアがテンプレート ファイルから情報をコピーするのに数分かかる場合があります。
- ビデオが別のカメラで録画された場合は、 アリーナ設定 に移動してテンプレートを再調整します(手順4.6および4.7に従います)。
- [検出設定]または[取得]に移動して、選択されているビデオを確認し、必要に応じてビデオファイルを変更します。
- [Acquisition]で、[DDS > Ready to Start]を選択します。ソフトウェアがビデオを処理するのに数分かかる場合があります。
- 取得が終了したら、 トラックエディターに移動します。加速度x16を選択して、処理されたビデオをより速く読み取り、トラッキングが正しいかどうかを確認します。
注:場合によっては、追跡に「損失」が発生する場合があります(ソフトウェア自体の反射または混乱が原因です)。数が少ない場合は、この部分から手動で編集できます。それ以外の場合は、実験全体を再処理して、キャンバスの定義と検出を改善することが望ましいです。 - [統計] で [データの計算>エクスポート] をクリックします。データのエクスポートは、実験フォルダーに直接配置されます。
- [ Track Visualization] または [Heatmaps] で、動物の追跡画像を生成してエクスポートします (右クリックして画像をエクスポートし、実験の [Export Files ] フォルダーを選択して、このデータをスプレッドシート レポートに保存します)。
- [ ファイル ] に移動してアクティブな実験 を閉じ 、次の動画でこの手順を繰り返します。
5. 統計解析
- 各グループのデータの正規性(Shapiro-Wilk検定)を分析します。
- Leveneの検定で均質分散性を評価します。
- 一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くDunnettとTukeyの多重比較検定を使用して、正規性と等分散性の基準を棄却できない場合にグループ間の差を検定します。
- Kruskal-Wallis検定に続いてBonferroni補正を使用したペアワイズ比較を使用して、正規性と等分散性の基準が棄却された場合のグループ間の差を検定します。
- グラフィカル ソフトウェアでデータをプロットします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このセクションでは、魚類の神経毒性学におけるこれらの行動ツールの可能なアプリケーションについて見ていきます。以下の結果は、娯楽用薬物であるメタンフェタミン(METH)の急性または過食症の影響、および水生生態系に見られる主要な除草剤の1つであるグリホサートの亜慢性効果の特徴付けに対応しています。
成魚ゼブラフィッシュにおけるメタンフェタミン過食神経毒性モデルの特性評価
40 mg/L METH が NTT に及ぼす影響を評価したところ (図 3)、Kruskal-Wallis 試験により、ばく露された動物は、実験水槽の上部ゾーンでの探査時間の減少 (H(2) = 35.964、 P = 1.55 x 10-8) およびこの部分の移動距離 (H(2) = 32.272) P = 9.82 x 10-8)、および訪問回数(H(2) = 36.527、 P = 1.17 x 10-8)です。また、上部ゾーンへの最初の訪問に先立つ待ち時間の有意な増加も観察されました(H(2) = 17.264、 P = 0.00018)。METH 曝露後に NTT で測定されたパラメータで観察された差は、Bonferroni 補正 (P > 0.8) によって確認されたように、経時的に一貫していることに注意することが重要です。ばく露時間の有意な影響は、凍結挙動に対して見出された(H(2) = 13.120, P = 0.0014)。
図3:40 mg/Lメタンフェタミン(METH)に3時間および48時間曝露された成魚の標準的な6分間の新規水槽試験(NTT)で評価された不安様行動。 各実験のデータは、対応するコントロール値に正規化されました。結合されたデータは、中央値 (n = 14-15)、**p < 0.01、***p < 0.001 の散布図として報告されます。Kruskal WallisテストとNTTエンドポイントのBonferroni補正2つの独立した実験からのデータ。この図は、Bedrossiantz et al.15の許可を得て転載したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
凍結の動きは、凍結の頻度、遅延、期間、または場所を評価することで定量化できます。それらを採点する最良の方法は間違いなく経験豊富な観察者の目であり、これは非常に面倒で複雑なので、EthoVisionソフトウェアを使用してフリーズ動作を検出するための自動化された代替手段を試しました19。ソフトウェアによって計算された凍結攻撃の数、遅延、および期間(表1A)は、観察者が手動でスコアリングしたエピソード(表1B)と良好な精度で相関していることがわかりました。2つの方法は結果の点で同等ですが(P = 0.958、スチューデントの検定)、ここでは自動アプローチを使用して凍結を評価しました。METHに3時間曝露した後、凍結時間は有意に増加したが(P = 0.0012)、48時間曝露後の対照群には差は認められなかった(P = 0.16)。METH は、いずれの場合も不規則な動きには効果をもたらさなかった。
我々は、2つの実験パラダイムを用いて、METHへの急性曝露後の社会的行動への影響を評価した。ST(図4)では、個体間の平均距離と最遠距離は、METH処理された魚の方が有意に大きいことが明らかになりました(H(2) = 53.261、 P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 (それぞれ平均魚間距離と最遠魚間距離)は、社会的孤立の行動表現型を指摘している。繰り返しになりますが、ボンフェローニの事後検定(P > 0.5)では時間効果は見られませんでした。
図4:40mg/Lメタンフェタミン(METH)に3時間および48時間曝露された水中ゼブラフィッシュ成魚の社会的行動。 平均魚間距離と最遠距離を含む浅瀬テスト(ST)の結果。結合されたデータは、中央値 (n = 18)、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 の散布図として報告されます。Kruskal Wallis検定とBonferroni補正2つの独立した実験からのデータ。この図は、Bedrossiantz et al.15の許可を得て転載したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
SPT(図5)では、処理された魚は、同種帯で費やされた時間と移動距離の有意な減少を示しています(F(2,74) = 14.497、 P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13.461、 P = 0.00001 (それぞれ同種ゾーンでの滞在時間と移動距離)。これらの結果は、TSの結果によって示唆された社会的孤立の表現型を再確認するものである。テューキーの正直有意差(HSD)事後検定では、2つの分析時間の間に差の可能性は認められませんでした(P > 0.5)。
図5:40mg/Lメタンフェタミン(METH)に3時間および48時間曝露した水上ゼブラフィッシュ成魚の社会的行動。 社会的選好テスト(SPT)の結果には、実験水槽の3つの仮想ゾーン(空、中心、同種)のそれぞれにおける魚の時間と距離が含まれます。各実験のデータは、対応するコントロール値に正規化されました。結合されたデータは、中央値(n = 17-20)、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001の散布図として報告されます。Dunnett の多重比較検定による一元配置分散分析。2つの独立した実験からのデータ。この図は、Bedrossiantz et al.15の許可を得て転載したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
グリホサートの環境レベルへの亜慢性曝露の行動への影響
3μg/Lグリホサートへの亜慢性曝露がNTTに及ぼす影響の行動分析(図6)では、頂上探索に費やす時間(F2,77 = 8.744, P = 0.0004)、この部分での移動距離(F2,77 = 9.118, P = 0.0003)、訪問回数(F2,77 = 3.441, P = 0.037) です。これらの効果は、正のジオタキシス挙動の特徴であり、タンクの上部への最初の訪問に先立つ待ち時間に観察される増加効果も同様です(H(2) = 9.628、 P = 0.008)。また、被ばくした動物の不規則で凍結した行動の発現もNTTで解析した。期間(H(2) = 17.261、 P = 0.025)および不規則なエピソードの数(F2,76 = 10.073、 P = 0.0001)は、グリホサートによって有意に増加しました。対照的に、対照群では凝固差は見られませんでした(ピアソンカイ二乗(2) = 2.964、 P = 0.253)。生態学的な文脈に当てはめると、NTTで行われた観察は、グリホサートが魚の探索行動を著しく減少させ、野生での生存能力を危険にさらす可能性があることを示唆しています。
図6:0.3 μg/Lおよび3 μg/Lのグリホサートに2週間曝露した成魚の標準的な6分間の新規水槽試験(NTT)で評価された不安様行動。 行動パラメータが分析され、実験用タンクが上下の2つの等しい仮想ゾーンに分割された漫画。中央値(n = 23-29)、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001の散布図として報告されたデータ。Dunnett の多重比較検定による一元配置分散分析 (総距離、トップの距離、トップの時間、トップへの遷移、不規則な発作、高い移動度数) または Bonferroni 補正による Kruskal Wallis 検定 (トップへの待ち時間、不規則な持続時間)。凍結期間と凍結発作に差(P > 0.05)は認められなかった。2〜4回の独立した実験からのデータ。この図は、Faria et al.20の許可を得て転載したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
捕食者から身を守るための社会的圧力によって団結している同種の分極化されていないグループである学校教育は、 ダニオ・レリオの自然な傾向です。群れは、動物の不安や恐怖のレベルに応じて「引き締める」または「拡大する」ことができ、実験的に非常に簡単に特定できる特定の視覚効果があります(図7)。グリホサートの実験では、浅瀬試験により、3μg/Lに曝露された魚の不安の増加が明らかになり、群れのグループ化に反映され、したがって個体間の平均距離と最遠距離の有意な減少が見られました(F2,56 = 5.664、 P = 0.006および F2,56 = 7.413、 P = 0.001、平均および最も遠い魚間距離の場合、 それぞれ)をコントロールと比較した。
図7:0.3 μg/Lおよび3 μg/Lのグリホサートに2週間曝露された水産ゼブラフィッシュ成魚の社会的行動。 中央値(n = 19-20)、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001の散布図として報告されるデータ。Dunnettの多重比較検定による一元配置分散分析(平均魚間距離と最遠距離) 2〜4つの独立した実験からのデータ。この図は、Faria et al.20の許可を得て転載したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:自動分析を使用した固化挙動の近似値。 この表で報告されているデータは、2つの異なる方法で分析された同じ記録(ビデオ1)からのものです。(A)EthoVision V13ソフトウェアによる自動計算による凍結挙動の近似。可変移動度は、2つのサンプル間の被写体領域の変化から計算されるため、この領域の取得頻度に依存します。不動の閾値を非常に低く設定し(移動度は3%未満)、サンプルレートは最小連続時間5秒(150フレーム以上)に設定しました。(B)Behavioral Observation Research Interactive Software(BORIS、フリーでオープンソースのソフトウェア)による凍結行動の解析。BORISは、ビデオコーディングとライブ観察のためのイベントロギングソフトウェアです。BORIS を使用すると、オブザーバーはフリーズ エピソードを状態イベントとしてコード化し、開始点と終了点を定義できます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画1:斬新な水槽試験で魚をコントロール。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NTTで観察された特徴的な不安行動は、脳で分析されたセロトニンレベルと正の相関がありました21。例えば、5-HT生合成の阻害剤であるパラクロロフェニルアラニン(PCPA)に曝露した後、魚は陽性のジオタキシシスと脳の5-HTレベルの低下を示し22、METHで得られた結果と非常によく似た結果を示しました。したがって、METHに曝露されたゼブラフィッシュにおける脳のセロトニンレベルの低下と陽性のジオタキシシスの表示は、薬物によって引き起こされる不安行動がセロトニン作動性経路によって媒介されることを示唆しています。興味深いことに、同様の行動表現型、すなわち、ジオタキシスに対する抗不安作用は、0.3 3 μg/Lおよび3 μg/L(環境に関連する2つの濃度のグリホサート)に2週間曝露された成魚ゼブラフィッシュに見られます。ジオタキシスの増加は、神経毒性物質であるアクリルアミド6,23の成魚ゼブラフィッシュでも以前に報告されています。これらすべての場合において、この行動表現型(抗不安物質に特徴的なNTTにおけるジオタキシスの増加)は、モノアミン作動性神経伝達物質レベルの低下と関連していた。したがって、脳の神経化学的分析と組み合わせたNTTパラダイムは、生態学的に関連性のある情報、探索行動、および採餌効率を提供し、行動の神経表現型を神経伝達物質の調節に結び付けます。
一方、STとSPTの両アッセイにおける社会的行動の障害は、METH処理された魚類でも観察された。この研究で得られた結果は、ラットとサルを用いたいくつかの研究と一致しており、研究動物のMETHへの急性および慢性曝露は社会的引きこもりを引き起こします24。METH 乱用に伴う社会的行動の変化は、ヒトにおいて社会的認知機能の障害によって説明されている24。群れの大きさに対する抗不安作用は、3μg/Lのグリホサートに2週間曝露されたゼブラフィッシュで見出された。ゼブラフィッシュに53 mg/L(0.75 mM)のアクリルアミドを3日間曝露したところ、この効果の表現コピーが観察されました6,23。
NTT、ST、およびSPTアッセイは、成魚ゼブラフィッシュにおける急性メタンフェタミンおよび亜慢性グリホサート毒性モデルの研究によって示されるように、幅広い化学物質の潜在的な神経毒性効果25 を効果的に決定することを可能にします。行動は、毒物学では、関連する頂端エンドポイントであり、神経毒性と環境研究のための化学物質の生物レベルでの影響を特徴付けます。実験室条件では亜致死エンドポイントであるだけでなく、探索的行動や社会的行動などの行動の変化は、本質的に有害である可能性があります。さらに、提案された行動分析バッテリーは、実装が容易な半自動の方法11 であり、したがって、アッセイが意識的に計画されている場合(還元原理)26。これらのアッセイを1つのタンクで試験用電池として行うことで、動物の数を減らし、実験時間や廃棄物の発生量を減らすことができます。
バッテリー内のアッセイの順序は、各試験における個人の反応プロファイルを研究する場合、重要な考慮事項です。この目的のために、個々のアッセイ( 図2を参照)を実施することで、動物を識別し、その探索行動を社会的選好に関連付けることができます。さらに、魚がサンプリングの終点まで同定されていれば、動物の行動反応は、神経伝達物質プロファイルや遺伝子発現などの他の生物学的データと関連付けることができます(図2A)。
通常、行動分析では、グループ間の違いを観察することができます。まず、個々の応答は、グループごとにデータを統合する前に、動物追跡27に基づいて計算される。次に、平均と対照群に対する分散の差が、計算された行動パラメータごとに比較されます。浅瀬分析12では、個々の魚の行動は群れ内の他の魚の影響を受けるため、分散の単位は個々の魚ではなく、テスト魚のグループであることを非常に明確にすることが重要です。これは、行動データを処理するためにほとんどの論文で使用されている方法です28。しかし、行動パラメータの解析は、パラメータごとではなく、試行ごとの全体的な反応として再考することが有用である。たとえば、試行で行われた各測定値の共分散を計算し、同じものを測定する別の方法(不安行動、探索行動、社交行動)として報告できます。行動データを計算および解釈する方法はたくさんあります28,29。条件の数、テストの種類、画像取得(2Dまたは3D)30,31に応じて、データを最大限に活用するために分析を完全に再考することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、スペイン科学イノベーション省の「Agencia Estatal de Investigación」(プロジェクトPID2020-113371RB-C21)、IDAEA-CSIC、セベロオチョアセンターオブエクセレンス(CEX2018-000794-S)の支援を受けました。Juliette Bedrossiantzは、スペイン政府と欧州社会基金(ESF)が共同出資する博士号助成金(PRE2018-083513)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
- Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
- Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
